Procédures modérées

264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'un cathéter veineux puis une chirurgie stéréotaxique posant des électrodes ou des fibres optiques dans le cerveau, pour étudier l'addiction à la nicotine, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque d'un fixateur. Le porteur invoque explicitement l'éthique "spéciste" qui interdit ces approches invasives chez l'humain pour justifier le recours au rat. Il conclut que l'addiction, trouble du comportement, ne peut être reproduite ni sur cultures cellulaires ni par modèle in silico.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier les altérations des circuits neuronaux de l’attention dans le développement de l’addiction à la nicotine. Nous avons précédemment montré que des différences dans les capacités attentionnelles des rats prédisent leur prédisposition à développer une addiction à la nicotine. De plus, le développement de l'addiction à la nicotine entraine des modifications de l'activité neuronale du cortex préfrontal (PFC), une structure fortement impliquée dans l’attention. Dans ce projet, nous chercherons tout d’abord à d'identifier les altérations des circuits neuronaux cortico-striataux de l’attention lors du développement de l’addiction à la nicotine (Prodécures 1 et 2). Pour cela, nous mesurerons l’activité des circuits neuronaux lors du d’une tâche attentionnelle avant et après addiction à la nicotine en utilisant des techniques électrophysiologiques (Procédure 1) et photométriques in vivo (Procédure 2). Puis, nous chercherons à modifier l'activité de ces voies neuronales afin de restaurer les capacités attentionnelles et diminuer la consommation de nicotine (Procédure 3) en utilisant des techniques d’optogénétiques in vivo.

Bénéfices attendus

Ces expériences fourniront des informations uniques sur la façon dont l'attention et les processus neuronaux associés aux PFC sont altérés à différents stades de la dépendance à la nicotine et ainsi d'étudier les variabilités individuelles de ces capacités attentionnelles dans la vulnérabilité à développer une addiction à la nicotine. De façon plus générale, ces expériences permettront également une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les capacités attentionnelles et leurs dysfonctionnement.

Procédures

Tous les animaux (n =264) seront tout d'abord soumis à une chirurgie intaveineuse pour l'implantation d'un catthéter intraveineux. Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 30 min. Les animaux seront ensuite soumis à une chirugie stéréotaxique soit pour l'implantation des électrodes pour les enregistrements électrophysiologiques (n = 48), soit pour l'implantation de fibres optiques (n= 168) ou photometriques pour les manipulation optiques ou les enregistrements de photométrie (n = 48). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 1h pour l'implantation des électrodes et 45 min pour l'implantation des fibres.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...).

Devenir

A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier l'emplacement des électrodes (Procédure 1, Exp 1), des fibres photométriques (Procédure 1, Exp 2), et optiques (Procédure 2, Exp 3). Ceci nécessite une fixation du tissu cérébral par perfusion intracardiaque d’un agent fixant (formaldéhyde, 3,6%) des animaux des expériences 1, 2 et 3. Cette procédure est réalisée sous analgésie (carprofène, dose 5 mg/kg, s.c., 15 min avant) et anesthésie profonde (mélange de kétamine 110 mg/kg et de xylazine 15 mg/kg, i.v.) afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Un effectif de 14 rats par groupe est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 11-12 individus. Etant donné que le pourcentage d’attrition est estimé à 20% en fin d’expérience, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 14 rats. Enfin, les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques, principalement des analyses de variance, avec comparaisons inter-groupes et mesures répétées, suivies de tests a posteriori (HSD Tuckey). Le seuil de significativité statistique sera fixé à p < 0.05.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, dose 5mg/kg, sous-cutanée, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie chimique (Kétamine 110mg/kg +Xylazine 15mg/kg, intrapéritonéale) ou gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min-1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection intraveineuse d'antibiotique (0.2ml) ainsi qu’une injection sous-cutanée de NaCl, pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (i.e., remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant une période de récupération de 7-10 jours durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h/jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces critères incluent une perte excessive de poids, une diminution de la température corporelle, une dégradation de l’apparence physique (manque de soin, pelage sale) et une altération anormale du comportement (hyper ou hypoactivité, agressivité défensive, repli sur soi), ces performances comportementales. Ces manifestations éventuelles sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière [3 fois par semaine]). Si une perte de poids corporel supérieure à 20% est observée en 48 heures, l'animal sera alors mis à mort, sachant que dans tous les cas, il y a aussi d’autres points limites listés ci-dessus qui sont atteints (cf. méthodes de mise à mort). Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 MYA) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées (e.g., C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la nicotine mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro ou in silico. Chez l'Homme, les troubles de l'attention sont une pathologie qui se manifeste tôt dans la vie d'un individu et qui a des répercussions importantes tout au long de la vie adule de l'individu. Dans ce projet, les animaux utilisés seront de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité au développement de troubles attentionnels et à l'addiction aux drogues.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de molécules puis une chirurgie exposant le muscle tibial pour l'imagerie, la quasi-totalité étant tuée avant tout réveil et quelques-unes gardées une journée avant mise à mort. Le projet vise à visualiser la restauration de la dystrophine, protéine absente dans la myopathie de Duchenne. Le porteur affirme que la pharmacocinétique de la protéine restaurée ne peut être évaluée sans imagerie intravitale sur animal, "seul moyen" selon lui de visualiser cette dynamique in vivo.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), maladie musculaire héréditaire et fatale la plus fréquente chez l’enfant, est causée par des mutations dans le gène codant la dystrophine et menant à un manque d’expression de cette protéine indispensable au maintien de l’architecture de la fibre musculaire. La dystrophine est exprimée dans les fibres musculaires, tout au long du sarcolemme mais elle est exprimée dans d’autres compartiments que sont les jonctions myotendineuses et neuromusculaires de la fibre ainsi qu’au niveau de la niche des cellules souches musculaires. Nous développons au laboratoire trois types d’outils thérapeutiques pour restaurer l’expression de la dystrophine en interférant au niveau ADN ou ARN. Jusqu’alors la recherche sur la dynamique d’expression et de restauration d’expression de cette protéine était entravée par l’absence d’un modèle animal permettant l’imagerie directe in vivo de la dystrophine dans des conditions normales ou pathologiques dans ces différents compartiments d’expression. Nous avons créé au laboratoire plusieurs lignées murines transgéniques saines et pathologiques. Ces lignées vont nous permettre maintenant d’atteindre plusieurs objectifs : Objectif 1 : Etudier in vivo la stabilité et le turnover de la dystrophine sauvage ou restaurée Objectif 2 : Etudier in vivo la pharmacodynamique de la restauration de l’expression de la dystrophine dans les différents compartiments de son expression par le biais des approches thérapeutiques développées au laboratoire.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet doivent permettre i) de connaître la stabilité de la protéine dystrophine dans la situation contrôle/sain et la situation de protéine restaurée suite au traitement du modèle pathologique, ii) d’affirmer (ou infirmer) que les cellules souches musculaires sont un site cible pour la restauration de la dystrophine dans le contexte pathologique, iii) d’étudier la pharmacocinétique de la restauration de l’expression de la dystrophine dans ses différents sites d’expression en comparant différentes approches thérapeutiques (ciblant l’ADN ou l’ARN). A terme, ces résultats amélioreraient la compréhension de l’expression de la dystrophine manquante aux patients atteints de DMD et permettraient d’améliorer ou prédire les effets des thérapies pour cette maladie.

Procédures

Dans cette étude, les animaux des lots traités seront soumis à des injections intra-veineuses (une injection par semaine, entre une et quatre semaines, durée 1 minute avec la contention) ou une injection unique intra-musculaire (durée 30 secondes avec la contention), suivi d’une procédure chirurgicale pour l’imagerie intravitale sans réveil sauf pour un petit nombre d’animaux qui seront gardés au plus une journée après la chirurgie. La procédure chirurgicale décrite ici sera conduite sur animal anesthésié àl 'isoflurane. Un anesthésique local sera injectée en sous-cutanée avant incision des couches derme-épiderme pour exposition du muscle tibial antérieur nécessaire à l'imagerie. Cette procédure sera conduite pour tous les animaux du projet. Cette procédure ne sera conduite qu'une seule fois par animal. La quasi-totalité des animaux sera euthanasiée à la fin de la séance d'imagerie avant réveil et les muscles seront prélevés post-mortem. Un très faible nombre d'animaux sera réveillé pour être gardé une journée supplémentaire. Dans ce cas, un antidouleur sera injecté en sous-cutanée avant réveil. A J+1, les animaux seront euthanasiés avant prélèvement des muscles et isolement des fibres.

Impact sur les animaux

Notre recul sur les procédures in vivo nous a démontré qu’il n’y a aucun effet secondaire après administration des traitements envisagés dans ce projet. Par ailleurs, toutes les souris sont euthanasiées avant réveil immédiatement après la séance d’imagerie. Seuls certains animaux seront réveillés après l’imagerie. Des pertes de mobilité peuvent être attendues pour ces animaux après leur réveil dus aux points de suture au niveau du muscle tibial. Toutefois, un antidouleur sera administrée par injection sous-cutanée pour limiter la douleur. Du gel diet sera déposé dans la cage afin de faciliter leur récupération et nutrition tout en sachant que ces animaux ne seront maintenus en vie que pour une journée supplémentaire.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélévement et analyse des tissus musculaires.

Remplacement

L’efficacité des molécules thérapeutiques développées au laboratoire a été évaluée dans un 1er temps in vitro pour ne retenir que celles ayant démontré une efficacité moléculaire et tissulaire in vivo, avec un profil toxicologique satisfaisant. Toutefois, leur pharmacocinétique ne peut être correctement évaluée sans essai en imagerie intravitale sur modèles animaux, seul moyen de réellement visualiser la dynamique de l’expression et adressage de la protéine restaurée dans des conditions physiologiques.

Réduction

Les modèles murins utilisés ont des phénotypes peu ou pas dommageable. L’objectif de ce projet de recherche vise d’une part à étudier la pharmacocinétique des molécules thérapeutiques permettant de restaurer l’expression d’une protéine absente, et par conséquent d’améliorer le phénotype pathologique des animaux, et d’autre part d’avoir une meilleure compréhension de l’expression de cette protéine dans le muscle et au niveau des cellules souches musculaires in vivo. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini en fonction de notre expérience passée sur fibres isolées.

Raffinement

Les animaux seront traités avec des analgésiques pour limiter la douleur pendant la chirurgie et l’imagerie in vivo. Tous les animaux seront sacrifiés après l’imagerie avant leur réveil sauf si un prélèvement de fibres musculaires est jugé utile. Dans ce cas précis, les souris seront recousues au niveau du muscle exposé, réveillées puis gardées une journée supplémentaire avec nouvelle administration d’analgésique.

Choix des espèces

Les modèles murins mdx sont les modèles couramment utilisés pour l’évaluation préclinique de molécules thérapeutiques pour la DMD car eux seuls reproduisent le défaut génétique observé chez les patients, à savoir une mutation dans le gène DMD invalidant la production de protéine fonctionnelle en conditions physiopathologiques. Ainsi, nos lignées transgéniques nous permettront de suivre par fluorescence la protéine dystrophine couplée à l’EGFP, endogène dans le cas d’une souris normale (DmdEGFP) ou la protéine restaurée suite au traitement dans le cas de la souris portant la mutation mdx. D’autres lignées murines nous permettront aussi, grâce au système Cre/Lox, d’induire l’expression du fluorophore tdTomato uniquement dans les cellules souches musculaires.

45 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés vivants ensuite pour une éventuelle réutilisation ou un placement. Leur peau est lésée avec un adhésif puis exposée à un allergène pour déclencher une dermatite de contact, avec jusqu'à huit biopsies cutanées par animal sous anesthésie locale, dans le but de tester des traitements de la dermatite atopique canine. Le porteur héberge une partie des chiens en cage individuelle quelques jours et revendique un modèle applicable "rapidement sur le terrain". Il affirme que la maladie met en jeu des réactions impossibles à reproduire sur peau artificielle et justifie le recours à l'animal par l'observation des effets sur un "organisme entier".

Objectifs

dermatite de contact est une maladie inflammatoire qui représente 1 à 10% des maladies de peau chez le chien. C’est une maladie qui est responsable d’abandons ou euthanasies. Une molécule étrangère traverse la peau et entre en contact avec les cellules de Langerhans. Ces cellules, après avoir phagocyté la molécule, vont présenter l’antigène aux lymphocytes T helper. Ces lymphocytes T activés produisent des interleukines qui induisent la prolifération des lymphocytes T spécifiques, effecteurs et mémoires, qui circulent alors dans tout le corps. Lors d’un second contact avec la molécule étrangère, les cellules de Langerhans activent les lymphocytes T se trouvant au point d’entrée de la molécule étrangère ce qui déclenche l’inflammation. L’objectif de ce projet consiste à : - Induire plusieurs modèles de dermatite de contact par allergie à un allergène chez le chien - Evaluer l’allergie de contact par un ensemble de critères afin de mieux comprendre l’allergie et de pouvoir la caractériser d’un point de vue physiologique et clinique. - Evaluer différents traitements innovants

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet de disposer d'un modèle pour étudier des médicaments de traitement de la dermatite atopique du chien.

Procédures

Nous réalisons une application d'un allergène sur la peau après avoir lésé la peau avec un adhésif type scotch. Ensuite, une fois le chien sensibilité, nous appliquons à nouveau l'allergène sur la peau lésée en un autre endroit et évaluon la réactions allergique locale. Pour suivre la réactions cutantée nous réalisons des biopsies cutanées de 6-8mm à raison d'un maximum de 8 biopsiées sur la totalité du protocole par chien, sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour le chiens sont : l'hébergement temporairement en cage individuelle, mais limité à quelques jours suivant l'application des haptènes, ainsi que les biopsies cutanées sous anesthésie locale (maximum de 8 biopsies par procédures)

Devenir

0Les chiens sont conservés pour une éventuelle réutilisation ou ils pourront ensuite être placés.

Remplacement

La dermatite de contact par allergie est une affection complexe. Cette maladie met en jeu des réactions locales et systémiques qui ne peuvent être reproduites sur peau artificielle ou par toute autre technique de substitution. Il est, donc, nécessaire, pour la mise en place et l’évaluation de traitements innovants, de disposer d’un modèle animal en vu d’un traitement chez le chien, voire chez l’homme. Le fait d’utiliser des animaux permet d’observer les effets de la maladie sur un organisme entier.

Réduction

Nous utiisons le nombre minimum nécessaire de chiens pour avoir des indications applicables rapidement sur le terrain. Avec 4 à 5 animaux par haptène et par traitement, nous pouvons orienter le choix d'un traitement.

Raffinement

La procédure est peu invasive. Les contraintes sontlimitées. La plupart du temps, les chiens sont hébergés en groupes sociaux, avec un enrichissement adapté et l'accès à l'extérieur. Les procédures sont réalisées par des vétérinaires spécialisés en dermatologie. L'hébergement et les soins quotidiens sont assurés par une équipe formée au suivi des chiens et à la détection des signes d'inconfort. Les chiens peuvent ensuite être réutilisés voire placés.

Choix des espèces

Le chien est la seul espèce animale qui présente une dermatite de contact aux protéines semblable à celle de l’homme sur le plan clinique et pathogénique. C’est également une maladie fréquente avec des formes graves. L’utilisation de chiens permettra, d’une part, d’approfondir les connaissances sur la dermatite de contact et ainsi de pourvoir explorer le rôle de l’allergène dans le déclenchement ou l’aggravation de la maladie et, d’autre part, de tester un traitement basé sur l’application de micro ou nanoparticules. Adultes, car l'étude de l'allergie nécessite un système immunitaire mature.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses pour développer des cancers disséminés, puis des séances d'imagerie sous anesthésie, afin de mettre au point des agents de diagnostic des métastases. Le porteur décrit une perte de poids et des signes de mal-être suivis par une grille, l'animal étant tué dès un score supérieur à 6, les autres tués pour prélever les tumeurs. Les retombées annoncées pour les patients relèvent d'une médecine personnalisée future, l'imagerie étant présentée comme réduisant le nombre d'animaux par rapport à une étude classique.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. La mortalité des patients atteints de cancer est aujourd’hui principalement médiée par l’évolution des tumeurs primaires en maladies systémiques par l’apparition de métastases. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est d’abord de mettre en place des modèles de cancers disséminés mimant l’envahissement systémique des métastases, puis de développer de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer la réponse aux traitements anti-cancéreux et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira au développement d’agents d’imagerie non invasifs permettant le diagnostic et le suivi des métastases issues de divers cancer. Ces agents permettront une meilleure prise en charge des patients et sera un pas de plus vers la médecine personnalisée en oncologie. De plus, ce projet permettra l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre l’apparition de métastases au cours du développement tumoral.

Procédures

Les animaux subiront des injections de cellules par voie IP ou IV. Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie IP, IV ou oral (gavage). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (PET/SPECT/fluorescence/bioluminescence).

Impact sur les animaux

Le développement de modèles animaux de cancer disséminés est susceptible d’induire chez les animaux des signes cliniques tels qu’une perte de poids ou des signes de mal être qui seront très étroitement suivis tout au long des procédures du projet afin de mettre à mort les animaux dès l’apparition de ces signes cliniques indésirables comme décrit dans le tableau 1 en annexe. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera mis à mort. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement et l'analyse des tumeurs.

Remplacement

La mise en place de ce projet s’est attachée à respecter la règle des 3R. L’étude préalable des molécules d’intérêt sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée.

Réduction

En comparaison avec une étude « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant d’obtenir des données anatomiques et fonctionnelles quantifiables se substituant à des méthodes de prélèvements plus traumatiques pour l’animal. La totalité des procédures impliquant les animaux (injection sous-cutanée, intraveineuse et imagerie) est réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Les murins de type souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie moléculaire eux-mêmes très proches des appareillages humains (SPECT, TEP, IRM et fluorescence), facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette demande ne couvre que la partie élevage d'un projet sur la sclérose latérale amyotrophique, les animaux ne subissant pas d'intervention active mais développant les altérations motrices de la maladie, suivies par une grille de score. Le porteur indique que le phénotype lui-même est dommageable et surveille de près la moitié des animaux. Le bénéfice avancé est une meilleure compréhension d'une maladie mortelle chez l'humain.

Objectifs

Cette DAP ne couvrira que la partie élevage du projet. La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homeostasie corporelle. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones cholinergiques qui sont moléculairement extremement proches des neurones qui commandent les muscles striés: les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caracterisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et au décès des patients par insuffissance respiratoire. Les causes précises de la degenerescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette degenerescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau de son partenaire synaptique: le muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du controle vasculaire et nerveux des muscles à la degenerescence des MNs. L' objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoses (avant l'apparition des symptomes moteurs) de la regulation sympathique sur un modele murin de la SLA, la souris SOD1 G93A.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la SLA. La maladie se déclare à l’âge adulte chez l'humain (40- 80 ans) et va évoluer, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient par paralysie des muscles respiratoires. Il est donc important pour les patients qu'on avance sur la connaissance de cette maladie (cause, détection de signes précoses, traitements, etc.)

Procédures

Les animaux ne subiront aucune procédure. Seul le phénotype sera dommageable et donc suivi dans le temps grâce à une feuille de scoring. L'ensemble des animaux du projet seront concernés (n=80)

Impact sur les animaux

La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude)

Devenir

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immunohistologiques.

Remplacement

le nombre d'animaux choisit pour l'étude est le minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiques fiables. Il est important de ne faire ni trop, ni trop peu afin de ne pas avoir à refaire l'ensemble de l'expérimentation. Ce nombre a été choisit sur la base de d'expériences précedentes du laboratoire et de la bibliographie dans ce domaine. Les tests utilisés seront d'abord un test de normalité afin de savoir si les courbes des données recueillies suivent la loi normale. En fonction, des tests paramétriques ou non seront faits afin de comparer nos lots.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations dans notre laboratoire sont faites ex vivo, sur cellules vivantes. Cela a permis d'obtenir un certain nombre de données en évitant toute souffrance animale. Toutefois, dans certains cas, il est indispensable de travailler dans un système intégré comme un organisme complet. Ainsi, il n'est, dans notre cas, pas possible de reproduire les modifications de commande nerveuse sympathique dans une modèle de maladie, avec uniquement des systèmes ex-vivo. Pour le traitement des données, nous utiliserons des tests ANOVA one and two ways.

Raffinement

Les individus porteurs de la mutation seront suivis régulierement. Un scoring sera fait toutes les semaines à partir de P60 puis tous les 3 jours à partir de P90. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé inutilement afin de préserver le caractère grégaire de la souris.

Choix des espèces

La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les mâles reproducteurs seront mis en accouplement dès 7 semaines à la descente des testicules. Les stades de prélèvements sont ceux habituellement utilisés dans la littérature pour l'évaluation de la SLA sur ce modele murin.