Procédures modérées

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries pendant six mois avec des croquettes contenant des pesticides, subissent des prélèvements et des mesures de fonction rénale, puis une chirurgie qui provoque une agression rénale aiguë et une détérioration de leur fonction rénale. Le porteur indique une perte de poids, une prostration ou une léthargie possibles, déclenchant la mise à mort au-delà de 24 heures. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet aujourd'hui de tenir compte de la physiologie d'un "organisme entier".

Objectifs

Les maladies rénales chroniques et aigues sont en augmentation constante dans le monde et représentent un problème important de santé publique. Les reins sont des organes sensibles à certaines molécules toxiques. Parmis celles-là, les pesticides sont largement utilisés en agriculture et peuvent parfois ne pas être totalement spécifiques des organismes nuisibles mais pourraient affecter aussi la faune et l’Homme. Nous voulons donc savoir si une exposition chronique à de faibles doses de pesticides modifie la fonction rénale et rend ces organes plus fragiles.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projets sont de mieux caractériser les effets rénaux des pesticides, afin de savoir s'ils fragilisent les reins et peuvent les faire évoluer vers une insuffisance rénale.

Procédures

Les animaux seront nourris pendant 6 mois avec des croquettes contenant des pesticides. Pendant ces 6 mois de régime, des prélèvement d’urine, de selles et de sang pourront être effectués à 2 reprises, chez les animaux vigiles. Des mesures de la fonction rénale seront réalisées 3 fois . Cette intervention nécessite une courte anesthésie d'environ 5 minutes suivie d'une mesure de 45 minute sur animal vigile grâce à un dispositif fixé sur le dos de l'animal qui est ensuite retiré. Enfin, à l'issue des 6 mois de régime, les animaux subiront une intervention chirurgicale d'environ 30 minutes (sous anesthésie générale et analgésie) pour induire une agression rénale.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une agression rénale aigue, résultant en une détérioration de leur fonction rénale.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin du projet.

Remplacement

Étant donné la complexité des mécanismes pathologiques mis en jeu, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants qui ne tiennent pas compte de la physiologie d’un organisme entier. Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives pour obtenir des résultats exploitables et pertinents par rapport à la pathologie humaine.

Réduction

les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 216 souris

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis: 1) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’ARA ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est déjà l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.

140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélever leur cerveau. Le protocole applique aux nouveau-nés une séparation maternelle répétée de trois heures par jour, pour reproduire un facteur de risque de troubles du développement et étudier le réseau de l'ocytocine. Le porteur indique que les souris devenues adultes peuvent être plus anxieuses, effet recherché par les tests comportementaux qui suivent. Il précise que les souris servant de stimulus social sont réutilisées dans un autre projet, et revendique la souris comme modèle "essentiel".

Objectifs

Contexte de l’étude : L’ocytocine largement distribuée dans le cerveau, est fortement impliquée dans les interactions sociales à l’âge adulte (par exemple en favorisant la reconnaissance et la perception des émotions, la mémoire sociale, ou encore la confiance en autrui), mais est également soupçonnée de participer à l’établissement de la sociabilité au cours du développement de l’enfant. Il a été récemment mis en évidence l’existence de deux réseaux de l’ocytocine, l’un inné et constitutif, présent dès la naissance, l’autre acquis précocement après la naissance, et qui se développerait avec l’expérience. Ces résultats indiquent que le développement cérébral est soumis à une plasticité ciblée du système ocytocinergique. Objectif principal : Ce phénomène de maturation neuronale qui se prolonge dans l’enfance, est donc susceptible d’être affecté par l’environnement, et modifié par l’expérience sociale et pourrait constituer un facteur de risque précoce dans les troubles du développement. En effet, parmi les nombreux facteurs génétiques, anténataux et environnementaux, l’hypothèse d’un lien entre des évènements stressants de vie au cours des premières années constitue un facteur de susceptibilité. Ce présent projet vise à vérifier l’hypothèse selon laquelle l’expression des réseaux de l’ocytocine est 1) influencée par l’expérience sociale précoce, et 2) que cela se traduit par des comportements sociaux inadaptés à l’âge adulte. Ainsi afin d’étudier les effets cellulaires et comportementaux des interactions socio-parentales, nous prévoyons d’utiliser un modèle de séparation maternelle précoce. En effet de précédentes études ont permis de montrer que l’isolement maternel néonatal, qui influence le lien d’attachement entre la mère et ses petits, peut entrainer plus tardivement des comportements associés à l’autisme. Cette étude a donc pour objectif principal de comparer le développement postnatal du réseau ocytocinergique et ses conséquences sur le comportement social chez des souris issues de portées élevées en condition standardisée, avec des souris séparées transitoirement de leur mère et de leur fratrie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ces travaux permettront dans un premier temps d’approfondir la connaissance du système ocytocinergique et son implication dans le développement des troubles du neurodeveloppement affectant la dimension sociale du comportement. Les données obtenues chez le rongeur ont considérablement accrue notre compréhension du système nerveux central. Ainsi ces travaux de recherche permettront également d’identifier les bases neuronales du comportement social et permettrait de développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblées. A moyen et long-terme, ces expériences pourraient avoir des applications cliniques pour des pathologies telles que l’autisme et l’anxiété sociale.

Procédures

Les animaux ne subiront pas d'intervention, seulement un stress potenitel lié a la séparation maternelle de 3H par jour.

Impact sur les animaux

L’accès à la nourriture et à l’eau se fera ad libitum (à l’exception des heures de séparation maternelle), quelle que soit les conditions expérimentales. Suite aux procédures de séparation maternelle (de 3, 7 ou 14 jours), il n’y a pas d’effet indésirable attendu concernant le poids. Pour autant, les animaux seront pesés quotidiennement par les expérimentateurs pendant la durée de la séparation, puis toutes les semaines le cas échéant (protocole à long terme), afin d’effectuer un suivi régulier de poids. Il est possible que les animaux devenus adultes soient plus anxieux que les portées élevées en condition standard, ce qui pourrait se ressentir lors des tests expérimentaux. Nous n’attendons pas d’anxiété excessive lors de l’hébergement. Une surveillance quotidienne, puis hebdomadaire de la qualité du pelage sera effectuée en parallèle de celle du poids. Nous n’attendons cependant pas d’anxiété excessive car ce sont des fratries ayant toujours vécues ensemble dans la cage d’accueil d’origine. En cas de pelage d’apparence détérioré du a un toilettage excessif, aucune médication n’est prévue. En revanche, un enrichissement supplémentaire (tunnel, briquettes de bois) pourra être alors fourni afin d’atténuer le stress des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis a mort à l’issu des procédures 1 et 2, car la collecte du cerveau est nécessaire à l’étude anatomique du système ocytocinergique. Les animaux étrangers utilisés pour les tests comportementaux seront replacés dans un autre projet de l’établissement utilisateur.

Remplacement

Notre projet de recherche porte sur l’anatomie du réseau de l’ocytocine et la fonction de plusieurs régions cérébrales. Par conséquent, les études in vitro ou la modélisation ne peuvent pas constituer des modèles expérimentaux satisfaisant et le recours aux a l’expérimentation animale est nécessaire pour cette étude. De plus l’analyse fonctionnelle du réseau ocytocinergique par la mise en place de tests comportementaux ne peut se faire que par une approche in vivo.

Réduction

Approche statistique pour réduire au minimum le nombre d’animaux : Le nombre d’animaux a été calculé statistiquement par un test anova afin de limiter le nombre d’animaux et de n’utiliser que le nombre nécessaire. Une étude pilote est également prévue afin de déterminer le nombre de jours adéquat de séparation maternelle pour obtenir un effet. Cela également dans un but de réduction de groupes expérimentaux qui seront utilisés, par identification de la période nécessaire de séparation à mettre en place pour l’étude à long terme. Nous groupons également les analyses histologiques et comportementales afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Pour les tests comportementaux incluant l’utilisation d’animaux étrangers (test 3 chambres et résident-intrus), nous utiliserons si possible des animaux de l’animalerie d’accueil déjà inclus dans d’autres protocoles, et ce dans un but de réduction afin de ne pas commander d’animaux supplémentaires pour un seul test comportemental. Si cela n’est possible les animaux utilisés pourront être replacés à la fin du protocole.

Raffinement

Ces travaux de recherche fondamentale nécessitent des observations sur des animaux vivant dans de bonnes conditions psychophysiologiques. Les souris utilisées pour ce projet sont nées et ont été élevées dans des établissements agrées. Le bien-être des animaux est impérativement pris en compte à chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage que pourraient ressentir les animaux. De plus le bien-être animal conditionne le bon déroulement et les résultats de nos tests comportementaux, nous sommes donc extrêmement exigeants sur la qualité de vie des animaux. De plus, dans un objectif de raffinement, nous procéderons à une étude pilote, qui permettra de déterminer la durée de séparation maternelle. Nous laissons notamment une période d’acclimatation pour les animaux dans la salle de comportement avant de démarrer les tests afin de diminuer le stress causé par un nouvel environnement. Nous surveillons en temps réel les bébés lors de la séparation et nous filmons les retrouvailles avec la mère afin de s’assurer du bon déroulement de l’étude par ailleurs ceci nous permet de pouvoir intervenir si besoin directement. Des mesures de suivi de poids et de pelage seront aussi effectuées quotidiennement afin de s'assurer du dévelopememnt normal des animaux.

Choix des espèces

Dans le cade de ce projet, la souris (Mus musculus) est le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques avec l'homme. Les souris apparaissent comme essentiel dans l’étude anatomique et fonctionnelle de l’ocytocine, puisque les réseaux de ce peptide sont très conservés, y compris chez les rongeurs. De façon intéressante, le rôle fonctionnel et comportemental de l’ocytocine est conservé dans de nombreuses espèces animales, y compris la souris, rendant l’étude de ce modèle animal pertinent pour la compréhension des mécanismes neuronaux sous-jacents. De plus, les études de référence sur le système ocytocinergique porte sur cette espèce, ce qui permettra d’inclure ces données dans celles de la littérature . Par conséquent, ce modèle animal offre la possibilité de caractériser l’anatomie des systèmes mis en jeu lors de perturbations environnementales précoces et leurs liens avec les troubles de la sociabilité observés ultérieurement. La souris est donc l’espèce animale susceptible de fournir des résultats fondamentaux très satisfaisants

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent à entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques, jusqu'à cinq gestes par animal, injections par voies multiples, prélèvements sanguins, injections intra-trachéale et rétro-orbitaire sous anesthésie, certaines étant ensuite utilisées pour s'exercer au prélèvement d'organes post mortem. Le porteur indique que ces souris sont des animaux de réforme d'élevage déjà destinés à l'euthanasie. Il affirme que l'usage d'animaux vivants est "incontournable" et ne peut être remplacé par des modèles in vitro.

Objectifs

Le but de ce projet est de former, entrainer et/ou perfectionner les utilisateurs à la réalisation de gestes techniques chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Cette formation est essentielle en termes de réduction et de raffinement. Elle permet, par la maitrise des gestes par les expérimentateurs, d’obtenir des résultats plus fiables et reproductifs au cours des projets diminuant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Des protocoles maitrisés permettent une diminution de la douleur ou de la gene potentiellement ressenties par les animaux. Tous les animaux sont des animaux de réforme issus d’élevage et destinés à l’euthanasie.

Procédures

Les gestes expérimentaux attendus seront : Sur animaux vigiles : Administration de composé par voies SC (sous-cutanée), IM (Intra-musculaire), IP (intra-péritonéale), IV (Intra-veineuse caudale), par voie orale (gavage) et par voie intra-nasale. Sur animaux préalablement anesthésiés par inhalation d’isoflurane en continu (3% débit de gaz frais 0,8L/min) : Prélevements sanguins de la veine faciale (sous-maxillaire) et injections IT (intra-trachéale) et IV sinus retro-orbital. Il s’agit de gestes rapides (maximum 10-15 min pour l’injection IT) et un maximum de 5 gestes différents sera réalisé sur un même animal avec seulement 1 geste de procédure modérée. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections SC de 30µl de buprénorphine (0.05mg/kg) pourraient être réalisées.

Impact sur les animaux

Les animaux de la procédure 2 classe modéree pourraient montrer des signes cliniques de douleur transitoire comme, par exemple, une perte de poids

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin du projet pour éviter de la souffrance par l’utilisation répétée des animaux. Certains seront également utilisés pour l’entrainement au prélevement d’organes et à certains gestes réalisés post mortem

Remplacement

Nous sommes dans un contexte educatif et l’objectif de ce projet est de maitriser un certain nombre de gestes techniques chez les rongeurs. De plus, il est necessaire de pouvoir réaliser les gestes sur des animaux vivants de façon à appréhender toute réaction de l’animal lors de nos protocoles par la suite. L’utilisation d’animaux est donc incontournable et ne peut être remplacée par des modèles in vitro.

Réduction

Tous les animaux utilisés dans ces procédures sont des animaux de réforme d’élevage destinés à l’euthanasie. Certains gestes pourront être réalisés sur les mêmes animaux afin d’en réduire le nombre notamment les gestes de classe légère et certains animaux pourront également être utilisés pour l’apprentissage de procédures post-mortem de prélevements. Le nombre d’animaux est choisi en tenant compte du nombre nécessaire et suffisant pour obtenir du personnel formé, compétent et sûr de lui, et des possibles évolutions de nos protocoles de recherche.

Raffinement

Afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, certaines procédures seront réalisées sous anethésie générale (isoflurane) et anesthésie locale (lidocaine). Les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans des cages avec enrichissement (frisottis). Les formations seront données par du personnel expert afin d’assurer les contentions, manipulations et gestes techniques au mieux pour eviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Afin de s’assurer de réaliser les bons gestes sur les animaux, nous devons faire nos formations sur des animaux de la même espèce que celle qui sera utilisée dans nos protocoles. La souris est le modèle d’etude utilisé dans les différents protocoles de l’équipe de recherche. L’apprentissage et/ou l’entrainement des gestes expérimentaux seront donc réalisés sur la souris. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines et jusqu’à une 30aines de semaines en fonction des euthanasies programmées dans l’animalerie (animaux de réforme)

164 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de myopathie de Duchenne, elles subissent des mesures de la fonction respiratoire, dont une technique nécessitant une trachéotomie, une ventilation mécanique et une injection de curare sous anesthésie sans réveil, pour tester une molécule sur la respiration. Le porteur indique que les 144 souris passées à cette technique sont systématiquement tuées, la trachéotomie et les oscillations forcées lésant l'appareil respiratoire. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative pour étudier la fonction respiratoire au niveau d'un "organisme entier".

Objectifs

La souris MDX (X-linked muscular dystrophy) est un modèle spontané de la myopathie de Duchenne, myopathie héréditaire et fatale due à l'absence de dystrophine. Un médicament administré dans l'eau de boisson permet de restaurer la fonction musculaire et la mobilitée. Dans ce projet, nous evaluerons donc l'influence d' un traitement (molécule BIO101- 50mg/ml*jr) sur la fonction respiratoire. Deux nouveaux groupes contrôles C57BL6/J seront mis en place pour tester l'effet de la molécule BIO101 : ils nous permettront de vérifier que les différences observées chez les souris Mdx ne sont pas dépendantes du fond génétique du groupe expériemental.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est que la molécule BIO101 améliore la fonction respiratoire quelque soit le fond génétique du modèle expérimental.

Procédures

Pour l'analyse de la fonction respiratoire : - par plethysmo: n= 144 souris . Cette technique dure en moyenne 45 minutes et sera répétée au maximum 4 fois. - par flexivent n= 144 souris . Cette technique dure en moyenne 30 minutes. Pour les souris de référence, aucune intervention sera faite sur les souris au cours du traitement. Il y aura uniquement un changement de biberon et de litière pour ces animaux.

Impact sur les animaux

Pour explorer la capacité respiratoire de nos animaux, pour ce projet, deux approches seront utilisées : 1-la pléthysmographie, qui permet de mesurer l'ensemble des volumes pulmonaires de façon non-invasive. Pour cela, les souris, libres de leur mouvement, sont placées dans des enceintes de pléthysmographie, hermétiquement fermées, à l'exception de l'arrivée d'air contrôlée. Les souris pourront ressentir du stress, dû à leur manipulation et à un nouvel environnement plus restreint pendant un temps limité. 2- la technique d'oscillation forcée (FlexiVent), nécessitant une trachéotomie et une ventilation mécanique adaptée, est réalisée sous anesthésie générale profonde sans réveil, évitant toute souffrance aux animaux tout au long de l'expérience. Concernant les groupes contrôles, les 20 animaux ne recevront que le traitement par eau de boisson et ne subiront aucune procédure décrite dans cette DAP. Seules les bronches seront prélevées post-mortem donc pas d'effets indésirables prévus.

Devenir

Tous les animaux soumis à la technique du flexivent (soit 144 souris) sont systématiquement sacrifiés en raison de la trachéotomie, l’injection de curare et des oscillations forcées induisant des lésions tissulaires au niveau de l’appareil respiratoire.

Remplacement

Nous travaillons sur la fonction respiratoire et il n’existe pas d’alternative pour étudier les phénomènes mis en jeu au niveau d’un organisme entier mis à part les modèles animaux.

Réduction

Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le modèle animal utilisé a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'effet du traitement sur les souris mdx dont la souche est connue et caractérisée. Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera réalisé. Une pvalue inférieure à 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Tout au long de cette procédure, les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et seront en plus surveillés tous les 2 jours par les expérimentateurs (traitement en eau de boisson nécessitant un changement ou un réajustement des volumes tous les 2 jours). Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les animaux seront hébergés à raison de 4 mâles par cage dans un environnement enrichi pour limiter le stress et faciliter les relations sociales. En cas d'agressions répétées, des mâles pourraient être isolés de façon transitoire. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera mise à mort sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable de la SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera mise à mort sans délai. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : - Les signes notables, définis sur l’aspect extérieur de l’animal, seront les suivants : pelage sale, pâleur (yeux, oreilles, peau), isolement, position recroquevillée, faciès contracté, yeux larmoyants. - Les signes cliniques spécifiques seront surtout visibles à la manipulation : zone urogénitale souillée, réticent à se déplacer, respiration difficile, évolution pondérale anormale (Perte de poids >10%). Concernant les groupes contrôles, les 20 animaux ne recevront que le traitement par eau de boisson et ne subiront aucune procédure décrite dans cette DAP. Seules les bronches seront prélevées post-mortem donc nous n’attendons aucun effet indésirable pour ce dernier groupe.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche mdx mimant la pathologie étudié et des C57BL10 comme controles. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude de la pathologie Deux nouveaux groupes contrôles C57BL6/J seront mis en place pour tester l'effet de la molécule BIO101 : ils nous permettront de vérifier que les différences observées chez les souris Mdx ne sont pas dépendantes du fond génétique du groupe expériemental. Les souris seront utlisées à un âge avancé (12 semaines) pour se rapprocher de la situation clinique.

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent des régimes gras, des injections d'un composé toxique pour le foie ou une chirurgie de ligature des voies biliaires, pour étudier une protéine impliquée dans la fibrose du foie liée au diabète. Le porteur reconnaît que la ligature des voies biliaires "entraîne des douleurs" et que certains régimes font perdre du poids aux animaux, suivis jusqu'à un point limite. Il affirme que l'usage de souris génétiquement modifiées est "nécessaire" et ne peut être remplacé par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

Des études épidémiologiques ont établi un lien entre l’accumulation de tissu adipeux dans la région intra-abdominale (obésité viscérale), la stéatose et la fribro-inflammation du foie avec le risque de développer un diabète de type-2. L’accumulation anormale de lipides dans le foie va induire un stress inflammatoire provoquant le développement d'une fibrose hépatique. L’état d’inflammation chronique, est considéré comme un facteur important de la détérioration de l’homéostasie glucidique. Il est bien établi aujourd'hui que les macrophages hépatiques (cellules de kupffer) jouent un rôle important dans la mise en place de cette fibrose. Récemment la protéine GPS2 (G-protein pathway suppressor 2) a été identifiée comme un modulateur de l'activation des macrophages dans le contexte du diabèté et de l'obésité́. Son rôle dans l'inflammation hépatique reste cependant énigmatique. Ce projet a pour but de démontrer le rôle de cette protéine dans les processus cellulaires impliqués dans le développement de la fibrose hépatique. Pour ceci, des souris invalidées pour GPS2 spécifiquement dans les macrophages et des souris contrôles subirront différents modéles d’induction de fibrose hépatique (régimes, traitement pharmacologique et chirurgie).

Bénéfices attendus

Nous devrions démontrer l’importance de GPS2 dans un programme transcriptionnel orchestrant les altérations cellulaires et structurales du foie qui favorisent la fibrose hépatique et le développement du diabète de type-2. Ce projet de recherche fondamental a pour objet de définir et d’identifier l’implication du facteur de transcription GPS2 dans les altérations du foie associées au diabète de type-2. A terme, réduire l’activité de GPS2 pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique pour contrôler l’inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type-2.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents régimes (régime riche en graisse HFD, régime déficient en méthionine et en choline MCD, régime gras déficient en choline CD-HFD), à des injections de CCL4, à une procédure chirurgicale de ligature des voies biliaires et enfin à des tests métaboliques. 30 min avant la chirurgie, les souris reçoivent une injection de buprénorphine (0,09mg/mL) en SC. Puis elles sont anesthésiées par isoflurane (5% d’isoflurane et 2L/min d’air) dans une chambre d’induction, puis maintenues sous anesthésie sur une plaque chauffante munie d’un masque d’anesthésie (2,5% d’isoflurane, 0,5L/min d’air et 0,2L/min d’oxygène). Une injection de buprénorphine est réalisée 2 fois par jour le lendemain et le surlendemain de l’opération.

Impact sur les animaux

Les animaux placés sous régimes enrichis en lipides (HFD et CD-HFD) vont prendre du poids tout au long des semaines de régime et vont devenir un peu moins active. Les souris placés sous régime MCD vont perdre du poids, elles seront surveillées de près pour ne pas qu'elles dépassent une perte de poids de 20%. La chirurgie de la ligature des voies biliaires entraine des douleurs chez la souris.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de leur procédure afin de récupèrer différents organes pour phénotyper les altérations fibro-inflammatoires du foie par histologie, cytométrie en flux, expression de gènes…

Remplacement

Afin de prouver l'implication de notre protéine d'intérêt, dans le développement de la fibrose et de l'inflammation hépatique, nous avons utiliser la strégie d'invalidation génique dans des cellules spécifiques comme les macrophages. Pour ceci, nous avons utilisé le systéme "Cre-Lox" chez la souris. Ces souris sont actuellement disponibles. De plus, la souris est un des meilleurs modéles avec le rat dans l'étude de la fibrose hépatique. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. En effet, dans le but de répondre à notre étude du rôle de la protéine GPS2 dans la régulation de voies de signalisation métabolique et inflammatoire, l’utilisation des modèles murins génétiquement modifié est nécessaire. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est de 440. Afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple l’évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline. Avec une période de récupération d’au moins 3 jours entre chaque test, chaque animal sera soumis aux 2 évaluations. Pour chaque condition expérimentale, des groupes de 20 souris seront créés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. De plus, des tests statistiques seront nécessaires pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés et ont un accès ad libitum a la nourriture. Les conditions de température et d'hygromètrie sont controlées et monitorées tous les jours. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du « bien être » des souris, elles bénéficieront de coton et de « maisons » en carton afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance journalière. Pour l'ensemble des procédures, des points limites ont été établis. Des protocoles d'anesthésie et d'analgésie ont été mis en place lorsque cela était nécessaire.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques ont été validés chez la souris. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Les souris utilisées auront entre 8 et 10 semaines au début de chaque procédure.

218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Diabétiques ou non, elles reçoivent des injections de peptides puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des tests métaboliques par incision de la queue, pour évaluer la toxicité et les effets de ces molécules sur le diabète et la stéatose hépatique. Le porteur anticipe une possible perte de poids et une atteinte neurologique liées à l'action des peptides sur le cerveau. Il juge "erronée" la corrélation entre viabilité cellulaire in vitro et humain, et affirme qu'un "système animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

La prévalence de l'obésite, du diabète de type 2 (DT2) et de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a doublé au cours des 20 dernières années et représente dans la région Grand-Est, environ 1/4 de la population. La prise en charge de ces pathologies, appelées syndrome métabolique, est une priorité en santé publique et mérite un intérêt marqué pour la recherche clinique expérimentale. Il convient de noter le succès relativement limité des médicaments biologiques et chimiques disponibles pour traiter l'obésité pathologique et les maladies associées. Dans ce contexte, nous avons identifié des petites molécules appelées peptides dérivés de l'élastine (PDE) qui sont notamment impliquées dans le développement du diabète de type 2. Ces mêmes peptides activent une molécule présente à la surface des cellules que l'on appelle la neuraminidase-1, NEU-1. Le regroupement de deux NEU-1 (processus de dimérisation) permet l'élimination d'acides sialiques (appelée désialylation) présents sur certaines molécules. Par exemple, la désialylation du récepteur de l'insuline (RI) provoque le développement du diabète de type 2 mais également de la stéatose hépatique. Afin de réduire l'impact de la désialylation induite par NEU-1 sur le développement de ces pathologies, nous avons élaboré une stratégie innovante par l'utilisation de peptides interférents (PI). Ils ont été mis au point et testés sur différents types de cellules. En effet, ils diminuent la dimérisation de NEU-1 et le phénomène de désialylation associé. De ce fait, ces PI pourraient empêcher le développement du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. Il nous semble donc crucial de tester ces molécules sur un modèle animal (souris). Une première approche animale a été menée sur un modèle de souris développant des tumeurs de façon importante et spontanée. Une injection unique de ces molécules a été testée lors de cette première étude et une détection de ces dernières 7 jours après injection a été observée au sein des tumeurs. Cependant aucune donnée sur les effets indésirables de ces molécules et de leur temps d'action n'a été évoquée sur modèle animal. C'est pourquoi nous proposons une étude sur le temps d'action, la dose, la fréquence d'injection ainsi que sur la potentielle toxicité de nos molécules (procédure 1 à 3) avant toute investigation thérapeutique comme l'impact de ces molécules sur le développement du syndrome métabolique induit par l'activation de NEU-1 (procédure 4).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra, à court terme et à long terme, d’obtenir des données cruciales pour la suite des expérimentations et permettra une avancée importante dans la recherche translationnelle tant en clinique humaine qu’en clinique vétérinaire. En effet, la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale et sous-optimale des peptides interférents fluorescents à injecter. Par la suite, nous connaîtrons, via la procédure 2, la fréquence d’injection optimale afin d’éviter un potentiel effet cytotoxique des peptides fluorescents injectés de façon chronique. Enfin, grâce à la procédure 3, nous pourrons vérifier si une potentielle intolérance pourrait être observée chez des animaux insulino-résistants et qui seront utiles pour la suite des expérimentations. Enfin la procédure 4 nous permettra d’évaluer les effets biologiques des peptides interférents sur l’insulino-résistance et la NASH développée par l’accumulation de PDE observées chez les sujets vieillissants ou diabétiques. Ces PDE et le CRE qui y est associé, ont été décrits comme des inducteurs de maladies cardio-vasculaires (thromboses, athérosclérose, hypertension artérielle…), métaboliques (NASH, insulino-résistance, fibrose adipeuses…), cancer (sein, mélanome, …), … Si les peptides interférents ont un réel effet sur l’insulino-résistance, alors ces peptides pourraient avoir un impact thérapeutique important sur diverses pathologies dont les traitements sont peu convaincants.

Procédures

Procédure 1 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas deux fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédures 2 et 3 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas une fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement durant toute la durée du traitement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédure 4 : Etape 1 : Aucun prélèvement n’est effectué. Etape 2 : Une incision de 1 mm au niveau de la queue est réalisée afin de recueillir une goutte de sang (

Impact sur les animaux

Nos données préliminaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) sur cellules, n’ont pas montré de modifications sur la prolifération, la viabilité ou la sénescence cellulaire. De ce fait, l’injection de doses raisonnables de peptides interférents (ne dépassant pas 1 mg/kg) ne devrait pas induire d’effets indésirables. Cependant, dans notre cas, il serait possible que ces injections induisent une perte de poids par manque d’appétit. En effet, NEU-1 a été décrit dans le système nerveux central (hippocampe) mais pourrait aussi être exprimé dans d’autres régions comme l’hypothalamus renfermant notamment le centre de la faim. La présence de NEU-1 dans le système nerveux central et l’inhibition de son activité par les peptides interférents pourraient entraîner une atteinte neurologique associée à une modification du comportement.

Devenir

Les animaux de chaque procédure (procédures 1 à 4) seront mis à mort afin de réaliser des études de biodistribution de la fluorescence et de cytotoxicité organe par organe (procédures 1 à 3), ou des études biochimiques/histologiques (procédures 1 à 4).

Remplacement

Le recours aux modèles in vitro a été réalisé en amont de la demande d’autorisation de projet. En effet, des résultats in vitro ont été obtenus concernant l’étude de la viabilité cellulaire de différentes lignées cellulaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) après incubation avec le peptide transmembranaire interférent ou le véhicule seul (micelles de Lithium Dodécyl Sulfate ou LDS qui est un détergent utilisé en biologie). Bien que nous n’ayons observé aucune cytotoxicité de ces peptides et des micelles à 1 µM et 0,1 µM après différents temps d’incubation (10), la corrélation de cette étude de viabilité sur des modèles cellulaires isolés avec l’Homme est erronée d’un point de vue scientifique. Il est donc nécessaire d’étudier la posologie et la potentielle cytotoxicité de ces peptides dans un système animal entier afin d’obtenir des informations clés pour la suite des expérimentations (procédure 1 à 3). En ce qui concerne la procédure 4, à notre connaissance, aucun modèle in silico et in vitro ne peut remplacer un modèle in vivo pour cette application et cette thématique (développement d’un syndrome métabolique, à savoir, l’insulino-résistance et la NASH).

Réduction

Les procédures 1 à 3 ont été réalisées afin de se limiter aux expérimentations jugées absolument indispensables pour la procédure 4. Une réflexion biostastistique (G-Power) a été intégrée à la création de ce projet afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Ainsi la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale à injecter tandis que les procédures 2 et 3 nous permettront de déterminer la fréquence d’injection afin d’atteindre les objectifs fixés dans la procédure 4, tout en garantissant le bien-être animal. L’avantage d'avoir mis au point ces procédures liées est qu'il sera possible et nécessaire d’arrêter le projet si les conditions fixées ne sont pas respectées pour l’ensemble ou l’un des deux sexes, réduisant ainsi le nombre d’animaux. De plus, pour les procédures 1 et 2, nous avons envisagé une prise de sang avant l’injection de peptides interférents afin que chaque individu soit son propre contrôle. En effet, une semaine avant le début des injections, un prélèvement de sang de 100 µL sera effectué pour chaque individu. Ceci permet de réduire le nombre d’individus nécessaire en éliminant un groupe contrôle ne subissant aucune injection. Pour les études de tomographie, un suivi dans le temps est réalisé par individu permettant d’éviter les sacrifices d’animaux aux temps intermédiaires de mesures (1h, 6h, 24h, 3 jours). Pour la procédure 4, comme les informations nécessaires à sa réalisation seront connues (posologie et biodistribution des peptides interférents), le nombre d’animaux sera le nombre minimum nécessaire. De plus, les étapes expérimentales dans cette procédure 4 impliquent de nombreuses méthodologies non invasives, permettant là encore une réduction du nombre d’animaux. Enfin des analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test Mann-Whitney (test non paramétrique) ou de test de rang de type Wilcoxon qui sont adaptés pour l’étude sur un faible nombre d’individus.

Raffinement

Une période de stabulation sera réalisée à l’arrivée des souris, leur permettant de s’acclimater à leur nouvel environnement. La température et l'hygrométrie du local sont relevés quotidiennement. La nourriture et l’eau seront vérifiées tous les jours et disponibles ad libitum. Les cycles jour/nuit de 12h seront respectés. La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de diurèse excessive des souris diabétiques. Les cages aux dimensions réglementaires (30x40cm) présenteront un enrichissement adapté et plusieurs animaux du même sexe y seront hébergées. Lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées (isoflurane 4% pour l’induction et 1,5% pour le maintien) lors de certaines méthodologies (échographie/ tomographie) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention. Cela devrait réduire le stress au minimum. Une vigilance d’autant plus accrue sera déployée à la suite des injections de peptides fluorescents ou de véhicule seul. En effet, un suivi régulier des animaux (au moins deux fois par jour) sera effectué notamment en déterminant, à l’aide d’une grille de score préalablement définie, le bien-être animal (voir document associé). Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de perte ou de gain de la masse corporelle) ou d’une hyperglycémie (supérieur à 600 mg/dl de glucose) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de mise à mort de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases de tomographies, de prélèvements de sang, des anesthésiques généraux ou locaux seront administrés. De plus, les ponctions de sang seront réalisées sous anesthésie générale à la suite de la mesure au FMT afin de réduire le temps de manipulation, le stress et la souffrance des souris. Une grille de score définie (voir en annexe) nous permettra de définir l’état dans lequel se trouvent les individus. Des tests neurocomportementaux (Labyrinthe à 8 branches, Labyrinthe en Croix Surélevé, Open Field) pourront être envisagés pour s'assurer qu'il n'y ait pas d'atteintes neurologiques suite aux traitements.

Choix des espèces

Les maladies métaboliques touchent principalement les adultes. Ainsi, afin de se placer dans les conditions les plus représentatives de ce que l'on peut retrouver chez l'Homme, les souris seront âgées de 8 semaines lors de la réception.

819 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une cryolésion, une brûlure par le froid de degré 4 détruisant le muscle, réalisée sous anesthésie et provoquant une boiterie transitoire, pour étudier le rôle d'une chimiokine dans la réparation musculaire. Le porteur soutient, références à l'appui, que la destruction des terminaisons nerveuses rend la zone insensible, et prévoit un antalgique péri-opératoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne pourrait reproduire la complexité des interactions cellulaires impliquées.

Objectifs

L’objectif du projet est de détailler le rôle des isoformes de CXCL12 dans la stabilité de la microvasculature musculaire à l’homéostasie et dans la réparation musculaire après lésion. La microvasculature à l’homéostasie et les étapes de réparation tissulaire seront étudiées dans des souris de phénotype sauvage, dans des souris dont CXCL12 est dépourvu de tous ses sites de fixation à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gatm) et dans des souris n’exprimant pas CXCL12γ qui est l’isoforme ayant de loin la plus forte affinité à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gamma). Nous avons des souris portant également la mutation Flk1-GFP qui permet de visualiser directement les vaisseaux sanguins en microscopie confocale. Les lésions musculaires seront créées en suivant le protocole de cryolésion décrit dans le projet dont celui-ci prend la suite. A différents temps post-lésions, les muscles seront prélevés après mise à mort des animaux et étudiés par des méthodes standard d’histologie impliquant des colorations de coupes et des immunomarquages des populations cellulaires impliquées. Ces analyses seront complétées par des quantification d’expression, par qPCR, des isoformes de CXCL12.

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre de comprendre de façon plus fine l’implication de CXCL12 dans les processus de réparation musculaire et devraient à plus long terme ouvrir à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de cette chimiokine multifonctionnelle, exprimée dans de nombreux organes et tissus depuis les premières étapes du développement et tout au long de la vie. La très grande similarité entre CXCL12 de souris et CXCL12 humaine (CXCL12 est extrêmement conservée dans l’évolution) est évidemment un atout important dans une perspective translationnelle. Des interventions thérapeutiques ciblées sur un isoforme, dans le cas de processus pathologiques impliquant CXCL12, pourraient permettre de moduler l’action de cette cytokine qu’il est difficile de cibler dans sa totalité du fait de son caractère essentiel.

Procédures

Cryolésion une fois dans leur vie (une intervention réalisée sous anesthésie). L’intervention dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les mutations sur CXCL12 ou sur flk1 n’entraînent aucun phénotype particulier, en particulier aucune altération visible du comportement ou de la fertilité. Chez l’humain les brûlures par le froid (gelures) de degré 3 (atteinte de toute l’épaisseur du derme) et 4 (destruction musculaire) détruisent les terminaisons nerveuses et s’accompagnent d’une perte de sensibilité. Cf les deux sites web ci-dessous : https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/frostbite/symptoms-causes/syc-20372656 (“Deep (severe) frostbite … [that] affects all layers of the skin as well as the tissues that lie below [makes] the skin turns white or blue-gray and you lose all sensation of cold, pain or discomfort in the area.”) http://www.brulures.be/index.php/degres-de-gravite/fr/ (« les atteintes du 3e degré sont indolores du fait de la destruction des terminaisons nerveuses ») La brûlure que nous appliquons aux souris est de degré 4 et donc après cryolésion les terminaisons nerveuses du tissu sont détruites. Nous pouvons en déduire que, par les mêmes mécanismes que chez l’Homme, il y a une perte de sensibilité au niveau de la cryolésion. Les souris seront protégées de la douleur de l’incision cutanée par une anesthésie générale à l’isoflurane, complétée d’un traitement antalgique péri-opératoire. Il est possible que des douleurs apparaissent à la ré-innervation ou du fait de la réaction inflammatoire. Le risque d’infection secondaire qui accompagne les brûlures graves chez l’Homme est ici très faible parce que la brûlure sera protégée par la peau qui, elle, sera intacte (quoique suturée). Du côté lésé, les souris auront une perte transitoire de la fonction musculaire engendrant une boiterie, qui n’empêchera pas les animaux d’accéder à la nourriture dans la grille.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le projet seront euthanasiés.

Remplacement

Nous nous intéressons à la régulation complexe par CXCL12 et ses isoformes d’interactions entre des populations cellulaires différentes (résidentes du tissu et recrutées à partir du sang) permettant la régénération d’un tissu lésé. CXCL12 lui-même peut avoir différentes cibles cellulaires. Aucun système de culture ne pourrait reproduire fidèlement la complexité de l’environnement cellulaire impliqué.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé en comptant 7 animaux par groupe, et en multipliant par le nombre de points d’observation prévus. Le nombre de souris pour chaque groupe a été déterminé sur la base de précédentes expériences. Un effectif de 7 animaux par groupe a été retenu pour permettre de détecter les différences de moyenne attendues entre les deux lignées mutantes, avec une puissance statistique suffisante. Chaque animal fournit un muscle lésé et son contrôle controlatéral, non lésé, et un groupe contrôle présentant le phénotype sauvage est également inclus.

Raffinement

La cryolésion sera réalisée dans le cadre d’une anesthésie gazeuse et d’un traitement antalgique complémentaire. Les animaux seront sur plaque chauffante le temps de l’intervention et des chaufferettes seront utilisées jusqu’au réveil complet. De l’aliment appétent facilement absorbable sera rajouté dans les cages qui seront également enrichies d’un igloo. Les souris seront surveillées quotidiennement par le responsable du protocole à la recherche de signes de complications locales, de douleur ou d’altération de l’état général. Si certains de ces signes apparaissent, des actions adaptées seront mises en oeuvre.

Choix des espèces

Nous travaillons chez la souris car il s’agit d’un petit Mammifère, étudié par de nombreuses unités de recherche (important pour les confrontations avec les résultats antérieurs), pour lequel de nombreux outils existent (anticorps, biologie moléculaire, etc…), génétiquement manipulable, aux temps de génération courts et aux portées nombreuses, permettant d’obtenir rapidement le nombre d’animaux nécessaire pour nos expérimentations. De plus, le CXCL12 murin est homologue à 99% au CXCL12 humain. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes âgés de 6 et 10 semaines. Le choix de cette tranche d’âge résulte des éléments suivants : 1) L’importance de garder les mêmes conditions expérimentales que celles qui ont été utilisées dans une étude antérieure dont celle-ci prendra la suite ; 2) Pour ces deux études, le but est d’étudier des processus de réparation tissulaire et vasculaire à l’âge adulte, sans interférence avec la croissance et la maturation du système immunitaire des premières semaines de vie, ni avec les processus de vieillissement qui surviennent au-delà de quelques mois.