Procédures sans réveil
Mise en place d’un modèle murin d’athérothrombose induite par rupture de plaque pour l’étude d’un nouvel agent médicamenteux 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées sur la table sans jamais reprendre conscience, 40 souris sont opérées sous anesthésie pour tester un peptide antithrombotique. Nourries au régime gras jusqu'à 28 semaines pour développer des plaques d'athérome, elles reçoivent deux injections intraveineuses, puis subissent une chirurgie de quinze minutes destinée à provoquer la rupture de la plaque et à filmer la formation du caillot. Le porteur indique que les actes chirurgicaux ne permettent pas le réveil des animaux. Le bénéfice avancé, un antithrombotique sans risque hémorragique accru pour des millions de patients, reste au conditionnel, quand la mort des 40 souris est programmée dès le protocole.
Objectifs
Dans le monde, les pathologies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité (environ 38 % des décès) devant les cancers. Les complications majeures de la thrombose survenant suite à la rupture d’une plaque graisseuse (plaque d’athérome) dans une artère sont l’infarctus du myocarde et les accidents vasculaires cérébraux. À la vue de ce constat, il est aujourd’hui essentiel de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre des cibles moléculaires originales impliquées dans ces processus. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre candidat peptide sont une diminution de la taille voir une absence de thrombus suite à la rupture/érosion de la plaque d’athérome. De plus, comme décrit précédemment des traitements antithrombotiques existent actuellement sur le marché cependant ceux-ci sont fortement corrélés à un risque accru de saignement. Le candidat peptide étudié dans notre procédure n’augmente pas le risque hémorragique. Ce candidat peptide pourrait donc conduire à un réel bénéfice clinique pour des millions de patients traités en prévention primaire ou secondaire de pathologies cardiovasculaires. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettra de valider et de renforcer les résultats obtenus précédemment et ainsi de démontrer l’effet antithrombotique de notre candidat peptide dans un modèle murin, et ainsi permettre d'avoir des données physiopathologiques qui se rapprochent des cas cliniques observés. En effet les patients les plus à risque de thrombose développent, au cours du vieillissement ou lors de pathologies chroniques, des plaques à l’intérieur de la paroi des artères.
Procédures
Pour toutes les souris de la procédure : injection d’anesthésique et d’analgésique, injection intraveineuse (2 fois), chirurgie (15 minutes). Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs : l'établissement utilisateur 1 pour l'hébergement des animaux et l'établissement utilisateur 2 pour la réalisation des expériences.
Impact sur les animaux
Au-delà d'induire une augmentation des constantes métaboliques (cholestérol total, LDL, notamment) par rapport à un régime standard et une prise de poids plus rapide, le régime gras n'induit pas de nuisances comportementales particulières au niveau des animaux. Les effets indésirables peuvent être un stress physique de courte durée et une douleur de courte durée à l’endroit des injections.
Devenir
A l'issue de la procédure les animaux seront euthanasiés sans douleur et encore sous anesthésie. Les actes chirurgicaux induits par la procédure sur les animaux ne permettent pas le réveil des animaux.
Remplacement
Nos résultats très encourageants d’une part sur des modèles ex vivo (expériences d’agrégation plaquettaire humaine, chambres de perfusion), et d’autre part sur les modèles in vivo avec les plaquettes de souris (modèle murin de thrombus carotidienne induite par le perchlorure de fer) nous permettent de penser que ce modèle permet de réconcilier les limites de chaque approche, et dans le futur, de se rapprocher de l’aspect physiopathologique de la clinique.
Réduction
Le nombre de souris par expérience est calculé pour permettre le plus faible nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats permettant une interprétation fiable basée sur des analyses statistiques adaptées
Raffinement
Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne). Puis, au cours de l’anesthésie, les signes vitaux seront surveillés avec une attention particulière portée à la respiration et au rythme cardiaque avec un maintien de la température corporelle grâce à une plaque thermorégulée et une lampe chauffante. L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole. Afin de pouvoir réaliser les expériences de microscopie intravitale nécessaire pour la mesure de la thrombose, les animaux seront transportés de l'Etablissement Utilisateur 1 (lieu d'hébergement pendant toute la durée du régime gras) à l'Etablissement Utilisateur 2 (lieu d'hébergement terminal avant réalisation des expériences et euthanasie des animaux). Les animaux seront transportés par véhicule personnel climatisé afin de conserver une température optimale pour les animaux de 20°C (5,8 km, 10 min de transport). Le transport sera effectué dans des cages de transport propres, dédiées, et les animaux seront remis en cage de stabulation avec eau et nourriture ad libitum dès leur arrivée.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans ce projet constitue le modèle de référence pour leur capacité à développer des plaques athéroscléreuses dans la paroi des artères. L'utilisation à 28 semaines de ces animaux après un régime riche en graisse permet de se rapprocher des conditions physiopathologiques retrouvées chez l'homme.
Autophagie neuronale et AVC ischémique: comprendre les mécanismes d’autophagie neuronale lors de la phase aigue des AVC ischémiques ainsi que l’impact de la thrombolyse par le rtPA sur ces processus
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Muscle masséter dissocié, crâne ouvert, artère cérébrale moyenne atteinte sous anesthésie pendant soixante-dix minutes, puis une IRM de trente-quatre minutes vingt-quatre heures plus tard : 250 souris vont être utilisées, dont dix opérées et tuées sans reprendre conscience, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les douleurs postopératoires, la perte de masse corporelle et des déficits fonctionnels sont attendus après l'induction de l'AVC. Il détaille en regard une couverture chauffante sous la moitié de la cage, de la nourriture humidifiée et un transport sans secousses. Les 250 souris sont tuées pour prélever les tissus destinés aux analyses immunohistochimiques.
Objectifs
Cette étude vise à comprendre le rôle de l’autophagie neuronale dans les processus de mort cellulaire et d’inflammation à la suite d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique. De plus, l’impact de la thrombolyse (injection de la forme recombinante de l’activateur tissulaire du plasminogène, rtPA) qui est l’actuel traitement pharmacologique en clinique lors d’un AVC ischémique, sur les processus d’autophagie neuronale sera également étudié dans ce projet. L'objectif de ce projet est d'observer la dynamique du processus autophagique neuronal et son impact sur la mort cellulaire et l’inflammation à la suite d’un AVC ischémique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l’autophagie neuronale ainsi que l'impact du rtPA sur la mort cellulaire et l'inflammation cérébrale et ainsi nous permettra de proposer de nouvelles pistes pour de potentielles stratégies thérapeutiques en combinaison de la thrombolyse par rtPA.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 34 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient des douleurs postopératoires après l’induction de l’AVC ischémique, notamment dû à la dissociation du muscle masséter pour procéder à la craniotomie. Les animaux sont susceptibles de perdent de la masse corporelle et de ressentir un stress après les anesthésies et l'induction du modèle d’AVC. Des déficits fonctionnels pourraient également survenir suite à l’AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (250 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 250 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total :250) a été évalué par une analyse statistique.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le reveil des animaux à l'issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est controlée et adaptée au bien être des animaux.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence pour l’étude de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-20 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation et des AVC.
Conséquences de l’invalidation simultanée de facteurs circulants hépatiques impliqués dans l’angiogenèse sur le système vasculaire de la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris génétiquement modifiées, privées dès la naissance de deux facteurs produits par le foie, BMP9 et BMP10, sont élevées pour tenter de reproduire la maladie de Rendu-Osler, qui fragilise les vaisseaux sanguins. 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Selon le porteur, beaucoup de nouveau-nés de cette lignée semblent ne pas survivre à la mise-bas, sans que l'équipe sache encore quand ni pourquoi, et des femelles gestantes sont tuées pour le découvrir. Chez les adultes, gardés jusqu'à huit mois, l'équipe attend un élargissement des vaisseaux et des connexions anormales entre artères et veines. En fin de procédure, ou plus tôt si des signes de souffrance apparaissent, ils reçoivent un analgésique, une anesthésie, puis une perfusion de fixateur ou jusqu'à trois injections, et sont tués sans réveil pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
La maladie de Rendu-Osler est une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, rupture de vaisseaux au niveau du foie, des poumons et dans des cas très rares dans le cerveau. Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie génétique rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Parmi les acteurs impliqués dans le développement de la maladie de Rendu-Osler, se trouvent des facteurs circulants dont l’origine peut être cardiaque ou hépatique. Les rôles spécifiques de chacun de ces facteurs ne sont pas identifiés. Nous générons des modèles de souris ayant perdu l’un des facteurs, cardiaque, ou hépatique. L’objectif de ce projet est de prouver que le facteur essentiel permettant de protéger les souris du développement de la maladie de Rendu-Osler proviendrait du foie et non du cœur, hypothèse de travail à valider auprès de la communauté scientifique. Nous étudierons les vaisseaux de différents organes, et notamment ceux touchés dans la maladie de Rendu-Osler (poumons, foie) afin de déterminer si la perte de ces facteurs permet de reproduire la maladie. Ces étapes sont essentielles à la compréhension du mécanisme de développement de la maladie et sont nécessaires à l’identification de nouvelles pistes de traitement des patients atteints de Rendu-Osler.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte d’expression simultanée de facteurs circulants impliqués dans la formation des vaisseaux sanguins et produits dans le foie. Ces facteurs, nommés BMP9 et BMP10 sont nécessaires pour protéger d’une maladie vasculaire, la maladie de Rendu-Osler. On peut anticiper que les défauts vasculaires que l’on va observer s’apparenteront à ceux de la pathologie humaine (mauvaises connexions entre les artères et les veines, hémorragies). Il est attendu que ces phénotypes apparaissent sur les animaux adultes comme c’est le cas dans la pathologie humaine. Ces résultats apportent des connaissances fondamentales sur une meilleure compréhension du développement de la maladie. Actuellement, seuls des traitements pour limiter les symptômes ou leurs effets existent l (traitement contre les saignements de nez, transfusion sanguine pour limiter les effets des hémorragies…) mais il n’y a pas de traitement curatif de la maladie. A court terme, des connaissances apportées par des publications scientifiques sont attendues visant à élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques (à moyen-long terme). C’est la première fois que des souris n’exprimant plus ces deux ligands, BMP9 et BMP10 hépatiques, et ce depuis la naissance, sont générées et nous espérons obtenir un nouveau modèle murin reproduisant les symptômes de la pathologie.
Procédures
Les animaux adultes recevront un analgésique 30 minutes avant l’anesthésie puis ils seront anesthésiés avant toute intervention (5 à 10 minutes avant tout geste invasif). Les gestes invasifs peuvent être une perfusion PFA pendant 15 minutes ou une injection d’un produit qui diffuse dans l’organisme pendant 10 à 15 minutes soir au total un maximum de 3 injections /animal. Les animaux ne sont pas réveillés à l’issue des procédures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent essentiellement les nouveau-nés, ou les fœtus en fin de gestation. Une précédente étude a montré que lors de la mise en place de l’élevage, le nombre de nouveau-nés n’exprimant pas les deux ligands était réduit par rapport à celui de nouveau-nés d’un élevage classique. Dans l’état actuel du projet, on ne sait pas encore quand et pourquoi les animaux génétiquement modifiés sont en nombre plus faibles le lendemain de la mise-bas: Une perte de fœtus est possible pendant la gestation ou au moment de la mise-bas. Nous attendons par contre des effets indésirables modérés chez l’adulte qui reproduisent certains symptômes de la maladie de Rendu-Osler (élargissement des vaisseaux, mauvaises connexions entre les artères et les veines). Il s’agit d’une maladie évolutive avec l’âge, les symptômes s’aggravant après 40 ans chez l’homme.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.
Remplacement
In vitro, les molécules que nous étudions sont deux molécules aux fonctions très similaires : L’une provient du foie, l’autre du cœur mais seule leur origine tissulaire, du foie ou du cœur permet de comprendre l’importance de chacune des molécules, dans le contexte d’un organisme vivant. Une de ces molécules contrôlent le développement des vaisseaux sanguins et on ne peut donc pas remplacer nos modèles animaux, ayant perdu l’expression des molécules spécifiquement dans un seul organe (en l’occurrence le foie) par des modèles in vitro pour démontrer l’importance de la source de production hépatique. La source principale de production est le coeur, et nos résultats indiquent pour la première fois un rôle essentiel de l’origine hépatique qui n’est pas du tout connu par la communauté scientifique et qui sera un élément déterminant pour comprendre comment la maladie de Rendu-Osler se développe avec l’âge.
Réduction
Nous avons effectué une analyse précise permettant de déterminer la taille des groupes nécessaires. Dix souris par groupe seront nécessaires. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les animaux reproduisant les symptômes de la maladie de Rendu-Osler sont générés uniquement pour rentrer dans une procédure mais ne sont pas utilisés pour la reproduction.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens (personnel assurant au sein de l’établissement des activités d'élevage ou de maintenance des d'animaux selon des protocoles établis). Les changements de litière, de biberon et l’apport d’alimentation sont pris en charge par les zootechniciens de façon quotidienne, y compris les week-end. Les cages contiennent des petites maisons et du matériel de nidification changé régulièrement comme dispositif d’enrichissement. Les femelles gestantes seront surveillées étroitement pendant la fin de la gestation et les nouveau-nés seront observés tous les jours dès la mise-bas. Chez les souris adultes, une mise en place de point limite permettra de s’assurer du bien-être des animaux. les animaux rentrent en dans une procédure expérimentale immédiatement si des signes de souffrance apparaissent. L’ensemble des interventions sera effectué sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet seront des souris génétiquement modifiées pour deux molécules jouant un rôle clé dans la maladie de Rendu-Osler , l’une d’origine cardiaque, l’autre d’origine hépatique. Ce modèle de souris est le seul existant actuellement permettant d’évaluer l’importance de la molécule hépatique, alors que toutes les recherches se sont jusqu’à présent consacrées au rôle global de la molécule, sans chercher à discriminer si l’origine tissulaire avait une importance. Pourtant il semble que les défauts de développement vasculaire sanguin de la pathologie de Rendu-Osler soit liés uniquement à la molécule hépatique. Pour évaluer le rôle de la molécule hépatique, les animaux seront utilisés à plusieurs stades : de la fin de la gestation et jusqu’à 8 mois maximum pour éviter l’aggravation des symptômes pouvant évoluer avec l’âge. Il semble que beaucoup de nouveau-nés génétiquement modifiés ne survivent pas à la mise-bas. Nous devons donc évaluer si les souris ont un problème de développement in utero, ou à la mise-bas. Pour répondre à cette question, des souris gestantes seront euthanasiées. Une étude sur des animaux jeunes (jour 6 ou 7 après la naissance) permettra également d’étudier le développement des vaisseaux sanguins juste après la naissance dans un modèle très couramment dans les laboratoires de recherche sur le système vasculaire. Enfin ces animaux seront suivis tout au long de leur vie, et les expériences seront réalisées sur des animaux adultes entre 3 mois et 8 mois pour déterminer les défauts vasculaires similaires à la pathologie de Rendu-Osler.
Prélèvement de produits biologiques d’origine animale sur lapin
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tués par exsanguination, 3 750 lapins sont exploités pour leur sang, leur sérum et leur plasma, 2 000 d'entre eux saignés au cœur sous anesthésie et tués avant tout réveil, 1 750 soumis sur animal vigile à des ponctions répétées de l'artère ou de la veine de l'oreille. Le porteur décrit des prélèvements pouvant atteindre 20 % du sang circulant, et annonce comme nuisances des saignements, des inflammations aux points de ponction, une anémie et une fatigue, tout en affirmant par ailleurs que ces volumes n'entraînent pas de fatigue. La mise à mort intervient dès que les veines et artères de l'oreille ne sont plus utilisables. Ces lapins, présentés comme des "excédents de production", fournissent des réactifs de diagnostic et des matériaux d'étalonnage que le porteur déclare non substituables.
Objectifs
L’objectif du projet est de fournir aux scientifiques des produits biologiques d’origine animale de lapins (sang, sérum, plasma). Ceux-ci ne pouvant pas être produits par des méthodes alternatives.
Bénéfices attendus
Les produits biologiques d’origine animale (PBOA) sont utilisés à des fins scientifiques. Ils permettront la préparation de diagnostics ou réactifs pour des tests biologiques comme par exemple les tests immunologiques , mais également comme matériaux d’étalonnage ou de contrôle.
Procédures
Les techniques utilisées pour réaliser les prélèvements de sang sont les suivantes : L’artère médiane et la veine marginale de l’oreille sont les voies décrites et utilisées chez le lapin vigile pour réaliser des prélèvements de sang. La quantité prélevée ne dépassera pas les recommandations éthiques en vigueur. Le volume prélevé ; la date de prélèvement ; le poids de l’animal ainsi que la voie de prélèvement et le temps de récupération nécessaire sont reportés dans un registre. Dans le cadre d’un prélèvement unique par jour, plusieurs choix sont possibles en fonction du temps de récupération : -0,75% du sang total circulant peut être prélevé sur 24 heures de récupération. Exemple pour 1 lapin de 3kg : 1mL -7,5% du sang total circulant peut être prélevé sur 1 semaine de récupération. Exemple pour 1 lapin de 3kg : 12mL -10% du sang total circulant peut être prélevé sur 2 semaines de récupération. Exemple pour 1 lapin de 3kg : 17mL -15 à 20% du sang total circulant peut être prélevé sur 4 semaines de récupération. Exemple pour 1 lapin de 3kg : 25 mL En cas de protocole prolongé (> 1 semaine) – une pesée hebdomadaire sera effectuée. Le prélèvement par voie intracardiaque sera réalisé après anesthésie générale. L’état général des animaux sera vérifié avant la réalisation du prélèvement. Une mise à jeun alimentaire peut être demandé par le scientifique.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de la production de produits biologiques d’origine animale (PBOA), sont les saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, l’anémie/fatigue de l’animal suite au(x) prélèvement(s), la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener du stress chez l’animal.
Devenir
Mise à mort dès lors que les voies d’accès aux prélèvements ne sont plus disponibles. L’animal décède par exsanguination terminal (mort de l’animal).
Remplacement
Les produits biologiques d’origine animale (PBOA) sont des produits utilisés par les scientifiques comme outil de diagnostics ou réactifs pour tests biologiques à partir du sang de lapin, non substituables par des méthodes in vitro ou composés chimiques.
Réduction
Les animaux sont prélevés uniquement en fonction des demandes des scientifiques sur l'année auprès de l’Etablissement Utilisateur, dans le respect des recommandations éthiques, notamment en termes de volume et de temps de récupération. Il n’y a pas de production d’animaux spécifique pour ces procédures. Les animaux utilisés sont des excédents de production.
Raffinement
Les lapins sont hébergés en groupe sociaux à partir du sevrage. Néanmoins en cas de conflit entre individus, certains animaux peuvent être isolés ; il apparait ici que reformer des groupes sociaux à postériori engendre de nouveaux conflits. Certains animaux peuvent être isolés si l’un ou plusieurs des congénères d’une même cage ont été retirés pour raison de vente . De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin et/ou balle plastique …), un cycle jour nuit est présent (16h/08h). Une anesthésie générale est réalisée avant le prélèvement par voie intra-cardiaque. Les prélèvements sont effectués sur des sites sans hématome - ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. Également, la peau de l’animal est désinfectée avec de l’alcool avant prélèvement. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de colle chirurgicale sera appliqué pour assurer l’arrêt du saignement. De par notre expérience – les volumes et fréquences des prélèvements n’entrainent pas de fatigue chez l’animal. L’équipe chargée de réaliser cette procédure est formée à la détection des signes cliniques et des points limites sont mis en place (terminaux non spécifiques, terminaux spécifiques et intermédiaire). Tous les animaux sont observés de manière quotidienne pendant toute la durée de l’étude et une observation minutieuse est réalisée au retour dans la cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les scientifiques demandent des produits biologiques type sang, sérum, plasma, issus du lapin. Ceux-ci ne peuvent pas être produits par des méthodes alternatives. Le lapin est âgé de minimum 5 semaines (âge du sevrage) afin que l’artère ou la veine soient accessibles. L’âge et le sexe du lapin sera ensuite adapté selon la demande spécifique du scientifique. Des femelles gestantes pourront aussi être utilisées selon la demande spécifique du scientifique. Le prélèvement par voie intracardiaque pourra être réalisé sur des lapins à partir de 3 semaines, en fonction de la demande du scientifique. Également le sexe du lapin est adapté à la demande du scientifique.
Evaluation d’un dispositif médical d’ablation par micro-ondes pour le traitement de tumeurs pulmonaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Soumis à une bronchoscopie de quatre à cinq heures sous anesthésie générale au cours de laquelle une zone de leur poumon est brûlée par micro-ondes, 25 cochons de 40 à 70 kg sont tués à l'issue pour analyse histologique, 17 d'entre eux sans reprise de conscience. Le porteur annonce comme complications possibles des saignements, une défaillance respiratoire, un pneumothorax, une pneumonie ou une pleurésie. L'objet du projet consiste à vérifier la performance et la sécurité d'un dispositif commercial d'ablation thermique avant son emploi sur des patients. Le porteur revendique l'intérêt de l'approche sans réveil parce qu'elle permet de multiplier les ablations sur peu d'individus, et invoque les attentes des autorités sanitaires pour écarter les essais sur tissus.
Objectifs
Le cancer du poumon est le 3ème cancer le plus fréquent et la 1ère cause de décès par cancer en France. Entre 2010 et 2023, si l'incidence de ce cancer diminue légèrement chez l’homme (-0,5 % par an), elle progresse fortement chez la femme (+4,3 % par an). Le taux de survie nette à 5 ans augmente mais reste mauvais, en effet au niveau mondial le nombre de décès est estimé en 2020 à 1 796 144 tous sexes et âges compris. Il existe différentes approches thérapeutiques face à ce cancer, incluant entre autres des approches chirurgicales permettant la destruction (l’ablation) des tumeurs en leur appliquant une source d’énergie ciblée, nécrosante. L’objectif du projet est d’évaluer la performance et la sécurité d’un nouveau dispositif médical, qui vise à traiter les tumeurs du poumon périphérique par ablation thermique, avant son application chez le patient.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à vérifier que ce dispositif d’ablation thermique peut être utilisé en sécurité pour traiter efficacement des zones pulmonaires localisées, en alternative aux approches qui nécessitent une thoracotomie, et ainsi apporter une solution thérapeutique mini-invasive supplémentaire contre le cancer du poumon.
Procédures
Un premier groupe d'animaux sera soumis à un examen d'imagerie scanner (rayons X) sous anesthésie d'une durée de 30 minutes, puis, 3 jours après, une chirurgie pulmonaire mini-invasive (accès par voie endobronchique) sera réalisée sous anesthésie générale, d'une durée de 4 à 5 heures. Un deuxième groupe sera soumis au même examen d'imagerie sous anesthésie de 30 minutes, puis, 3 jours après, à la chirurgie pulmonaire mini-invasive sous anesthésie générale de 2 à 3 heures, puis après 4 semaines, à un contrôle d'imagerie sous anesthésie de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont liés à l’anesthésie (nausée, désorientation, hypothermie, irritation trachéale) et à l’intervention chirurgicale au niveau des voies respiratoires dont les complications peuvent être des saignements, une défaillance respiratoire (obstruction des voies bronchiques, désaturation en oxygène, pneumothorax) ou l’infection (pneumonie, pleurésie).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser des analyses histologiques des organes traités.
Remplacement
Cette étude vise à évaluer la capacité du dispositif médical à effectuer une ablation tissulaire (coagulation) dans les poumons. De nombreux tests sur tissus synthétiques et organiques ont déjà été réalisés. Mais les études ex-vivo n'intègrent pas les effets du flux sanguin qui ont un impact considérable sur le transfert de chaleur et, par conséquent, sur l'étendue des dommages tissulaires induits par l’ablation thermique. En outre, les propriétés diélectriques des tissus peuvent également varier entre l'in-vivo et l'ex-vivo (en raison de la déshydratation), ce qui crée un environnement d'ablation inexact pour tester le dispositif. Selon les considérations générales des autorités sanitaires, les études sur les animaux sont nécessaires pour fournir des preuves initiales de la sécurité des dispositifs, de leur performance potentielle lorsqu'ils sont utilisés dans un système vivant, et de la réponse biologique qu'un système vivant peut avoir à l'égard du dispositif.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit eu mieux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs et conclure sur la fiabilité et l’efficacité du dispositif. L’approche aigue permet de réaliser un grand nombre d’ablations et de démontrer la performance du dispositif : les animaux n’étant pas réveillés, il est possible d’obtenir de nombreuses données sur un faible effectif animal. L’approche chronique se limitera à l’évaluation de la sécurité sur la base d’une à 2 ablations par animal. Des tests de faisabilité sur quelques individus seront réalisés en amont, avant d’engager des lots d’animaux dans les tests règlementaires.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe social, dans des box enrichis de jouets, avec une période d’acclimatation avant l’opération. Les paramètres environnementaux sont contrôlés, des récompenses sont distribués pour familiariser les animaux aux manipulations (prise de température, auscultation, palpation). Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, avec couverture antalgique et monitoring des fonctions vitales. Un expert pneumologue réalise les gestes spécifiques liés à la bronchoscopie, au déploiement et à l’utilisation du dispositif. Les animaux en survie sont étroitement surveillés jusqu’à leur réveil et durant les jours suivant l’intervention. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Des porcs charcutiers, mâles ou femelles de 4 à 6 mois sont retenus pour ce projet. A cet âge ils pèsent entre 40 et 70 Kg et leur anatomie pulmonaire est comparable à celle de l’homme. Cela permet de réaliser une bronchoscopie dans les mêmes conditions que chez le patient.
Caractérisation des phénotypes comportementaux d’un modèle murin porteur de deux mutations identifiées chez une patiente présentant une mort subite inattendue en épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 36 d'entre elles anesthésiées et tuées avant tout réveil. Porteuses de deux mutations relevées chez une jeune fille épileptique morte à 16 ans, elles reçoivent une puce sous la peau, boivent une eau acidifiée pendant quatre semaines, sont exposées à des sons de 110 décibels et reçoivent une injection d'agent convulsivant destinée à tester leur susceptibilité aux crises. Le porteur nomme les épreuves comportementales employées, labyrinthe à bras ouverts, arène, alternance, interactions sociales et test de mémoire, et indique qu'une souris qui convulse plus de trois minutes lors d'une manipulation est mise à mort. L'objectif déclaré se limite à vérifier si ces souris reproduisent les symptômes de la patiente, la validation du modèle conditionnant les recherches thérapeutiques annoncées ensuite.
Objectifs
Notre recherche porte sur la caractérisation in vivo de deux variants identifiés chez une jeune fille atteinte d’épilepsie frontale nocturne décédée brutalement au décours d’une crise d’épilepsie fatale. Les investigations génétiques ont permis d’identifier deux variants de deux gènes, chacun à l’état hétérozygote (où un seul chromosome porte la mutation). Les mutations liées à l'un des gènes sont rapportées dans l’épilepsie frontale nocturne et dans d’autres pathologies tel que le trouble du spectre autistique, mais pas aux crises d’épilepsie fatale. Plusieurs variants du deuxième gène ont été associés à des épilepsies focales héréditaires (dont l’épilepsie frontale nocturne) avec résistance aux médicaments et un risque accru de crise d’épilepsie fatale, mais le variant identifié dans notre cas n’a encore jamais été rapporté dans un cas de crise fatale. Notre objectif est ainsi de caractériser les souris portant les deux mutations afin de déterminer si elles reproduisent les phénotypes observés chez la patiente.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de valider les souris portant deux mutations pour deux gènes impliqués dans des crises d'épilepsie, mais également de mort subite et inattendue en épilepsie. En effet, le projet a pour but de déterminer les phénotypes comportementaux chez la souris et de les comparer à ceux observés chez la patiente afin de déterminer si les souris portant les deux mutations sont un bon modèle pour ces maladies humaines. Une fois le modèle murin validé, il permettra de caractériser les mécanismes physiopathologiques impliqués, ce qui facilitera l’identification des cibles thérapeutiques qui pourront ensuite être testées sur ce même modèle murin.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes). - Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. - Lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information, des sons à fréquence croissante seront présentés à l'animal sur plusieurs sessions (durée totale du test: environ 45 min). - test de susceptibilité aux crises épileptiques (injection d'un agent convulvisant): 5 sec; durée du test:20 minutes);
Impact sur les animaux
Le modèle murin étudié modélise la situation observée chez une patiente porteuse des deux mutations sur deux gènes différents présentant des crises hypermotrices frontales nocturnes, une forme d’épilepsie modérée pour laquelle elle était traitée depuis l’âge de 11 ans. Il est donc attendu que les souris porteuses de ces deux mutations présentent les mêmes symptômes d’épilepsie frontale survenant pendant le sommeil. Il faudra donc faire une surveillance renforcée des souris en journée pour voir si les souris (qui sont des animaux nocturnes) présentent des épilepsies. Les souris pouvant présenter des crises convulsives spontanées à n’importe quel moment de la journée, il est impossible de mettre en place un suivi permanent. Cependant, les crises ayant tendance à apparaitre après stimulation, elles peuvent se produire lors de la manipulation de l’animal. Si lors d'une manipulation, nous observons une souris qui convulse plus de 3 min (temps au-delà duquel les convulsions peuvent entraîner des dommages sur le cerveau), celle-ci sera euthanasiée. Par ailleurs, ce projet comprend une implantation d'une puce RFID en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'implantation. Le test acoustique présente quant à lui un inconfort léger notamment en raison des stimuli auditifs qui sont de 110dB et durent quelques ms.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des croisements ou de la réalisation de l'ensemble des expériences, pour prélever des organes en vue des analyses post-mortem.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. L’épilepsie étant causée par un déséquilibre de la balance excitation et inhibition dans le cerveau, il n’est pas possible d’étudier dans un modèle cellulaire l’impact de nos mutations sur le risque de survenue de crises épileptiques.
Réduction
Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Nous appliquerons des analyses statistiques adéquates pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles) : nombre et durée des entrées dans les bras ouverts d'un labyrinthe; distance parcourue et temps passé dans le centre d'une arène; nombre d'alternance; nombre et type d'interactions ; performance lors du test du mémoire; caractérisation des crises épileptiques après administration d'un agent pro-convulsivant.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Afin de prévenir la survenue de crises épileptiques, nous éviterons les bruits au maximum et nous manipulerons les souris avec douceur, en utilisant un tunnel lors de chaque manipulation et change de cage. La manipulation par tunnel sera mise en œuvre dès le sevrage afin que l’animal s’y habitue. Si lors d'une manipulation, nous observons une souris qui convulse plus de 3 min (temps au-delà duquel les convulsions peuvent entraîner des dommages sur le cerveau), celle-ci sera euthanasiée. Par ailleurs, chacune des lignées sera maintenue à l'état hétérozygote pour chacune des mutations individuelles, pour ne pas induire de phénotype dommageable
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme. En particulier, deux gènes sont fortement conservés entre la souris et l’humain. Par ailleurs, grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations ponctuelles dans le génome de la souris et modéliser ainsi une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques et cellulaires. Enfin, des résultats sont disponibles sur des modèles de souris ne portant qu'une seule des deux mutations, pouvant permettre de comparer ces résultats à ceux qui seront issus du modèle souris mutées pour les deux gènes. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 5 à 18 semaines. Cet âge a été choisi selon la symptomatologie clinique, la patiente portant ces deux mutations ayant présenté un tableau clinique à l'adolescence (âge du décès de la patiente à 16 ans).
Contourner les récepteurs opioïdes pour une antalgie plus sûre : activation directe des canaux TREK1 en aval
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, 4 446 souris subissent l'induction de huit modèles de douleur différents, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 552 souris classées en souffrance sévère et 30 anesthésiées puis tuées sans réveil. Le porteur décrit une douleur inflammatoire de la patte chez 480 animaux, puis chez 184 souris chacune une douleur post-chirurgicale, une arthrite du genou, deux douleurs neuropathiques dont l'une provoquée par chimiothérapie anticancéreuse, deux douleurs coliques et une migraine, avec des durées d'entretien de la douleur allant de trois heures à dix-sept jours. Les tests comportementaux réalisés après injection des composés ne sont pas détaillés. L'objectif déclaré consiste à évaluer des activateurs du canal TREK1 comme alternative aux opioïdes, le porteur indiquant que la mise à mort devient "obligatoire" en fin d'expérience parce que les modèles de douleur interdisent toute réutilisation.
Objectifs
Les opioïdes constituent une classe de médicaments antalgiques efficaces mais dont les effets indésirables sont un obstacle au soulagement des patients et à l’origine d’une crise sanitaire grave. La recherche d’alternatives thérapeutiques est aujourd’hui basée sur une évolution des modalités d’activation du récepteur mu aux opioïdes et ne résout que partiellement ce problème. Nous avons montré que le canal potassique TREK1 était impliqué dans l’effet antalgique de la morphine mais pas dans ses effets indésirables, et que l’activation directe de ce canal était antalgique et bien tolérée. En s’appuyant sur le récent développement de nouveaux activateurs du canal TREK1, ce projet vise à (1) déterminer dans quels contextes physiopathologiques cette stratégie antalgique est la plus efficace, (2) définir si cet effet antalgique fait intervenir les canaux TREK1 du système nerveux central et/ou périphérique pour guider le développement de futurs composés, et (3) évaluer les potentiels effets indésirables liés à l’activation de TREK1, notamment au niveau central. Ce travail permettrait une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la douleur, du potentiel antalgique des activateurs de TREK1 ainsi que de la sécurité de cette stratégie. Les activateurs du canal TREK1 pourraient en effet offrir une alternative aux opioïdes et constituer une nouvelle classe de médicaments antalgiques efficaces et mieux tolérés.
Bénéfices attendus
A l'issue de ce projet, nous aurons une vision claire du bénéfice thérapeutique potentiel des activateurs de TREK1, de leurs effets indésirables ainsi que des indications les plus pertinentes pour ces produits. L'étude de la contribution des canaux TREK1 centraux et périphériques à l'effet antalgique des composés permettra d'orienter le développement de nouveaux activateurs du canal. En effet, si l'effet antalgique est principalement périphérique, il pourra être intéressant de synthétiser des composés ne passant pas la barrière hémato-encéphalique pour limiter l'exposition du système nerveux central et donc les effets indésirables potentiels.
Procédures
Les interventions se limitent à des tests comportementaux réalisés dans les 3h suivant l'injection d'un composé chez des animaux, visant à évaluer l'effet anti-douleur et les éventuels effets indésirables de ce traitement. Chez certains animaux, un modèle de douleur est induit en amont de ces tests. Il s'agit de modèles de douleur inflammatoire de la patte : 3h30 chez 480 animaux - de douleur post-chirurgicale de la patte : 24h chez 184 animaux - d'arthrite du genou : 7 jours chez 184 animaux - de douleur neuropathique induite par chirurgie : 14 jours chez 184 animaux - de douleur neuropathique induite par chimio-thérapie anticancéreuse : 72h chez 184 animaux - de douleur colique inflammatoire : 12 jours chez 184 animaux - de douleur colique non-inflammatoire : 17 jours chez 184 animaux - de migraine : 9 jours chez 184 animaux
Impact sur les animaux
Les composés testés peuvent avoir une toxicité, que nous chercherons à évaluer par des échelles de doses. Ce projet nécessite également l'induction de modèles de douleur au sein de procédures qualifiées de modérées à sévèrees, et qui constituent de fait une nuisance pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue des expérimentations car les traitements réalisés ne permettent pas leur réutilisation. De plus, des procédures impliquent l'induction d'un modèle de douleur, ce qui rend leur euthanasie obligatoire en fin d'expérience.
Remplacement
Les composés activateurs de TREK1 seront sélectionnés par une approche in vitro, permettant le remplacement complet de l'utilisation d'animaux. Pour la troisième phase du projet, les premiers travaux seront réalisés ex vivo/in vitro sur des tissus ou des cultures de neurones. Ces expériences nécessitent le sacrifice d'animaux, mais permettent d'obtenir une grande quantité de résultats par animal, limitant le nombre total d'animaux utilisés au minimum. L'utilisation d'animaux vivants est donc limitée au strict nécessaire, à savoir l'évaluation de comportements et paramètres physiologiques nécessitant une approche intégrative, et qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet à ce jour d'appréhender.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée grace à un outil statistique dédié. Certaines procédures sont adaptées pour obtenir plus d'information à partir des mêmes animaux (par exemple, les tests de douleur seront couplés à un test de sédation), lorsque les tests réalisés chez les mêmes animaux n'interagissent pas ensemble et que la multiplication des tests n'engendre pas de nuisance supplémentaire. Pour les études de toxicité, le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum par l'utilisation d'échelles de doses sur un petit nombre d'animaux (augmentation des doses jusqu'à atteindre la dose maximale ou apparition d'effets indésirables). Une banque de tissus sera maintenue pour les expériences d'histologie, réduisant le recours à de nouveaux animaux pour chaque expérience.
Raffinement
Afin d'obtenir un maximum d'information des animaux utilisés, des tissus seront prélevés en fin d'expérimentation comportementale lorsque cela est pertinent (pour l'étude de l'expression de TREK1 ou de l'activation neuronale chez les modèles de douleur notamment). Afin de prévenir une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie, et sacrifiés si un point limite est franchi. En effet, si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié. Les cages contiendront un enrichissement de type maisonnette ainsi que du coton pour la constitution d'un nid.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur le modèle souris car c'est sur ce modèle qu'ont été mis au point au laboratoire toutes les techniques d'investigation comportementale et électrophysiologique ainsi que les différents modèles de douleur utilisés. C'est également le modèle pour lequel nous disposons du plus de données dans la littérature. Enfin, notre animalerie est une animalerie petit rongeur concue pour l'hébergement des souris, modèle sur lequel notre personnel a le plus d'expertise. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (8-12 semaines). Si la douleur touche essentiellement des personnes âgées, travailler sur la souris âgée représenterait un risque et surcoût extrêmement important qui mettrait en péril le projet dans son ensemble (coût d'achat d'animaux âgés et surmortalité de ces animaux). L'animalerie et son personnel ne sont pas en mesure d'accueillir à grande échelle des animaux âgés demandant une surveillance et des soins accrus et adaptés. Enfin, les tests et modèles utilisés, comme les données disponibles dans la littérature, concernent sauf cas très spécifiques des animaux jeunes.
Evaluation de thérapie génique dans un modèle murin de pathologie dominante liée à RYR1
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour tester une thérapie génique contre les mutations dominantes du gène RYR1, 336 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 40 d'entre elles anesthésiées et tuées avant tout réveil. Elles reçoivent un poinçon à l'oreille pour le génotypage, une injection unique dans l'abdomen ou dans le muscle, puis des tests de comportement destinés à mesurer leur force musculaire, dont la nature n'est pas précisée, toutes les deux semaines pendant deux mois. Le porteur indique que l'anesthésie peut déclencher chez les souris porteuses de la mutation une crise d'hyperthermie maligne, avec montée de température et contraction musculaire généralisée aux effets parfois fatals, et que le traitement lui-même peut entraîner une fonte musculaire. Toutes sont tuées pour prélever les muscles, le porteur affirmant qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer la force musculaire ou la sensibilité aux anesthésiques.
Objectifs
Le récepteur à la ryanodine RYR1 est une protéine essentielle à la contraction musculaire. Les mutations dans le gène qui code pour cette protéine conduisent chez l’homme à plusieurs maladies graves, héréditaires et rares du muscle squelettique. Les mutations dominantes de RYR1 peuvent ainsi conduire à la myopathie à cores centraux, ou à une maladie déclenchée comme l'hyperthermie maligne, les deux pouvant être associées chez un même patient. Il n'y a pas de traitement pour ces maladies qui peuvent être mortelles. La myopathie à cores centraux se caractérise par une faiblesse musculaire de sévérité variable chez les patients, prise en charge uniquement par kinésithérapie et corticothérapie en l'absence de tout traitement curatif. L’hyperthermie maligne est un accident d'anesthésie d'origine génétique induit par l'exposition à des certains produits anesthésiques. Elle se traduit lors de l'anesthésie par une augmentation rapide de la température du patient associée à une contracture généralisée qui conduisent à la mort si le patient ne reçoit pas rapidement un traitement adapté. La fréquence de l’hyperthermie maligne est d'environ 1/50 000 anesthésies. Ces deux pathologies étant intimement liées, après l'identification d'une mutation dans le gène RYR1, un patient myopathe est considéré comme sujet à risque d'hyperthermie maligne. Pour étudier les mécanismes physiopathologiques qui découlent de mutations dans le gène RYR1, plusieurs modèles de souris ont été développés. Dans ce projet, nous souhaitons développer une thérapie génique pour toutes les mutations dominantes de RYR1, quelque soit la pathologie qui en découle. Nous avons établi la preuve de concept dans des modèles de cellule en culture du bénéfice de cette approche, et nous souhaitons maintenant l'étudier chez l'animal. Nous utiliserons un modèle de souris porteur d'une mutation dominante qui conduit chez la souris à l'hyperthermie maligne.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de mutation dominante, sur les deux copies du gène RYR1, une copie est porteuse de la mutation alors que l'autre copie est saine. Nous souhaitons enlever la copie mutée et ne conserver que la copie saine, qui assurera à elle seule la fonction normale du muscle. Nous avons montré dans des cellules musculaire en culture que les fonctions essentielles la protéine RYR1 étaient améliorées avec cette approche thérapeutique, et nous allons maintenant montrer que ces fonctions sont améliorées également dans un organisme entier. Cette stratégie est novatrice car la même approche pourrait s'appliquer à tous les patients porteurs de mutation dominante dans le gène RYR1, mais également dans d'autres gènes associés à d'autres maladies génétiques.
Procédures
Le génotype des animaux sera vérifié sur un prélèvement réalisé par un poinçon à l'oreille, le prélèvement durera quelques secondes (moins de 5 s). Chaque animal subira au maximum une injection (soit dans l'abdomen, soit dans le muscle) d'une durée de moins de 20 secondes par animal, 1 seule fois dans sa vie. Sa force musculaire sera éventuellement mesurée par des tests de comportement réalisés pendant 2 mois toutes les deux semaines et d'une durée de 30 min maximum. Il subira une anesthésie gazeuse de 20 min maximum.
Impact sur les animaux
Les souris du modèle de l'hyperthermie maligne ne présentent pas de signe en dehors de l'anesthésie. Cependant, des nuisances apparaissent chez les animaux porteurs de la mutation lors d’une anesthésie réalisée avec certains composés conduisant à l'apparition d’une crise d'hyperthermie maligne, associant une montée en température et une contraction musculaire généralisée au cours de l'anesthésie. Concernant les autres nuisances potientielles, nous pouvons attendre : 1- Chez certains animaux le traitement pourra entraîner une myopathie progressive avec une fonte musculaire et une perte de la force musculaire. 2- Les injections abdominales et dans le muscle (1 seule fois) peuvent aboutir à des hématomes au site d’injection. 3- Des effets indésirables liés à une hausse de la température centrale corporelle qui peuvent être fatals durant l'anesthésie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort et les muscles prélevés pour réaliser des analyses moléculaires et biochimiques essentielles à la confirmation des phénotypes observés lors des tests comportementaux ou de sensibilité à l'anesthésique.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, permettant l’évaluation de la force musculaire ou la sensibilité à certains produits anesthésiques, et confirmant ainsi l'efficacite du traitement que nous voulons tester. Les outils ont été préalablement sélectionnés sur des cellules musculaires en culture et seul les meilleurs seront testés chez l'animal.
Réduction
Afin de limiter le nombre conditions et donc de réduire le nombre d'animaux vivants utilisés, nous réaliserons un criblage sur des cellules musculaires en culture, et seuls les outils validés seront testés chez les animaux. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de répétitions des expériences sont déterminés à l'aide de tests statistiques appropriés tout en optimisant l'interprétation statistique des informations recueillies. Le projet a été désigné pour une mise au point des étapes préliminaires sur un nombre réduit d'animaux, avant de tester uniquement la méthode optimale sur un plus grand nombre.
Raffinement
1- Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du premier février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Les animaux sont hébergés en groupe, en milieu adapté, à température constante, éclairage alterné (12h/12h), avec boissons et aliments sans restriction. 2- Les injections sont réalisées à l'aide d'aiguilles fines et changées à chaque animal. 3- Les tests de comportement sont réalisés après une période d'entraînement permettant de limiter le stress de la nouveauté. 4- Une grille de cotation adaptée est établie afin d'identifier les points limites les plus précoces, et de mettre en place les actions correctrices à apporter (antidouleur dans l'eau de boisson; aliment hydraté dans la cage).
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a permis de comprendre de nombreuses pathologies humaines, et la plupart des modèles animaux de maladies humaines sont des modèles souris. Ainsi, nous disposons d'une souche de souris, le modèle murin R163C, permettant de modéliser une altération observée chez des patients atteints d’hyperthermie maligne. Nous avons la possibilité également de croiser des souris de différents fonds génétiques afin d’utiliser la variabilité génétique naturelle existant entre les lignées de souris pour valider nos outils thérapeutiques. Des souriceaux seront utilisés à l'age de 15 jours. Cet âge est choisi comme le plus précoce permettant de réaliser une injection abdominale sur des animaux de faible poids et donc de diminuer les quantités de vecteurs viraux à injecter. Cet âge sera destiné a apporter une preuve de concept de l'efficacité maximale de notre stratégie en se placant à un stade précoce. Des souris adultes seront utilisées à 8-10 semaines. Cet âge correspond à l'âge jeune adulte des patients chez lesquels on découvre une mutation dominante dans le gène RYR1 associée à une susceptibilité à l’hyperthermie maligne (lors d’une anesthésie le plus souvent) ou une myopathie. Cet âge sera destiné à se rapprocher des conditions cliniques réelles pour les patients atteints de pathologie dominante liée à RYR1.
Optimisation de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par une approche d’ultrasons chez le porc pour la délivrance ciblée de médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour régler un système à ultrasons qui ouvre la barrière entre le sang et le cerveau, dans une collaboration entre entreprises privées et laboratoire public, 6 cochons d'environ trois mois vont être opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Pendant trois à cinq heures, chacun reçoit des cathéters dans la veine jugulaire et la carotide, subit une ouverture du crâne avec pose d'un implant, puis des injections de produits de contraste et des examens IRM. Le porteur annonce une hausse locale de température de 1,5 °C et une micro-hémorragie, sans douleur ni souffrance selon lui puisque l'animal reste anesthésié. Les gestes nouveaux sont d'abord répétés sur les corps d'animaux non-humains tués dans d'autres protocoles. Le porteur justifie la mise à mort finale par une chirurgie qui ne permettrait pas une récupération "sans nuisance majeure".
Objectifs
Les systèmes de génération d'ultra-sons pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique (BHE) sont utilisés dans le traitement de certains cancers du cerveau. Leur utilisation pour d'autres maladies cérébrales à ouvert de nouveaux espoirs. Cependant, leur utilisation pour des méthodes ne visant pas la destruction cellulaire, requière de nouveaux tests et mise au point en recherche pré-clinique. Ce projet est une collaboration entre des entreprises privées et un laboratoire publique. Grâce à une première collaboration sur modèle rongeur, nous avons pu optimiser les paramètres acoustiques et développer une nouvelle méthode d'analyse d'image utilisant 2 marqueurs de perméabilité membranaires afin de mieux quantifier l'ouverture de la BHE. L'objectif technique de la présente étude pré-clinique vise à valider notre méthode et sa performance sur un modèle plus proche de l'homme (pour les paramètres ultrasonores d'ouverture de la BHE), sur une autre modalité d'imagerie plus proche de la clinique (IRM) en comparant deux agents de contrastes de tailles différentes.
Bénéfices attendus
L'objectif moyen-terme du projet vise à permettre le démarrage des essais cliniques dans le traitement de maladies cérébrales afin d'évaluer si la méthode permet d'augmenter l'entrée des médicaments dans le cerveau. En effet, une première version du système est déjà utilisée en cancérologie. Néanmoins, l'utilisation à des fins de protection cellulaire et non de destruction cellulaire, pour d'autres pathologies cérébrales nécessite une meilleure caractérisation et calibration du système ultrasonores de sorte à ne pas induire de lésions thermiques. L'intérêt long-terme réside l'utilisation de cette méthode en pratique clinique courante dans le traitement pharmacologique des maladies cérébrales.
Procédures
L’animal est anesthésié profondément tout au long de l’expérimentation, jusqu’à l’euthanasie, soit environ 3-5h. L’expérimentation consiste en : - La pose de cathéters au niveau de la veine jugulaire et de la carotide - D’une craniotomie avec mise en place d’un implant - L’injection des produits d’intérêt par le cathéter, activation de l’implant et examens IRM
Impact sur les animaux
Deux effets liés au traitement par ultrasons peuvent survenir : une augmentation locale de la température de 1,5°C (n’engendrant donc pas de brûlure du tissus) et une micro-hémorragie localisée (ne remettant pas en cause la vie de l’animal pendant l’expérimentation et n’entrainant ni douleur, ni souffrance, ni angoisse sur l’animal anesthésié). Il s’agit de procédure sans réveil après l’expérimentation.
Devenir
Il s'agit d'une procédure sans réveil. La chirurgie prévue dans le protocole ne permet pas une récupération sans nuisance majeure pour l'animal. Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de la procédure.
Remplacement
L’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons a déjà été validée sur modèle in vitro, sur un modèle in vivo de rongeur et est déjà utilisé en clinique dans le traitement de certaines tumeurs cérébrales. Dans ce dernier cas, les ultrasons permettent de favoriser l'entrée de chimiothérapies dans la tumeur et génèrent un effet thermique destructeur supplémentaires. L'application à des pathologies dans lesquelles on voudrait apporter un traitement pharmacologique sans destruction cellulaire requière une amélioration et une évaluation du protocole de stimulation ultrasonore. L’impact sur le cerveau nécessite d’expérimenter sur animaux. Notre étude antérieure réalisée sur la souris a permis de tester un nombre important de configuration ultra-sonores et le présent projet vise à valider les meilleurs sur le modèle pré-clinique de porc.
Réduction
- Les effectifs ont été calculés au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement exploitables : le nombre d’animaux a été fixé à 6 afin de pouvoir comparer la diffusion des deux agents de contraste. Cette procédure étant une preuve de concept expérimentale sur gros animal, une augmentation des effectifs pour avoir plus de puissance statistique n'est pas nécessaire. - Afin de réduire le nombre d’animaux, nous réaliserons des tests de positionnement, de chirurgies et d’imagerie sur des animaux en post-mortem, à la fin d’autres protocoles expérimentaux. Ceci nous permettra d’acquérir une expérience pour réaliser notre procédure dans les meilleures conditions. - Enfin, l’utilisation de l’imagerie IRM permet de limiter le nombre d’animaux, chaque animal étant son propre contrôle.
Raffinement
L’intégralité de l’expérimentation (depuis la pose des cathéters jusqu’à la mise à mort de l’animal) sera réalisée sous anesthésie générale profonde et sous couverture analgésique adaptée . En outre, une partie de la chirurgie prévue dans ces procédures est une chirurgie acquise depuis longtemps par nos expérimentateurs : pré-anesthésie, pose de voie centrale veineuse et artérielle. La partie nouvelle de chirurgie, à savoir l’implantation du système à ultrasons, sera travaillée sur des animaux d’autres protocoles en cours, en post-mortem. Une fois les protocoles réalisés, notre équipe viendra travailler, en présences de neuro-chirurgiens afin d’acquérir les gestes adéquats à la réalisation du protocole. Le protocole ne commencera qu’après cette étape, et l’assurance que les gestes sont maîtrisés.
Choix des espèces
Suite à notre étude sur la souris, réalisée pour tester et affiner les paramètres ultrasonores utilisés et mettre au point une nouvelle technique d'analyse d'image permettant de quantifier l'ouverture de la BHE, et avant de pouvoir proposer des essais cliniques chez l'homme, nous avons choisi le porc qui est un bon modèle animal pré-clinique et qui permet d'utiliser le matériel d'usage clinique (poids de corps, volume de la tête et volume sanguins sont assez proches de ceux de l'homme) et de valider l’ouverture de la BHE et l’innocuité sur le tissu cérébral par l’IRM clinique. En outre, les protocoles déjà en cours au sein du laboratoire, nous permettrons d’acquérir les gestes chirurgicaux nécessaires, en amont de la phase pilote, sur des animaux en post-mortem. Nous utiliserons de jeunes porcs d’environ trois mois ayant un poids compris entre 35 et 40 kg. Notre laboratoire a une bonne expérience de l’utilisation de ces animaux, à cet âge. En effet, les résultats obtenus ont fait l’objet de nombreuses publications, issues de notre laboratoire. En outre, pour des raisons pratiques, les animaux de plus de 45-50 kg sont non adaptés à nos installations La taille de ces animaux sera suffisante pour l’implantation et la réalisation des images. Ces tailles seront comparables et transposables à des données cliniques.
Formation à la chirurgie cardiaque pour induire une insuffisance cardiaque chez le rongeur.
- Formation professionnelle
Rats : 105
Toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, 315 souris et rats subissent une ligature coronaire ou une constriction de l'aorte de vingt minutes sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 135 d'entre eux ne se réveillant jamais. Le projet ne vise aucune connaissance nouvelle, seulement l'entraînement de personnels aux gestes chirurgicaux avant les projets scientifiques. Le porteur indique que la douleur de l'infarctus est maximale pendant 24 heures et que l'insuffisance cardiaque qui s'installe s'accompagne d'ascite et d'œdème pulmonaire, provoquant fatigue, essoufflement, perte de poids et prostration. Il justifie ce recours par le risque d'avoir "trop de mortalité inutile" pendant les projets scientifiques ensuite, et affirme que l'usage de modèles animaux est "indispensable".
Objectifs
Ce projet vise à former des personnels à la réalisation de modèles animaux pour l’étude de l’insuffisance cardiaque. L’insuffisance cardiaque est une maladie fréquente, touchant un million de personnes en France et dont la fréquence d’apparition a doublé en 10 ans. Elle correspond à l’incapacité du cœur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Afin de respecter le principe des 3R (Réduction, Raffinement, Remplacement), le laboratoire développe au maximum des méthodes d’analyses in vitro. Cependant pour étudier la pathologie de l’insuffisance cardiaque, l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour l’évaluation de la fonction cardiovasculaire. En effet le système cardiovasculaire est régulé par des mécanismes physiologiques qui ne sont pas simulables dans toute leur complexité in vitro. Pour cela nous utilisons des modèles d’insuffisance cardiaque chez la souris ou le rat générés par des procédures chirurgicales. L’évolution de la pathologie peut être suivie par échocardiographie et permet ainsi de tester les hypothèses mécanistiques et thérapeutiques. Ces procédures sont complexes et nécessitent un apprentissage approfondi par l’expérimentateur sur des animaux contrôles avant de réaliser les expériences liées aux projets scientifiques dans les meilleures conditions et de respecter ainsi pour tous les projets scientifiques le principe des 3R. En l’absence de formation préalable, le risque est d’avoir trop de mortalité inutile pendant les projets scientifiques.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est de former le personnel afin d'avoir des modèles reproductibles et standardisés afin de mettre en oeuvre nos projets scientifiques de manière plus efficace.
Procédures
135 animaux seront intégrés dans des procédures sans réveil. Ils seront soumis à une procédure chirurgicale (induisant l'insuffisance cardiaque) de 20 minutes sous anesthésie générale. 180 animaux seront intégrés dans des procédures avec réveil. Ils seront soumis à une procédure chirurgicale (induisant l'insuffisance cardiaque) de 20 minutes sous anesthésie générale. Ils seront ensuite soumis à 3 échographies cardiaque sous anesthésie générale durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’infarctus du myocarde et la constriction de l'aorte peuvent entrainer plusieurs effets indésirables chez la souris et le rat. La douleur attribuable à l'infarctus du myocarde est maximale jusqu'à 24 h chez la souris et le rat . Les chirurgies réalisées entraineront des douleurs plus ou moins importantes selon que les animaux subiront ou non la ligature coronaire ou la constriction de l'aorte. L’insuffisance cardiaque qui va ensuite s’installer dans les groupes ayant subi la ligature de la coronaire ou la constriction de l'aorte va s’accompagner des signes cliniques de cette pathologie. Apparition d’une ascite et un œdème pulmonaire, qui provoquent fatigue, essoufflement, perte de poids et prostration. Au moment des chirurgies et de l’échographie les yeux des animaux peuvent subir un léger dessèchement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par disclocation cervicale afin de récupérer les différents tissus en vue d'expériences scientifiques ultérieures.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine. De plus, lors d’un infarctus, le corps met en place des régulations physiologiques impliquant le système neuro-hormonal. Ces régulations neuro-hormonales ne peuvent pas être reproduites in vitro ce qui rend indispensable l’expérimentation dans un modèle préclinique intégré. L'utilisation d'animaux se justifie également par l'incapacité d'obtenir une lignée cellulaire stable de cellules cardiaques.
Réduction
Les manipulateurs réaliseront une échocardiographie après chaque opération. Dès qu’une certaine homogénéité dans les opérations sera atteinte, celle-ci étant observée grâce à la mesure de fraction d’éjection, l’expérimentateur arrêtera son entrainement et pourra passer à un projet autorisé plus ciblé. Le critère de jugement principal sera la baisse de la fraction d’éjection cardiaque. Afin de minimiser le nombre d’animaux, cette formation utilisera des animaux issus de colonies transgéniques déjà présentes à l’animalerie et qui ne seront pas utilisés. A la fin des expérimentations les animaux sont euthanasiés et les organes pourront être prélevés afin de collecter le tissu pour des expérimentations de mise au point.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les animaux seront mis en cage et observés tous les jours. Les cages seront changées 1 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. Les procédures seront réalisées en respectant au maximum le bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront placées sur une table chauffante thermorégulée à 37 °C durant tout le temps de l’intervention chirurgicale et des échographies. Pour chaque injection, une anesthésie locale par application d’un gel de lidocaïne au point d’injection sera réalisée. Les yeux seront protégés du dessèchement par un onguent ophtalmique et de la lumière par une compresse humidifiée. Des critères bien spécifiques ont été determinés afin de mettre en place les points limites de cette étude.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont choisis car ce sont des mammifères qui constituent des modèles courants et classiques pour l'étude de la fonction cardiovasculaire y compris dans un contexte pathologique. Ce sont des modèles de choix car ils offrent la possibilité d’induire l’insuffisance cardiaque par des procédures chirurgicales. Des animaux adultes âgés de 7 à 10 semaines sont utilisés car les maladies cardiovasculaires se déclarent essentiellement à l’âge adulte.
Programmation métabolique de la fibrillation atriale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Anesthésiées pour un prélèvement de sang intracardiaque et tuées sans reprise de conscience, 324 souris sont suralimentées après la naissance et privées du gène du BDNF dans leurs cellules endothéliales, pour relier ces conditions à un trouble du rythme cardiaque. Le porteur décrit un geste court, deux minutes en moyenne, et signale surtout le stress de la préhension ainsi que celui infligé aux mères par la constitution des groupes deux jours après la naissance. Le récit des atteintes s'arrête là, alors que le projet repose sur l'installation d'une obésité et d'une atteinte cardiaque. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un "organisme entier", les modèles cellulaires ne reflétant pas l'environnement neuro-hormonal.
Objectifs
La fibrillation atriale (FA) est un trouble du rythme cardiaque touchant les oreillettes, qui les fait battre de manière irrégulière, c’est-à-dire de façon arythmique. Son apparition est favorisée par le vieillissement, l’obésité et par la dysfonction de l’endothélium vasculaire. Ce dernier est une barrière cellulaire entre les tissus et le sang. On parle de dysfonction endothéliale quand l’endothélium n’est plus en capacité d’assurer ses fonctions, comme la régulation de la perméabilité vasculaire et de la tonicité vasculaire (dilatation ou constriction des vaisseaux). L’activité endothéliale est dépendante de certains composés, notamment le brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Le BDNF est fortement exprimé dans les cellules qui composent l’endothélium (cellules endothéliales : CE) et dans les cellules qui permettent la contraction du cœur (les cardiomyocytes). Sa diminution est associée au développement de l’obésité, du diabète et des maladies cardiovasculaires. A l’inverse, un article récent souligne que le BDNF limite le phénomène de mort cellulaire des CE et des CM. Malgré tous les éléments disponibles dans la littérature, le rôle précis du BDNF dans la mise en place de la FA associée à des anomalies du métabolisme reste à déterminer. De plus, l’environnement au cours des premières étapes de la vie, pendant les périodes fœtales et postnatales, joue un rôle clef dans la détermination de la santé d’un individu. Dans ce cadre, on sait désormais que les conditions nutritionnelles avant et après la naissance peuvent influencer non seulement le poids corporel et le pourcentage de masse grasse, mais aussi favoriser à long terme le développement de maladies cardiaques et métaboliques. Le modèle de suralimentation postnatale (SAPN) chez le rongeur est particulièrement pertinent pour étudier la mise en place progressive de maladies cardiaques et métaboliques retrouvées chez l’humain adulte, en lien avec l’alimentation du début de la vie. Notre hypothèse est que des changements précoces de l’environnement nutritionnel pourraient prédisposer le cœur au développement d’une FA médiée par la voie du BDNF. L’objectif de ce projet sera d’établir le lien entre l’expression du BDNF endothélial vasculaire et la survenue de FA chez des souris suralimentées post natalement et KO pour le BDNF dans les CE.
Bénéfices attendus
L'un des principaux résultats du projet sera d'aborder le rôle du BDNF dans la FA métabolique d'un point de vue translationnel, ce qui ouvre la voie à la découverte de nouveaux mécanismes, cibles et médicaments grâce à la genèse d'un large éventail de données innovantes. Par exemple, certains résultats obtenus sur des modèles expérimentaux de rongeurs pourraient être pris en compte dans des études cliniques à grande échelle afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques pour traiter ou prévenir la FA. Ainsi, notre projet a des impacts scientifiques, socio-économiques et cliniques élevés. Les données obtenues dans ce projet seront régulièrement présentées à la communauté scientifique lors de conférences nationales et internationales annuelles. Les résultats seront publiés dans des revues d’audience internationale à comité de lecture.
Procédures
Des prélèvements sanguins intracardiaques et du tissu cardiaque seront nécessaires pour la réalisation de l’ensemble des expérimentations de ce projet. Ces prélèvements sont de courte durée et durent en moyenne 2 mins par souris, pour un temps d’anesthésie inférieur à 5 mins (induction + prélèvements).
Impact sur les animaux
La préhension préalable à l’induction de l’anesthésie en vue de prélever les tissus cardiaques ainsi que le sang pourrait induire un certain stress aux animaux. Les souris seront maniées avec douceur par du personnel formé à la manipulation de rongeurs de laboratoire. De plus, la constitution des groupes 2 jours après la naissance des souriceaux peut engendrer un stress chez les mères.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l’issue de ce projet afin de réaliser des prélèvements tissulaires et sanguins pour analyses biochimiques ultérieures.
Remplacement
Le syndrome métabolique est une pathologie multifactorielle. Pour apprécier l’incidence du syndrome métabolique induit par une SAPN sur la fonction cardiaque, il est indispensable de travailler sur un organisme entier et sur des cœurs isolés afin d’extraire uniquement un type cellulaire, notamment les cardiomyocytes. De plus, l’étude de la fonction et du métabolisme cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).
Réduction
Ne seront utilisés que le nombre d’animaux strictement nécessaire à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes (utilisation de tests statistiques adaptés aux petits échantillons). Le nombre de 9 animaux par groupes est suffisant pour obtenir des résultats statistiques.
Raffinement
Les souris seront constamment hébergées en groupe avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. L’évaluation de la douleur se fera à l’aide d’une grille de score et sa prise en charge sera faite par l’utilisation d’anesthésiques locaux et généraux. Enfin, des points limites ont été définis et seront respectés pour l’ensemble des procédures.
Choix des espèces
Notre équipe de recherche a une longue expérience de projets expérimentaux conduits chez la souris. La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés qui seront aussi utilisés dans ce projet. Pour l’étude de l’impact à plus long terme d’une SAPN sur le risque cardiométabolique, les animaux auront 6 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris et à l’apparition des maladies cardiaques chez l’humain.
Travaux pratiques de Physiologie animale pour la Licence et le Master de Sciences de la Vie et de la Santé
- Enseignement supérieur
Tués avant tout réveil, 1 105 rats sont anesthésiés de trente minutes à trois heures pour que des étudiants de licence et de master s'exercent à canuler la trachée, la veine jugulaire, l'artère carotide et la vessie, avant une injection létale. Le porteur décrit ces séances comme une formation pratique et non comme un travail de recherche, un animal servant à deux ou trois étudiants. Il indique que des travaux pratiques virtuels ou sur organes isolés existent et sont utilisés quand les objectifs pédagogiques le permettent, tout en jugeant ces séances sur animaux vivants "indispensables" aux étudiants visant un poste de technicien. Il conclut à l'absence de toute sensation, les procédures étant classées sans réveil.
Objectifs
Le projet concerne la formation pratique à l’exploration fonctionnelle des fonctions physiologiques respiratoire et cardiovasculaire d'étudiants de licence et de master en sciences de la vie et de la santé. Les 5 procédures concernées, correspondant à 5 travaux pratiques (TP) visent à former les étudiants aux techniques de canulation (artère carotide, trachée, veine jugulaire et vessie) et d’analyse fonctionnelle respiratoire et cardiovasculaire sur le rat anesthésié par injection intra-péritonéale d'un anesthésique (kétamine) et d’un analgésique (xylazine), ainsi qu’une injection sous-cutanée d’un anesthésique local (lidocaïne). Ces TP sont indispensables aux étudiants désireux de s'insérer sur le marché du travail avec un niveau de technicien et constituent également, pour ceux qui souhaitent poursuivre leurs études en 2e année de Master et doctorat, des TP préparatoires aux méthodologies nécessaires pour certains lors de leur stage pratique en laboratoire.
Bénéfices attendus
La mise en place de travaux pratiques utilisant des animaux vivants vise à initier les étudiants à l’expérimentation en physiologie animale, à leur enseigner les connaissances pratiques de techniques d'étude sur animal vivant et à les sensibiliser aux notions éthiques et réglementaires de l'expérimentation animale. Elle répond par ailleurs au référentiel de connaissances et de compétences en licence de Sciences de la Vie précisant que les étudiants doivent être formés à « appliquer les techniques expérimentales fondamentales en Sciences de la Vie dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire ».
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animaux anesthésiés sans réveil, pour une durée de 30 minutes à 3 heures maximum, selon les procédures. Chaque intervention est réalisée une seule fois. - cathétérisation de la trachée (20 à 30 min selon le niveau de formation) - cathétérisation de la veine jugulaire (30 min) - cathétérisation de l’artère carotide (30 min) - cathétérisation de la vessie (15 min) - injections létales (30 secondes)
Impact sur les animaux
Toutes les procédures sont classées « sans réveil », donc en absence de sensation, notamment de douleur, souffrance ou mal-être, durant la procédure sous anesthésie et, par définition, de douleur post-opératoire. L’absence de sensation est assurée par le contrôle de la profondeur de l’anesthésie générale, combinée à l’injection d’un anesthésique local préalablement à la réalisation des gestes invasifs.Le stress de la contention ou un inconfort lié à l'injection d'anesthésique peuvent être observés.
Devenir
Les procédures étant sans réveil, les interventions pratiquées ne permettent pas le réveil des animaux, et les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure avant retour à l’état de conscience.
Remplacement
Dans une stratégie de remplacement, lorsque les objectifs pédagogiques sont compatibles, les travaux pratiques (TP) sont des TP virtuels, ou réalisés sur organes isolés, hors procédure. Les TP sur animaux se limitent à des enseignements de spécialisation, et concernent, par rapport aux effectifs totaux, un nombre restreint d’étudiants ayant choisi de suivre ces enseignements en rapport avec leurs objectifs professionnels
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les étudiants dans les enseignements à forts effectifs (plus de 100 étudiants) travaillent en trinôme lors des 3 séances de TP. Pour les formations à plus faible effectif (moins de 20 étudiants), les étudiants travaillent en binômes. Un seul animal est donc utilisé pour 2 ou 3 étudiants, de manière à limiter le nombre d’animaux utilisés, en fonction des objectifs pédagogiques.
Raffinement
Toutes les procédures sont classées « sans réveil », donc en absence de sensation, notamment de douleur, souffrance ou mal-être, durant la procédure sous anesthésie et, par définition, de douleur post-opératoire. L’absence de sensation est assurée par le contrôle de la profondeur de l’anesthésie générale, combinée à l’injection d’un anesthésique local préalablement à la réalisation des gestes invasifs, superficiels. L’anesthésie est assurée par l’association d’un d'anesthésique général, la kétamine, associée à un sédatif/analgésique/myorelaxant, la xylazine, ce qui induit une anesthésie profonde d’environ 45 min. Durant l’anesthésie, la température corporelle est maintenue à la valeur physiologique (37°C) par le maintien de l’animal sur un tapis chauffant adapté. Pour limiter le stimulus nociceptif induit par la procédure de pose des cathéters, une anesthésie locale (lidocaïne) préalable des zones cathétérisées est réalisée. De plus, lorsque cela est compatible avec l’interprétabilité des données, les systèmes invasifs de recueil des paramètres physiologiques (comme la pose d’un cathéter trachéal) sont remplacés des systèmes non invasifs (comme la pose d’un masque à anesthésie). L’enregistrement des paramètres physiologiques n’est pas en lui-même douloureux. L’évaluation de la profondeur de l’anesthésie est évaluée régulièrement en peropératoire par l’absence de réflexe podal et de réflexe palpébral. Les signes avant-coureurs du réveil (réponse au pincement de la patte, réflexe palpébral, apparition de mouvement spontané) sont attentivement surveillés et, s'ils apparaissent avant le moment prévu de la réinjection régulière d’anesthésiques, entrainent une injection anticipée d’anesthésique et de sédatif, de façon à éviter toute souffrance ou angoisse à l'animal. Des points limites appropriés sont définis et appliqués. En amont des procédures proprement dites, le bien-être des animaux et l’absence de stress ou douleur sont assurés lors de l’accueil et de l’hébergement des animaux par une période d’acclimatation dans la zone de stabulation d’au moins 5 jours avant les TP et un hébergement en groupes sociaux stables dans un environnement calme avec un enrichissement adapté à l’espèce (tunnels translucides rouges ; lanières de bois pour paille de nid.)
Choix des espèces
Le rat, outre le fait d'être classiquement utilisé dans les laboratoires de recherche, présente l'avantage par rapport à la souris d'être de taille plus importante et donc de faciliter la canulation de la trachée, des différents vaisseaux et de la vessie. Animaux adultes jeunes de taille moyenne (250 - 400 g) afin de standardiser au maximum les procédures (adéquation entre le diamètre des vaisseaux et le diamètre des cathéters disponibles) et de faciliter la canulation des différents vaisseaux et de la vessie par les étudiants se formant à ces gestes techniques. Des rats mâles ou femelles seront utilisés selon leur disponibilité auprès des fournisseurs, l’analyse des paramètres étudiés ne dépendant pas du sexe.