Procédures modérées

180 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus transgéniques pour exprimer deux gènes de canard, ils sont infectés par le virus de la grippe aviaire H7N1, subissent jusqu'à neuf prises de sang et de nombreux écouvillons, puis sont euthanasiés pour prélever leurs organes. Les animaux infectés peuvent développer détresse respiratoire, prostration et immobilité, l'euthanasie étant déclenchée quand au moins trois signes cliniques sur six apparaissent. Le porteur affirme que l'étude de la réponse immunitaire adaptative "n'est possible que par des études in vivo" et présente ces poulets comme un "modèle unique".

Objectifs

Les virus de la grippe aviaire (AIV) représentent une menace majeure pour la santé humaine et animale. Les AIV, sont susceptibles d'acquérir des mutations dans les protéines virales, ce qui augmente le risque de transmission de l'oiseau à l'homme. Les oiseaux aquatiques sauvages, dont les canards, représentent le réservoir naturel des AIV. Il a été suggéré que les caractéristiques génomiques de ces espèces aviaires étaient associées à une résistance virale naturelle contre les maladies induites par le virus AIV. Chez le canard, le RIG-I (retinoic acid inducible gene 1) est considéré comme un gène de résistance naturelle contre la grippe aviaire. RIG-I est impliqué dans le déclenchement de la réponse antivirale caractérisée par une production des interférons (IFN) de type I et de type III, suivie de la production de gènes stimulés par l'IFN. Alors que les poulets sont très sensibles à l'infection grippale et présentent des symptômes cliniques, les canards ne développent pas de symptômes cliniques lors de l'infection par plusieurs sous-types de virus de la grippe aviaire, ce qui est peut-être dû à la présence de RIG-I, mais pourrait aussi être lié à la protéine 135 du doigt d'encoche (RNF-135). RIG-I et RNF-135 sont absents du génome du poulet, ce qui pourrait être à l'origine d'une plus grande sensibilité à certaines infections virales. Ce projet permettra d'expliquer pour la première fois le rôle des gènes de canards capables de maitriser les AIV en utilisant des poulets transgéniques. Les objectifs du projet sont de répondre à deux questions principales : 1) Les poulets transgéniques qui expriment le RIG-I et le RNF-135 de canard sont-ils protégés contre l'infection par des virus virulents de la grippe aviaire? 2) Quel est le rôle de RIG-I et RNF-135 de canard dans les réponses immunitaires adaptatives aux virus de la grippe aviaire ? Le nombre total d’animaux est de 180.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de répondre à des questions relatives à l'aviculture, à l'immunologie et à la virologie qui n'ont pu être résolues jusqu'à présent en raison de l'absence de poulets transgéniques. Nous obtiendrons de nouvelles informations sur le rôle des gènes du canard chez la volaille. Cela permettra de mieux contrôler le virus de la grippe aviaire chez les volailles en développant de nouvelles thérapies qui conduisent à l'activation de certaines voies immunitaires. En outre, les résultats de ce projet contribueront à la compréhension de l'oiseau aquatique en tant que réservoir du virus et expliqueront le rôle exact de RIG-I ainsi que de RNF-135 du canard. De plus, nous espérons fournir une compréhension approfondie des interactions virus-hôte d'une importante infection potentiellement zoonotique, ce qui bénéficiera à la santé des humains et des animaux.

Procédures

- Inoculation par voie intra-trachéale et intra-choanale de 100 µL virus (144 animaux) ou de 100 µL de PBS (36 animaux) : vigile, soit 180 animaux, à raison d’une administration pour 150 animaux (120 animaux avec le virus et 30 animaux avec le PBS) et 2 administrations pour les 30 autres (24 infectés et 6 témoins). Les inoculations durent moins de 30 sec en moyenne par animal. - Prélèvements de sang au sinus occipital : vigile, quelques µL à 100 µL à naissance, jour 1, 3, 7, 11, 14, 18 et 22 post-inoculation) soit 9 prises de sang par animal pour ceux euthanasiés à J22 (60 animaux), 5 prises de sang pour ceux euthanasiés à J7 (60 animaux) et 3 prises de sang pour ceux euthanasiés à J1 (60 animaux). - Ecouvillons oropharyngés et cloanaux : vigile, sur tous les animaux, un écouvillon de chaque à raison de 8 fois par animal (à 1, 3, 7, 11, 14, 18 et 22dpi) pour ceux euthanasiés à J22 (60 animaux), 4 écouvillons de chaque pour ceux euthanasiés à J7 (60 animaux) et 2 écouvillons pour ceux euthanasiés à J1 (60 animaux). Le prélèvement ne dure que quelques sec.

Impact sur les animaux

Les poulets transgéniques non infectés n'ont présenté aucun phénotype anormal. Au cours de l’infection, certains animaux qui ne sont pas génétiquement modifiés peuvent presenter dès 24h des signes cliniques modérés qui sont liés à la réponse de l’organisme à l’infection virale, mais ne présagent pas toujours d’une issue fatale. Il n’existe pas actuellement de grilles de scores cliniques adaptées à l’influenza aviaire expérimental. Cependant, en nous inspirant des études de bien-être du Welfare Quality® chez le poulet, nous mettrons en place le système d’évaluation de l’état clinique de l’animal suivant: Les animaux seront observés deux fois par jour par un animalier expérimenté, connaissant parfaitement les signes cliniques de l’influenza aviaire. Les animaux qui présenteront au moins 3 des 6 paramètres suivants seront euthanasiés par injection létale de barbiturique: - difficulté respiratoire visible - fermeture anormale de l'oeil (mi-fermé, fermé) - position anormale de la tête et de la queue - posture anormale des ailes (écartées, tombantes) - plumage ébouriffé - Absence de réponse à la stimulation (immobilité). Ce modèle d’infection de grippe (souche H7N1) chez les vollailes de type PA12 de statut EOPS ou axéniques est bien connu et maitrisé au sein de nos équipes. Les signes cliniques sont bien connus du personnel technique.

Devenir

Le projet est de réaliser un challenge infectieux (inoculation de la grippe) avec un suivi clinique de la maladie sur des prises de sang et écouvillons. Les animaux à la fin du projet (procédure) seront tous euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes afin de quantifier le virus. Les animaux infectieux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés sur le plan sanitaire pour l’environnement, pour la santé animale et publique. Pour les animaux témoins, ils seront également euthanasiés afin de réaliser les prélèvements d’organes, ils serviront de témoins dans les dosages de cytokines et l’identification des cellules immunitaires.

Remplacement

L'étude du rôle du RIG-I et du RNF-135 du canard dans la protection contre le virus de la grippe aviaire ainsi que dans la réponse immunitaire adaptée n'est possible que par des études in vivo. Nous utilisons des poulets transgéniques qui représentent un modèle unique pour de telles études.

Réduction

Le nombre d'animaux sélectionnés répartis sur deux expériences pour répondre à deux questions spécifiques concernant la susceptibilité des animaux à l'infection virale ainsi que le rôle de la réponse immunitaire adaptative dans la prévention des réinfections. Statistiques : Si p est inférieur à 0,05, l'hypothèse nulle est rejetée et l'hypothèse alternative est acceptée. Le nombre d'animaux requis a été calculé à l'aide du logiciel G*Power 3.1. La base de calcul de la taille des groupes est le nombre d'animaux par groupe qui est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement évaluables lors de l'autopsie et des tests de laboratoire ultérieurs (Tests F – ANOVA). Avant la production des poulets transgéniques, notre collaborateur en Allemagne a mené plusieurs expériences in vitro sur des fibroblastes et des cellules germinales de poulet qui nous ont permis de comprendre la fonction des gènes RIG-I et RNF-135. Toutes les expériences préliminaires ont éliminé la nécessité d'utiliser des animaux vivants pour comprendre le rôle du RIG-I dans la réponse immunitaire innée. Les données préliminaires in vitro nous ont permis de formuler des hypothèses spécifiques et de poser de nouvelles questions scientifiques qui ne peuvent être abordées que par des études in vivo, telles que le rôle de l'immunité adaptative et l'effet physiologique de l'expression de RIG-I sur l'animal pendant l'infection.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe dans des isolateurs adaptés en nombre et en taille, dans des conditions environnementales contrôlées (température, hygrométrie, éclairage), avec nourriture et boisson à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement social (élevés en groupe) et du milieu avec des jouets à picorer et des petits perchoirs. Les surfaces d’hébergement seront respectées. Le nombre d’isolateurs sera adapté (surface de 0,84 m²/isolateur). Une surveillance clinique quotidienne des animaux sera réalisée avec des observations physiologiques et comportementales pour ne pas dépasser le point limite. Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié. Pour les points limites, il n’existe pas actuellement de grilles de scores cliniques adaptées à l’influenza aviaire expérimental. Cependant, en nous inspirant des études de bien-être du Welfare Quality® chez le poulet, nous mettrons en place le système d’évaluation de l’état clinique de l’animal suivant : Les animaux seront observés deux fois par jour par un animalier expérimenté, connaissant parfaitement les signes cliniques de l’influenza aviaire. Les animaux qui présenteront au moins 3 des 6 paramètres suivants seront euthanasiés par injection létale de barbiturique: - difficulté respiratoire visible - fermeture anormale de l'oeil (mi-fermé, fermé) - position anormale de la tête et de la queue - posture anormale des ailes (écartées, tombantes) - plumage ébouriffé - Absence de réponse à la stimulation (immobilité). Ce modèle d’infection de grippe chez les vollailes de type PA12 de statut EOPS ou axéniques est bien connu et maitrisé au sein de nos équipes. Les signes cliniques sont bien connus du personnel technique.

Choix des espèces

L’espèce cible de la maladie est le poulet. Les questions abordées dans ce projet nécessitent l'utilisation de poulets transgéniques pour deux raisons principales : la première, il n'existe pas de poulets qui expriment les gènes du canard. Nous supposons que le poulet a perdu les gènes étudiés à un moment donné au cours de l'évolution et que la seule façon possible de ré-exprimer ces gènes dans le poulet est d'utiliser la transgénèse. Deuxièmement, notre objectif est d'étudier en détail la réponse immunitaire adaptative, ce qui n'est pas possible en utilisant des modèles in vitro qui ne permettent pas d'étudier les réponses immunitaires cellulaires telles que les lymphocytes T. Sur la base d'études antérieures ayant utilisé le même virus H7N1, les animaux seront utilisés à l'âge de trois semaines et conservés pendant 22 jours supplémentaires après l'infection initiale. Les œufs reçus de notre partenaire (environ 200 par expérience) seront incubés et éclos dans nos installations, les poussins seront élevés dans les isolateurs de 0 à 3 semaines. Ce seront les mêmes isolateurs que ceux de l’expérimentation.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunisées avec un allergène, une partie recevant ensuite des injections de toxine diphtérique destinées à détruire un type de cellules immunitaires, avant d'être euthanasiées au dixième jour pour prélever la rate et les ganglions. L'objectif est de valider une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées, un outil qui sera ensuite mis à disposition d'autres équipes. Le porteur affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend l'expérimentation in vivo "nécessaire" et écarte les méthodes sans animaux.

Objectifs

Les cellules Tfh (lymphocytes T folliculaires helper) sont des cellules immunitaires impliquées dans différentes réponses immunitaires. En effet, elles aident à la mise en place des réponses immunitaires impliquant la production d'anticorps, ce qui en fait des cellules clés de la défense immunitaire. Elles sont par exemple impliquées dans la réponse immunitaire suite à une vaccination mais aussi suite à une infection comme dans la réponse anti-VIH. Cependant, si ces cellules sont dérégulées, ceci peut conduire à différentes maladies comme des maladies auto-immunes (lupus érythémateux disséminé, la polyarthrite rhumatoïde) ou encore les allergies. Ces exemples permettent de comprendre l'intérêt pour ces cellules dans l'étude des pathologies actuelles. Comprendre leur fonctionnement pourrait permettre de renforcer l'efficacité des vaccinations ou de prévenir ou soigner ces maladies. Toutefois, les outils classiques de biologie ou modèles de souris actuels ne permettent pas de visualiser ces cellules in vivo ou de les éliminer sans impacter d'autres cellules, ce qui rend leur étude difficile actuellement. C'est pourquoi notre équipe a développé un nouveau modèle de souris permettant de visualiser les cellules Tfh et de les éliminer. En effet, au sein de ces souris, les cellules Tfh produiront une molécule fluorescente, ce qui permettra de suivre ces cellules. De plus, ce modèle permettra aussi d'éliminer les cellules Tfh grâce à une technique communément utilisée en biologie. En effet, les cellules Tfh seront modifiées génétiquement pour produire le récepteur de la toxine diphtérique (DTR) à leur surface. Par conséquent, l'injection de toxine diphtérique induira uniquement l'élimination des cellules Tfh. Cette toxine n'induit pas de réponse néfaste chez la souris comme chez l'homme car les autres cellules de la souris ne produisent pas le DTR. Cet outil pourra être utilisé par différentes équipes pour étudier le rôle des Tfh dans différentes pathologies, soit en suivant les cellules Tfh, soit en les éliminant spécifiquement. Néanmoins, l'utilisation de ce nouveau modèle est soumise à validation de celui-ci. Pour ce faire, il nous faut montrer que les cellules Tfh de cette lignée produisent bel et bien la molécule fluorescente. Dans un second temps, il nous faut démontrer l'élimination des cellules Tfh suite à l'injection de toxine diphtérique. Nous étudierons ceci en conditions inflammatoire (suite à une immunisation avec un allergène et un adjuvant) ou non.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider un nouveau modèle murin permettant de suivre les cellules Tfh avec une molécule rapportrice, la BFP, ou permettant la déplétion de ces cellules suite au croisement avec des souris exprimant Cre et à l'injection de toxine diphtérique. Ce modèle sera mis à disposition et pourra permettre l'étude des cellules Tfh dans différents contextes, comme les allergies, l'auto-immunité, les infections ou la vaccination, pour contrer les pathologies ou améliorer la vaccination.

Procédures

Tous les animaux (270) seront anesthésiés puis immunisés avec deux injections de CFA/OVA ou de PBS au jour 0 (durée de la procédure : 5 minutes). Parmi les 270 animaux, 198 animaux seront également injectés au jour 8 et jour 9 (durée de la procédure : 10 secondes par injection, soit 20 secondes au total sur deux jours) avec de la toxine diphtérique pour induire l'élimination des cellules Tfh. A jour 10, les 270 animaux seront euthanasiés par exposition à une dose croissante de CO2 pour pouvoir prélever la rate et les ganglions dans le but de voir le nombre de cellules Tfh dans nos différents groupes d'animaux pour valider notre modèle.

Impact sur les animaux

Les animaux devraient initier une réponse immunitaire dans les ganglions iliaques et la rate contre l'allergène utilisé suite à l'immunisation. L'injection étant locale, nous n'attendons pas d'effet indésirables autre qu'une inflammation locale, cependant si certains devaient survenir, ils seront traités selon les points limites établis pour limiter la souffrance de l'animal. Ayant déjà pratiqué les injections de toxine diphtérique dans d'autres modèles de souris et n'ayant observé aucune souffrance ou changement de comportement, nous n'attendons pas d'effet indésirable.

Devenir

Après injection de CFA/OVA, les animaux non concernés par la procédure expérimentale "Injection de toxine diphtérique" seront euthanasiés selon la procédure autorisée pour prélèvement et analyses des ganglions et de la rate, soit 72 souris. Tous les animaux concernés par la procédure expérimentale "Injection de toxine diphtérique" seront euthanasiés après celle-ci selon la procédure autorisée pour prélèvement et analyses des ganglions et de la rate, soit 198 souris

Remplacement

L'étude de la réponse immunitaire, et en particulier au cours de l'allergie, met en jeu différents organes et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse immunitaire et le rôle de chaque cellule impliquée.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 270 souris, permettant de caractériser les cellules exprimant la molécule rapportrice, ainsi que la déplétion des cellules Tfh. L'effectif par groupe est de 11 souris, ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales, avec un nid comme enrichissement. L'injection pour l'immunisation est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter la souffrance / stress des animaux. Après ce traitement, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Tout au long du protocol, les animaux seront surveillés de manière visuelle avec un suivi de l'aspect général des animaux, de leur posture et de leur comportement et déplacement. Une grille évaluant la douleur sera utilisée. Si celle ci est importante, ils seront retirés de l'étude et bénéficieront de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La lignée à caractériser est une lignée de souris. La souris a été choisie comme modèle car cette lignée sera ensuite utilisée dans l'étude du système immunitaire et en particulier de l'allergie. Le système immunitaire murin est proche de celui de l'homme avec une immunité innée mais également une immunité adaptative, ce qui permet l'étude spécifique de l'antigène et de la réponse mémoire. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.

424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées avec de la peau humaine et injectées de cellules immunitaires humaines, elles reçoivent un traitement quotidien pour tester une combinaison de molécules contre le rejet de greffe. Le porteur indique que l'injection de cellules humaines déclenche une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et mise à mort au-delà de 20 % du poids initial. Il présente ces souris humanisées comme une alternative à l'usage de primates non-humains.

Objectifs

En transplantation d’organes solides, les inhibiteurs de la calcineurine permettent de prévenir efficacement le risque de rejet aigu précoce. Néanmoins après quelques années survient une dysfonction chronique du greffon due d’une part à la néphrotoxicité des inhibiteurs de la calcineurine et d’autre part à un mauvais contrôle de la réponse allo-immune (humorale avec l’apparition d’anticorps anti-donneur et cellulaire matérialisé par l'apparition de plage de fibrose). Ainsi l’amélioration de la survie des greffons nécessite le développement de nouvelles stratégies immunosuppressives contrôlant mieux la réponse allo-immune et la progression de la fibrose. Dans cette optique les inhibiteurs de MEK sont une piste encourageante. La voie MAPK classique étant située en aval du TCR, les inhibiteurs de MEK ont un effet immunosuppresseur. Dans le cadre de la transplantation, cet effet a été rapporté dans un modèle murin de Graft versus Host Disease (GVHD), dans un modèle murin de greffe cardiaque et dans un modèle de transplantation pulmonaire chez le rat. Dans ces différents modèles les inhibiteurs de MEK bloquent l’activation des CD8 et favorisent l’épuisement des lymphocytes CD4 allo-réactifs. Par ailleurs les inhibiteurs de MEK favorisent l’essor des lymphocytes T régulateurs. Enfin il a été montré dans des modèles murins que les anti-MEK permettent de prévenir la fibrose rénale. Nous avons montré que les inhibiteur de MEK permettent de prolonger la survie des greffes de peau humaine allogéniques de façon significative comparativement aux contrôles non traités dans un modèle de peau greffée chez la souris NSG humanisée mais les inhibiteurs de MEK n’empêchent pas un rejet à long terme. Notre objectif est maintenant d’évaluer l’inhibition de la voie MEK en combinaison avec un traitement d’induction avec un inhibiteur de la calcineurine. Les inhibiteur de MEK, avec un bon profil de tolérance, pourraient être une alternative aux immunosuppresseurs classiques une fois la phase de rejet aigu maîtrisé avec un inhibiteur de la calcineurine.

Bénéfices attendus

Les inhibiteurs de MEK ont montré une bonne efficacité pour prévenir le rejet de greffe et un effet anti-fibrotique dans des modèles murins. Cependant, ces modèles ne peuvent valider l’efficacité d’une molécule sur les cellules du système immunitaire humain. Nous avons montré dans le modèle de greffe de peau allogénique humaine chez la souris NSG humanisée que l’inhibition de la voie MEK permet d’augmenter de façon significative la survie des greffons mais ne permet pas d’éviter le rejet. Les inhibiteurs de la calcineurine sont efficaces pour prévenir le rejet aigu mais leur utilisation au long cours n’empêche pas le rejet chronique et est associé à de nombreux effets indésirables. Cette étude vise à évaluer l’efficacité des anti-MEK combiné à un inhibiteur de la calcineurine pour prévenir le rejet de greffe d’organe dans le modèle bien validé de greffe de peau humaine chez la souris NSG humanisée par injection de PBMCs humain. En cas de résultats encourageants, cette combinaison de molécules pourrait être évaluée dans un modèle pré-clinique encore plus relevant (primates non humains par exemple). A plus long terme, cela pourrait aboutir à une diminution de l’utilisation des inhibiteurs de la calcineurine, dont la toxicité est reconnue, dans le traitement des patients transplantés

Procédures

Une greffe de peau sous anesthésie générale, durée de l’opération 1 heure. Une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, 5 min. Administration quotidienne du traitement par voie orale et/ou administration intrapéritonéale, 5 min. Prélèvement de sang , 1 fois par semaine.Jusqu'à J56 puis une fois par mois. 5 min.

Impact sur les animaux

La greffe de peau humaine chez la souris NSG n’entraîne pas de signe clinique chez la souris. L'humanisation des souris avec des cellules hPBMC entrainera des signes cliniques liés à l’apparition d’une xéno-GVHD (graft versus host disease) lorsque la quantité de cellules humaines sera suffisamment importante, notamment des lymphocytes T. Les souris seront surveillées quotidiennement au niveau comportemental et pesées 3 fois/semaine puis tous les jours lorsque les premiers signes cliniques apparaîtront ; chute de poids notamment. L'animal sera euthanasié si le poids atteint une perte de poids de 20% du poids initial. Le comportement général de la souris sera observé et l’animal sera euthanasié si un comportement anormal est constaté (par exemple, animal isolée du reste de ses congénères, dos vouté, poils hérissés).

Devenir

Toutes les souris de la procédure 1 seront utilisées pour la procédure 2. A l’issue de la procédure 2, les souris seront euthanasiées.

Remplacement

La molécule que nous souhaitons tester chez la souris NSG humanisée a déjà été étudiée in vitro et in vivo dans des modèles murins. Le passage dans un modèle in vivo mimant la situation complexe que constitue le système immunitaire humain apportera des arguments supplémentaires quant à son efficacité pour prévenir le rejet de greffe chez l’homme.

Réduction

Les données issues de ce projet devront donc être suffisamment robustes (c'est-à-dire validées avec tests statistiques). Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques (Test de Mann- Whitney) car nous ne pourrons pas nous assurer d’une distribution normale (n < 30. Nombre total d’animaux 424). Chaque groupe sera constitué de 5 souris .

Raffinement

Lors des manipulations pouvant générer une douleur, les animaux bénéficieront en amont d’une analgésie. Les souris seront hébergées sur des portoirs ventilés avec un accès libre à la nourriture et à l’eau de boisson, un cycle jour/nuit au niveau de la lumière et un enrichissement adapté. Les animaux seront suivis quotidiennement lorsque les cellules humaines seront injectées et les signes cliniques notables et sévères décrits dans le tableau en annexe de cette saisine seront notés. Lorsque 3 signes cliniques notables ou un seul signe clinique sévère seront notés alors les animaux seront sortis du protocole et euthanasiés. Tous les animaux seront analysés post-mortem avec des prélèvements d'organes en vue d'études immunohistochimiques ou histologiques permettant de caractériser au mieux l’effet des molécules testées.

Choix des espèces

Les souris immunodéficiences NSG sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre. Il est possible de reconstituer un système immunitaire humain dans ces souris par injection de PBMC humains. Ces souris ainsi humanisées offrent une alternative à l'utilisation de primates en recherche clinique. Cependant, si nous constatons que la fenêtre de lecture expérimentale n’est pas suffisamment longue avant la survenue de la GvHD nous changerons de souche de souris et prendrons des NSG déficientes pour les molécules de CMH de classe I et II. En effet, ces souris montrent une GvHD nettement retardée voire inexistante. Les cellules immunitaires humaines injectées dans ces souris survivent et prolifèrent. Ce modèle pourra donc servir d’alternative. Lors des greffes de peau les souris NSG seront adultes (âgées de 6 à 8 semaines). Au moment de l’humanisation avec des hPBMC elles seront agées de 11 à 13 semaines pour permettre à ces cellules humaines de se développer .

246 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation du cerveau sous anesthésie puis des administrations par le nez de vésicules issues de cellules souches, avec des tests comportementaux comme le labyrinthe en Y, le labyrinthe surélevé et le rotarod, pour limiter les séquelles cognitives de la radiothérapie. Le porteur indique surveiller les animaux quotidiennement et les mettre à mort en cas d'écoulement nasal marqué, de tête penchée ou d'une perte de poids de 20 %. Il affirme qu'un modèle in vivo est obligatoire pour valider cette stratégie thérapeutique.

Objectifs

La radiothérapie ou un surdosage consécutif aux applications médicales sont très souvent associés au traitement des tumeurs du système nerveux central. 50-90% des patients survivants au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie présentent dans les 6 mois suivant le traitement des troubles cognitifs tardifs. Les rayonnements ionisants induisent au niveau cérébral un stress oxydatif chronique, une neuro-inflammation, l’apoptose des cellules endothéliales, une raréfaction vasculaire et une atteinte des zones de neurogenèse induisant à terme des troubles cognitifs. Par conséquent, il est indispensable de développer de nouveau traitement. L’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour le traitement des lésions intestinales radio-induites ou musculo-cutanées a été démontré. Les VE-CSM favorisent le processus de néovascularisation et le processus de réparation tissulaire. L’objectif de ce projet est de proposer une thérapie innovante basée sur l’administration intra-nasale des VE-CSM afin de limiter les conséquences vasculaires et neuropathologiques de la radiothérapie cérébrale et à long terme les troubles cognitifs. Dans le cadre du respect de la règle des 3R, les protocoles expérimentaux sont établis avec un nombre d’animaux réduit mais suffisant pour obtenir des résultats pertinents. Les animaux seront irradiés avec un Sarrp au niveau cérébral. Les animaux seront euthanasiés à différents temps post-irradiation. Les études fonctionnelles, moléculaires et cellulaires seront réalisé sur animaux vigiles ou anesthésiés. Des prélèvements seront réalisés sur un modèle murin anesthésié avant ou après euthanasie. Le nombre total d’animaux utilisés pour ce projet sera de 246.

Bénéfices attendus

Le succès de cette preuve de concept thérapeutique sur l’injection des VE-CSM sera complétée par un autre modèle de radiothérapie fractionnée (3*5Gy) et dans le futur avec une validation sur gros animal qui ouvrirait vers des perspectives de transfert clinique pour limiter la toxicité associée au traitement des tumeurs cérébrales par radiothérapie.

Procédures

Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-nasale sous anesthésie gazeuse : environ 5 min par administration Tests comportementaux : - Labyrinthe en Y : 10 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Labyrinthe en croix surélevé : 5 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Rotarod : 3 fois 3 min par séance (1h entre chacun des 3 passages), réalisé 2 fois (4 et 6 mois) Analyse echodoppler sous anesthésie gazeuse : 10 min sous légère anesthésie gazeuse isoflurane Prélèvement sanguin (80uL) 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes

Impact sur les animaux

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. La souffrance de l’animal sera évaluée quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (piloérection, perte de poids, prise alimentaire). Si un animal montre des difficultés à se déplacer tel qu’un comportement et/ou déplacement anormal, une prise alimentaire diminuée : des croquettes humidifiées ou du gel de transport seront déposés dans la cage. Également, après l’inoculation nasale, si un animal présente un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, il sera euthanasié. Enfin, si un animal montre une perte de poids de 20%, piloérection et/ou dos rond, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques. Ici le 1er modèle utilisé est la souris sur lequel nous maîtrisons les techniques fonctionnelles (vasculaire, inflammatoires, comportementales/cognitifs) pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation utilisés sont fortement influencés par la physiologie. Pour l’évaluation des paramètres vasculaires et inflammatoires le nombre de 10 animaux comptabilisés dans chaque protocole expérimental est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes (Anova, Ttest). Afin d’évaluer les paramètres cognitifs, un nombre de 15 animaux est indispensable pour obtenir des résultats exploitables (Anova, Ttest).

Raffinement

Un suivi des animaux quotidien sera réalisé afin d’appliquer les points limites pour limiter la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement.

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie provoquant un traumatisme crânien, puis sont tuées pour que leurs cerveaux servent à préparer des débris de myéline destinés à des cultures cellulaires. Le porteur indique que le traumatisme peut réduire la prise de nourriture et d'eau, et prévoit une analgésie et des points limites. Il affirme que ce projet, visant à produire ces débris à partir de cerveaux de souris, ne peut être remplacé par des modèles in vitro.

Objectifs

Le traumatisme crânien est un problème majeur de santé publique lourd de conséquences neurologiques et lésionnelles à court comme à long terme pour lequel il n’existe aujourd’hui aucun traitement. Ces conséquences tardives sont en grande partie reliées à des lésions jusqu’ici largement sous-estimées et méconnues : les lésions de la substance blanche. Cette dernière contient essentiellement des cellules nerveuses entourées d'une gaine particulière, la myéline, permettant la transmission des informations dans le cerveau. L'espoir d'améliorer le pronostic du traumatisme crânien repose sur la découverte des mécanismes impliqués dans les lésions de la substance blanche et les désordres neurocomportementaux conséquents. Parmi ces mécanismes, des études suggèrent le rôle de la neuro-inflammation dans les lésions de la substance blanche après un traumatisme crânien. La microglie est une cellule immunitaire du cerveau qui joue un rôle majeur dans la neuro-inflammation. Des études suggèrent que les débris de myéline induits par le traumatisme crânien pourraient activer à leur tour la microglie. Une fois activée, la microglie peut adopter 2 phénotypes distincts, c'est-à-dire qu'elle peut exercer des effets délétères, mais elle peut aussi exercer des effets bénéfiques, et ceci, selon son environnement. Ainsi, des études ont rapporté aussi bien des effets pro- ou anti-inflammatoires des débris de myéline, mais à ce jour, aucun lien entre débris de myéline et activation microgliale n’a pu être mis en évidence dans le traumatisme crânien. L'objectif de ce projet est donc de préparer des débris de myéline à partir de cerveaux de souris mâles Swiss ayant subi un traumatisme crânien, afin (1) d'étudier leurs effets (bénéfiques ou délétères) sur le phénotype microglial, et (2) d'identifier les mécanismes mis en jeu, et ceci sur des cultures de microglies de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra d'identifier des cibles moléculaires permettant de moduler la neuro-inflammation d'origine microgliale induite par les débris de myéline suite à un traumatisme crânien.

Procédures

Une procédure chirurgicale permettant d'induire un traumatisme crânien sera réalisé chez les souris. L’ensemble de cette procédure dure 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'induction du traumatisme crânien peut entraîner une diminution de la prise alimentaire et d'eau.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour préparer les débris de myéline.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant de préparer des débris de myéline à partir de cerveaux de souris mâles Swiss ayant subi un traumatisme crânien pour en étudier les effets sur des cultures de microglies, il ne peut donc être remplacé par des modèles in vitro ou autres.

Réduction

Le faible taux d'échec (10%) des gestes pour réaliser le traumatisme crânien, ainsi que la bonne connaissance de la temporalité des mécanismes induits par le traumatisme crânien (activation microgliale, démyélinisation, détection des débris de myéline, déficits comportementaux, lésions de la substance blanche) permettront de réduire le nombre d'animaux au minimum

Raffinement

L'eau et la nourriture seront fournies à volonté et le milieu sera enrichi par des cotons compactés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Afin de s'assurer du bien-être animal, l'intervention chirurgicale permettant de réaliser le traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera donné en pré- et post-opératoire, afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de points limites et l'observation du comportement des animaux permettront d'identifier toute souffrance et douleur, et d'entraîner une mise à mort anticipée, si nécessaire.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de traumatisme crânien. Le traumatisme crânien sera réalisé chez des souris jeunes adultes (6-8 semaines), puisque c'est un évènement fréquent dans cette tranche d'âge chez l'Homme.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries seize semaines avec un régime riche en gras et en sucre, elles subissent des jeûnes, des gavages ou injections et des prélèvements de sang à la queue lors de tests de tolérance, avant une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Le porteur affirme que ce régime n'engendre ni douleur ni anxiété d'après l'observation du comportement, et classe en modéré la souffrance liée au jeûne, au gavage et aux prélèvements. Il affirme que l'usage d'animaux est "essentiel", une enzyme clé n'étant pas exprimée par les lignées cellulaires.

Objectifs

Les points de contact entre les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MAMs pour Mitochondria-Associated Membranes, ont un rôle crucial dans le contrôle de l'homéostasie glucido-lipidique de l’hépatocyte. Ces plateformes dynamiques peuvent être régulées par différents facteurs, notamment les nutriments. Des données récentes montrent que les MAMs sont altérées dans le foie de modèles murins d'obésité, de résistance à l’insuline et de stéatose hépatique, faisant des MAMs une cible thérapeutique privilégiée pour la prévention ou le traitement des désordres métaboliques hépatiques associés à l’obésité. Ces derniers sont étroitement associés à une diminution de la concentration plasmatique en certains acides aminés comme l'arginine, la glycine et la bétaine. Par ailleurs, des travaux in vitro ont démontré que les acides aminés arginine, citrulline, glycine et bétaine sont capables de réguler les MAMs par des voies de signalisation que l'on peut cibler par des molécules pharmacologiques comme la tetrahydrobioptérine (pour arginine et citrulline) et la S-adenosyl-méthionine (pour la glycine et la bétaine). L'objectif de ce projet consistera à 1) valider l'intérêt d'une supplémentation en acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques (résistance à l'insuline, stéatose) associés à l'obésité, 2) démontrer que les bénéfices santé sont associés à une restauration de d'intégrité des MAMs dans le foie des souris traitées et 3) valider in vivo les voies de signalisation impliquées par l'utilisation de molécules pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Le projet présenté vise à apporter des preuves de concept, d'une part sur l'intérêt de certains acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité, d'autre de l'intérêt des MAMs comme cible thérapeutique pour la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité chez l'Homme. Le projet apportera des connaissances mécanistiques solides pour soutenir une approche très originale et porteuse de potentiel d'innovation pour la santé humaine pour le futur proche.

Procédures

L'intervention principale sur les animaux consistera en de petits prélèvements sanguins au niveau de la queue lors de tests de tolérance au glucose et au pyruvate qui seront réalisés sur animal vigil, à jeun depuis 6h (tolérance au glucose) ou 10h (tolérance au pyruvate), respectivement. Après anesthésie locale (crème lidocaïne) et incision au scalpel à l'extrémité de la queue, des ponctions de 4-5 µL de sang seront réalisées à la veine caudale avant et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après gavage oral (pour la moitié des souris) ou injection intrapériotonéale (pour l'autre moitié des souris) de glucose (2mg/g) ou injection intrapériotonéale (pour toutes les souris) de pyruvate (1.5 mg/g) pour suivre la glycémie à l'aide d'un glucomètre. Après le premier prélèvement, les suivants seront réalisés par simple grattage du caillot sanguin. La durée du jeune avant chaque test a été optimisée afin de limiter la nuisance infligée à l'animal tout en garantissant l'obtention d'un résultat métabolique fiable et reproductible, donc interprétable. Les protocoles se termineront par un jeune de 10h avant la mise à mort des animaux. Cette durée de jeune est indispensable pour garantir la qualité des mesures réalisées sur le foie de animaux.

Impact sur les animaux

D’après les premiers protocoles réalisés, 16 semaines de régime riche en gras et en sucre n’engendrent pas de douleur ou d’anxiété comme évalué par l’observation régulière du comportement des animaux, et n'empêchent pas les animaux de bouger dans la cage, notamment pour se nourrir et boire. Par ailleurs, selon les connaissances actuelles, il est peu probable que les interventions nutritionnelles testées aient des effets indésirables sur la santé et le bien-être des animaux. Lors de la mise à mort, l’utilisation de la dislocation cervicale sur animal anesthésié est une méthode rapide qui respecte les réglementations en vigueur pour les petits rongeurs. La douleur associée à la mise à jeun, au gavage ou aux injections intrapéritonéales, et aux prélèvements sanguins à la queue sont des contraintes dont le degré de sévérité est évalué de classe modérée.

Devenir

Les protocoles se termineront après anesthésie des animaux (kétamine/xylazine: 100/20 mg/kg soit 220µL de mélange pour une souris pesant 20g) et mise à mort par dislocation cervicale pour pouvoir récupérer différents tissus et organes. La nécessité de faire des anlayses histologiques et biochimiques justifie la mise à mort pour récupérer les tissus et organes.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse des effets de régimes sur un organisme complexe, et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées, qui n'expriment pas une enzyme clé impliquée dans nos mécanismes, la GNMT.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles.

Raffinement

Nous aurons pour objectif d'optimiser les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et les stress subis par les animaux. En particulier, nous n'utilisons pas de procédures susceptibles d'induire un dépassement de point limite de souffrance. Le raffinement sera appliqué tout au long de la vie des animaux. Pour cela, nous planifierons les protocoles de façon à éviter les perturbations susceptibles de procurer le stress de l'animal. Les protocoles ont été prévus de façon à obtenir le plus d'informations possibles par animal en imposant en même temps, un "moindre coût" en terme de mal-être de l'animal. Nous utiliserons une procédure d'analgésie pour les prises de sang, et une procédure d'anesthésie et de mise à mort par dislocation cervicale. Enfin, nos procédures de raffinement nous permettront de générer des résultats de meilleure qualité et d'exploiter au mieux les résultats obtenus.

Choix des espèces

Le travail avec des animaux est indispensable pour mimer au plus près la réalité de la surnutrition, de l'obésité et des désordres métaboliques comme dans l’espèce humaine. Le travail en épidémiologie sur l’Homme permet, en effet, de faire des corrélations entre la surnutrition et l'apparition de l’obésité et des désordres métaboliques. Le travail sur l’animal nous permet de montrer un effet causal, des manipulations nutritionnelles sur les paramètres biologiques ciblés et leurs bénéfices métaboliques à l'échelle de l'organe et du corps entier.

2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections induisant des tumeurs du foie et un suivi par échographie sous anesthésie, pour étudier le rôle des macrophages dans le cancer hépatique et la réponse aux immunothérapies. Le porteur indique qu'un quart des animaux peut développer une encéphalopathie foudroyante deux à quatre semaines après l'invalidation d'un gène. Il affirme que les lignées cellulaires ne permettent pas d'appréhender le foie dans sa globalité et présente le recours à Crispr comme une réduction du nombre d'animaux.

Objectifs

Notre objectif est d’étudier comment les macrophages du foie sont impliqués dans le développement du cancer du foie dépendant de la beta-caténine et modifient la réponse aux traitements d’immunothérapie dans des modèles murins de CHC (carcinome hépatocellulaire) relevants. Ce projet est divisé en 3 grands axes: 1) déterminer de manière cinétique au cours du processus tumoral comment une activation oncogénique de la beta-caténine dans les hépatocytes remodele le paysage immunitaire à son voisinage et notamment les macrophages embryonnaires. 2) comprendre comment les macrophages embryonnaires sont progressivement perdus au cours du processus tumoral pour être remplacés par des macrophages dérivés des monocytes et comment des événements oncogéniques associés à l'activation de la beta-caténine modifient ce remodelage macrophagique et 3) déterminer comment la réponse aux immunothérapies de ces cancers est modifié selon le remodelage des macrophages.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie en s'intéressant à une population immunitaire qui fut longtemps peu étudiée et dont la diversité des sous-populations a récemment été mise en lumière grâce à l'utilisation du single RNAseq (scRNAseq), ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeants ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre.

Procédures

1) Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles durant 10 secondes, 2) Injection intraveineuse sous anesthésie durant 30secondes 3) échographie hépatique sous anesthésie durant 10minutes si l'animal ne présente pas de tumeurs jusqu'à 25minutes si les tumeurs sont nombreuses 4) prélèvement sanguin sous anesthésie durant 30secondes

Impact sur les animaux

Les modèles de CHC décrits dans ce projet sont des modèles créés au laboratoire et que nous utilisons depuis plusieurs années. Entre la 2ème et la 4ème semaine après invalidation d’Apc un phénotype délétère lié à une encéphalopathie foudroyante peut être observé chez 25% des animaux, sans perte de poids. Ce phénomène est aussi observé dans le modèle de déletion de l'exon 3 de la beta-catenine par Crispr/Cas9 mais un mois et demi à deux mois après édition du gène du fait du temps de latence plus long pour que la machinerie Crispr soit pleinement efficace. Les autres traitements sont sans nuisances sur les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet seront euthanasiés pour analyse de leurs tissus hépatiques et leurs tumeurs afin de comprendre les événements génétiques et immunitaires à l'origine du développement de ces tumeurs et si nos traitements ont pu modifier leurs caractéristiques (invasion, prolifération)

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire (cellules immunitaires, cellules endothéliales...). L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité, d’autant plus que les CHC mutés pour la beta-caténine sont peu proliférants et donc difficiles à maintenir en culture. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous optons pour la technique des ciseaux moléculaires ou crispr/cas9. 1290 animaux sur les 2650 nécessaires au projet suivent ce protocole, le quadruple ayant été nécessaire sans l’utilisation de cette stratégie. Nous suivrons le développement des tumeurs par suivi échographique, un appareil ayant été acquis récemment au sein de l'animalerie, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral évitant d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à nos expériences précédentes et à un calcul de puissance pour obtenir des résultats robustes : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Nous suivrons le développement des tumeurs par échographie, ce qui permet un suivi longitudinal depuis les phases précoces du développement tumoral évitant la souffrance des animaux liée à un développement tumoral trop important. Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée - les animaux étant euthanasiés si le score de souffrance est trop élevé. Les injections stressantes et les échographies seront réalisées sous anesthésie et les animaux mis sur tapis chauffant pour limiter l’hypothermie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum.

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèle murin. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les CHC humains. Pour toutes les procédures, des souris mâles âgées de deux mois seront utilisées pour induire les délétions géniques d'intérêt (par Cre/lox ou Crispr/cas9) afin de réaliser un suivi longitudinal de l’initiation et du développement tumoral chez la souris adulte jeune et de les traiter avec les immunothérapies

Ovariectomie avec implant d'œstradiol, pose d'un capteur de glycémie ou d'un cathéter permanent lors de chirurgies de deux heures, frottis vaginaux quotidiens et prélèvements de sang par incision de la queue : 312 femelles d'un rongeur diurne, Arvicanthis ansorgei, subissent ces actes dans un projet sur les effets de la lumière nocturne sur le métabolisme et la fertilité. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à l'issue pour l'étude de leurs gènes, hormones et organes. Pour 16 d'entre elles, 150 microlitres de sang sont prélevés toutes les trois heures pendant vingt-quatre heures par le cathéter. Le porteur reconnaît que ces rongeurs sont sociaux et prévoit d'en garder une partie en cage individuelle pendant toute l'expérimentation.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à déterminer les mécanismes biologiques, à ce jour très mal connus, impliqués dans les effets néfastes de la pollution lumineuse et de la désynchronisation circadienne (= désynchronisation des rythmes biologiques proche de 24 heures). Les résultats permettront de répondre aux enjeux de santé publique visant à améliorer la santé du personnel exposé aux conditions de travail posté et des populations exposées à la lumière nocturne (professionnels navigants sur plusieurs fuseaux-horaires, travaillant très tôt ou très tard, enfants et adolescents s’exposant à la lumière d’écrans la nuit). Les mécanismes impliqués dans les effets sanitaires néfastes de la pollution lumineuse et des horaires décalés sont difficiles à établir chez les sujets humains, et nécessitent l'utilisation d’un modèle animal proche de l’homme. Les modèles classiques (rats, souris) ont un phénotype nocturne (vivent la nuit) qui est inadapté aux applications biomédicales. Nombre de leurs rythmes journaliers (cycles veille-sommeil, prise alimentaire-jeune) sont inversés par rapport à l’Homme (phénotype diurne, de jour). La majorité des études expérimentales sont réalisées chez des individus mâles, ignorant l’effet sexe de ces analyses. Les études ne distinguent pas l’impact direct de la pollution lumineuse nocturne de l’effet indirect de la désynchronisation circadienne sur la physiologie. Nous proposons une approche originale pour mieux comprendre les effets de la pollution lumineuse et des décalages horaires sur le métabolisme et la fertilité féminine. L’objectif de ce projet est de fournir de nouvelles connaissances pour mieux comprendre les effets délétères de la pollution lumineuse sur l'homéostasie métabolique et la fertilité. Le choix d’un modèle diurne, le rongeur Arvicanthis Ansorgei, permettra la production de résultats rapidement exploitables dans le domaine de la santé humaine. La majorité des études dans cette thématique étant menées chez les individus masculins, notre choix de sujets féminins permettra d’évaluer les points critiques et, de gérer les risques sanitaires de la pollution lumineuse sur l'ensemble de la population générale. La réalisation de ce projet aidera à développer des approches préventives.

Bénéfices attendus

Ce projet va aider à mieux comprendre les mécanismes néfastes de la pollution lumineuse nocturne sur la santé métabolique et la fertilité. Les résultats obtenus chez un modèle animal diurne ( = vivant de jour) féminin permettront de mieux appréhender les risques sanitaires de la pollution lumineuse pour le personnel exposé aux conditions de travail en horaires décalés ainsi que pour toutes les autres catégories populationnelles exposées à de la lumière nocturne (par exemple, personnel navigant sur plusieurs fuseaux-horaires, personnes de toutes classes d’âge s’exposant à la lumière d’écrans pendant la nuit). La réalisation de ce projet conduira ensuite à développer des approches préventives sous forme de mesures interventionnelles ou de recommandations de bonnes pratiques et de gestion des risques professionnels.

Procédures

108 animaux vigiles seront soumis à une injection d’une solution sucrée ((2 g de D-glucose / kg masse corporelle) à l’aide d’une seringue d'un mL afin de réaliser un test de tolérance au glucose (durée 3H). Ce test sera effectué avant le début de l'expérience, puis à la fin de chaque mois, l’expérimentation durant entre 1 et 3 mois selon les résultats obtenus. Des micro-volumes de sang (5 μl) seront prélevés à 5 reprises sur une durée totale de 3 h à l’aide d’une micro-incision de la queue. Un anti-douleur sera administré sur la queue à la fin du protocole. 16 animaux seront soumis à une chirurgie permettant la pause d’un capteur donnant la glycémie 24/24h (durée 2H). Cette opération s’effectuera sous anesthésie générale et un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. 32 animaux seront soumis à une cathétérisation permanente (durée de la chirurgie 2H). Cette chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale et un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. Pour 16 des animaux, un volume de 150 μl sera prélevé toutes les 3 heures avec réinjection des éléments sanguins (durée 24H). Pour les 16 animaux restants ce volume sera de 50 μl (prélèvement répété sur plusieurs jours) avec réinjection des éléments sanguins. 48 animaux seront soumis à une ovariectomie et à un implant estradiol sous anesthésie générale puis un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. Ces animaux seront soumis à un unique frottis vaginal. Les frottis seront réalisés sur animaux éveillés maintenu à l’aide d’un tissu englobant le corps (pour réduire le stress) pendant une durée d’environ une minute. Les cellules sont recueillies avec 10 microL de sérum physiologique inséré dans le vagin à l’aide d’une micropipette. 108 individus seront soumis à des frottis vaginaux quotidiens (décrit précédemment) et des micro-prélèvements sanguins réguliers (jour déterminé par frottis). Les micro-volumes de sang (4 μL) seront prélevés à 4 reprises sur une durée totale de 8h par une micro-incision de la queue. Un anti-douleur sera administré sur la queue à la fin du protocole.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse (douleur modérée) et inflammatoire. Toute intervention chirurgicale sera donc effectuée sous anesthésie générale, anti-douleur locale et avec apport d’anti-inflammatoires pour réduire toute souffrance et éviter toute inflammation post-opératoire. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une perte de poids de 15%. Au-delà de ce seuil,l'expérience sera interrompu. Le poids sera surveillé à J+1, J+3 et J+5 après tout prélèvement sanguin ou toute intervention chirurgicale. Bien que les rongeurs soient des espèces « dit » social, il faudra garder certains individus en cage individuelle après intervention chirurgicale pour éviter que ses congénères ouvrent la plaie et empêchent la cicatrisation. De plus, certaines analyses s’effectueront dans des cages particulières n’étant pas prévu pour l’analyse de 2 individus simultanément. Une partie des animaux sera donc placés en cages individuelles pendant toute l’expérimentation. Les cages seront enrichies au mieux (bâton à ronger). Dans une telle étude, l’animal devra être habitué à être manipulé. Pour l’habituation de la présence humaine tout sera fait de façon la plus neutre possible (même blouse, absence de parfum).

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire puisqu'elle permettra d’étudier les gènes, hormones et organes afin de comprendre le mécansime biologique d’action de la lumière sur le métabolisme et la reproduction.

Remplacement

En termes de remplacement, la régulation du métabolisme et des cycles reproducteurs impliquant plusieurs organes (notamment, cerveau, foie, pancréas, muscles, hypophyse, ovaires), l’investigation des interactions nécessite l’utilisation d’organismes entiers, et non pas d’organes ou de cellules isolées.

Réduction

En termes de Réduction, le nombre d’animaux propose est basé sur un nombre minimal qui prend en compte les moyennes des données comportementales recueillies dans des études précédentes. Ici nous privilégions l’utilisation des mêmes animaux pour les expérimentations calorimétrie, tolérance au glucose, actimétrie.

Raffinement

En termes de Raffinement, les cages seront systématiquement enrichies d’un morceau de bois à ronger. L’ajout de matériel de nidification n’est pas utile chez les Arvicanthis en stabulation car ni les mâles, ni les femelles hors reproduction ne construisent de nid avec ce matériau. Par ailleurs, bien que ce projet nécessite des procédures invasives, le maximum sera fait pour réduire la douleur et le stress des animaux tout au long de l’expérience (environnement enrichi, anesthésie et analgésie profondes, suivi du score de douleur). De plus, l’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Des points limites prédictifs ont été établis permettant d’interrompre les procédures et soustraire ainsi l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei a été choisi car son système circadien fonctionne d’une manière similaire à celui des Hommes, contrairement aux rongeurs classiques de laboratoire (rats et souris qui ont une activité nocturne). Le modèle Arvicanthis présente donc des atouts novateurs indéniables pour les applications biomédicales visant à étudier les effets de la pollution lumineuse sur la santé humaine. Nous avons choisi d’étudier l’effet de la pollution lumineuse sur un modèle de rongeur de sexe féminin pour trois raisons majeures : 1) le genre féminin est rarement étudié dans les investigations scientifiques à ce jour, 2) il existe des différences spécifiques liées a la reproduction féminine qui implique les rythmes biologique de 24 h dans la création des cycles reproducteurs ; 3) un nombre croissant de femmes travaille en horaires décalés alors que leurs systèmes reproducteur et métabolique sont particulièrement sensibles à la pollution lumineuse. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier des fonctions matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier les fonctions physiologiques matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature et non-sénescentes.

Les 96 souris de ce projet appartiennent à des lignées génétiquement modifiées, conçues pour que l'équipe puisse éteindre l'activité électrique ou l'horloge moléculaire de cellules précises de leur cerveau. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une injection dans la profondeur du cerveau sous anesthésie générale, puis un hébergement en cage individuelle équipée d'une roue, pour mesurer leur rythme d'activité sous alternance de jour et de nuit, puis dans l'obscurité constante. L'effet recherché est une perte ou un décalage de leur rythme circadien, qui peut provoquer selon le porteur une fatigue liée à des troubles du sommeil. Toutes sont tuées en fin de procédure pour vérifier au microscope l'emplacement de l'injection, et une souris qui perdrait 15 % de son poids serait tuée avant, par dislocation cervicale.

Objectifs

En France, environ 15% de la population active est concernée par le travail de nuit. Ce mode d'organisation du travail augmente les risques de troubles du sommeil et du métabolisme, de cancer ou de problèmes cardiovasculaires et psychiques. Pour répondre à cet enjeu de santé publique, il convient de mieux connaitre l'horloge interne qui régule nos rythmes biologiques en adéquation avec le cycle jour-nuit de 24 heures. Cette horloge circadienne (= "autour du jour") est localisée dans une petite structure du cerveau profond, appelée les noyaux suprachiasmatiques (NSC). Les NSC contiennent environ 10000 cellules nerveuses, douées d'une rythmicité circadienne autonome reposant sur un petit ensemble de gènes, appelés gènes de l'horloge. Alors que les interactions entre ces gènes de l'horloge sont maintenant bien connues et définissent les rouages moléculaires de l'horloge, le rôle des différentes cellules des NSC reste mal connu. Pour répondre à cette question, notre approche expérimentale vise à éteindre l'activité électrique ou à inactiver le mécanisme de l'horloge moléculaire dans des populations cellulaires spécifiques des NSC chez des souris génétiquement modifiées. Notre objectif sera de cibler une dizaine de populations cellulaires différentes et d'identifier lesquelles participent au rythme de locomotion circadienne, mesurée à l'aide d'une roue d'activité dans la cage des animaux.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra d'identifier les cellules régulant les rythmes circadiens, et selon quelle modalité (phase, amplitude, période?). Cette dissection cellulaire de l'horloge circadienne des Mammifères est une étape essentielle pour comprendre le fonctionnement physiologique de l'horloge et son dérèglement pathologique dans le cadre de notre société moderne, active 7 jours sur 7, 24 heures sur 24. A terme, les cellules ainsi identifiées pourraient constituer la cible de traitements adaptés pour accompagner les travailleurs de nuit et les voyageurs souffrant de jetlag. Un autre bénéfice attendu consiste dans l'obtention de nouvelles données sur le rôle du canal NALCN que nous ciblerons pour éteindre l'activité électrique des cellules des NSC. Ce canal ionique est associé à des maladies génétiques rares. Les enfants touchés par ces maladies développent très souvent des troubles du rythme veille-sommeil. Comprendre le rôle précis de NALCN dans l'horloge circadienne serait une avancée majeure pour alléger les conditions de vie de ces jeunes patients et de leur famille, déjà confrontés à des situations très sévères.

Procédures

Injection intra-cérébrale sous anesthésie générale. Hébergement en cage individuelle (avec contact visuel avec des congénères) pour mesure du rythme de lcomotion volontaire dans une roue d'activité.

Impact sur les animaux

L'effet attendu des manipulations réalisées est une perturbation de l'horloge circadienne : diminution ou perte totale de la rythmicité circadienne, ou déphasage entre le rythme interne et le cycle jour-nuit extérieur. La perte de rythme n'est a priori pas dommageable sur la durée du protocole. Le déphasage peut provoquer une fatigue liée à des troubles du sommeil. Sur le long terme, le développement d'un syndrome métabolique (diabète, obésité) ou au contraire un amaigrissement est possible, ainsi qu'un risque accru de cancer est possible. Cependant, ces effets extrêmes ne sont pas envisageables en quelques semaines. La nuisance potentiellement causée par la procédure chirurgicale d'injection stéréotaxique sera traitée par anesthésie/analgésie et surveillance des animaux

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour réaliser une vérification histologique du site d'injection.

Remplacement

Le fonctionnement moléculaire de l'horloge a déjà été largement étudié in vitro. Mais comprendre l'impact de ce mécanisme dans des cellules spécifiques au sein d'un organisme nécessite le recours aux modèles animaux. Ici, nous regarderons comment une manipulation cellulaire dans le cerveau profond modifie le rythme repos-activité chez la souris. Les résultats expérimentaux que nous obtiendrons révéleront la complexité fonctionnelle de l'horloge circadienne. Ces données pourront servir de base pour une modélisation réaliste de ce système.

Réduction

Pour chaque groupe expérimental, la quantité totale d'activé sera mesurée en condition d'éclairage jour-nuit, puis d'obscurité constante. Les paramètres du rythme d'activité locomotrice, directement liés à l'horloge, seront évalués sous ces conditions d'obscurité constante (= conditions de libre cours) : 1. Analyse qualitative : le rythme circadien d'activité est-il préservé ou aboli? 2. Analyse quantitative : si une rythmicité est préservée, la période du rythme en conditions de libre cours sera le paramètre limitant. Nous avons réalisé une étude statistique (programme G-Power) pour estimer la taille nécessaire de nos groupes expérimentaux.

Raffinement

L'injection stéréotaxique de petits volumes (1 µl) dans les NSC est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil, avec utilisation d'analgésiques et per- et post-opératoire. La mesure de l'activité locomotrice implique l'hébergement en cage individuelle, équipée d'une roue d'activité. Pour limiter l'isolement social, les animaux garderons un contact visuel avec leurs congénères. D'autre part, l'accès à la roue constitue un enrichissement des conditions d'hébergement très apprécié. Les animaux seront observés visuellement de façon quotidienne. En plus des signes de souffrance couramment recherchés (prostration, poil hérissé, amaigrissement), nous utiliserons la mesure d'activité locomotrice comme point limite spécifique à la procédure mise en œuvre : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par des souris contrôles sera pesée et observée plus en détail. En fonction des signes cliniques observés, la souris aura accès à une nourriture hydratée et/ou un analgésique adapté. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% au poids avant l'opération, alors elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix, donnant accès à un grand nombre de lignées génétiquement modifiées. Ici les lignées Bmal1-flox et Nalcn-flox sont uniques et particulièrement adaptée pour répondre à la question posée. D'autre part, la mesure de l'activité locomotrice volontaire dans des cages à roue est un outil très largement utilisé en chronobiologie pour évaluer le fonctionnement de l'horloge circadienne des rongeurs. Souris jeunes adultes (7-8 semaines), lorsque la croissance est terminée pour des coordonnées stéréotaxiques fiables.