Procédures modérées
Rôle pathogénique du stroma médullaire dans la leucémie myélomonocytaire chronique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 170 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré. Elles sont irradiées puis greffées de cellules et suivies pendant leur vieillissement, avec prélèvements de sang mensuels sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine IGFBP2 dans une leucémie chronique. Le porteur indique que les effets indésirables tiennent à l'irradiation et au développement du clone leucémique. Il affirme travailler autant que possible sur des cellules de patients, mais conclut que certaines questions ne peuvent être résolues ni chez l'homme ni en culture in vitro.
Objectifs
Notre équipe explore les mécanismes physiopathologiques à l’origine d’une leucémie chronique appelée leucémie myélomonocytaire chronique. C’est une affection maligne associée au vieillissement de la moelle osseuse hématopoïétique, le tissu qui fabrique les cellules sanguines. C’est une affection sévère puisque l’espérance de vie est en moyenne de 2 à 3 ans après le diagnostic. Le seul traitement susceptible de guérir de cette leucémie est la greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques mais ce traitement est souvent irréalisable compte tenu de l’âge des patients – en moyenne 70 ans et ne fonctionne pas très bien avec des rechutes fréquentes. Il n’y a pas de solution médicamenteuse efficace. Depuis des années, notre équipe s’efforce de déchiffrer les mécanismes de cette maladie afin d’imaginer des solutions thérapeutiques. Le plus souvent, nous travaillons à partir de cellules de patients. Pour répondre à certaines questions, il nous est utile de recourir aux modèles animaux. Cette leucémie est attribuée à l’accumulation d’évènements génétiques anormaux dans une cellule souche de la moelle osseuse hématopoïétique. Ces évènements sont nécessaires, ils ne sont pas suffisants. Pour que la maladie se développe, il faut que le tissu dans lequel se fait la fabrication des cellules sanguines (on parle de niche médullaire) le permette. En d’autres termes, la leucémie est la conséquence à la fois d’un dérèglement du tissu hématopoïétique (celui qui fabrique les cellules sanguines) et du tissu qui l’entoure (la niche médullaire). Nos travaux nous ont permis d’observer que l’une des modifications les plus nettes de la niche médullaire est la capacité de certaines des cellules de cette niche à produire une protéine appelée IGFBP2. Or, cette protéine est connue pour modifier le comportement des cellules hématopoïétiques. Elle est même utilisée pour favoriser l'expansion des cellules souches hématopoïétiques humaines dans le contexte de la greffe de moelle. Dans le projet proposé, nous posons la question suivante : est-ce qu’IGFBP2 produit anormalement par les cellules de la niche médullaire favorise le développement de cellules leucémiques? Nous explorerons l’impact du vieillissement normal, de la production excessive de la protéine IGFBP2, et du développement d’un clone leucémique sur la composition de la niche médullaire. Puis nous déterminerons si la quantité d’IGFBP2 produite favorise le développement d’un clone leucémique.
Bénéfices attendus
Les résultats de nos travaux chez la souris, complétés par des analyses en cours chez les patients, nous indiquerons s’il serait utile de tester un médicament inhibant IGFBP2 pour contrôler l’évolution de la leucémie étudiée. C’est une hypothèse d’autant plus séduisante que la neutralisation d’IGFBP2 chez la souris la protège de maladies chroniques comme le diabète.
Procédures
Irradiation des souris destinées à subir une transplantation (environ 10min). Transplantation de splénocytes (sous anesthésie par inhalation d'isoflurane 1.5-2%) (environ 10min). Prélèvement de sang au niveau sous-mandibulaire sous anesthésie par inhalation d'isoflurane 1.5-2% (< 5min).
Impact sur les animaux
Nous allons suivre l’évolution de la composition de la niche médullaire au cours du vieillissement de souris sauvages ou produisant trop d’IGFBP2. Les nuisances et effets indésirables seront limités puisque nous laisserons les souris vieillir sans autre manipulation qu’un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les mois. Il a été montré que la surexpression d’IGFBP2 chez la souris la protège de l’obésité et du diabète induit par un régime riche en sucres et graisses sans phénotype délétère identifié. Nous allons également suivre l’évolution de la composition de la niche médullaire au cours du vieillissement de souris développant une leucémie. Les effets indésirables seront liés au développement du clone leucémique au cours du vieillissement. Les effets indésirables seront ceux de l’irradiation (perte de poids transtoire) nécessaire à la greffe puis ils seront liés au développement du clone leucémique .
Devenir
Pour chaque procédure, les souris seront euthanasiées à terme afin de récolter tout le matériel biologique (souris CTRL comprises) nécessaire à nos analyses (scRNAseq, cytométrie en flux, numération des cellules sanguines, immunohistochimie sur coupes, ELISA)
Remplacement
Aussi souvent que possible, les expériences réalisées dans ce programme le sont à partir de cellules de patients collectées lors de bilans de surveillance. Cependant, la réponse à certaines questions ne peut pas être obtenue chez l’homme ni dans des systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D in vitro. Il s’agit de connaître 1)le rôle du vieillissement sur l’évolution de la composition de la niche médullaire (l’analyse de souris de génotype identique et d’âge variable permet de maîtriser ce paramètre considéré comme important puisque la maladie étudiée est une maladie directement liée au vieillissement, ce que révèle l’analyse génomique des cellules leucémiques des patients) 2)la dynamique de l’impact d’un clone leucémique sur la composition de la niche médullaire qui, elle aussi, nécessite des analyses répétées au cours du vieillissement, non réalisables chez l’homme. 3)l’impact d’un taux accru d’IGFBP2 sur la croissance d’un clone leucémique et sa compétitivité vis-à-vis d’un clone sauvage est une troisième question à laquelle il n’est pas possible de répondre à partir d’échantillons issus de patients. Ces données doivent nous permettre d’évaluer l’utilité d’une approche thérapeutique visant à maîtriser la production d’IGFBP2 chez les patients lorsqu’un clone leucémique a été détecté. Dans ce programme de recherche, les animaux ne sont utilisés que lorsque la réponse aux questions générées par l’exploration de la leucémie étudiée ne peut être obtenue chez l’homme et par des expériences à partir de modèles in vitro : la plupart des expériences du programme de recherche soutenu par l’INCa sont réalisées à partir de prélèvement de sang ou de moelle obtenus de patients avec leur accord. Ce sont ces analyses qui nous conduisent maintenant à interroger le rôle d’IGFBP2 dans la leucémie myélomonocytaire chronique.
Réduction
Les expériences seront réalisées sur des cohortes d’animaux les plus petites possibles, mais assez grandes pour nous permettre d’obtenir des résultats fiables et, lorsque cela a du sens, significatifs d’un point de vue statistique. Le nombre des animaux nécessaires a été calculé - A partir du nombre de cellules à collecter pour les analyses envisagées : l’analyse de la composition de la niche médullaire des souris au cours du vieillissement ne nécessite pas de calcul statistique puisqu’il s’agit d’analyses observationnelles qui seront réalisées en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaires à la collecte de 25000 cellules analysables par une approche de séquençage d’ARN à l’échelle unicellulaire. Tout sera fait pour optimiser la collecte de cellules afin de réduire le nombre des animaux impliqués. - A partir d’une hypothèse sur le gain de compétitivité du clone muté en présence d’IGFBP2,le nombre d’animaux utilisés repose sur un calcul statistique. Certains animaux seront caractérisés à différentes étapes de leur vieillissement (4, 8, 12 mois). Il pourra s’agir d’animaux sans phénotype anormal ou d’animaux génétiquement modifiés susceptibles de développer un phénotype lié à l’expansion du clone leucémique après quelques mois. Ils seront étudiés à différentes étapes de leur vieillissement.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement, des mesures d'adaptation du régime seront mises en place quand nécessaire (en cas d'amaigrissement, même minime, un régime de haute énergie, facile à ingérer sera fourni). Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale, dépendanmment de l'intervention. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi à l’aide de nestlets et maisons en cartons afin de réduire le stress. Des points limite stricts ont été définis et seront scrupuleusement appliqués.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dicté 1) par la bonne connaissance que nous avons de l’hématopoïèse murine qui reproduit de nombreux aspects de l’hématopoïèse humaine ; 2) la disponibilité de modèles génétiquement modifiés permettant de répondre aux questions que nous nous posons ; 3) son vieillissement relativement rapide, compatible avec les analyses envisagées Nous envisageons de réaliser nos expériences de transplantation de cellules souches hématopoïétiques sur des souris âgées de 1.5 à 5 mois pour mimer la situation chez les patients. Les analyses au cours du vieillissement spontané seront réalisées chez des souris âgées de 4, 8 et 12 mois pour observer une évolution de la maladie dans le temps comme chez les patients.
Effets d’un régime supplémenté en vitamine D associé à un programme de marche sur tapis roulant dans la prévention des altérations ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont rendus obèses par un régime riche en graisses pendant vingt-huit semaines, soumis à une heure de tapis roulant cinq jours par semaine, à des tests de tolérance au glucose et au test comportemental du catwalk, puis euthanasiés par exsanguination de l'aorte. Le porteur affirme n'attendre aucun dommage majeur du régime seul et vise à prévenir les atteintes ostéo-articulaires par la vitamine D et la marche. Il affirme l'absence de méthode "in silico ou in vitro" pour reproduire ces lésions.
Objectifs
L’obésité est une affection très répandue aussi bien chez l’Homme que chez les animaux de compagnie. Cette maladie correspond à un déséquilibre entre les apports et les dépenses énergétiques de l’individu et se caractérise par un excès de masse grasse corporelle et une altération de la qualité de vie conduisant à de nombreuses complications. Des altérations ostéo-articulaires résultent de la surcharge pondérale et de l’inflammation associées à cette obésité. La prise en charge des complications ostéo-articulaires, comme l’arthrose, passe souvent par l’utilisation de médicaments visant seulement à soulager les douleurs engendrées. Très peu de composés sont destinés à limiter la propagation des lésions, à l’exception de traitements chirurgicaux lourds et coûteux. Malgré une prévalence élevée de l’obésité, aussi bien chez les animaux de compagnie que chez l’Homme, et des nombreuses complications ostéo-articulaires qui en découlent, l’association d’une intervention nutritionnelle à la vitamine D avec une activité de marche sur tapis roulant n’a jamais fait l’objet de travaux expérimentaux visant la prévention tertiaire (traitement après installation de la pathologie) des anomalies ostéo-articulaires liées à l’obésité. L’action préventive de la vitamine D et de l'activité physique sera évaluée sur un modèle de rat Wistar soumis à un régime riche en gras. La vitamine D3 (cholécalciférol) sera incorporée dans l’alimentation (15 000 UI/kg). L'activité physique sera effectuée sur tapis roulant selon un programme de 60 minutes, 5 fois par semaine. Pendant une première période de 14 semaines, les rats seront soumis au régime riche en gras seul. Pendant les 14 semaines suivantes, en plus du régime riche en gras, les rats seront traités avec la vitamine D3 et la marche sur tapis roulant. Après réception de tous les animaux sur leur lieu d'hébergement, ils subiront une période d’acclimatation de 7 jours avant le début des procédures. L’aliment et l’eau seront fournis ad libitum. Les rats seront âgés de 6-7 semaines au commencement de l’étude. Un total de 80 rats seront utilisés dans le cadre de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de limiter et/ou prévenir les complications ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat. À terme, l'étude pourrait déboucher sur de potentielles applications chez l'Homme ou chez les animaux de compagnie tels que les chiens et les chats. Ce projet pourrait également donner l'opportunité de mieux comprendre les mécanismes qui régissent la pathogenèse de l'arthrose. De plus, il pourrait mettre en lumière de nouveaux bénéfices de l'utilisation de la vitamine D et/ou de la marche. Enfin, ces travaux pourraient permettre d'éclaircir le lien entre le microbiote et l'obésité ou les complications ostéo-articulaires et ainsi amener de nouvelles informations sur son rôle.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. La marche sur tapis roulant pour 4 groupes sur 8 (1 heure par rat) sera effectuée 5 jours par semaine pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le test de tolérance au glucose (1h30 par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat), le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat) et le catwalk (environ 30 minutes par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorte abdominale. Ces interventions concernent les 80 animaux sur une durée totale de 28 semaines.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques et ostéoarticulaires qui seront l'objet de l'étude. Chez les animaux soumis uniquement au régime HFD, il y a une très bonne tolérance de ce régime sur la période (28 semaines) sans dommage majeur pour la santé de l'animal. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.
Devenir
Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses fonctionnelles, histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in silico ou in vitro) pour explorer un développement naturel des lésions ostéo-articulaires liées à l’obésité et des potentiels effets bénéfiques du traitement.
Réduction
De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 10 rats par groupe est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et exploitables et réaliser une analyse descriptive. Le nombre d'animaux a été calculé sur BiostaTGV en prenant l'estimation de la variation du taux de leptine avec ou sans traitement (delta de 35 pg avec écart-type de 24 pg à 5% d'erreur de première espèce et 0,93 de puissance) et donne 10 animaux par groupe expérimental.
Raffinement
- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Manipulation douce régulière des animaux pour habituation à l'expérimentateur. - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). - Définition des points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - Optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
L’obésité est une pathologie systémique caractérisée par des altérations multi-organiques et une inflammation de bas-grade qui peuvent déclencher des problèmes ostéo-articulaires comme étudié ici. La souche de rat Wistar est communément utilisée, selon la bibliographie, pour étudier les modifications métaboliques et ostéo-articulaires et répond très bien à l'utilisation d'un régime obésogène. L’utilisation de ce modèle permettra d’étudier la capacité de nos produits testés à prévenir le développement des problèmes ostéo-articulaires et son impact sur l'obésité. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines pendant 28 semaines. Ces animaux sont des jeunes adultes, stade optimal pour étudier l'impact de nos traitements sur les régimes apportés.
Evaluation de nouvelles thérapies et étude des mécanismes de progression des tumeurs du foie dans un modèle murin immunocompétent
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales du foie, par chirurgie dans l'organe ou par injection sous la peau, puis des traitements par voie intrapéritonéale ou par plasma froid et un suivi par imagerie sous anesthésie, pour évaluer de nouvelles thérapies des cancers hépatiques. Le porteur indique que la contrainte principale tient au développement tumoral et prévoit des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".
Objectifs
Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.
Bénéfices attendus
Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.
Protection de la fonction cardiaque par la dapagliflozine dans un modèle original de syndrome métabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré. Une partie subit une chirurgie d'infarctus du myocarde sous anesthésie, avec ischémie cardiaque provoquée, ainsi que des tests de glycémie et des prélèvements de sang à la queue. Le porteur décrit un modèle de suralimentation postnatale reproduisant surpoids et intolérance au glucose, et prévoit d'euthanasier les petits écartés lors de la réduction des portées. Il affirme que le projet, reposant sur des interactions entre organes, ne peut être conduit que sur un "animal entier".
Objectifs
Le surpoids et l’obésité constituent des facteurs de risque majeurs dans l’apparition des maladies cardio-métaboliques, qui touchent aujourd’hui des populations de plus en plus jeunes. Le concept d’origines développementales de la Santé indique que l’environnement nutritionnel périnatal jouerait un rôle clef dans la détermination du phénotype ultérieur de l’individu. Le modèle de suralimentation postnatale (SAPN) est particulièrement pertinent car il rassemble plusieurs des composantes caractéristiques du syndrome métabolique chez l’Homme : il est d’apparition progressive, s’accompagne d’un surpoids, d’une intolérance au glucose et d’une résistance à l’insuline ; la dysfonction cardiaque et la sensibilité cardiaque accrue à l’ischémie sont présentes, et apparaissent à l’âge adulte. Ce modèle original correspond donc à une situation de programmation précoce du risque cardio-métabolique. Les inhibiteurs SGLT2 (ex : dapagliflozine) constituent une nouvelle classe de médicaments ouvrant des perspectives nouvelles en termes de cardioprotection chez le patient diabétique. Les objectifs de ce projet, qui sera conduit sur notre modèle original de syndrome métabolique induit par SAPN, sont les suivants : 1. Déterminer si un traitement chronique par la dapagliflozine peut diminuer l’altération progressive de la fonction contractile cardiaque 2. Evaluer si un traitement par la dapagliflozine peut réduire la survenue d’une insuffisance cardiaque après un infarctus du myocarde expérimental 3. Explorer l’importance de l’environnement inflammatoire paracrine, lié au développement de la graisse péricardique, et l’effet de la dapagliflozine sur cet environnement
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de mieux comprendre l’origine des effets cardioprotecteurs de la dapagliflozine dans le contexte du syndrome métabolique et d’accroitre nos connaissances sur les liens entre la graisse péricardique et le cœur. Nous souhaitons confirmer que des perturbations nutritionnelles précoces ont un impact à long terme sur la santé cardiovasculaire et métabolique des individus, et que des mesures de correction thérapeutiques appropriées, même une fois le phénotype « programmé », s’avèrent bénéfiques
Procédures
Une partie des animaux utilisés pour ce projet auront une procédure chirurgicale invasive, c’est-à-dire 60 animaux. La chirurgie dure en moyenne 20 mins, c’est-à-dire que les animaux sont sous anesthésie profonde pendant 20 mins, et les souris se réveillent et sont mobiles seulement 3-4 mins après l’arrêt de l’anesthésie. Une fois réveillées, les souris sont placées en couveuse pendant environ deux heures afin de se remettre pleinement de la chirurgie dans une atmosphère chauffée, ventilée et calme.
Impact sur les animaux
La procédure de mesure de la fonction cardiaque par échocardiographie se fait sous anesthésie par isoflurane, mais peut constituer un stress pour l’animal lié à l’anesthésie générale. Les mesures de sensibilité au glucose et l’insuline sont accompagnées d’une injection intrapéritonéale et de prélèvement de sang à la queue après légère coupure, qui peuvent générer de la douleur ou de l’inconfort chez la souris. Une crème anesthésique locale (Anesderm Gé, 5% Lidocaïne) sera au préalable utilisé sur la queue des souris. La procédure chirurgicale de réalisation d’un infarctus du myocarde expérimental in vivo, réalisé sous anesthésie générale à l’isoflurane, s’accompagne d’ouvertures cutanées au niveau du cou et du thorax (utilisation d’un anesthésique local : Anesderm, Gé, 5% Lidocaïne), de l’espace intercostal, d’une intubation trachéale, et de l’induction d’une ischémie cardiaque. La prise en compte de la douleur péri et post-opératoire est jugulée par l’administration d’un antalgique puissant : la buprénorphine.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des deux procédures afin de réaliser des prélèvements tissulaires et sanguins pour des analyses biochimiques ultérieures.
Remplacement
Ce projet de recherche, qui repose sur des interactions entre différents organes (tissu adipeux, cerveau, foie, cœur et vaisseaux) ne peut malheureusement être approché par des techniques reposant sur la culture cellulaire. Il nécessite d’être conduit sur un animal entier
Réduction
Ne seront utilisés que le nombre d’animaux strictement nécessaire et suffisant à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes (utilisation de tests statistiques adaptés aux petits échantillons, ANOVA à un ou deux facteurs). En outre, la gestion de l’élevage permettra de réguler le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation du projet et cet élevage s’arrêtera une fois le nombre d’animaux nécessaire obtenus : selon notre expérience dans le modèle de SAPN, le nombre de 10 animaux par groupes est suffisant pour
Raffinement
La reproduction et l’élevage des animaux se feront dans des cages dont le milieu aura été enrichi, dans un environnement calme et non stressant. Le sacrifice des petits non conservés pour réaliser les groupes lors de la réduction des portées se fera par inhalation de CO2 suivie de dislocation cervicale. Les manipulations non douloureuses (pesées, mesure de la pression artérielle) se feront dans des conditions de calme non stressantes. Toutes les procédures chirurgicales seront accompagnées de l’utilisation d’antalgique approprié (buprénorphine injectable) afin d’inhiber la douleur occasionnée. Le suivi post opératoire sera strictement encadré (réveil et maintien en couveuse thermostatée, surveillance) afin de détecter des signes précoces de souffrance (aspect physique externe, non réponses comportementales aux stimuli externes, diminution de la fréquence cardiaque et respiratoire...), qui seront éventuellement traités par une nouvelle administration d’antalgiques. Tout animal dont l’état fonctionnel post opératoire ne s’améliore pas et présente des signes persistants de douleurs sera euthanasié (inhalation de CO2).
Choix des espèces
Les études actuelles poursuivies par le laboratoire PEC2 sur la sensibilité du cœur à l’ischémie et l’infarctus sont réalisées chez la souris. De nombreuses données expérimentales sont déjà à disposition, et le protocole de chirurgie est parfaitement maitrisé dans cette espèce (plus de 3 ans de recul). Ce projet fait suite au projet numéro APAFIS#16589-201809031052199 v2. Les animaux auront 4 mois de vie lors de leur première utilisation. Ce stade de la vie correspond au stade de jeune adulte chez la souris, période à laquelle les maladies cardiovasculaires apparaissent chez l’homme. Ce projet prévoit de suivre ces animaux pendant 4 mois, donc les souris auront 8 mois à la fin des expérimentations, ce qui correspond au stade adulte mature chez la souris.
Accélération de la cardiomyopathie dans un modèle rat de la glycogénose de type III et test de stratégies de thérapie génique basées sur les vecteurs
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
190 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation sous la peau de pompes délivrant de l'angiotensine II pour accélérer une atteinte cardiaque, puis des prélèvements de sang, des épreuves de course sur tapis roulant et des échographies sous anesthésie, pour tester une thérapie génique de la glycogénose de type III. Le porteur indique attendre un possible dommage rénal lié à l'angiotensine, jugé limité par la durée courte d'administration. Il affirme que le mécanisme de défense contre les virus est "impossible à recréer en laboratoire" et que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
-Etudier l’efficacité d’une approche de thérapie génique pour la glycogénose de type III (GSD III) dans un nouveau modèle rat de la pathologie présentant une hypertrophie du ventricule gauche à 9 mois. -Administration de l'Angiotensine II pour accélérer le développement du phénotype cardiaque afin d’évaluer l’effcicacité des produits de therapie génique sur le traitement ou la prévention de l’apparition de la pathologie cardiaque.
Bénéfices attendus
Développement d’un traitement de thérapie génique pour la glycogénose de type III
Procédures
-Implantation de les pompes d’Ang II. Procédure chirurgicale légère car l’implantation se fait sous le peau. La procédure d'implantation durera 10 minutes maximum. Les pompes resteront sous le peau un maximum de 14 jours. -Prélèvements du sang sont réalisés sur animal anesthésié lors d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire ou sur animal vigile à la veine sous-maxilliare. La procédure de prélèvement de sang est rapide, 5 minutes maximum de l’endormissement de l'animal à son réveil après le prélèvement. Pour le prélèvement dans la veine sous-mandibulaire, le prélèvement durera entre 30 sec et 1min maximum. -Evaluation fonctionnelle: tapis roulant (course maximum 10 minutes) et wirehang (moins d'un minute). -Echocardiographie et ECG sur animaux anesthésiés : la durée maximale sera de 15 minutes pour chaque procédure de l’endormissement au réveil de l’animal après les examens.
Impact sur les animaux
Le dommage collatéral que pourrait causer l’administration d’Ang II pourrait être le développement d’un dommage rénal, car l’effet direct est l’augmentation de la tension artérielle. Par contre on n'éspère pas avoir un dommange rénal car le temps de dosage sera que de 15 jours.
Devenir
Ils seront éuthanasiés par surdosage d’anesthésique (0,35 ml/kg d'EUTHASOL en tant que 140mg de pentobarbital sodique par kilo) à la fin du protocole afin de prélever les tissues: coeur, foie et muscles squelettiques pour analyser en premier lieu l'accelaration de la cardiomyophatie avec l'infusion de la AngII (fibrose et hypertrophie des cardiomyocites), asin que la correction par nos produits de therapie genique de la cardiomyopathie et de la pathologie musculaire et du foie présent chez les patients GSDIII et que le modèle de rat reproduit.
Remplacement
Dans le cas particulier des maladies génétiques, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étrangers à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le cDNA de l’enzyme GDE (enzyme de débranchement du glycogène) jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire. Le recours à l'animal est donc indispensable pour vérifier le pouvoir thérapeutique des virus modifiés que nous utilisons. Nous testerons les virus que nous avons sélectionnés après nos premières expériences réalisées sur des cellules: tous les virus qui ne produisaient pas suffisamment d’enzyme GDE fonctionnelle ont ainsi été éliminés.
Réduction
Lors de la procédure 1, nous identifirons la dose, l’âge et le temps d’administration optimals de l’Ang II, cela nous permettra d’utiliser ces paramètres dans les procédures suivantes. Nous réaliserons une analyse statistique afin d'avoir le nombre d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée. Nous avons utilisé un test unilatéral standard de comparaison des moyennes afin d’avoir 90% de chance (Z1-β=-1.282) de détecter une baisse de la force chez le rat GSDIII avec un risque d’erreur de 5% (Z1-α =-1.645). Formule : n=2*((σ²/Δ²)*(Z1-α+Z1-β)²) - σ :déviation standard attendue (σ=0,261) - Δ : différence entre les moyennes (Δ=0,4998) D’où n=5 rats GSDIII par groupe.
Raffinement
Prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire sur rat vigile ou à la queue sur rat anesthésié pour mésurer la glycemie. L'échocardiographie est non invasive et sans douleur, mais pour réaliser cet examen dans les meilleures conditions pour les animaux, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse, ça sera aussi le cas pour l'ECG. La minipompe d’Ang II est placée sous la peau des rats anesthésiés par voie gazeuse.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle rat car dans un autre modèle rat de glycogénose de type II (maladie de Pompe), une atteinte cardiaque majeure a été identifiée. Le rat GDS III est le modèle de la glycogénose de type III, voilà pourquoi nous utiliserons ce rat et non le rat GDS II qui est le modèle pour la glycogénose de type II. De plus, le modèle rat a une taille qui permet de mieux étudier la morphologie du coeur par échocardiographie. Les procédures 1-2 nous permettront de définir la dose et le temps d'administration de l'Ang II ainsi comme la durabilite du phenotype apres l'enlevement des pompes. L'expérience que nous avons chez la souris et les rats nous a montré que les animaux accumulent du glycogène à partir de la naissance et qu'ils montrent un phénotype d'hypoglycemie à partir de 6 semaines. Donc nous utiliserons des rats de 6 semaines minimun.
Identification de régulateurs de la dissémination métastatique dans un modèle de mélanome dans le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Oncologie
10 924 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une dose d'irradiation aux rayons X puis une transplantation de cellules de mélanome, avec un suivi sous anesthésie pouvant durer six mois, pour identifier des gènes régulant les métastases. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer troubles de la nage, œdèmes et léthargie, et prévoit une mise à mort quand ces signes n'évoluent pas sous douze heures. Il affirme que la culture cellulaire, y compris en 3D, ne reproduit pas la complexité d'un "organisme vivant".
Objectifs
La formation de métastases est la première cause de mortalité chez les patients atteints de cancers solides. La compréhension du processus menant à la dissémination des cellules tumorales représente donc un enjeu majeur de santé publique. Si ces mécanismes commencent à être caractérisés dans les tumeurs épithéliales telles que le poumon ou le sein, ils demeurent mal connus dans les tumeurs non-épithéliales comme le mélanome. En particulier, le rôle d’interactions potentielles entre signaux extérieurs et adhérence des cellules tumorales dans la dissémination du mélanome n’a pas été élucidé. L’objectif de ce projet est de découvrir de nouvelles molécules exprimées à la surface des cellules de mélanome et qui régulent la formation de métastases.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de découvrir de nouveaux gènes régulateurs de la capacité de dissémination des cellules de mélanome. La compréhension du mécanisme d’action de ces gènes pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques contre les cancers métastatiques.
Procédures
A partir de l’apparition de la première tumeur, les poissons sujets au développement de tumeurs seront soumis à une observation hebdomadaire et individuelle. Le suivi sera réalisé sur une durée de 6 mois, après quoi tous les poissons seront mis à mort, qu’ils aient ou non développé une tumeur. Des poissons adultes de la lignée casper recevront une dose sub-létale d’irradiation aux rayons X de l’ordre de 30 Gy (déterminée par la procédure 1) répartie sur deux jours (15 Gy par exposition). Ils seront ensuite transplantés avec des cellules de mélanome 24 heures après la seconde irradiation. Pour suivre l’évolution des tumeurs, une documentation photographique sera réalisée sous anesthésie une fois par semaine. Ce suivi sera réalisé sur une durée maximale de 6 semaines après transplantation, après quoi tous les poissons seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de stress ou de maladie dus au développement de tumeurs primaires. Les signes les plus précoces et les plus légers comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 12h. En absence d’amélioration des signes de stress ou de maladie listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. Le hérissement des écailles, la présence d’œdèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites plus rarement observés et plus graves nécessitant une mise à mort immédiate.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, les animaux susceptibles de développer des tumeurs ne peuvent être replacés ou adoptés.
Remplacement
Les modèles de migration et d’invasion cellulaires seront utilisés à chaque fois que cela est possible, notamment pour les analyses mécanistiques du rôle des gènes impliqués dans la formation de métastases et identifiés au cours de ce projet. Cependant, les lignées cellulaires de cancers humains rendent mal compte de la complexité des comportements des cellules dans leur milieu naturel, notamment dans un cadre de migration, et souffrent de limites importantes pour la modélisation des étapes de progression métastatique puisque la plupart des lignées cellulaires de mélanome humain proviennent de métastases et se sont adaptées à leurs conditions de culture in vitro. Les méthodes alternatives telles que la culture en 3D seront aussi envisagées mais ne peuvent à l’heure actuelle reproduire la complexité chimique, biologique et physique d’un organisme vivant pour étudier le comportement des cellules dans un environnement physiologique.
Réduction
Le recours à des expériences pilotes permettront d’optimiser les protocoles sur un petit nombre de poissons adultes. De plus, une stratégie visant à tester tous les gènes candidats en même temps réduira considérablement le nombre total d’animaux utilisés par rapport à une stratégie qui s’intéresserait à chaque gène candidat séparément. Enfin, des analyses statistiques a priori basées sur notre expérience du type de manipulations proposées ont permis d’établir les tailles d’échantillons nécessaires pour observer des différences significatives, réduisant ainsi au minimum le nombre d’animaux utilisés pour ce projet.
Raffinement
Le développement de tumeurs présente un risque de souffrance animale modérée. Cependant, cette souffrance éventuelle peut être prévenue par une surveillance attentive des animaux et l’application de critères d’arrêt définis. Afin de réduire le stress des animaux et de prévenir toute souffrance, les poissons sujets au développement de tumeurs seront observés au moins deux fois par semaine à la recherche de signes ou de changements de comportement précoces et prédictifs de la maladie. Ceux-ci comprendront principalement (par ordre de fréquence) des modifications de la nage, une respiration accélérée prolongée, une léthargie (immobilité prolongée au fond de l’aquarium) ou une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau. Des cas plus rares peuvent présenter un hérissement des écailles, la présence d’œdèmes ou une incapacité à se nourrir. Les poissons malades seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 12h. En absence d’amélioration des signes de stress ou de maladie listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. Dans un souci de raffinement, les poissons seront maintenus à une densité optimale de 5-8 poissons par litre d’eau pour favoriser leurs interactions sociales, en accord avec les recommandations de l’AAALAC. Les poissons seront également nourris une fois par jour avec des artémias pour préserver leurs instincts prédateurs et enrichir leur milieu.
Choix des espèces
Le poisson zèbre représente un organisme modèle particulièrement adapté à l'étude de la fonction de gènes d’intérêt dans le cancer. Des modèles très fiables de mélanome ont été établis et des outils performants sont disponibles pour modifier des gènes spécifiquement dans ces tumeurs afin d’en examiner le rôle, en particulier sur le comportement des cellules cancéreuses. De plus, l’environnement des cellules est très bien conservé entre l’homme et le poisson puisque la plupart des organes ont des programmes de développement et des structures semblables. D'autres espèces pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique. Les microinjections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade une-cellule, ce qui permet l’intégration dans le génome et la production d’animaux transgéniques mosaïques. Les tumeurs primaires surviennent au stade adulte entre 8 et 30 semaines après fécondation. Les transplantations sous-cutanées nécessitent l’utilisation de poissons adultes âgés de 12 à 26 semaines car les poissons âgés de moins de 3 mois sont trop petits pour permettre l’observation de la migration spatiale des cellules tumorales et les poissons âgés de plus de 6 mois présentent une variabilité plus importante de la réponse à l’irradiation.
Etude de l’induction d’une mort cellulaire immunogène par thérapie photodynamique et vaccination
- Recherche appliquée
- Cancers
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis une greffe de cellules tumorales sous la peau, pour tester si une vaccination prévient l'apparition de tumeurs des voies aérodigestives. Le porteur indique que des tumeurs sont attendues, au moins dans les groupes témoins, et prévoit des points limites de taille et d'aspect. Il affirme que le recours à des souris immunocompétentes est "indispensable" et invoque le même fond génétique de l'"organisme entier" pour éviter le rejet de greffe.
Objectifs
Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETC) définissent un groupe hétérogène de tumeurs malignes qui se développent au dépend de l'épithélium des voies aérodigestives supérieures (cavité orale, pharynx et larynx). Les CETC sont le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde, avec plus de 600 000 cas diagnostiqués chaque année. Leur incidence est particulièrement élevée en Europe de l'Ouest, et dans le Nord et le Nord-Est de la France (23 cas/100.000 habitants). Les CETC diagnostiqués à un stade précoce sont traités par radiothérapie ou chirurgie, et le pronostic est bon avec une survie globale à 5 ans d'environ 90%. Cependant, la majorité des CETS sont diagnostiqués à un stade localement avancé. La prise en charge de ces tumeurs de haut grade est multimodale et repose sur la combinaison de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie à base de platine. Malgré des modalités de traitement agressives, le pronostic des CETC ne s'est que marginalement amélioré au cours des trois dernières décennies, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 45-50 %. Ces traitements sont agressifs, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et malgré cela, le pronostic de ces tumeurs reste sombre, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 50%. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur ORL. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothese qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées deja utilisees dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particuliere qui stimule le systeme immunitaire. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter leur efficacité. L’enjeu de ce projet est donc la réalisation d’une expérience d’immunisation (vaccination) sur de modèles murins de cancer et l’évaluation de la capacité de cette vaccination à prévenir l’apparition ou la progression tumorale de manière prophylactique.
Bénéfices attendus
Cette approche nous permettra d’établir si les protocoles de vaccination que nous avons mis au point sont capables de mobiliser le système immunitaire. Si une action anti-tumorale prophylactique est démontrée, cela permettra d’établir un rationnel solide sur l'induction d'une MCI. Cette mort cellulaire immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité pour des stratégies thérapeutiques futures.
Procédures
Chaque souris engagée dans ce projet sera d'abord injectée en sous-cutanée avec une suspension cellulaire pour la phase de vaccination. Une semaine plus tard, une deuxième injection sous-cutanée de suspension de cellules tumorales sera réalisée pour induire une tumeur.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront 2 injections sous-cutanées à une semaine d'intervalle. Ce geste ne devrait pas engendrer de douleur ou de souffrance particulière. La deuxième injection a pour but d'effectuer une greffe tumorale. Nous nous attendons donc à observer l'appartition de tumeurs, au moins pour les groupes témoins si la vaccination devait être un succès. Les souris seront surveillées tous les jours afin d'observer leur état général (état du pelage, comportement...). Des points limites sont définis (aspect et taille de la tumeur par exemple) pour pouvoir soustraire un animal avant qu'une souffrance ou une douleur ne s'installe.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.
Remplacement
Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients. La démonstration de capacité de notre protocole vaccinla à induire une MCI complète nécessite des éléments de preuves in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche est la seule admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale.
Réduction
Le projet nécessitera un nombre maximum de 120 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été établis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris de la lignée C57BL/6. Ceci se justifie par le fait que les lignées cellulaires que nous allons utiliser sont dérivées de carcinome ORL de souris C57BL/6. Il est indispensable que les lignées cellulaires et l'organisme entier utilisé pour cette étude que faut le même fond génétique pour éviter un phénomène de rejet de greffe (les souris C57BL/6 étant immunocompétentes). Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6-8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.
Etude de pharmacocinétique utilisant des comprimés buccaux mucoadhésifs chez le lapin
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
7 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent sous anesthésie des comprimés mucoadhésifs dans la cavité buccale, puis des prélèvements de sang, pour établir le profil pharmacocinétique et la réponse immunitaire d'un nouveau médicament buccal. Le porteur indique un risque de stress lié à la contention et de vomissements liés à la dissolution des comprimés. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et qu'il est "nécessaire de recourir à l'animal dans son ensemble".
Objectifs
L'enjeu de ce projet est : 1/Déterminer les profils pharmacocinétiques des comprimés mucoadhésifs buccaux dans le plasma de lapins femelles après deux administrations uniques à Jour 0 puis à un rappel Jour 21, 2/ Evaluer la réponse immunitaire notamment la production des anticorps suite à la mise en place des comprimés mucoadhésifs.
Bénéfices attendus
Ce projet participe à la mise en place d'un nouveau medicament buccal mucoadhésif, non traumatique pour l'administration. Cela pourra être non négligleable pour les populations fragiles (jeunes enfants, personnes agées par exemple)
Procédures
Ce test sera réalisé sous animal anesthésié (Psychotrope+α2-agoniste ). Des composés (n=5) seront appliqués dans la zone buccales de chaque animal. Puis des prélèvements sanguins seront réalisés sur 5 animaux à Jour 0, 10, 31 (et 52 si nécessaire). Un volume de 2 mL de sang sera prélevé selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur
Impact sur les animaux
Il peut y avoir du stress liée à la contention pour réaliser l'anesthésie générale des animaux. Ce stress sera réduit au maximum car toute manipulation sera faite par une personne expérimentée. Il pourrait également avoir des vomissements liés à la dissolution des tablettes mucoadhésives. Si les vomissements sont nombreux ou volumineux l'animal pourra être exclu de l'étude. L'anesthésie générale des animaux sera sous surveillance avec la présence d'un vétérinaire, les animaux seront également surveillés lors de leur réveil. Une attention particulière sera apportée pour maintenir les animaux au calme et également un suivi de la température corporelle (via un tapis chauffant) sera mis en place lors de l'anesthésie et du réveil des animaux.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux ayant reçu les comprimés à tester.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative permettant de prouver l'efficacité (Réponse immunitaire, durée d'action) de cet élément test, il est donc nécessaire de recourir à l'animal dans son ensemble. Ce modèle In vivo ne peut pas etre remplacé, il est nécessaire de recourir à l'animal.
Réduction
7 animaux au total seront inclus dans ce projet. 2 animaux spares seront utilisés pour le pré test pour vérifier l'adhésion des composés aux parois buccales. Les 5 animaux restants feront la totalité du projet. 7 animaux au total est le nombre minimum pour avoir des résultats représentatifs, pour pouvoir démontrer la reproductibilité de ce modèle tout en minimisant la variabilité.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en boxe collectif dés l'arrivée jusqu'à la fin de la phase animale. Cet hébergement collectif est nécessaire durant l'étude pour un contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, présence de jouets.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce fréquemment utilisée en recheche pre-clinique pour le développement de médicaments destinés à l'homme et la taille de cet animal permet de le manipuler assez facilement. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes afin de ne pas avoir de cavités bucalles en fin de croissance et qui ne présentant pas de pathologies liées au vieillissement.
Étude des défauts hypothalamiques dans des modèles murins de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations mimant la sclérose latérale amyotrophique et subissent des chirurgies cérébrales, implantation de pompes, pose d'électrodes sous-durales et injection intracérébrale, puis des tests glycémiques, métaboliques et des tests comportementaux non détaillés sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des douleurs atténuées par des analgésiques et prévoit de retirer un animal dont l'état ne s'améliore pas sous 48 heures. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal dont l'hypothalamus est bien caractérisé et conclut que la souris ne "saurait être remplacée".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), la plus fréquente des maladies du système moteur adulte (2 à 3 nouveaux cas pour 100 000 habitants), reste une pathologie incurable et présente un pronostic extrêmement sévère, conduisant au décès, 2 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA présente des formes sporadiques (90%) et familiales (10%). Diverses lignées de souris transgéniques ont été mises au point, récapitulant les symptômes de la maladie : une dégénérescence des neurones moteurs cortico-spinaux et des motoneurones spinaux, une dénervation des muscles striés squelettiques accompagnée d’une atrophie musculaire et d’une paralysie progressive se finissant par la mort. Ces lignées transgéniques sont à la base des recherches expérimentales dans le domaine de la SLA. Outre les symptômes moteurs, la SLA est aussi accompagné par une perte de poids très importante (chez l’homme et modèles murins) due à une diminution de la prise alimentaire, associée à un changement de la dépense énergétique. Il a été observé récemment que les modèles transgéniques ont aussi des dysfonctionnements du sommeil et du métabolisme. Ces altérations à l’origine de ces symptômes n'ont pas encore été demontrees. Chez la souris, l’hypothèse expliquant les bases cellulaires de ces dysfonctionnements sont un défaut fonctionnel des neurones hypothalamiques impliquées dans la régulation de la balance énergétique, la prise alimentaire et le sommeil. Ceci suggère l’existence d’un défaut hypothalamique touchant le contrôle de la prise alimentaire et la qualité/quantité de sommeil aussi chez le patient SLA. De plus d'un point de vue moléculaire, il a été montré que l'une des molécules impliquées dans la maladie, est un élément central de l’horloge interne. Ce dernier gène particulièrement contrôle de façon remarquable le rythme de prise alimentaire et le sommeil. Ceci faisant le lien entre la pathologie étudiée et les problèmes de l'horloge interne. Nous investiguerons donc, dans cette etude, le sommeil et le metabolisme de ces lignees transgeniques mimant la SLA.
Bénéfices attendus
Ces expériences nous permettront de déterminer si les défauts fonctionnels de l’hypothalamus peuvent être reversés et ainsi ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour la SLA. Au-delà de la SLA, ce projet est destiné à contribuer à l’effort commun de recherche sur l’étiologie des maladies neurodégénératives du système moteur.
Procédures
Les animaux subiront des procédures chirurgicales (implantation de pompes iPRECIO durée 2h, implantation d’électrodes subdurales durée 3h, injection intracérébrale durée 2h) en plus de test glycémique (durée 2h), comportementaux et métaboliques. Ces expériences dureront maximum 35 jours et prennent en compte le développement de la pathologie dans les 2 lignées transgéniques. Les prélèvements ne seront fait qu’en phase terminale d’une procédure.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à des douleurs causées par les procédures chirurgicales qui seront atténuées par des antalgiques et analgésiques avant, pendant et après la chirurgie ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant la période de récupération des souris. Nous préviendrons toutes infections par l’apport d’antibiotique a la fin des procédures chirurgicales. Enfin, nous ne laisserons aucune souris dans la souffrance en nous référant à la feuille en Annexe 1. Il sera pris la décision de sortir une souris de l’étude si les conditions de la souris ne montrent pas d'amélioration sous 48 heures.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour des analyses biochimiques et immunologiques, après avoir collecté sang, tissus et organes.
Remplacement
La SLA est une maladie d’origine multifactorielle et multicellulaire. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré de cette pathologie. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent, en outre, une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études fonctionnelles. Le nombre de souris incluses dans ce projet a été précisément calculé à partir des observations faites dans le laboratoire lors d’études préliminaires ce qui a permis de calculer la puissance statistique et d’éviter les biais de taille d’effet (nombre suffisant permettant l’exploitation statistique). Le logiciel GPower nous a permis de calculer le nombre minimum nécessaire par groupe à 24. Secondairement lorsque les données seront récoltées nous utiliserons une analyse statistique ANOVA à un facteur avec une analyse post-hoc pour analyser les résultats.
Raffinement
Les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions d’hébergement conformes à la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des animaux (coton compressé pour faire des nids, maisons en plastique rouge), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s’assurer de leurs bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites (perte de poids, difficultés métaboliques, etc.) permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établi. De plus, nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de pré-anesthésie, d’anesthésie et de prise en charge analgésique en cas de procédure.
Choix des espèces
La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la SLA. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Les animaux seront utilisés à partir de 30 jours, au moment du sevrage, car l’injection de DREADDS nécessite d’être faite sur des souris âgées de 30 jours car le DREADDS est laissé 15 jours avant de pouvoir conduire un quelconque effet. Pour les pompes iPRECIO et l’EEG des animaux de 65 jours seront utilisés pour pouvoir observer les effets au stade présymptomatique.
Développement de radiotraceur pour l’imagerie de la mutations mIDH1 dans le chondrosarcome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales en sous-cutané ou près du tibia, puis l'injection de traceurs radioactifs pour l'imagerie, avant d'être tuées pour analyser la distribution des molécules. Le porteur reconnaît que la greffe près du tibia peut être douloureuse et gêner le déplacement une fois la tumeur développée. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" pour valider ces traceurs.
Objectifs
Les mutations des gènes de l’Isocitrate Déshydrogénase (mIDH) favorisent la progression tumorale. Ces mutations sont fréquemment identifiées dans des cancers comme le gliome ou le chondrosarcome (CHS), tumeurs solides infiltrantes et invasives, limitant une résection complète et provoquant souvent des récidives ainsi qu’une incapacité progressive des patients. De nouveaux inhibiteurs ciblant mIDH pourraient représenter de nouveaux espoirs de thérapie, mais leur succès repose sur une évaluation préalable de l’expression de mIDH dans ces tumeurs. Cependant, contrairement aux alternatives invasives comme la biopsie, les modalités d’imagerie non invasives pour la quantification de l’expression de mIDH n’ont été que peu étudiées pour ces tumeurs. Ce projet consiste en une approche translationnelle et multimodale de développement de méthodes d’imagerie, via des radiotraceurs marqués au fluor-18 pour l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP). Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.
Bénéfices attendus
Si les résultats de biodistribution sont favorables au transfert et à évaluation clinique de radiotraceurs, la quantification de l’expression de mIDH sera évaluée par autoradiographie sur tissus de tumeurs cérébrales et de CHS issus de patients, afin de conduire pour la première fois à des données quantitatives concernant l’expression de mIDH sur des tumeurs humaines. Si ces résultats sont favorable, cette mutation et son impact métabolique seront également étudiés en clinique par spectroscopies per-opératives de résonance magnétique chez des patients atteints de gliome ou de CHS afin d’évaluer leur intérêt pour estimer plus précisément l’étendue de la résection à réaliser, paramètre impactant fortement le taux de survie. A plus long terme, Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra une injection sous cutanée ou paratibiale sous anesthésie gazeuse (durée 5min). Pour les animaux des lots 2 à 4, ils recevront également une injection intraveineuse (moins de 1min) en vigile entre 15 jours et 6 semaines après l’injection sous cutanée ou paratibiale.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules en paratibiale pourrait entrainer une douleur poste injection (douleur anticiper par l’administration préventive d’antalgique (Rimadyl, 20mg/kg ou Méloxicam 5 mg/kg) en pré et post implantation. Une gêne au déplacement pourra aussi être observé une fois la tumeur ayant atteint un certain stade de développement.
Devenir
Procédure 1 et 2 : Mise à mort Lot 1 pour l’analyse protéique, génomique et histologique des tumeurs Procédure 3 : Mise à mort Lot 2 détermination de la distribution des radiotraceur dans les organes des animaux à différent temps Mise à mort Lot 3 analyses de spécificité de fixation par prélèvement Mise à mort du lot 4 analyses des métabolites sang et urine et tumeur
Remplacement
Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouveaux radiotraceurs requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude pilote (étude 1) et les examens d’imagerie (étude 3) permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 488 souris maximum sur une période de 5 ans.
Raffinement
Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection…). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, l’étude pilote ainsi que l’étude impliquant des examens d’imagerie permettent de raffiner cette étude en termes de caractérisation du modèle et d’examen non invasif.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptés pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèle.
Etude in vivo de l’impact de la colonisation des bactéries filamentaires segmentées sur l’activation immunitaire et sur la flore intestinale de l’hôte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent gavages, injections répétées, greffes de moelle osseuse et prélèvements de sang et de fèces, une partie recevant du busulfan qui supprime l'immunité et peut provoquer des hémorragies sévères. Le porteur mène une recherche fondamentale sur des bactéries intestinales et écrit ne prévoir "aucune perte" et juger "négligeable" l'effet de l'hébergement en cage. Il conclut à la nécessité de la souris pour reproduire ces interactions entre hôte et bactéries.
Objectifs
Les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries naturellement présentes dans la flore intestinale de nombreuses espèces dont l’Homme. Ces bactéries sont attachées à la paroi intestinale de manière spécifique à l’espèce hôte. Ces bactéries peuvent entrainer une réponse immunitaire au niveau de l’intestin de leur hôte. Chez la souris, la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées protège l’hôte de certaines bactéries infectieuses. Cette colonisation peut également accentuer la gravité de certaines maladies ayant pour cause un dysfonctionnement du système immunitaire de l’hôte. Pour ces raisons les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries clés à la fois dans l’évolution de la santé et de la maladie. Cependant de nombreux impacts de la colonisation d’un hôte par les bactéries filamentaires segmentées restent à définir. Au cours de notre projet nous tenterons de définir les impacts de la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées sur l’activation de la réponse immunitaire. Nous étudierons également les mécanismes de détection des bactéries filamentaires segmentées par le système immunitaire de l’hôte. Nous évaluerons ensuite l’impact de la colonisation de l’hôte par les bactéries filamentaires segmentées sur l’évolution de la flore intestinale, mais également lors d’infection par des entéropathogènes.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est une meilleure compréhension des premiers évènements survenant pendant la colonisation des bactéries filamentaires segmentées chez l’hôte. De plus, nous comprendrons mieux comment la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées a un impact sur l’évolution de la flore intestinales et la résistance aux infections bactériennes intestinales. Ces connaissances fondamentales constitueront la base d’une application des bactéries filamentaires segmentées dans l’amélioration de la santé intestinale dans le futur.
Procédures
Au cours de notre projet les animaux subiront différentes interventions en fonctions des procédures expérimentales. En ce qui concerne la colonisation et l’inoculation de bactéries, un gavage ponctuel sera réalisé sur 3456 animaux éveillés, 2 gavages ponctuels et distant de 21 jours seront réalisés sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne les traitements par injection, sur une période de 6 jours, 2 injections ponctuelles distantes de 5 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 7 jours, 3 injections ponctuelles distantes de 3 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, 1 injection ponctuelle par jour sera réalisé sur 288 animaux éveillés. Sur une période de 5 jours, 1 injection ponctuelle par jours sera réalisé sur 1728 animaux éveillés. En ce qui concerne la greffe de moelle osseuse, 1 injection ponctuelle sera réalisée sur 1728 animaux sous anesthésie générale. En ce qui concerne le traitement administré par l’eau de boisson, sur une période de 4 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de fèces, sur une période de 5 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les jours sur 1728 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les 2 jours sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de sang, 2 prélèvements sanguin distant de 60 jours seront réalisés par ponction sur 1728 animaux éveillés.
Impact sur les animaux
Durant notre projet certaines procédures entraineront des nuisances et effets secondaires sur les animaux. La procédure de gavage bien que non douloureuse pour l’animal entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation de l’animal. L’inoculation de bactérie aura pour effets indésirables des troubles gastriques sans gravités dus au changement de la flore intestinale. L’injection entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation. Toutes les substances injectées ou administrées à l’animal à l’exception du busulfan n’auront pas d’effets indésirables sur les animaux. Le traitement au busulfan aura comme effets indésirables attendus une suppression des cellules responsables de l’immunité. Nous pourrons observer également comme effets secondaires, des troubles de la nutrition, diarrhée, inflammation au niveau du site d’injection, ainsi que de manière exceptionnelle des hémorragies sévères dues à une diminution du nombre de plaquettes. En ce qui concerne les prélèvements effectués chez l’animal, seul le prélèvement sanguin entrainera une nuisance après le prélèvement. Cette nuisance se caractérisera par une fatigue transitoire après le prélèvement.
Devenir
A la fin de chaque procédure expérimentale la totalité des animaux sera mise à mort par dislocation cervicale ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par la nécessité à la fin de chaque procédure de procéder au prélèvement d’organe tel que la rate, le foie, le ccum, le colon ainsi que les ganglions lymphatiques. Ces organes sont des organes vitaux ce qui exclut pour des raisons éthiques leur prélèvement sur animaux éveillés. Les animaux qui ne seront pas prélevés en raison de leur exclusion d’un lot expérimentale afin de ne pas compromettre les résultats d’une expérience seront également mis à mort par dislocation cervical ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par l’impossibilité de réutiliser, replacer ou adopter ces animaux à la fin de nos procédures expérimentales.
Remplacement
La culture en laboratoire des bactéries filamentaires segmentées reste très difficile et limitée dans le temps. Ceci limite l'utilisation de système artificiel. Les systèmes artificiels seuls ne nous permettrons pas d'atteindre les différents objectifs de recherche décris dans ce projet. Afin de caractériser en détail les interactions complexes entre bactéries filamentaires segmentées et son hôte, nous devons avoir recours à un modèle animal pouvant reproduire ces types d'interactions en laboratoire et ce dans différentes conditions avec des paramètres contrôlés. La souris est la solution que nous avons retenue pour atteindre nos objectifs. La grande variété de modèle disponible pour cet animal et ça similarité anatomique et physiologique avec l'humain en font un modèle adapté pour atteindre les objectifs de notre projet.
Réduction
Dans un principe de réduction nous avons conçu nos expérimentations en réduisant au minimum le nombre de procédure expérimentale. Ainsi chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre spécifiquement un des objectifs précédemment décrits. Nous nous sommes assurés d’exclure toute répétition et de garantir l’obtention de résultats originaux. Pour l’ensemble de nos procédures et afin d’obtenir des résultats significatifs nous avons fixé un niveau de risque suffisamment faible et une puissance élevée afin d’obtenir avec un minimum d’animaux des résultats expérimentaux incontestables. Les animaux seront hébergés en groupe de 5. Nous ne prenons pas en compte l’effet lié à l’hébergement en cage que nous jugeons négligeable durant nos expériences. Lors de la réalisation de nos expérimentations nous ne prévoyons aucune perte. Nous décidons d’utiliser 12 animaux par groupe. Ce nombre nous permettra d’obtenir lors de nos analyses statistiques des résultats significatifs. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu et indépendante de nos protocoles expérimentaux.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les animaux seront hébergés en groupe. Le nombre d’animaux par cage ne pourra être supérieur à 5. En conditions d’hébergement sans microorganisme les animaux seront hébergés dans les mêmes conditions. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par un personnel correctement formé et limité au maximum dans le temps. Afin de diminuer les désagréments et les douleurs lors de certaines expérimentations les animaux seront anesthésiés. Toutes les expérimentations incluant un traitement avec une substance chimique pouvant potentiellement induire des effets secondaires, ont été conçues afin de réduire au maximum la posologie du traitement tout en garantissant l’induction des effets souhaités chez l’animal. Des points limites généraux et spécifiques à chaque procédure, suffisamment prédictifs ont été mis en place. Si aucun moyen efficace n’est disponible afin de supprimer la souffrance, la douleur et l’angoisse de l’animal sans compromettre les résultats de nos expériences, l’animal sera mis à mort. Le bien-être animal sera une priorité lors de notre projet de recherche et ce dernier sera régulièrement évalué et optimisé au cours de notre projet.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser cette espèce car elle présente de nombreux avantages pour notre projet d'étude. Cette espèce peut nous fournir un grand nombre de modèle génétique et d'individu dépourvus de flore bactérienne nécessaires pour notre projet. Cette espèce possède également une grande similarité anatomique de son système digestif avec l'Homme. Il en est de même du point de vu immunitaire. Cette espèce est également facile à manipuler en laboratoire ce qui participera de limiter les risques liés aux manipulations expérimentales. L’hébergement séparé des mâles et des femelles est également possible. Des souris mâles et femelles de chaque espèce, âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisées. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris adultes dont le système immunitaire et la flore intestinale sont pleinement développés. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage et l'injection sont plus faciles à réaliser chez les souris adultes, ce qui minimise les douleurs inutiles dues aux manipulations.
reconstruction osseuse segmentaire fémorale avec greffe d’un biomatériau
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du fémur pour y greffer un biomatériau, puis quatre séances d'imagerie sur trois mois avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique une douleur modérée traitée par analgésique et précise que les rats dont le fémur n'a pas été correctement stabilisé sont tués et remplacés. Il présente cette étape animale comme un préalable "impératif" avant des essais sur de plus gros animaux puis en clinique.
Objectifs
La reconstruction des pertes de substances osseuses importantes, telles qu'elles se produisent dans les cas d'accidents graves, de cancers ou de métastases osseuses, reste un challenge. Les greffes d'os autologue (lambeaux osseux, prélevés chez le patient) sont le traitement de référence mais ils présentent de nombreux inconvénients, en raison de la quantité limitée d'os que l'on peut prélever sur un site sain, et des conséquences de ce prélèvement sur son état général et sur sa qualité de vie. En outre, ces procédés chirurgicaux complexes ne sont pas toujours réalisables en raison de contre-indications d'ordre anatomique, vasculaire ou médicale. Le but des recherches qui seront menées durant les 5 prochaines années, est de développer un procédé de reconstruction osseuse avec greffe d'un biomatériau capable de se substituer à l'os manquant dans un premier temps, puis idéalement de permettre la régénération d'un os nouveau.
Bénéfices attendus
Les résultats des expériences conduites sur ce modèle animal sont un préalable à la poursuite de travaux impliquant d'autres modèles, notamment chez le gros animal. Des résultats médiocres obtenus avec un biomatériau conduisent à l'arrêt de l'étude de celui-ci. A l'inverse, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une chirurgie orthopédique (il s'agit d'un acte chirurgical unique d'une durée de 20 minutes), puis à 4 séances d'imagerie de rayons X (durée de l'examen: 15 minutes) et d'IRM (durée de l'examen: 30 minutes) à J2, J28, J56, J72, éventuellement J90.
Impact sur les animaux
Les opérations réalisées pourront entraîner une douleur modérée. Celle-ci sera traitée par l'injection intra-péritonéale de buprénorphine. Dans certains cas, une réduction de la mobilité des animaux pourra être constatée, si les fixateurs externes destinés à stabiliser le fémur n'ont pas été parfaitement posés. Dans ce cas, les animaux concernés seront sacrifiés et remplacés par d'autres.
Devenir
Les animaux sont maintenus en vie jusqu'à 3 mois après l'opération. Ils sont tous sacrifiés à J90 pour procéder à une analyse histologique des tissus dans la région opérée.
Remplacement
L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau (nHA +/- Sr) et pour évaluer le potentiel de différenciation ostéoblastique de ce complexe. Le modèle de défait osseux critique sur la diaphyse fémorale de rat a été décrit dans plusieurs études antérieures.
Réduction
L'utilisation de systèmes d'imagerie non invasie (IRM et microtomographie de rayons X) permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, le suivi de chaque animal permet d'obtenir des informations sur le processus de régénération et sur divers autres paramètres biologiques à différents temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Sans ces procédures, il faudrait envisager des groupes de rats pour chaque temps expérimental où une analyse est requise.
Raffinement
L'utilisation de l'imagerie non invasive par microtomographie de rayons X constitue en soi un raffinement dans la mesure où il limite le nombre d'animaux et permet d'obytenir un grand nombre d'informations sur le même animal tout au long de l'expérience. Pendant la chirurgie, une cage après l'autre sera amenée dans la salle d'opération afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveillera dans une cage à part pour éviter le contact avec des conégnères non anesthésiés. L'anesthésie se fera par inhalation d'isoflurane, et la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée par immobilité, réflexe de retrait et fréquence respiratoire. La prise en charge de la douleur sera prise en charge par l'injection sous-cutanée d'un analgésique: 0.3 mg par kg de buprénorphine juste avant l'intervention et 24 heures après comme recommandé. Si nécessaire, une troisième dose peut être appliquée après 48 heures. Pour réduire le risque d'infection au niveau du site opératoire, un antibiotique prophylactique (céfazoline, 100 mg/kg) sera injecté par voie sous-cutanée le jour de l'opération et le lendemain (protocole calqué sur celui utilisé en clinique). Après le réveil, le rat reviendra dans sa cage d'origine. Les rats seront hébergés par 3 dans des cages comportant des tunnels, avec accès illimité à l'eau et à la nourriture, placées dans une salle dont les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie) sont parfaitement contrôlés.
Choix des espèces
le rat wistar a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés hostologiques et biologiques des membranes induites en site osseux fémoral chez le rat. Il est d'autre part décrit dans de nombreuses études dans le monde. Autres critères retenus: animaux adultes , poids 225-250 grammes la croissance du squelette doit être arrivée à son terme il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure