Procédures sans réveil
Identification d’une nouvelle piste thérapeutique dans l’atteinte pulmonaire de la sclérodermie systémique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Abordées chirurgicalement sous anesthésie générale pour recevoir de la bléomycine directement dans la trachée, 228 souris vont être utilisées, 20 tuées avant tout réveil et 208 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à J14 pour analyse des poumons, après cinq séances d'imagerie par tomographie de trente minutes. La fibrose ainsi provoquée sert à tester si une protéine, CD146, peut devenir une cible thérapeutique dans la sclérodermie systémique. Le porteur décrit une douleur et une perte de poids possibles après la chirurgie, et annonce vouloir mettre au point une instillation non chirurgicale pour "limiter la morbimortalité des souris", reconnaissant ainsi que la technique employée aujourd'hui en tue une partie.
Objectifs
La sclérodermie systémique (ScS) est une pathologie auto-immune caractérisée par une mauvaise fonction des petits vaisseaux sanguins responsables d’une inflammation cutanée et fréquemment pulmonaire. L’atteinte pulmonaire, appelée fibrose, est responsable d'une toux et essoufflement handicapant des patients pouvant aboutir au décès. Cette atteinte représente la principale cause de décès et son mécanisme reste mal connu. CD146 une protéine impliquée dans la formation des vaisseaux été récemment identifiée comme une nouvelle piste thérapeutique dans la ScS. Nous avons montré dans l’atteinte cutanée chez l’humain et dans un modèle de sclérodermie cutanée induite par la bléomycine (agent profibrosant), que CD146 était impliqué. Ces résultats nous conduisent aujourd’hui à poser l’hypothèse du rôle de CD146 dans la fibrose pulmonaire sclérodermique et d’en étudier le mécanisme. Pour cela nous comparerons le développement d’une fibrose pulmonaire induite par la bléomycine entre des souris saines et des souris pour lesquelles le gêne CD146 a été inactivé. Nous étudierons les mécanismes impliqués et évaluerons l’efficacité d’un traitement par CD146 afin de prévenir ou diminuer la fibrose pulmonaire. Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la fibrose pulmonaire de la ScS et de proposer CD146 comme nouvelle piste thérapeutique pour le traitement des patients.
Bénéfices attendus
L‘évaluation du rôle de la protéine CD146, une protéine impliquée dans la formation des vaisseaux, dans notre modèle murin de fibrose pulmonaire permettra d’approfondir les connaissances dans le domaine de la fibrose pulmonaire de la sclérodermie systémique. La mise en évidence d’une telle voie physiopathologique et d’un tel marqueur permettra d’obtenir un outil d’évaluation et pronostic simple pour les patients atteints de sclérodermie avec fibrose pulmonaire mais surtout de développer des thérapeutiques ciblées sur CD146 dans cette population à haut risque de mortalité.
Procédures
Les animaux seront soumis à une instillation intratrachéale, qui dure 10 minutes, de bléomycine (un agent profibrosant) ou sérum physiologique sous anesthésie générale par voie chirurgicale. Nous tenterons également de mettre au point un modèle par instillation par voie non chirurgicale afin de limiter la morbimortalité des souris. Les animaux auront une imagerie, qui dure 30 minutes,par tomographie par emission de positons à J-1 , J0, J3, J7 et J14 sous anesthésie générale. A J14, les animaux seront euthanasiés après anesthésie générale pour analyse des poumons
Impact sur les animaux
Du fait de l’instillation intratrachéale d'un agent profibrosant, une douleur et une perte de poids pourront suivre la chirurgie. Une surveillance particulière sera réalisée. Le protocole sera arrêté si l'animal présente des difficultés à respirer, s'il est prostré ou si la perte de poids de l'animal est supérieure ou égale à 20%. Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir. Au moyen de cette grille, nous déterminerons un score régulièrement (3 fois/semaine). Ainsi, selon le score obtenu, l'analgésie peut- etre effectuée (score 4 à 9). Si le score est élevé (10 à 20) : l’arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal sera immédiate.Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse histologique des tissus.
Remplacement
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux. Malgré les stratégies de remplacement mises en place dans le projet, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique. Par ailleurs, les animaux génétiquement modifiés (souris transgéniques et knockouts) représentent un atout majeur pour l’obtention de résultats les plus pertinents relatifs à la compréhension des maladies humaines. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physio-pathologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux en fonction des données disponibles dans littérature. L’objectif sera d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence une différence entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre tout en réduisant le nombre d’animaux au minimum nécessaire. Un dernier lot d’animaux sera nécessaire afin d’optimiser la procédure et limiter la souffrance. Le protocole initial et tel qu’il est décrit dans la littérature consiste en une instillation intra-trachéale par voie chirurgicale. Au cours de l’étude nous nous efforcerons de mettre en place une technique non chirurgicale par intubation en passant par les voies naturelles. Cela limitera la mortalité mais aussi la morbidité liée à la douleur tout en garantissant une technique d’induction aussi efficace. Afin de limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale les données obtenues sur chaque animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Raffinement
L'induction trachéale s'effectue sous anesthésie des souris à la kétamine/xylazine par voie intra-péritonéale, avec injection de buprénorphine 30 minutes avant l'incision et d'une anesthésie locale de la souris par injection sous-cutanée de lidocaïne 5%. Du fait de l’instillation intratrachéale de bléomycine, une douleur et une perte de poids pourront suivre la chirurgie. Une surveillance particulière quotidienne sera réalisée. Le protocole sera arrêté si l'animal présente des difficultés à respirer, s'il est prostré ou si la perte de poids de l'animal est supérieure ou égale à 20%. Au moyen de la grille d'évaluation de la douleur, nous déterminerons un score régulièrement (3 fois/semaine). Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir. Ainsi, selon le score obtenu, l'analgésie peut- etre effectuée (score 4 à 9) par administration de buprénorphine .Nous nous efforcerons de mettre au point une technique non invasive par instillation à travers une sonde d’intubation oro-trachéale. Ainsi aucune douleur et gêne ne pourra être attribuée à l’induction, limitant ainsi la douleur et les décès pour la procédure.
Choix des espèces
Les souris utilisées seront des souris mâles et femelles C57bl/6. Nous utiliserons ces souris car c’est l’espèce de souris la plus utilisée dans la littérature pour le modèle murin de fibrose pulmonaire induit par bléomycine. En effet les thérapeutiques disponibles actuellement ont été évaluées sur un modèle murin de fibrose pulmonaire. L’utilisation de cette espèce nous garantit donc des résultats analysables et extrapolables aux données déjà disponibles dans la littérature. Les souris seront à un stade adulte, elles auront ainsi entre 8 et 12 semaines lors de l’induction, cet âge est celui utilisé dans la littérature pour l’induction de fibrose pulmonaire.
Effet du stress prénatal sur le développement et la fonction des mécanorécepteurs à bas seuil d’activation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
222 souris gestantes sont immobilisées sous une lumière vive, trois fois par jour, trente minutes par séance, six jours de suite. 4 002 souris vont être utilisées, 2 304 dans des procédures menées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 698 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec prélèvement de fœtus à E15 et E18,5 puis mise à mort des souriceaux à plusieurs âges. La plupart des souris de la première génération sont tuées pour prélever les organes, les géniteurs non stressés étant proposés à d'autres équipes puis tués si personne ne les reprend, le tout pour mesurer l'effet du stress maternel sur les neurones du toucher affectif. 1 008 souris passent des tests d'anxiété, d'état dépressif et de sensibilité mécanique qualifiés de non invasifs, sans qu'aucun soit nommé, celui de l'état dépressif durant trois heures.
Objectifs
Le toucher est un sens qui comprend non seulement la perception tactile de son environnement, mais également une composante émotionnelle et motivationnelle appelée toucher affectif. Cette composante est notamment très importante pour le développement social des individus. Dans la peau, cette composante émotionnelle de l'information tactile est dépendante de l'activation d'une population de neurones sensitifs spécialisée appelée les fibres C mécanoréceptrices à bas seuil d'activation ou C-LTMRs. Chez l'homme une altération de ce toucher affectif peut aboutir à des comportement d'isolement social (trouble du spectre autistique) associés à des états anxieux et/ou dépressifs. Il a été montré chez la souris que l'activation spécifiques des C-LTMRs est suffisante pour engendrer une augmentation des interactions sociales. Le développement des C-LTMRs intervient chez la souris entre le jour embryonnaire E13, où les précurseurs neuronaux commencent à se différencier, pour se poursuivre jusqu'à plusieurs jours après la naissance. La période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris le système nerveux, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence chez la souris qu’un stress prénatal (c'est à dire subit par la mère durant la gestation) entraine à la fois une hypersensibilité mécanique, mais aussi une modification transcriptomique profonde dans les neurones sensitifs, notamment de gènes spécifiques des C-LTMRs. Nous émettons donc l'hypothèse que le stress prénatal pourrait induire une perturbation du développement des cLTMRs chez la descendance, et donc perturber le sens du toucher et donc le développement des interactions sociales chez les souris nées de mères stressées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de possiblement mettre en évidence l'effet du stress prénatal sur la susceptibilité des individus à développer des troubles du comportement anxieux/dépressif, ainsi que des troubles du comportement social. Il explorera également pour la première fois les mécanismes biologiques sous-jacents, en se concentrant sur le développement des neurones sensoriels périphériques, notamment les c-LTMRs. Il apportera donc des informations cruciales sur les effets du stress subit par la mère durant sa grossesse sur le développement des organes sensoriels de l'enfant, et sur le remodelage des comportements qui pourraient en découler.
Procédures
Procédure 1 : Modèle de stress prénatal Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour, 30 minutes par session, sur 6 jours consécutifs (222 animaux) . Procédure 2, 5 et 6 : Les animaux subiront des tests comportementaux (1008 animaux) non invasifs visant à évaluer l'état d'anxiété (durée des tests, 10 minutes et 30 minutes), l'état dépressif (durée du test, 3h) , et la sensibilité mécanique (stimulation de 1s maximum). Procédure 5 : les nouveaux nés seront injectés sous anesthésie par le froid et par voie intrapéritonéale (durée de l'injection, 3 secondes maximum) . A l’âge adulte ils seront injectés par voie intrapéritonéale (576 animaux). Procédure 6 : Les souris seront injectées en intra-péritonéal (durée de l'injection, 2 secondes maximum) avant chaque session de stress, voire trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs (36 animaux)
Impact sur les animaux
Dans le projet proposé, les souris subiront des tests pas ou peu invasifs. Bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberaient le comportement soit de la mère stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà fait en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle, les souris seront accompagnées et suivies et observées régulièrement (au moins une fois par jour), pour détecter la présence de comportements anormaux (prostration, isolement, absence de nettoyage). L'injection de l'inhibiteur de corticosterone sera également contrôlée (fréquence, dose, etc.) d’autant que la corticostérone joue un rôle clé durant la gestation. Nous utiliserons des doses déjà validées dans la littérature et suivront attentivement l'état des souris et souriceaux.
Devenir
La plupart des animaux de la 1ère génération (F1) sera euthanasiée à l'issu des procédures, pour récupérer les organes d'intérêt. Les souris mâles, et femelles non stressées ayant servi de géniteurs seront proposés à la communauté, et euthanasié si non utilisés.
Remplacement
Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut remplacer l'usage d'animaux pour investiguer cette thématique. La substitution par l'humain n'est pas évidente, étant donné d’une part que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des neurones sensoriels de foetus ou de mamans durant la gestation n'est pas possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le développement des neurones sensoriels et sur les comportements associés.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal (protocoles éthiques obtenus précédemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 12 mères par groupe, par génotype, réparties entre contrôle et stress. Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2 mâles / 3 femelles . Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées, . L’utilisation de vecteur viraux pour permettre l’expression de gènes d’intérêt dans les souris permettra également d’éviter le recours à des lignées de souris transgéniques supplémentaires.
Raffinement
Jusqu'à présent, le taux de mortalité lors des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Lors de la mise en place des procédures expérimentales, l’état clinique des animaux sera monitoré tous les jours. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, les souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Lors du suivi quotidien des souris, nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels qu’un comportement anormal (mouvement stéréotypés, isolement du groupe), la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Nous examinerons également la présence de problèmes visibles (plaies cutanées étendues, dents longues, prolapsus anal). Si nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien un comportement apathique, des plaies trop importantes ou la présence de dents longues ou de prolapsus, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des C-LTMRS et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intérêt mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: Jour embryonnaire (E) 13 à E18 : Cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Cette période correspond également à la période de développement des neurones Jour embryonnaire E15, E18,5: Les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélevés, euthanasiés et analysés pour nos études, pour évaluer l’impact du stress sur la différenciation neuronale in utero. Jour post-natal P0, P5, P21 et P56 : Les souriceaux ou souris adultes de premieère génération seront euthanasiées à ces différents temps pour étudier l’impact du stress sur la maturation des neurones cLTMRs innervant la peau qui se déroule durant cette periode (P0 à P21) puis à l’age de jeune adulte (P56) .
Etude de l’impact de mutations Nr2f1 sur le développement du cerveau et des yeux chez des modèles de souris du syndrome d’atrophie optique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les femelles gestantes porteuses d'embryons mutés sur leurs deux copies du gène Nr2f1 sont tuées avant la mise bas, faute de savoir, pour deux des trois lignées, si les souriceaux survivraient. 2 214 souris vont être utilisées, 600 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 554 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 un niveau léger. Il s'agit de comprendre comment des mutations du gène NR2F1 perturbent le développement du cerveau et des yeux dans le syndrome d'atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf, en injectant des traceurs fluorescents dans le cerveau ou dans l'œil des animaux, puis en les tuant dix jours après pour analyser leurs tissus. 60 souris sont transférées vers d'autres procédures, les autres tuées pour prélever cerveau, œil et gonades.
Objectifs
Le syndrome d’atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est une maladie génétique qui touche le développement du cerveau et des yeux. Les personnes atteintes de ce syndrome rencontrent des problèmes de vue ainsi que des difficultés d'apprentissage, parfois associées à un retard cognitif. Cette maladie est causée par des variations dans un gène spécifique appelé NR2F1. Ces variations, appelées mutations, perturbent le fonctionnement normal du gène et peuvent entraîner des anomalies dans le développement du système nerveux central. Pour mieux comprendre comment ces mutations génétiques conduisent à la maladie, nous utilisons des modèles de souris génétiquement modifiées. Ces souris possèdent des mutations similaires à celles observées chez les patients atteints de BBSOAS. En étudiant ces modèles animaux, nous pourrons observer les effets des mutations sur le développement du cerveau et des yeux. Les objectifs principaux de ce projet sont de : 1. Identifier comment chaque mutation du gène NR2F1 contribue aux défauts observés dans le développement du système nerveux central. Certaines mutations pourraient affecter certaines parties du cerveau plus que d'autres, ce qui pourrait expliquer les variations de symptômes observées chez les patients. 2. Déterminer quelles cellules du système nerveux central sont impactées par les différentes mutations. Comprendre quelles régions du cerveau sont affectées et quelles cellules sont impliquées peut aider à mieux cibler les recherches sur de nouveaux traitements. 3. Comprendre comment ces mutations altèrent les mécanismes du développement du système nerveux central. Comprendre ces mécanismes peut fournir des informations cruciales sur les processus biologiques perturbés dans la maladie et aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à la maladie et en identifiant les cellules et les processus biologiques impliqués, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements et thérapies pour améliorer la prise en charge des personnes atteintes de BBSOAS.
Bénéfices attendus
De précédentes études ont déjà révélées des similitudes entre un modèle de souris et les jeunes patients atteints du BBSOAS, notamment une atrophie du nerf optique, des problèmes de myélinisation (l'enveloppe protectrice des nerfs) et des défauts dans la prolifération et la différenciation de certains types de cellules du cerveau. Pour approfondir notre compréhension de cette maladie, nous utilisons plusieurs modèles de souris ayant différentes mutations du gène NR2F1, similaires à celles observées chez les patients. Ces mutations ont été choisies pour représenter la diversité des altérations génétiques observées chez les patients. En étudiant ces modèles, nous pourrons examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les symptômes spécifiques liés à chaque mutation. À moyen terme, cette approche devrait nous permettre de mieux anticiper les symptômes chez les jeunes patients en fonction de leur mutation génétique, ce qui pourrait améliorer leur prise en charge précoce. À long terme, nous espérons identifier des cibles thérapeutiques pour contrer les effets néfastes des mutations sur le développement du cerveau et des yeux, afin d'améliorer les soins et le bien-être des jeunes patients.
Procédures
Afin de suivre le comportement des cellules dans le cerveau et les yeux à différents stades de développement post natal, nous injecterons des traceurs fluorescent dans le cerveau ou les yeux des animaux. Ces interventions ne dépasseront pas 15 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale. Après la chirurgie, les animaux recevront une injection sous cutanée d’antalgique et d’antibiotique répétée toutes les 24h sur 3 jours. Chaque animal ne subira qu’une seule injection et sera sacrifié 10 jours après pour analyser ses tissus. Pour suivre la prolifération cellulaire nous injecterons des nucléotides modifiés à différents stades de développement. L’injection unique, réalisée sur animal vigile sous contention, durera moins d’une minute. Si aucun signe de douleur ou d’inconfort n’est constaté dans les 15 minutes post injection, les animaux seront euthanasiés entre 2 et 24h après l’injection pour analyser leurs tissus.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, nous utiliserons 3 lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1, similaires à celles trouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique. Pour la première lignée, dont la mutation entraîne la perte d’expression de Nr2f1, l'absence de phénotype dommageable chez les souris porteuses de cette mutation sur une seule des deux copies du gène (souris hétérozygotes) a été montré par de précédentes études. Pour les deux autres lignées étudiées, l'absence de phénotype dommageable chez les souris hétérozygotes est attestée par ceux ayant généré ces lignées. Nous savons, pour la première lignée, que l’absence totale de Nr2f1 (mutation présente sur les deux copies du gène) entraîne la mort des souris dans les 7 premiers jours de vie, mais aucune information n'est disponible pour les deux autres mutations étudiées. Par mesure de précaution, nous ne ferons naitre aucune souris portant des mutations sur les 2 copies du gène Nr2f1 et les femelles gestantes susceptibles d’avoir de tels embryons seront prélevées avant la mise bas. Ces trois lignées pourront être croisées avec une lignée rapportrice, dont l'expression du marqueur GFP n'affecte pas le phénotype des animaux. Les animaux pourront être impliqués dans diverses procédures nécessitant des injections ou interventions chirurgicales. Pour les animaux subissant une stéréotaxie, une douleur ou un inconfort au niveau de l’incision de la peau du crane peut persister après la chirurgie jusqu'à la cicatrisation complète. Dans le cas de l'injection intravitréale, l'utilisation d'une aiguille fine et de volumes de liquide très faibles minimise le risque de lésions ou de pression intraoculaire gênantes. De plus, les traceurs injectés ne devraient pas la physiologie de l'œil ou du cerveau. L'injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur aiguë transitoire due à la piqûre, mais cette sensation disparaît rapidement. Pour les femelles gestantes, une attention particulière sera accordée à la surveillance post-injection, car leur état peut entraîner une douleur accrue, des saignements ou des contractions. Par mesure de sécurité, aucune injection ne sera administrée à des femelles ayant dépassé 16 jours de gestation.
Devenir
A la fin des procédures procédures tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir récupérer leur tissus (cerveau, oeil, gonades) et les analyser pour notre étude.
Remplacement
Afin de limiter autant que possible les expériences sur animaux vivants, nous utilisons, en parallèles des lignées de souris, des cultures cellulaires in vitro. Cependant, la détermination du programme de chaque cellule ne dépend pas seulement des facteurs génétiques. Les cellules communiquent entre elles et s’adaptent à leur environnement. Par conséquent, les facteurs spatiaux et temporels jouent un rôle crucial dans le bon développement du système nerveux central et sont impossibles à reproduire de manière identique in vitro. C’est pourquoi le recours à un modèle animal reste indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques qui mènent aux symptômes observés chez les patients. Les modèles animaux nous permettent de prendre pleinement en compte la complexité des interactions cellulaires et des influences environnementales dans le développement et la progression des maladies neurologiques, ce qui est essentiel pour notre compréhension globale de ces troubles et pour le développement de traitements efficaces.
Réduction
Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, indépendamment de leur sexe, réduisant ainsi le nombre total d'animaux produits. Pour optimiser au mieux l’utilisation de chaque animal, nous prélèverons systématiquement plusieurs organes (cerveau, yeux, gonades), et nous effectuerons une analyse complète des échantillons. Les protocoles utilisés ont été soigneusement choisis afin de réduire au maximum le nombre et l’ampleur des interventions pratiquées sur les animaux sans en compromettre l’efficacité.
Raffinement
Toutes nos interventions seront réalisées par des utilisateurs compétents et formés, réduisant ainsi le temps de manipulation et le stress pour les animaux. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale administrée par injection intrapéritonéale d'un mélange permettant à la fois une anesthésie générale, un bon relâchement musculaire et une couverture analgésique générale jusqu'à 24h après l'injection grâce à une combinaison d’un analgésique et d’un anti-inflammatoire. Pour les animaux maintenus en vie pendant et après la chirurgie, un protocole supplémentaire de prise en charge de la douleur sera mis en place. Ainsi, une anesthésie locale au niveau du site de la chirurgie sera administrée par une injection sous-cutanée pour les chirurgies crâniennes ou par l'application de collyre pour les injections dans les yeux. De plus, pour prévenir les infections post-opératoires, les animaux recevront un traitement antibiotique juste après la chirurgie. Ce traitement sera adapté à la nature spécifique de la chirurgie effectuée. Pour ce faire, une injection sous-cutanée de gentamicine ou l'application de crème ophtalmique antibiotique seront utilisées. Ces médicaments ont été choisis pour leur efficacité dans la prévention des infections et leur compatibilité avec les procédures chirurgicales réalisées. Enfin, un suivi quotidien des animaux en procédure sera assuré pour détecter tout signe de douleur avec une mise en place de points limites impliquant un arrêt immédiat de la procédure si la douleur ou l'inconfort détecté ne peut être soulagé dans les 24h.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de sa grande similarité génétique avec l'homme, ce qui en fait un modèle précieux pour étudier les gènes impliqués dans le développement du système nerveux central. De plus, les mécanismes neurodéveloppementaux que nous souhaitons étudier sont identiques chez la souris et l’homme et il existe déjà des lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1 retrouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique qui sont d’excellents modèles pour étudier cette maladie génétique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment différentes mutations du gène Nr2f1 affectent le développement du cerveau et des yeux. Ces mutations peuvent entraîner des dysfonctionnements dans le développement de ces organes, conduisant aux symptômes observés chez les patients. Dans ce but, nous analyserons différents stades de développement embryonnaires et postnataux chez des modèles de souris de cette maladie. Nous commencerons notre étude à 10,5 jours embryonnaires où, chez la souris, les bases du cortex cérébral et des yeux sont établies. Puis nous progressons à travers plusieurs autres stades embryonnaires (12.5 ; 14.5 ; 16.5 et 18 jours embryonnaire) où les structures cérébrales et oculaires continuent à se former et à se différencier. Chez les souris, tout comme chez les humains, le système nerveux central continue à se développer et à mûrir après la naissance, notamment par la myélinisation des fibres nerveuses. Pour cette raison, nous étudierons également plusieurs stades postnataux, jusqu'à ce que le processus de myélinisation soit complet. L’expression de Nr2f1 étant maintenue à l’âge adulte, nous analyserons aussi des souris adultes pour voir l’impact des mutations étudiées sur un système nerveux central pleinement mature.
Etude des récupérations sensorimotrices chez le rat après lésion de la moelle épinière et implantation d’une matrice contenant des cellules souches issues du tissu adipeux.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une contusion de la moelle épinière au niveau thoracique, 125 rats mâles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, cinq autres étant anesthésiés et tués sans réveil pour prélever la graisse dont sont tirées les cellules souches implantées. Tous sont tués à l'issue. Après l'opération, chaque rat est testé quinze minutes par semaine pendant trois mois sur sa récupération sensorimotrice, puis soumis à un enregistrement électrophysiologique d'une heure. Le porteur décrit des troubles de la miction imposant des massages manuels de la vessie, des douleurs pouvant persister trois semaines et, rarement, de l'automutilation. L'effectif reste ouvert entre 25 et 130 animaux selon les premières vagues, le porteur prévoyant d'abandonner l'étude s'il ne parvient pas à dégager de différence entre les groupes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de cellules souches issues du tissu adipeux et mises en culture sur un support 3D. Il s’agira d’étudier chez le rat mâle Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après une contusion spinale thoracique, à réparer ou préserver la moelle épinière à l’aide d’un hydrogel contenant des cellules souches. L’objectif principal étant de réduire les déficits post-traumatiques et d’entraîner une récupération sensori-motrice la plus complète possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subi des dommages de la moelle épinière. L’évaluation qui portera sur la récupération sensorimotrice et l’activité électrophysiologique (réflexe H : réflexe spinal monosynaptique entre les fibres afférentes proprioceptives Ia et les fibres motrices efférentes issues des motoneurones-α, activité des fibres nerveuses, ajustements ventilatoires) sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.
Bénéfices attendus
Dans le domaine de la réparation de la moelle épinière, malgré une recherche intensive depuis les cinquante dernières années, à ce jour aucune stratégie thérapeutique n’a été proposer afin de limiter la progression des déficits fonctionnels post-lésionnels et d’entraîner des récupérations sensori-motrices suffisantes permettant une récupération de l’autonomie des patients. Des études récentes très prometteuses ont montré que les cellules souches issues du tissu graisseux semblent entraîner une récupération fonctionnelle, une neurogenèse et une neuroprotection après lésion de la moelle épinière. Les cellules souches apparaissent comme une alternative prometteuse pour préserver et réparer la moelle épinière endommagée. Toutefois, ces études n’ont pas permis d’obtenir des résultats suffisamment marqués pour envisager une application chez des patients blessés médullaires car les cellules prélevées étaient mises en culture sur un support matriciel 2D ne permettant pas d’exprimer toutes leurs potentialités. Notre étude pré-clinique vise à tester l’efficacité thérapeutique de cellules souches mises en culture sur un support 3D en vue de proposer une thérapie transférable à l’Homme. Elle représente donc une étape très importante avant un transfert vers la clinique humaine.
Procédures
Chirurgie lésionnelle : n=1, durée : 1h ; Test sensorimoteurs : 1 fois par semaine pendant 3 mois, durée : 15 min ; Enregistrements électrophysiologiques : n=1, durée : 1h
Impact sur les animaux
La contusion spinale thoracique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels, ainsi que des troubles végétatifs, notamment en ce qui concerne la miction. Des douleurs peuvent également être présentes, ainsi qu’une perte de poids, une déshydratation ou une dénutrition. La littérature scientifique et notre expérience indiquent que les troubles végétatifs et les douleurs liées à la chirurgie peuvent persister jusqu’à 3 semaines selon le type et l’importance de la lésion spinale, ce qui nécessite une évaluation quotidienne des animaux. Toutefois, il faut noter que les lésions nerveuses centrales peuvent rarement conduire à de l’autophagie. Les autres nuisances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs liées aux injections intrapéritonéales, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux.
Devenir
A l'issu des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Les études in vivo n’utilisant pas des mammifères ou celles in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité́ infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise donc à proposer une nouvelle stratégie de préservation et/ou réparation de la moelle épinière directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière.
Réduction
Un à cinq animaux seront nécessaires pour prélever de la graisse à partir de laquelle les cellules souches seront isolées pour être mises en culture. Afin de mener à bien notre projet, nous devrons constituer 5 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g (environ 2 mois d’âge) lors de la chirurgie initiale. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques paramétriques (analyse de la variance), nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 (+ 5 pour l’extraction des cellules souches) animaux, soit un total de 125 (+ 5 pour l’extraction des cellules souches) animaux. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous enrôlerons, dans un premier temps, 5 (+ 1 pour l’extraction des cellules souches) animaux par groupe, soit un total de 25 (+ 1 pour l’extraction des cellules souches) animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, d’une puissance de 80% et d’un seuil de significativité de 5%, avec un test statistique approprié, les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre le groupe traité et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement ou qu’aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et conclurons à l’inefficacité du traitement thérapeutique.
Raffinement
Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection d’antalgique sera réalisée avant les chirurgies et une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique (dans l’eau de boisson renouvelée toutes les 12h), ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne (7j/7) de l’état de santé des animaux (à l’aide de la grille d’évaluation jointe en Annexe) et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures destinées à réduire la douleur et le stress. En cas de trouble de la miction, des massages seront réalisés afin de vidanger la vessie jusqu’à reprise d’une miction naturelle. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés selon la procédure réservée aux animaux éveillés. Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénères. Toutefois, même si les animaux sont placés seuls dans leur cage enrichie avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois en peuplier…), ils ne seront pas à l’isolement. Leurs cages seront placées sur des portoir de cages à côté des cages des autres animaux. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénères dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois en peuplier…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire. Nous nous efforcerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins et des gestes adaptés.
Choix des espèces
Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre chez les mammifères après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière et dont la littérature scientifique est très pauvre en ce qui concerne l’utilisation de ces genres. De plus, nous disposons de plateformes d’analyse du mouvement et des dispositifs d’enregistrement électrophysiologiques uniquement destinés aux genres Mus et Rattus. Les animaux seront des jeunes adultes de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ. Afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes.
Etude des changements d’efficacité de la communication entre les neurones dans un contexte d’addiction.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cathéter veineux posé sous anesthésie, puis dix séances de six heures d'auto-administration de cocaïne ou vingt-cinq séances de trois heures pour la nicotine, six semaines d'abstinence, une chirurgie cérébrale de deux heures trente : 960 rats enchaînent ce protocole, isolés en cage individuelle pendant 57 ou 81 jours. Les 1 088 rats du projet finissent par trois heures d'enregistrement de l'activité de leurs neurones sous anesthésie générale, 128 d'entre eux n'étant pas réveillés, les 960 autres relevant d'un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour analyser leur cerveau. Le porteur annonce que ces travaux pourraient mettre en évidence une nouvelle approche thérapeutique pour les personnes dépendantes, quand l'isolement de 57 à 81 jours et la prise chronique de cocaïne figurent, eux, parmi les nuisances attendues.
Objectifs
Le cerveau est en permanence soumis à des phénomènes de plasticité, c’est-à dire à des changements de l’efficacité de la communication entre des neurones, permettant l’encodage de nouvelles informations. L’exposition chronique à des drogues d’abus est connue pour induire de tels phénomènes, ce qui pourrait constituer une mémoire de la drogue et faire partie du processus pathologique menant à l’addiction et aux épisodes de rechute. Ce projet vise à étudier le rôle du cholestérol cérébral dans ces processus de changement d’efficacité synaptique induits par les drogues d’abus telles que la cocaine et la nicotine chez le rat.
Bénéfices attendus
La conduite de ce projet devrait permettre d’identifier les mécanismes par lesquels la manipulation du métabolisme du cholestérol cérébral modifie la recherche de drogue et la rechute (nouvelle consommation) chez des rats addicts. Ces expériences pourraient mettre en évidence une nouvelle approche thérapeutique, en ciblant le cholestérol cérébral chez les patients addicts pour les aider dans leur désir d’abstinence.
Procédures
Tous les rats (1088) seront pesés 2 fois par semaine. 960 rats auront une injection d’un antalgique et immédiatement après suivront une chirurgie sous anesthésie générale (15 minutes) afin d’implanter un cathéter veineux Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 960 rats seront hébergés seuls dans leur cage (57 jours pour les rats sous cocaïne et leurs contrôles (480 rats), 81 jours pour les rats sous nicotine et leurs contrôles (480 rats)). L'auto-administration de drogue se fera avec ces 960 rats pendant 10 sessions pour la cocaïne (480 rats) ou 25 sessions pour la nicotine (480 rats) à raison d’une session par jour (durée d'une session : 6 heures pour la cocaïne ou 3 heures pour la nicotine) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles ils sont libres de leur mouvement. Ces rats (960) seront ensuite placés en abstinence dans leur cage d’hébergement (6 semaines). Parmi les 1088 rats, 640 rats auront une injection d’un antalgique et immédiatement après une chirurgie cérébrale permettant l’injection d’un produit modifiant le cholestérol dans une région précise du cerveau (2h30 sous anesthésie générale gazeuse). Tous les rats (1088) seront soumis à des enregistrements de l’activité des neurones (3 heures sous anesthésie générale gazeuse).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques pendant et après la chirurgie et inconfort transitoire au réveil. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. -Auto-administration : La prise chronique de cocaine (bien que volontaire) peut causer un stress modéré et transitoire chez certains individus (poil hérissé, irritabilité) -La Période d’abstinence : peut causer un léger stress. -Isolement : stress modéré (57 jours pour les rats en auto-administration de cocaïne et leurs contrôles ; 81 jours pour les rats en auto-administration de nicotine et leurs contrôles)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de procéder à des analyses sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, qui vise à mesurer le changement d’efficacité synaptique cérébrale chez l’animal anesthésié suite à une exposition volontaire à la cocaïne ou à la nicotine, implique d’utiliser des modèles d’animaux vivants. L’étude des processus de changement d’efficacité synaptique cérébrale nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et des méthodes de substitution à l’animal entier ne peuvent être utilisés.
Réduction
Pour étudier les changements d’efficacité synaptique cérébrale en réponse à la consommation volontaire de cocaïne ou de nicotine, nous progresserons pas à pas en utilisant un arbre décisionnel de type Go/noGo pour étudier plusieurs protocoles de stimulation permettant d’induire ces changements. Dans la procédure1, nous avons choisi de tester 4protocoles d'enregistrement/stimulation/enregistrement pour chacune des 4régions cérébrales ciblées, et d’utiliser 8animaux maximum par protocole. Chaque animal sera son propre contrôle et nous comparerons les changements d’efficacité synaptique avec les différents protocoles. L’ordre des protocoles testés dans chaque région cérébrale sera basé sur la littérature scientifique. Dès qu’un protocole entrainera un changement d’efficacité synaptique, il sera retenu pour la région cérébrale et les autres protocoles ne seront pas testés. Si aucun changement d’efficacité pour une région, alors elle ne sera pas étudiée dans les procédures suivantes et la région cérébrale suivante sera étudiée avec le même cheminement. Lorsqu’un protocole induira des changements d’efficacité synaptique, nous étudierons si la consommation de cocaïne ou nicotine impacte cette efficacité. Si aucun effet des drogues n’est observé, alors cette région ne sera pas étudiée dans l'étude de l'effet du cholésterol. Pour réduire le nombre d’animaux et faire des analyses statistiques, le nombre d’animaux requis par groupe expérimental a été calculé par une méthodedite de puissance qui tient compte de la variabilité des mesures.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux et des pesées 2 fois par semaine. Selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans la décision d’intervention et d’arrêt. En effet, des points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoce dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal, atteignant un point limite défini nécessitant une intervention, sera pris en charge sans délai par l’expérimentateur. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale et de l’administration d’antalgiques. Un maintien de la température grâce à un tapis chauffant et une hydratation régulière des tissus seront assurés pendant les chirurgies.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Les rats ont des réponses aux drogues similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec d’autres espèces. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui limite le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rat en phase d’adolescence (juvéniles).
Caractérisation de nouveaux modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, dont 1 248 opérées sous anesthésie sans jamais reprendre conscience, 1 934 souris vont être utilisées pour caractériser quatre nouveaux modèles génétiques de la maladie de Huntington. Les 686 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger. Certaines lignées sont maintenues jusqu'à onze mois pour que des symptômes neurologiques et moteurs apparaissent, symptômes que le porteur dit jamais handicapants, avant une série de tests comportementaux d'une semaine au maximum puis une chirurgie terminale. Ces tests, présentés comme très fins et seuls capables de révéler les symptômes en question, ne sont nommés nulle part dans le résumé.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, quatre nouveaux modèles murins génétiquement modifiés ont été développés. Cependant, avant de pouvoir les utiliser en recherche, une description complète de leur comportement est indispensable. De plus, il faut également analyser si les modifications génétiques ne perturbent pas le développement des animaux afin de valider la fiabilité de ces nouveaux modèles. Cette étape est primordiale pour s'assurer que de futurs projets de recherche dans lesquels ces modèles seront utilisés ne seront pas biaisés.
Bénéfices attendus
Les différents modèles murins déjà existants pour étudier la maladie de Huntington ne permettent pas d’étudier et de visualiser directement et à l'état normal les protéines défaillantes et responsables de la maladie. Pour cela, il faut utiliser des intermédiaires cellulaires permettant de tracer et marquer les protéines. Cependant, l'ajout de ces intermédiaires peut engendrer des modifications cellulaires indésirables et fausser certains des résultats. Ainsi, ces nouveaux modèles murins vont être de précieux outils pour atteindre les objectifs des projets qui visent à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et à aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Ainsi, la caractérisation du développement, du comportement et des fonctions physiologiques de ces souris est essentielle.
Procédures
Parmi les animaux de ce projet, certains développent un phénotype dommageable avec l'âge. Tous les animaux effectueront une seule série de tests comportementaux pendant une durée maximale d'une semaine, puis une chirurgie terminale sera réalisée.
Impact sur les animaux
Certains des nouveaux modèles présentés ici peuvent développer avec l’âge des symptômes légers de la maladie de Huntington. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux très fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive ni une perte d'autonomie. Il est possible d’identifier 3 nuisances légères potentielles : 1) un stress léger pendant leur transport d'une animalerie vers l'autre. 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements et pendant la réalisation des tests comportementaux. 3) un stress léger d'une femelle ayant mis bas lorsque les animaux seront prélevés.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, les nouveaux modèles murins de la maladie de Huntington qui ont été développés vont permettre d'étudier le rôle de plusieurs protéines impliquées dans le développement de la maladie en conditions physiologiques et/ou pathologiques sans devoir utiliser des intermédiaires pouvant biaiser les résultats. Le modèle murin est indispensable pour comprendre le rôle de la protéine huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre total d’animaux pour ce projet a été calculés en considérant que les expérimentations doivent être validées avec au minimum deux groupes de souris afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de chaque étude, les tissus cérébraux ainsi que d’autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées et équipées d’une litière stérile ainsi que de la paille permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. De plus, différents matériaux pour divertir les rongeurs seront ajoutés dans la cage avec une rotation chaque semaine pour que les animaux aient chaque semaine un nouveau divertissement. Ces cages seront changées toutes les semaines. L’accès à l’eau et à la nourriture sera illimité. Les biberons d'eau et les croquettes seront également changés toutes les semaines. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre sera effectué en cages occultées avec au moins un matériau de divertissement et des croquettes mouillées à disposition. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé toutes les semaines ou tous les jours si besoin jusqu'à la fin de leur vie. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Certaines souris seront utilisées au stade de jeunes adultes, c'est-à-dire entre 8 et 12 semaines, d’autres devront atteindre l’âge de 11 mois afin qu'elles développent les symptômes légers de la maladie de Huntington et permettre que l’étude soit pertinente. Concernant les études développementales, les animaux seront utilisés à différents stades de développement cérébrale car cette période est fondamentale pour la mise en place des tissus cérébraux. En outre, de plus en plus d'études montrent que des dyfonctionnements cérébraux s’installent très tôt, bien avant l'apparition des symptômes de la maladie de Huntington.
Etude pilote : Marquage des neurones de la crosse aortique par injection guidée sous échographie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées pour mettre au point une injection de marqueurs près de la crosse aortique, guidée par échographie, une partie d'entre elles n'étant jamais réveillée et les autres tuées une à trois semaines après l'injection. Chaque séance dure 15 à 20 minutes sous anesthésie, avec un risque de pneumothorax que le porteur décrit comme des douleurs diffuses et intenses dans le thorax, des difficultés à respirer et une faiblesse générale. La technique n'a jamais été décrite, le protocole avance par sessions de 5 puis de 10 souris et l'étape suivante n'est franchie que si plus de la moitié des injections réussissent. Le porteur justifie ces essais par le fait que la seule méthode existante, une ouverture du thorax, est plus grave pour les animaux non-humains, et conclut que les alternatives non animales "n'existent pas".
Objectifs
L'hypertension artérielle est la principale cause des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Malgré les diverses options thérapeutiques disponibles, de nombreux patients hypertendus gardent une tension artérielle non contrôlée. Il a été montré que, dans ces cas d’hypertensions résistantes et/ou réfractaires aux traitements médicamenteux, les mécanismes de régulation de la pression artérielle sont affectés. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initié par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les sinus carotidiens (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du cœur). Cette sensibilité à l’étirement leur est conférée par l’expression de protéines similaires à celles qui sont impliquées dans le toucher et dont notre équipe est spécialiste. Notre projet vise donc à caractériser quelles protéines sont spécifiquement exprimées par les différents types de neurones détectant la pression sanguine chez la souris en conditions physiologiques, et, par la suite, leurs modifications dans des modèles d’hypertension. Nous nous intéresserons aux neurones de la crosse aortique. Afin de pouvoir les identifier, nous injecterons aux environs de la crosse aortique des molécules permettant de marquer les neurones appelées marqueurs neuronaux. Cependant, l’accès à la crosse aortique chez la souris nécessite une thoracotomie, c'est-à-dire l'ouverture de la cage thoracique. Cette procédure étant invasive et douloureuse pour l’animal, nous nous proposons de mettre en place une nouvelle méthode d’injection guidée par échographie, jamais décrite à ce jour. Ce projet est donc une étude pilote visant à évaluer la faisabilité de ce type d'injection.
Bénéfices attendus
A ce jour, la seule technique chirurgicale permettant le marquage des neurones de la crosse aortique est une thoracotomie. Cette nouvelle technique d'injection permettrait de largement diminuer la gravité de la procédure. L'injection sous échographie, beaucoup moins invasive qu'une thoracotomie, serait ainsi moins pénalisante pour les animaux. De plus, notre étude pourrait être à l'origine de l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l'hypertension.
Procédures
1) Injection guidée par échographie de marqueurs dans la crosse aortique. Les souris seront anesthésiées pour être positionnées sous l'échographe. Pour éviter toute douleur liée à l’injection, nous administrerons préalablement un analgésique par voie sous-cutanée . La zone d’injection sera épilée puis désinfectée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi de paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la procédure. A l'aide d'une microseringue, nous injecterons aux environs de la crosse aortique 1 microlitre d'une solution contenant l'un des marqueurs neuronaux que nous testerons. La procédure durera 15 à 20 minutes maximum. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce de surveillance post-examen, chauffé, avec eau et nourriture. 2) Visualisation du marquage de la crosse aortique. 4 à 5 jours après l’injection, les souris seront anesthésiées pour vérifier la présence d’un marquage au niveau de la crosse aortique grâce à un appareil d'imagerie in vivo. La manipulation durera 10 min maximum. 3) 1 à 3 semaines après l’injection, les souris seront mise à mort pour prélever les organes et procéder à des cultures de neurones.
Impact sur les animaux
Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire et perte de poids; 2) à l'injection bien que celle-ci soit guidée par échographie : risque de pneumothorax (douleurs diffuses et intenses dans la région du thorax, difficultés à respirer, respiration très rapide, faiblesse générale) et risque d’infection au point d’injection. Il n'y a aucun effet indésirable lié aux molécules injectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dans le but de vérifier la présence effective du marquage dans les neurones.
Remplacement
Le marquage des neurones de la crosse aortique ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les marqueurs neuronaux fonctionnent chez la souris. Les alternatives non animales n'existent pas.
Réduction
Ce projet est une étude pilote visant à évaluer la faisabilité des injections guidées par échographie de marqueurs neuronaux dans la paroi de la crosse aortique de souris. C'est une technique qui n'a jamais été décrite et pour laquelle il n'existe aucune référence. Nous allons donc procéder par étape pour limiter le nombre d'animaux. Etape 1/ Mise au point de l'injection guidée par échographie. Pour cela, nous injecterons un marqueur visible à l'oeil nu qui nous pemettra de valider la localisation de l'injection. Chaque session d’injections comprendra 5 souris. Nous effectuerons 4 sessions, soit une utilisation totale de 20 souris. Nous assumons que notre technique sera améliorée à chaque session donc le bilan sera effectué à la fin des 4 sessions. Si le taux de réussite de l'injection est supérieur à 50%, nous passerons à l'étape suivante. Etape 2/ Test des différents marqueurs neuronaux fluorescents. Nous injecterons trois marqueurs différents. Pour chaque marqueur, nous effectuerons 2 sessions d'injection comprenant 10 souris. Soit 20 souris par marqueur et 60 souris au total pour le test des 3 marqueurs neuronaux. Pour l'ensemble de l’étude pilote,nous utiliserons donc au maximum 80 animaux.
Raffinement
Les injections sous échographie se feront sous anesthésie. Pour éviter toute douleur liée à la procédure, nous administrerons un analgésique par voie sous cutanée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi des paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. Le gel d’échographie sera chauffé préalablement à son application sur l’animal. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce post-examen, chauffé, avec eau et nourriture ad libitum. Suite à la chirurgie, nous utiliserons une grille d'évaluation du bien-être des animaux tous les jours pendant 3 jours puis 2 fois par semaine. L'évaluation sera dépendante de plusieurs critères dont chaque modification sera cotée. En fonction du score total, les animaux pourront être placés sous traitement analgésique et/ou il y aura arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal. L’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes autoclavables et des nids à base de coton.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car si l'étude de faisabilité se révèle satisfaisante, nous aurons ainsi accès aux modèles de souris transgéniques. De plus, le marquage des neurones de la crosse aortique est une méthode qui a fait ses preuves sur la souris. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 10 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ne présentent pas encore d'accumulation de tissus graisseux et/ou fibreux qui pourraient nuire à la visibilité des structures sous échographie.
Manipulation pharmacologique d’agents anti-agrégats chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Des souriceaux nouveau-nés et juvéniles sont anesthésiés quelques minutes puis tués pour en extraire une partie du système nerveux, tandis que d'autres souris reçoivent deux solutions, par le nez sous anesthésie gazeuse ou par injection dans le ventre, avant des mesures de leur respiration en enceinte fermée. 1 182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, et chacune subit une biopsie de la queue pour le génotypage, que le porteur décrit comme "une source de douleur et de stress". Une partie porte la mutation du syndrome d'Ondine, où la respiration ne réagit plus à l'excès de CO2, et ces souris mutantes risquent des troubles respiratoires mortels lors des administrations par le nez sous anesthésie. L'équipe veut savoir si des agents qui empêchent la formation d'agrégats de protéines améliorent leur respiration. Le résumé ne nomme ni les deux solutions ni ces agents, et ne dit pas si la biopsie des nouveau-nés se fait sous anesthésie.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration et surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré) Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie. Ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et forme des assemblages protéiques anormaux (les agrégats) non fonctionnels. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC. Des approches utilisées chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettront d’étudier la commande centrale respiratoire, d’identifier l’agent anti-agrégats le plus efficace et d’enregistrer l’activité des neurones respiratoires avec ou sans agents anti-agrégats, qui participent à la détection du CO2 dans l’organisme et à la mise en place de la réponse respiratoire à l’hypercapnie. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’agents anti-agrégats sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’inhibition de la formation d’agrégats protéiques pourrait potentiellement : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes. 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles. 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des agents anti-agrégats au niveau de la commande respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
Les souris mutantes et contrôles, nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles puis adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) puis recevront une administration par voie nasale de deux solutions (faible volume par narine ; en 10 minutes par souris). 48 heures séparent les 2 administrations. D’autres souris juvéniles puis adultes recevront par administration intrapéritonéale les deux solutions. 48h sépareront les deux administrations. La mesure des variables ventilatoires chez les souris juvéniles et adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 60 min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. Une biopsie caudale (au niveau de la queue, inférieure à 2 mm) est réalisée chez les souris nouveau-nées, juvéniles et adultes pour génotypage.
Impact sur les animaux
Le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale. L’administration intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen) des deux solutions apparaît comme une source de douleur/un stress de courte durée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire et aux neurones qui élaborent cette commande, dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail réalisé à partir de souris vivantes. L’étude de l’influence d’agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par le(s) agent(s) anti-agrégats ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (1182 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes. L'isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés pour des contraintes zootechniques (agression entre congénères, etc...). Dans ce cas, la structure chargée du bien-être animal sera toujours sollicitée pour trouver la solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors de ces administrations sous anesthésie, une surveillance accrue en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène, présent sur des neurones impliqués dans la sensibilité au dioxyde de carbone (hypercapnie). Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes et leur contrôle, des souris sauvages ; étude de l’influence des agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude de la ventilation chez l’animal juvénile et adulte vigil et de l’effet sur la respiration des agents anti-agrégats appliqués par administration intranasale et par injection intrapéritonéale.
Caractérisation du rôle du tronc cérébral dans le signal « glucose-portal »
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées à l'issue pour que leur cerveau, leur foie et leurs tissus gras soient prélevés, 56 souris vont être utilisées dans des procédures dont 40 impliquent un niveau de souffrance sévère, 8 un niveau modéré et 8 se déroulent sous anesthésie sans réveil. Quarante d'entre elles subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis quinze jours plus tard la pose d'un cathéter dans la veine porte, avant une perfusion de 24 heures. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent provoquer de la douleur, une hémorragie locale, des troubles neuro-musculaires et des difficultés respiratoires sous anesthésie gazeuse. Il précise que les souris utilisées pour la mise au point sont des animaux de réforme, de toute façon mis à mort en dehors du projet, et affirme que comprendre le dialogue entre l'intestin et le cerveau impose de travailler sur l'"organisme entier".
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de sucre (glucose) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. L’intestin est en effet capable de produire du glucose en dehors des repas dans une veine spécifique (veine porte), située entre l’intestin et le foie. La détection de glucose dans cette veine après un repas induit un signal nerveux qui cible le cerveau, et qui en retour, va diminuer la taille du repas suivant. Ainsi, lorsque nous imitons la production de sucre par l’intestin en perfusant du glucose directement dans la veine porte, nous observons une diminution de la prise alimentaire associée à une activation de 3 régions du cerveau, connues pour contrôler la faim. Cependant, les études réalisées jusqu’alors ne permettent pas de déterminer si l’activation de chacun de ces 3 noyaux est nécessaire ou si elle est redondante pour les effets coupe-faim de la production intestinale de glucose. Un des noyaux impliqué dans ces effets coupe faim, le noyau du tractus solitaire (ou NTS), est un centre important d’intégration des signaux provenant du système digestif et est connu pour moduler la prise alimentaire. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer si l’activation de ce noyau est nécessaire à la mise en place de l’effet coupe-faim induit par la production intestinale de glucose. Pour cela, nous étudierons, sur une durée d’un an, si l’inactivation de ce noyau cérébral spécifique (par l’injection d’un virus directement dans le cerveau) annule les effets coupe-faim de la détection de glucose dans la veine porte.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets anti-diabète et anti-obésité ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier précisément quelles régions du cerveau sont indispensables à ces effets bénéfiques. Ils s’intègrent dans une étude plus globale qui cherche à comprendre comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. A plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre l’obésité et ses complications.
Procédures
A l’âge de 12 semaines, certaines souris subiront : - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris et sans réveil (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris avec un suivi post-opératoire de deux semaines (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris, puis 15 jours après, une chirurgie sous anesthésie générale permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte d’une durée de 20 minutes/ souris (40 souris). Une semaine après, ces souris subiront une infusion (via le cathéter installé) d’une solution contrôle (20 souris) ou une solution de glucose (sucre) (20 souris) pendant 24h.
Impact sur les animaux
- Les interventions chirurgicales sont susceptibles de provoquer de la douleur. - L’injection du virus peut entrainer une faible réponse immunitaire localisée. - La chirurgie réalisée dans le cerveau peut entrainer des problèmes neuro-musculaires. - Au cours de la chirurgie, l’anesthésie gazeuse peut entrainer des difficultés respiratoires. - La chirurgie peut entrainer une hémorragie locale. - L’injection peut entrainer une légère douleur au niveau de l’abdomen ainsi qu’un stress. Une attention particulière sera portée lors de l’injection pour éviter au maximum toute inflammation du péritoine. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de raffinements spécifiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes et analyses des tissus. Le cerveau, le foie et les tissus gras seront étudiés pour déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques de la détection de glucose dans la veine porte préalablement observé sur ces tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose dans la veine porte a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.
Réduction
La totalité des animaux utilisés dans la procédure de mise au point sont des animaux de réforme, systématiquement mis à mort en dehors de ce projet. Ainsi, l’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux spécifiquement pour cette expérience. Le nombre de souris utilisées pour l’expérience propre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 10 souris par groupe. De plus, différents tissus (cerveau, foie, reins, tissus adipeux, pancréas, …) seront prélevés afin de déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques à court terme induit par le signal glucose portal dans ces tissus. Ces tissus pourront constituer une banque de tissus commune au laboratoire pouvant être utilisés par la suite pour d’autres problématiques relatives à la production intestinale de glucose, notamment en évaluant la stéatose hépatique et le brunissement du tissu adipeux.
Raffinement
Les souris seront accueillies à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Les souris seront hébergées en animalerie conventionnelle avec eau et nourriture ad libitum avec enrichissement. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisées et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction de notre appareil à isoflurane va être ajouté. De plus, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce dont la température sera réglée à 28°C afin de garder les souris à thermoneutralité. La mise en place de ces raffinements nous a permis d’observer une meilleure reprise de poids post-opératoire. Après les chirurgies, un suivi intensif est régulier sera réalisé tous les jours tout au long de l’expérience pour identifier et réduire d’éventuelles souffrances selon une grille de score spécifique. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points particuliers limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.
Choix des espèces
Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.
Etude de la mitophagie dans un modèle murin de SLA/DFT
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Baguées à l'oreille et biopsiées à la queue dès le plus jeune âge, 1 122 souris porteuses d'une mutation de sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale sont ensuite laissées vieillir sans autre intervention, dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère. Leur prise de poids décroche dès trois mois. Entre dix et quatorze mois apparaissent la perte de poids, la baisse de mobilité et les tremblements, jusqu'au stade que le porteur retient comme final. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, le seuil déclenchant la mise à mort étant une perte de poids supérieure à 15 % ou l'incapacité à se retourner sur soi en moins de quinze secondes.
Objectifs
La maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique) et la démence frontotemporale sont des maladies neurodégénératives conduisant à la mort des motoneurones (= neurones situés dans la moelle épinière, innervant et commandant les fibres musculaires). Ces deux pathologies présentent un spectre clinique commun, 50% des patients atteints de sclérose latérale amyotrophique développent une démence frontotemporale, 15% des patients atteints de démence frontotemporale présentent des signes de sclérose latérale amyotrophique. Précédemment, une mutation sur le gène d'une protéine de la mitochondrie (= petit organite qui a un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires) a été identifiée chez des patients souffrant d'une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale. Parmi tous les facteurs impliqués dans le processus conduisant à la sclérose latérale amyotrophique, un dysfonctionnement des mitochondries a toujours été envisagé comme un acteur majeur de cette pathologie. Mais, l'identification d'une mutation dans un gène codant pour une protéine de la mitochondrie fut la 1ère preuve génétique démontrant le rôle primaire des mitochondries dans des atteintes du motoneurone. L'objectif général de notre projet de recherche est de comprendre comment la mutation de ce gène codant pour une protéine de la mitochondrie conduit à la mort des motoneurones. Pour cela, nous devons caractériser la séquence des évènements reliant l'atteinte des mitochondries à la mort des motoneurones. L'étude du modèle murin présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale suggérait une implication du processus de mitophagie (processus de mort permettant l'élimination des mitochondries anormales) dans différents organes. Ces souris ont été croisées avec des souris permettant de quantifier la mitophagie (la mitophagie est visualisée sous forme de points rouges en microscopie). Nous avons ainsi pu observer une augmentation de la mitophagie dans différents organes chez ces souris comparées à leurs souris contrôles. La poursuite de ce projet aura pour objectifs de 1/ caractériser le rôle de la mitophagie dans l'atteinte du motoneurone et 2/ établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones.
Bénéfices attendus
Actuellement, la maladie de Charcot et la démence frontotemporale ne présentent pas d'option thérapeutique, il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du processus de mitophagie peut être une piste thérapeutique intéressante dans le traitement des atteintes du motoneurone associées à un dysfonctionnement mitochondrial.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, l'identification des animaux nécessitera la pose d'une bague à l'oreille et d'une biopsie au niveau de la queue ou de l'oreille. Pour les procédures 1 et 2, les animaux seront élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement et ne seront soumis à aucune autre intervention avant la mise à mort des animaux. Pour la procédure 3 (240 animaux), les animaux seront également élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement. Au moment de la mise à mort des animaux, une injection intrapéritonéale d'une solution analgésique sera effectuée, suivie 15 minutes plus tard d'une deuxième injection intrapéritonéale d'une solution anesthésique. Deux injections en intrapéritonéales seront donc réalisées pendant la durée de vie de la souris.
Impact sur les animaux
Les souris présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale présenteront un phénotype dommageable conduisant à la mort des animaux. Les animaux présenteront : - une prise de poids diminée par rapport aux souris contrôles dès l'âge de 3 mois, - une diminution du poids et/ou une diminution de la mobilité des animaux et/ou la présence de tremblements à un stade plus avancé de la vie de l'animal (autour de 10 à 14 mois). L'identification des animaux (pose d'une bague et biopsie) entrainera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Les animaux étudiés présentent un phénotype de maladie neurodégénérative (sclérose latérale amyotrophique et démence frontotemporale) nécessitant la mise à mort des animaux afin de prélever les organes pour les analyser.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences in vitro ont été réalisées précédemment sur des cellules en culture à partir de fibroblastes primaires issus des patients porteurs de la mutation d'intérêt et à partir de motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites exprimant la mutation d'intérêt. Des expériences sur les motoneurones continueront à être menées. Néanmoins, bien que ces modèles cellulaires issus des patients présentent un potentiel important pour rempacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant une pathologie touchant plusieurs organes, seul un modèle animal permettra d'étudier les conséquences multiples du processus de mitophagie dans les différents organes et surtout d'établir une cinétique (à des âges différents) permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones.
Réduction
Dans un but de réduction, nous utiliserons des modèles cellulaires (notamment des motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites) pour étudier le rôle de la mitophagie dans la mort des motoneurones. Ces expériences nous permettront de répondre à certaines questions scientifiques et ainsi de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet. Afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous aurons besoin de 15 animaux par expérience et par génotype.
Raffinement
Dans un but de raffinement, un suivi hebdomadaire du poids sera réalisé et une fiche de score sera utilisée pour assurer un suivi optimal de chaque animal. Cette fiche de score a été établit en lien avec le phénotype attendu de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et a été précédemment utilisée pour le suivi de ces souris. Les animaux seront observés hebdomadairement, ce qui permettra d'identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant associé à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu'une perte de poids sera observée, une surveillance accrue de l'animal sera réalisée (2 fois par semaine ou tous les jours suivant le pourcentage de perte de poids), de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Lors de cette surveillance hebdomadaire, une attention particulière sera portée sur la mobilité (affaiblissement des membres inférieurs ou tremblements) et sur le comportement des animaux. L'environnement de l'animal sera enrichi par ajout d'un igloo en papier mâché et de carrés de ouate ou de tissu compressé (pour permettre à l'animal de se faire un nid à l'abri de la lumière), ainsi que de batonnets en bois (pour permettre à l'animal de ronger) dans chaque cage.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) présente des similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, permettant dans la mesure du possible d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. De plus, elle présente un cycle de vie court et un cycle de reproduction avec une natalité importante. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser les analyses protéique, génomique et histologique nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, les modèles murins utilisés sont des modèles spécifiques déjà établis et caractérisés (modèle de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et modèle permettant de quantifier la mitophagie in vivo). Aucun autre modèle ne peut donc être utilisé. Les animaux seront utilisés à 4 stades de développement : - stade correspondant à l'atteinte finale de la maladie (= soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l'extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner sur elle-même lorsqu'elle est sur le flanc en moins de 15 secondes) - stade d'apparition des 1ers signes cliniques = 3 mois de vie - stade intermédiaire = 6 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones) - stade intermédiaire = 9 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones)
Etude de la diffusion tissulaire du Meropenem-Vaborbactam, un nouvel antibiotique de la famille des béta-lactamines (Inhibiteurs de béta-lactamases) dans le rein, la prostate, le testicule et le muscle de porc par microdialyse
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Amenés depuis leur élevage situé à moins de cinq kilomètres et anesthésiés dès leur arrivée, 7 cochons sont opérés puis tués avant tout réveil. La chirurgie dure environ deux heures, l'anesthésie environ douze. Les expérimentateurs posent des sondes de microdialyse dans un rein, la prostate, un testicule, une veine abdominale et un muscle, installent un cathéter dans la veine jugulaire et effectuent huit prélèvements sanguins, sur des animaux sains, pour mesurer où diffuse un antibiotique de dernier recours. Le porteur retient le porc parce que c'est l'espèce anatomiquement la plus proche de l'humain, avec un rein et une prostate de taille comparable vers 80 kg.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la distribution tissulaire rénale, prostatique et testiculaire du méropénème-vaborbactam (béta-lactamines-inhibiteurs de béta-lactamases) chez le porc par microdialyse en mesurant les concentrations libres rénales, prostatiques, testiculaires et musculaires obtenues par microdialyse, le tissu musculaire ayant été choisi comme tissu contrôle ne présentant pas de barrière physiologique. Des données urinaires, obtenues grâce à des mesures de concentrations par microdialyse dans le bassinet, seront également ajoutées, elles permettront d’obtenir des données d’élimination de l’ATB nécessaires à la création d’un modèle pharmacocinétique physiologique (PBPK) pour l’analyse des données. Ces concentrations tissulaires seront ensuite comparées aux concentrations totales et libres plasmatiques. L'exposition de l'antibiotique dans ces différents fluides et tissus sera caractérisée par le calcul de la surface sous la courbe. Toutefois, ce projet n’est que la première étape du travail et il permet d’obtenir des données pré-cliniques chez l’animal sain afin de pouvoir simuler les concentrations humaines aux sites infectieux potentiels chez l’homme. Une investigation PK chez des animaux infectés couplée à une étude pharmacodynamique est envisagée dans un second temps. Ce projet vise donc à caractériser le comportement pharmacocinétique (PK) de ces molécules au site infectieux potentiel. La diffusion tissulaire des antibiotiques chez l’humain étant difficile à appréhender, la déterminer chez l’animal est un point important pour une meilleure compréhension du comportement des antibiotiques. Cette étude PK chez le porc est une étude incluse dans un projet plus conséquent, visant à étudier la diffusion tissulaire de ces antibiotiques dans plusieurs espèces animales (rat et porc) afin de simuler par modélisation PB/PK les concentrations tissulaires et notamment rénales, prostatiques et testiculaires obtenues chez l’humain lorsque ces antibiotiques sont administrés à des schémas posologiques usuels. Ce projet permettra d’apporter des informations nouvelles sur la PK tissulaire de ces antibiotiques au site d’infection et donc à terme d’optimiser leur utilisation dans le traitement des maladies rénales infectieuses sévères.
Bénéfices attendus
Les concentrations des antibiotiques au site infectieux chez l’humain n’étant pas accessibles, ce projet va permettre d’étudier le comportement pharmacocinétique au site d’infection rénal, prostatique et testiculaire d’un des antibiotiques de dernier recours utilisés dans le traitement des infections urinaires compliquées et résistantes. Cette étude PK chez le porc, associée à une étude identique de la diffusion tissulaire de l’antibiotique chez le rat, actuellement en cours de réalisation au laboratoire, va permettre par des approches de modélisation PB/PK de simuler les concentrations humaines au site infectieux lorsque ces antibiotiques sont administrés à des schémas posologiques usuels. Ce projet permettra une meilleure compréhension de la PK au site d’infection de l’antibiotique et donc à terme une optimisation de la prise en charge des patients.
Procédures
- Anesthésie générale et chirurgie de mise en place de sondes de microdialyse au niveau d'un rein, de la prostate, d'un testicule, d'une veine abdominale et d'un muscle et pose d'un cathéter central à la veine jugulaire : tous les animaux du projet, 1 chirurgie par animal, sur animaux anesthésiés et sous traitement analgésique, durée de la chirurgie : environ 2h, durée de l'anesthésie : environ 12h - Prélèvements de sang : Huit prélèvements sanguins de 1 mL seront réalisés (2 min)
Impact sur les animaux
Lors des anesthésies de longue durée, les animaux peuvent présenter une hypothermie. Afin de la prévenir, les animaux seront installés sur une table avec tapis chauffant. Une couverture chauffante pourra être mise en place, et la salle de chirurgie est également bien chauffée. Leur température est suivie tout au long de la procédure (sonde rectale à demeure) afin de réagir au plus vite. Une hyperthermie maligne en lien avec l'anesthésie générale à l'isoflurane peut exceptionnellement être observée. Elle entrainera l'euthanasie de l'animal. Parmi les complications précoces, citons un risque d'hématome, d'hémorragie lors de la pose du cathéter central veineux dans la jugulaire. Des réactions d’hypersensibilité peuvent être observées lors de l’administration de certains antibiotiques, ces réactions sont souvent ponctuelles et conduisent le plus souvent à l’apparition d’une éruption cutanée.
Devenir
Les animaux à la fin de la procédure seront tous euthanasiés. Les reins seront prélevés à l’issue de la mise à mort.
Remplacement
La diffusion tissulaire des antibiotiques chez l’humain est difficile à étudier, la déterminer chez l’animal est un point important pour une meilleure compréhension du comportement PK de ces antibiotiques. A l’heure actuelle, les modèles in vitro à notre disposition sont très imparfaits et ne permettent pas de mimer les concentrations tissulaires observées chez un être vivant, à la suite d’une administration de substance médicamenteuse, d’où la nécessité d’avoir recours aux animaux. De plus, ces données seront les premières décrivant la distribution de ces nouveaux antibiotiques dans le tissu rénal, prostatique ou testiculaire, permettant une meilleure compréhension de leur PK au site d’infection, ce qui à terme permettra d’envisager l’optimisation de leur utilisation dans le traitement des infections sévères et résistantes.
Réduction
La microdialyse est considérée comme la technique de référence en pharmacocinétique pour l’étude de la distribution tissulaire des médicaments. C’est une technique très puissante puisqu’elle permet de réaliser des prélèvements en continu dans différents fluides ou tissus chez un même animal permettant d’obtenir des données PK riches et ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés et donc la variabilité interindividuelle. De plus, comparativement aux techniques classiques de prélèvements, elle permet de limiter la déperdition de fluides chez des animaux anesthésiés sur du long terme.
Raffinement
Les porcs subiront une procédure sans réveil. Ils arriveront directement de leur site d’élevage au site d'expérimentation (les 2 bâtiments sont distants de moins de 5 km). Les animaux seront transportés dans un véhicule agréé. Le chauffeur est habilité. Pour la procédure, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane) avec une ventilation mécanique assistée et un monitoring des paramètres physiologiques (température, saturation en oxygène, fréquence cardiaque, EtCO2…). Un traitement analgésique sera administré avant même le début de la chirurgie (buprénorphine en IM). Un cathéter artériel sera installé afin de suivre la pression artérielle de l’animal de façon précise. Le suivi de la pression artérielle associé aux suivis des autres paramétres physiologiques nous permettra de définir le point limite qui est : en cas de tension artérielle insuffisamment corrigée par un remplissage vasculaire adapté au Ringer Lactate, une perfusion de noradrénaline sera débutée et adaptée selon la réponse tensionnelle. Les animaux seront manipulés dans le calme et anesthésiés dès leur arrivée.
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans un projet plus vaste dont l’objectif est de simuler les concentrations rénales humaines obtenues chez des patients après administration de doses usuelles par des approches d’extrapolation inter-espèces utilisant la modélisation PK physiologique (PB/PK) : le porc étant l’espèce présentant le plus de similitudes anatomiques avec l’humain, son utilisation apparait justifiée. Les porcs sont de race Large White. Les animaux seront âgés de 5 à 6 mois environ. A ce stade, les animaux pèsent autour de 80 kg. La taille du rein et de la prostate est proche à ce stade de celle de l’humain.
Etude de l’intérêt des implants en graphène dans l’amélioration du diagnostic des pathologies rétiniennes et en thérapeutique (restauration visuelle) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Neuf examens de la rétine, sept séances d'enregistrement d'une heure et jusqu'à quatre heures de stimulation électrique sous anesthésie : 500 rats vont être utilisés dans des procédures allant de la souffrance modérée à sévère, une partie opérée sans réveil, tous tués à l'issue pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit une injection qui détruit leur rétine, d'autres portent une mutation qui les rend progressivement aveugles. La pose d'électrodes sous la rétine dure jusqu'à une heure trente, et le porteur décrit comme risques une inflammation persistante dans 5 % des cas, le décollement de la fenêtre crânienne, une hémorragie sous celle-ci ou l'arrachement du connecteur par l'animal. Le rat a été retenu parce que son œil est assez grand pour recevoir les implants, la souris ayant été écartée pour cette seule raison.
Objectifs
Les pathologies rétiniennes touchent chaque année 10 millions de personnes dans le monde. Les plus connues sont la rétinite pigmentaire (RP) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) qui se caractérisent par la dégradation progressive des photorécepteurs et mènent irrémédiablement à la cécité. Afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints, il est essentiel de disposer d’outils performants pour les diagnostiquer le plus tôt possible et de développer des stratégies de restauration visuelle qui pallient les traitements médicamenteux actuels inefficaces. Divers types d’interfaces cerveau-machine ont été développés ces dernières années pour le diagnostic (enregistrement des signaux électrophysiologiques via des électrorétinogrammes) et pour la restauration visuelle (stimulation électrique des neurones résiduels). Le matériau des électrodes joue un rôle majeur dans les performances et la longévité de ces interfaces. Par exemple, les prothèses actuelles en tests cliniques ne permettent pas une résolution spatiale suffisante pour l’autonomie complète du patient aveugle. De même, les électrodes actuelles en or utilisées en diagnostic clinique ne fournissent pas une précision optimale pour la caractérisation des fonctions rétiniennes. Les matériaux carbonés possèdent de prometteuses propriétés électrochimiques qui permettraient une stimulation électrique plus efficace et/ou une restitution plus fidèle des signaux neuronaux rétiniens. L’objectif de ce projet est de démontrer la performance de ces nouveaux types d’implants, aussi bien dans la détection de signaux rétiniens anormaux (diagnostic) ou bien dans la stimulation électrique sous-rétinienne à la manière de photorécepteurs artificiels (thérapeutique). Cette étude sera menée sur deux modèles murins. Pour les implants en mode diagnostic, la validation fonctionnelle sera effectuée par enregistrements de l’activité de l’œil in vivo (électrorétinogrammes). En mode thérapie (restauration visuelle) la validation fonctionnelle sera réalisée par stimulation électrique de la prothèse et enregistrement simultanée des signaux corticaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de démontrer la supériorité des matériaux carbonés incorporé dans des interfaces cerveau-machine en permettant un enregistrement d’électrorétinogrammes (ERG) de qualité plus fine ainsi qu’en apportant une stimulation électrique plus stable et plus performante dans le temps. Ces implants, biocompatibles et plus performants que les prothèses classiques métalliques, permettront la mise en place d’une nouvelle génération d’interfaces dans l’espoir d’une translation clinique chez l’humain pour le diagnostic précoce de pathologies liées à la dégénérescence de l’épithélium rétinien pigmentaire (RPE) et pour la restauration visuelle.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : Injection d’un composé chimique induisant une dégénération de la rétine (5 min) : 1 fois par rat sous anesthésie générale et analgésie. Enregistrements des signaux rétiniens sur rats (1h) : 7 séances par animal sous anesthésie générale pour les rats normaux, et 5 fois par rat atteint de dégénérescence progressive de la rétine sous anesthésie générale (fixe) Examens de la rétine : - les rats normaux seront imagés un jour avant chaque session d’enregistrements rétiniens 7 fois sous anesthésie générale fixe, pendant 10 min. - les rats rat atteint de dégénérescence progressive de la rétine seront imagés 5 fois afin d’observer la dégénérescence sous anesthésie générale fixe, pendant 10 min. - Tous les rats avec des implants sous la rétine feront 9 examens de la rétine, le tout sous anesthésie générale fixe pendant 10 min. Chirurgie pour implantation sous la rétine d’électrodes : - rats normaux et aveugles, 1 fois par animal avec ou sans réveil pendant au maximum 1h30 sous anesthésie générale et sous analgésie Imagerie du cerveau et stimulation électrique de l’implant sous-rétinien sous anesthésie fixe - les rats avec un implant rétinien seront imagés et stimulés pendant 4h avec euthanasie à la fin de l’expérience. - autres rats avec un implants rétinien seront imagés sur 8 séances pendant 1h30. Mesures des propriétés électrochimiques l’implant : - les rats implantés avec un implant sous la rétine feront l’objet de mesures électrochimiques sur 9 séances, pendant 1h30/séance, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Durant les chirurgies une mauvaise réaction à l’anesthésie peut survenir tel que : stress thermique, détresse cardio-respiratoire, arrêt cardiorespiratoire (rare). Les anesthésies par injection intrapéritonéales répétés peuvent engendrer à terme une résistance à l’anesthésie. Pour les animaux implantés en sous-rétinien, une éventuelle inflammation au niveau du site d’implantation peut apparaître, se résorbant naturellement généralement sous 7 jours (95 pour cent des cas). Dans les cas où l’inflammation ne se résorbe pas (5 pour cent), le rat sera surveillé, re-imagé à 14 jours et gardé s’il ne montre pas de signes de douleur, détresse ou de problèmes oculaires (paupière gonflée, paupière fermée, cataracte). La pose d’implants chronique avec fenêtre/aminci cranial peut engendrer dans les 3 premiers jours post-chirurgie un stress physique et une perte de poids, en plus du stress social lié à son isolement en cage. Il existe également un risque que la fenêtre chronique se décolle, que les fils de suture sautent (auxquels cas ils doivent être immédiatement recousus), qu’il y ait une hémorragie sous la fenêtre, ou encore que l’animal arrache le connecteur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure. En effet, des prélèvements et analyses complémentaires sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
Dans ce projet, l’enregistrement des électrorétinogrammes ainsi que la transmission de l’information visuelle au cerveau suite à un stimulus électrique ne peuvent pas être réalisés par des expérimentations ex vivo. Le suivi des caractéristiques électrochimiques dans des conditions proches de l’humain n’a de sens qu’évalué in vivo chez le rongeur en pré-clinique. De même, les activations neuronales et variations de flux sanguin mesurées par les techniques d’imagerie par ultrasons au niveau du cortex visuel ne peuvent être observées que sur un cerveau en fonctionnement. L’utilisation du modèle animal est donc indispensable.
Réduction
Basé sur l’expertise du laboratoire, sur des projets proches, le nombre d’animaux a été estimé pour obtenir un nombre minimum de résultats significatifs tenant compte des éventuelles pertes dues à une mauvaise implantation, une mauvaise réaction à l’anesthésie, ou par atteinte des points limites durant les procédures expérimentales. La rédaction d’un protocole précis ainsi que la bonne maîtrise des outils de chirurgie et d’imagerie par les expérimentateurs correspondants permet de minimiser les pertes inutiles. Une analyse de puissance statistique a été faite et le nombre d’animaux utilisé par protocole expérimental a été estimé en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux raisonnable. Ceci implique l’utilisation de 500 animaux au total.
Raffinement
Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum, et sont hébergés en binôme avant le début des expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce utilisée. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Lors des différentes procédures, les animaux bénéficieront d’une anesthésie gazeuse ou fixe intrapéritonéale prodiguée par une seringue et une aiguille. Un analgésique, un anesthésiant local et un anti-inflammatoire seront administrés afin que l’animal sous anesthésie ne ressente aucune douleur pendant l’expérimentation. La douleur post-opératoire est gérée par l'administration d'analgésique jusqu’à 3 jours post-opération. Une signalétique spécifique mise en place permettra une surveillance quotidienne adaptée des animaux en expérimentation tout particulièrement pour les chirurgies. Tout signe d’inconfort ou de détresse sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale, dos courbé, position couchée sur le côté ; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, réduction de la mobilité. Des points limites adaptés au projet ont été définis.
Choix des espèces
Les rats présentent une architecture de l’œil très proche de celui humain, une organisation de la rétine similaire. Nous utilisons généralement dans le cadre de nos études des rats normaux, dont la taille de l’œil est adaptée à celle des implants fabriqués. Un modèle plus petit tel que les souris n’aurait pas convenu, du fait du trop petit diamètre de l’œil comparé aux implants de diagnostic et de stimulation électrique. Leur rétine devient mature à partir de 8 semaines d’âge, aussi nous les utiliserons à partir de 9 semaines. Des rats de lignée transgénique modélisant la rétinite pigmentaire montre une dégénérescence des photorécepteurs au bout d’environ 9 mois. Nous les utiliserons à partir de cet âge là. Ce modèle génétiquement modifié n’est pas à phénotype dommageable. En effet, La mutation induite entraîne la dégradation progressive des photorécepteurs et donc une cécité progressive, mais pas de douleur, détresse ou souffrance supérieure à celle causée par l’introduction d’une aiguille. Nous utilisons également un autre un modèle de dégénérescence héréditaire de la rétine qui débute à partir de 3 semaines post-naissance. Les enregistrements classiques des signaux rétiniens à partir de 3 mois d’âge montrent un signal plat du fait de la dégénérescence totale. Nous les utiliserons à partir de 2 semaines d’âge jusqu’à 2 mois d’âge, afin de visualiser l’évolution des signaux rétiniens avec l’avancée de la pathologie.