Procédures sans réveil

Opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 4 porcelets de 45 kg subissent chacun une chirurgie de deux heures de remplacement de l'œsophage par un œsophage humain décellularisé. Le projet ne produit pas de connaissances mais entraîne une équipe de chirurgiens et d'endoscopistes avant les premiers essais chez des humains, le porteur décrivant la répétition comme un moyen de "mémorisation" du schéma opératoire. Il affirme qu'il n'existe ni modèle in vitro ni modèle in silico et que le recours à l'expérimentation animale est donc "indispensable". Le choix de porcs charcutiers est justifié par l'habitude de l'équipe et par la longueur de leur œsophage.

Objectifs

L’objectif de l’étude actuelle est de parfaire la mise au point et de codifier précisément la technique de remplacement circonférentiel et segmentaire d’œsophage porcin par un oesophage décellularisé humain, avant d’effectuer les premiers remplacements chez l’homme.

Bénéfices attendus

L'expérimentation permettra de mettre au point, aux dimensions et avec des contraintes similaires à l'homme, l'ensemble du schéma opératoire, de codifier le remplacement œsophagien avec l’œsophage décellularisé humain et de poser l'endoprothèse par endoscopie. Enfin la répétition permettra la mémorisisation du schéma opératoire afin de limiter les risques pour les patients lors de l’essai clinique.

Procédures

Les interventions prévus sont des procédures chirurgicales sous anesthésie générale et antalgie sans réveil d'une durée de 2 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendus sur les animaux sont sur le circuit en pré-opératoire : la douleur associées aux injections et le stress des anesthésies.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure sans réveil

Remplacement

La mise au point et l’entrainement de l’équipe de chirurgien et d’endoscopiste au remplacement œsophagien sur un modèle de gros animal proche anatomiquement de l’homme a l’avantage de mimer les différentes étapes nécessaires à la réalisation du protocole chirurgical. Le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur des tests chirurgicaux au sein d’un organisme vivant complexe. Il n’y a ni modèle in vitro ou ni modèle in silico, le recours à l'expérimentation animale est donc indispensable. En effet, le déroulement du protocole sur ce modèle permettra d’être réalisé aux mêmes dimensions avec des contraintes similaires à ce qui sera réalisé chez l’homme. Enfin, la mise au point des différentes étapes permettra à la fois de prévoir le dérouler du remplacement œsophagien mais également de répéter et de mémoriser correctement le schéma opératoire afin de limiter les risques pour les patients lors de l’essai clinique.

Réduction

Les procédures chirurgicales de remplacement de l'oesophage par un oesophage décellularisé humain seront répétées et perfectionnées sur des porcs. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux. Cette stratégie nous permet de n’inclure que 4 animaux dans le groupe de mise au point chirurgicale. Le nombre total d’animaux a été décidé pour permettre à l'équipe chirurgicale de pouvoir réaliser 2 mises au point et 2 répétitions, préalable à l'essai clinique chez l'homme.

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi avec des jouets). Les animaux auront une anesthésie durant toute la durée de l'expérimentation et ils seront mis à mort à la fin sans réveil. Une pré-médication est assuré avec l'injection de deux médicaments. Pour l'anesthésie, un cathéter veineux est mis en place dans l’oreille, puis elle sera induite par injection de médicament.

Choix des espèces

Le choix du porc repose sur la nécessité d’étudier des animaux monogastres dont la physiologie et l’anatomie se rapprochent de celles de l'Homme. Par ailleurs, le porc a un œsophage suffisamment long pour permettre la résection d’un segment de 5 cm et la mise en place d’une endoprothèse, ce qui ne peut être réalisé chez le petit animal. Les porcs choisis sont des porcs charcutiers pour lesquels les membres de notre équipe ont l’habitude de ce modèle sur lequel toutes les expérimentations antérieures ont été réalisées. Enfin, toutes les expérimentations menées jusqu’à présent dans ce projet l’ont été sur ce même modèle animal. Les porcs opérés seront âgés de 6 à 8 semaines pesant environ 45 kgs à ce stade (poids maximal à l’âge adulte d'environ 150 kilogrammes), d’une taille adaptée à la chirurgie et à la taille des endoprothèses, sans être excessive, ce qui compliquerait les installations.

Opérés pendant environ quatre heures sous anesthésie puis tués sans réveil, 12 cochons subissent une série d'ablations, hystérectomie, splénectomie, résection digestive et curages, reproduisant une chirurgie du cancer de l'ovaire. Ces gestes ne visent aucun soin pour l'animal mais servent à tester un dispositif d'illumination de la cavité abdominale et à mesurer la lumière qu'il délivre. Le porteur qualifie cette illumination homogène d'"indispensable" à la thérapie photodynamique visée chez les patientes. Le choix du porc tient à la taille et à l'anatomie de son abdomen, proches de celles d'une femme.

Objectifs

Des études précliniques ont permis de démontrer l'efficacité de la thérapie photodynamique (PDT) sur la carcinose péritonéale d'origine ovarienne, actuellement en impasse thérapeutique. Trois études cliniques ont également mis en évidence la faisabilité de la PDT dans cette indication. La PDT a pour objectif de détruire les cellules tumorales résiduelles, laissées après exérèse des tumeurs visibles à l'oeil nu, disséminées dans la cavité péritonéale afin d'éviter les récidives de la maladie. En pratique, la PDT pourrait être intégrée au standard de traitement en étant proposée durant la chirurgie de cytoréduction, une fois que l'exérèse de la maladie macroscopie est réalisée. Cependant, aucun dispositif ne permet, à l'heure actuelle, l'illumination de la cavité péritonéale de façon homogène. Or, celle-ci est indispensable à la réalisation d'une PDT efficace. C'est dans ce contexte que nous avons développé un tel dispositif d'illumination. A ce stade du projet, la dernière étape avant une étude clinique permettant de démontrer l'efficacité de la PDT sur les patientes atteintes de carcinose péritonéale ovarienne à l'aide du dispositif développé au sein de la notre laboratoire, est une étude de faisabilité sur le gros animal. Ainsi, les objectifs de cette étude préclinique sont au nombre de 4. L'objectif principal est de s'assurer de la faisabilité d'une illumination de la cavité péritonéale à l'aide du dispositif lumineux faisant l'objet de l'étude en vérifiant que celui-ci peut être installé facilement et rapidement dans la cavité péritonéale. Nous mesurerons également les quantités de lumière que notre dispositif est capable de délivrer au sein de la cavité péritonéale, une fois inséré dans le corps de la patiente. Nous nous intéresserons également à la lumière que délivre le scialytique, lampe située au dessus de la patiente pendant la chirurgie, potentiellement capable d'induire un effet de PDT. Ainsi, le second objectif est de mesurer les doses de lumière par le scialytique en association avec le dispositif développé. Le troisième objectif consiste à mesurer les doses de lumières délivrées par le scialytique durant l'intervention chirurgicale. Enfin, afin de maximiser les quantités de lumière délivrées dans la cavité péritonéale et ainsi l'effet thérapeutique de la PDT, le 4ème objectif consiste à déterminer si une illumination à l'aide d'une partie du dispositif lumineux est possible pendant la chirurgie, sans gêner le chirurgien opérant.

Bénéfices attendus

Les cellules cancéreuses persistantes à l'issue de la chirurgie de cytoréduction sont responsables du taux élevé de récidive (60 à 70%). La PDT a pour objectif l'illumination de ces cellules tumorales résiduelles. L'étude préclinnique faisant l'objet de cette DAP vise à accélérer le positionnement de la PDT comme traitement adjuvant pour les patientes atteintes de carcinose péritonéale d'origine ovarienne. L'objectif a long terme, est de réduire le taux de récidives et ainsi augmenter la survie globale de ces patientes.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui durera environ 4h. Durant cette intervention, l'animal subira une série de gestes chirurgicaux : exploration de la cavité abdominale (temps estimé: 10minutes), hystérectomie avec annexectomie bilatérale (20 minutes), omentectomie infragastrique (15minutes), résection/fulguration du péritoine des coupoles diaphragmatiques (25minutes), résection digestive (30minutes), péritonectomie étendue (Espace de Morrisson, cul-de-sac de Douglas et espace vésico-utérin, 30 minutes), curages lombo-aortique (30 minutes), curages pelviens (30 minutes) et splénectomie (20 minutes), identiques à ceux réalisés chez les patientes atteintes d'une carcinose péritonéale d'origine ovarienne. La quantité de lumière délivrée au sein de la cavité abdominale sera mesurée durant chaque geste. Ces gestes ont également pour objectif de permettre la réalisation du test d'insertion du dispositif lumineux dans les conditions identiques à la pratique clinique. Des points de suture seront réalisés sur le péritoine pour permettre la fixation de 16 capteurs de lumière (11 capteurs isotropiques et 4 photodiodes) et les textiles lumineux qui composent le dispositif lumineux (1 point de suture par élément). Après réalisation de tous les gestes chirurgicaux et une fois les capteurs de lumière et le dispositif lumineux (textiles lumineux et baguette lumineuse) en place, la cavité péritonéale sera remplie d'une solution diffusante d'intra-lipide chauffée à 37°C. S'en suivra une ilumination de 30 minutes. A la fin de la procédure, l'abdomen de l'animal sera refermé avant de réaliser l'euthanasie de l'animal.

Impact sur les animaux

L'animal, sous anesthésie générale, subira une série de gestes chirurgicaux après l'exploration de la cavité péritonéale, à savoir: la réalisation d'une hystérectomie associée à une annexectomie bilatérale, une omentectomie infragadtrique, l'exérèse du péritoine en regard des coupoles diaphragmatiques ainsi qu'au niveau de l'espace de Morrisson, une résection digestive concernant l'intestin grêle, la réalisation d'un curage lombo-aortique associé à des cueages pelviens, ainsi q'une splénectomie. Ces gestes sont susceptibles d'entraîner des douleurs durant la chirurgie. Toutefois, une analgésie sera administrée au début de l'intervention et au besoin, au fil de l'intervention, afin que l'animal ressente le minimum de douleur possible. Par ailleurs, il ne sera pas réveillé à l'issue de la chirurgie, on ne prévoit donc pas de nuisance ou d'effet indésirable.

Devenir

Afin de leur éviter un réveil difficile après la procédure chirurgicale, les animaux ne seront pas réveillés de l'anesthésie. Ils seront donc euthanasiés à l'issue de la procédure.

Remplacement

Une étude préalable sur un modèle de cavité péritonéale, développé au sein de notre laboratoire, a permis une optimisation des emplacements dans lesquels seront placés les dispositifs lumineux et les capteurs de lumière nécessaires à la réalisation de la dosimétrie. Le banc de mesure optique (capteurs de lumière, photodiodes et puissance-mètres), associé à ce modèle de cavité péritonéale, a également été défini et calibré sur la base de ces essais sur un modèle de cavité péritonéale. Cependant, notre modèle ne tient pas compte des propriétés optiques des tissus biologiques et ne permet donc pas une estimation pertinente des quantités de lumière qui seront réellement délivrées au sein de la cavité péritonéale de la patiente en clinique. Ce modèle ne permet pas non plus de mimer une chirurgie de cytoréduction complexe, telle que réalisée sur une patiente. Or, cette chirurgie de cytoréduction est indispensable à l'étude de faisabilité de l'insertion du dispositif qui doit être faîte dans des conditions les plus proches possibles de la réalité clinique. De plus une étude précise de la littérature, ne nous permet pas d'affirmer qu'aucun modèle adapté à notre étude, commercialisé ou expérimental, n'existe à l'heure actuelle. Avant d'envisager une étude clinique, il est donc indispensable de réaliser une étude de faisabilité et de dosimétrie sur le gros animal.

Réduction

Notre protocole, précisément défini, ainsi que les études préalables sur modèle de cavité péritonéale, nous permettent de réduire au strict minimum le nombreux d'animaux inclus dans la présente étude, afin d'émettre une conclusion scientifique recevable en terme de faisabilité et de dosimétrie. Toutefois, il s'agit d'une étude pilote de faisabilité, ainsi, aucune approche statique n'a été réalisée.

Raffinement

Une attention particulière sera portée à la santé et au bien-être des animaux. Durant leur hébergement, des jouets et des confs (pour jouer tout en cherchant la nourriture) seront mis à disposition dans leur enclos. L'enclos, qui sera isolé du sol par des caillebotis, leur permettra d'avoir des interactions sociales avec leur congénères. Durant notre procédure, nous nous assurerons que l'animal ne ressente aucune douleur grâce à une analgésie une anesthésie profonde adaptées. Les points limites ont été soigneusement définis : durant la chirurgie, si une hémorragie, une hyperthermie, un trouble cardiaque ou respiratoire, ou une douleur sont observés, la procédure sera stoppée afin de se concentrer sur le rétablissement de l'animal. Afin de leur éviter un réveil difficile après la procédure chirurgicale, les animaux ne seront pas réveillés. De plus, le protocole des expérimentations prévues a été défini dans les moindres détails et validé par les chirurgiens gynécologues associés à l'étude. Cela permettra notamment de réduire le stress de l'équipe et ainsi le risque d'erreur de manipulation sur le cochon anesthésié. Les chirurgiens gynécologues opérant sur les cochons anesthésis sont des chirurgiens expérimentés ayant déjà pratiqué de nombreuses chirurgies de cytoréduction sur patientes atteintes de carcinose péritonéale d'origine ovarienne. Ils ont également pu s'entraîner à l'installation du dispositif lumineux et des capteurs de lumière sur le modèle de cavité péritonéale développé au sein de notre laboratoire.

Choix des espèces

Nous avons choisi le porc pour deux raisons. Premièrement, l'étude nécessite que la taille de la cavité péritonéale de l'animal se rapproche le plus possible de la taille de cavité péritonéale de la femme, cible de notre thérapie. Deuxièmement, le porc est l'animal donc l'anatomie (en termes d'organes présents dans la cavité péritonéale et de leurs positions) se rapproche le plus de l'anatomie de la femme. Les animaux utilisés seront adultes car nous avons besoin que les organes de la cavité péritonéale soient complètement formés et qu'ils aient atteint leur taille adulte.

200 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie unique pouvant durer jusqu'à trois heures, avec l'implantation de sondes destinées à mesurer la répartition du dihydrogène dans les organes, et le porteur signale des risques de détresse respiratoire et d'hémorragie. Le projet cherche à décrire la distribution et l'élimination du H2 selon la voie d'administration, présenté comme un candidat médicament. Le porteur affirme qu'aucun modèle sans animaux ne peut remplacer la complexité du corps et qualifie cette étape d'"incontournable".

Objectifs

Le dihydrogène (H2) est un candidat médicament très intéressant de par ses effets bénéfiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore du cancer. La petite taille de l'H2 lui permet de diffuser facilement dans les tissus et les organes. Lors de précédentes études, l'évolution de la concentration en H2 dans le coeur et dans le sang, pendant une administration par inhalation, a été explorée chez le rat. Au cours de ce projet, l'évolution de la concentration en H2 sera mesurée grâce à une sonde implantée dans différents tissus cibles. La présente étude permettra de déterminer la distribution et la vitesse d'élimination de l'H2 dans les différents organes suite à son administration par différentes voies et de qualifier chaque voie d'administration sur un plan qualitatif et quantitatif.

Bénéfices attendus

Ce projet est une étape incontournable pour la mise au point de nouvelles thérapies basées sur l'H2 qui permettront de soigner des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore le cancer.

Procédures

Chaque animal subira une intervention chirurgicale unique d'une durée maximale de 3 heures. Un même animal sera soumis à une anesthésie complémentée avec une analgésie, suivie d'une administration d'H2 par différentes voies possibles. La quantité d'H2 distribuée dans différents tissus sera mesurée à l'aide d'une sonde. Au terme de la mesure ou des trois heures, l'animal sera mis à mort sans réveil préalable.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent présenter des signes de détresse respiratoire ou des hémorragies.

Devenir

La procédure proposée est en classe "sans réveil", la mise à mort des animaux est donc incluse dans cette procédure et inévitable du fait du caractère lésionnel des abords chirurgicaux et de l'utilisation des sondes de mesure.

Remplacement

La présente étude a pour objectif de caractériser précisemment la distribution de l'H2 dans les différents organes et son élimination suite à un traitement à l'H2. Actuellement, il n'est pas possible de remplacer la complexité du corps humain par des modèles n'utilisant pas d'animaux, d'où la nécessité de leur utilisation dans ce projet.

Réduction

Un maximum de 200 rats sera utilisé dans ce protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux il est prévu d'effectuer les mesures d'H2 dans plusieurs organes par animal car nous disposons de plusieurs sondes. Il est envisagé qu'une dizaine de modes d'administration d'H2 seront testés, chaque groupe expérimental sera constitué de 20 animaux (10 contrôles et 10 traités ; prenant en compte une éventuelle mortalité due à l'opération d'environ 10%). Ce nombre d'animaux permettra de réaliser un test statistique afin de valider nos résultats. De plus, des animaux venant d'autres protocoles de contrainte légère à modérée pourront être utilisés.

Raffinement

Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. L'ensemble des personnels impliqués est à jour des formations réglementaires exigibles pour les manipulations sur des animaux vivants. Le rat correspond à l'espèce animale la plus pertinente dans ce type d'étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. L'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale complémentée par une analgésie.

Choix des espèces

Les similitudes d'anatomie et de physiologie entre le rongeur et l'Homme permettront d'obtenir une comparaison fiable des données obtenues et une meilleure compréhension de la distribution de l'H2 dans l'organisme. De plus, le diamètre des sondes utilisées (1,1-1,6 mm) est compatible avec la dimension des organes cibles de l'étude. Nous utiliserons des rats adultes de minimum 7 semaines pour les mâles et 10 semaines pour les femelles (d'un poids corporel supérieur à 300g). Ce sont les animaux les plus couramment utilisés en pharmacologie de sécurité.

300 souris vont être utilisées dans des procédures chirurgicales menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris subit une intervention pouvant durer jusqu'à une heure trente, pose de pompe, ablation des ovaires, vasectomie ou pose de cathéter, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnes aux gestes chirurgicaux. Le porteur indique recourir à des animaux de réforme issus d'élevages, qui ne peuvent être replacés. Il décrit une formation ex vivo sur peau artificielle mais affirme pertinent de la compléter par des séances sur animaux vivants.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de permettre aux utilisateurs de se former aux différentes techniques chirurgicales qu'ils seront amenés à réaliser.

Bénéfices attendus

Cette formation permettra aux utilisateurs de mieux appréhender et maitriser les gestes chirurgicaux qu’ils seront amenés à réaliser.

Procédures

Procédures chirurgicales sur animaux anesthésiés et analgésié du début à la fin (pose de pompe diffusant des substances, ovariectomie, vasectomie, pose de cathéter) / 1 procédure maximum par animal / 1h30 maximum

Impact sur les animaux

En théorie, les animaux étant mis à mort à la fin des expériences et ces expériences étant effectuées sous anesthésie et analgésie, aucune nuisance particulière n’est attendue pendant ces phases du projet.

Devenir

Ces animaux sont des animaux de réforme issus d’élevages qui ne peuvent être replacés, les procédures sont sans réveil.

Remplacement

La formation à la chirurgie expérimentale est une obligation réglementaire pour les concepteurs et les réalisateurs de procédures expérimentales incluant des procédures chirurgicales. Nous avons mis en place une formation à la chirurgie rongeurs en ex vivo (ne contenant pas d'animaux). Pour cela, nous remplaçons l’animal par des méthodes alternatives telles que de la peau artificielle silicone pour les TP suture… Cependant, pour certains utilisateurs, il est pertinent de pouvoir compléter cette formation par des séances de chirurgie expérimentale sur animaux vivants (souris). Ceci leur permet d'avoir une expérience analogue à ce qu’ils seront amenés à réaliser par la suite. Les techniques enseignées sont exactement celles dont ont besoin les utilisateurs ou des techniques qui permettent de suturer les grandes cavités.

Réduction

Cette saisine est d'une part pour compléter notre formation à la chirurgie expérimentale et d'autre part pour de l'entrainement aux actes chirurgicaux pour divers projets. Dans le cadre de notre formation diplômante il y a une première partie en ex vivo (sans animaux), ce qui nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux pour l'in vivo. Toujours dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux, nous priorisons les animaux de réforme. Ce sont des animaux surnuméraires, n'ayant pas été inclus dans les projets pour lesquels ils étaient destinés. Le nombre final d'animaux utilisé par technique l'est au vu du nombre d'animaux nécessaires pour acquérir cette technique sur la base de l'expérience de plus de 10 ans des formateurs. Il est réduit au maximum et sera utilisé comme suit : 20 étudiants par an avec chacun 3 souris par an soit 300 souris sur 5 ans (20*3*5) ou 4 techniques différentes réparties entre les utilisateurs soit 15 souris par technique et par an (4*15*5).

Raffinement

Les animaux utilisés pour cette formation proviennent d’un éleveur agréé. Ils sont hébergés en animalerie par groupes sociaux (maximum 5 par cage) avec de l’enrichissement (frosottis, papier craft...). Afin de réduire au maximum la souffrance, la douleur et l’angoisse de l’animal lors des gestes techniques, les animaux sont sous couverture anesthésique et analgésique chimique adaptée. Du personnel qualifié suit la profondeur de l’anesthésie et la qualité de l’analgésie pendant l’acte. Ces chirurgies sont encadrées par du personnel aguerri afin d’avoir un suivi plus approfondi. Des tapis chauffants permettent de maintenir la température corporelle de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle d'étude de nos utilisateurs. Ces derniers souhaitent donc légitimement être formés sur ce modèle. Les animaux sont utilisés à partir de 8 semaines et jusqu'à une 30aine de semaines en fonction des euthanasies programmées dans l'animalerie (animaux de réforme issus des élevages).

210 poissons vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Pêchés dans une rivière, ils subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie puis sont tués par dislocation cervicale pour prélever leurs gonades, afin d'évaluer la qualité chimique du milieu à partir de biomarqueurs. Le porteur indique qu'un suivi in vitro a déjà montré l'absence de perturbateurs endocriniens dans l'eau depuis plusieurs années. Il affirme qu'il reste "nécessaire" de confirmer cette absence directement sur les populations de poissons.

Objectifs

Evaluation de la qualité chimique du milieu par l'intermédiaire de biomarqueurs chez le poisson. Fait suite à une étude ayant contribué à la mise en place de l’arrêté 08/01874 par la préfecture du Puy-De-Dôme. Depuis des prélèvements ponctuels ont été effectués afin de vérifier l’amélioration de la qualité du milieu et de la santé des poissons. Lors de la dernière étude menée en 2016, près de la moitié des poissons femelles pêchés au niveau de la station aval de La Dore présentaient encore des teneurs fortes en vitellogénine et des gonades anormalement développées, avec un blocage de l’ovulation et atrésies ovocytaires. L’objectif de cette nouvelle étude est de faire le point sur la restauration du milieu et le bon état physiologique des poissons.

Bénéfices attendus

Informer sur l'état de santé des poissons de la Dore en amont et en aval de la zone étudiée.

Procédures

Prélèvements sanguins uniques sur 210 poissons anesthésiés

Impact sur les animaux

Les organismes subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie au niveau de la veine caudale.

Devenir

Les poissons seront mis à mort pour effectuer les prélèvemetns des gonades.

Remplacement

Fait suite à un suivi depuis plusierus années sur les capacités de reproduction et l'état de santé des poissons en eaux continentales. Dans le cadre du projet, un suivi par approche in vitro a été effectué démontrant l'absence de perturbateurs endocriniens dans le milieu depuis plusieurs années. Il est maintenant nécessaire de confirmer l'absence de perturbation endocrinienne sur les populations de poissons en place.

Réduction

Une analyse de la puissance statistique à partir des données historiques, nous montre qu’avec 20 poissons par station (à raison de 10 mâles et 10 femelles), nous pouvons détecter de faibles variations autour de la moyenne en situation contrôle des paramètres testés (distance minimale de détection de 10 à 70 % de la valeur contrôle). Une réduction du nombre d’individus ne serait pas statistiquement pertinente. Pour la synthèse du standard de vitellogénine issues de femelle en période de reproduction, nous utiliserons des poissons de pisciculture afin de réduire le nombre d'animaux prélevés sur le milieu.

Raffinement

Afin de veiller au bien-être animal, les poissons seront maintenus pendant moins d'une heure à raison de 1 individu adulte pour 2.5 litres dans de l'eau issue du milieu sans changement de température contenant de l'anesthésique pour sédater les animaux et réduire le stress. Pour la récupération des organes (sang, gonades), les poissons seront anesthésiés. Une fois inconscient, le sang est rapidement prélevé avant mise à mort par dislocation cervicale pour récupérer les gonades.

Choix des espèces

L'espèce est sélectionnée du fait d'un suivi régulier sur la rivière et d'effets démontrés sur la population et l'individu. L'espèce doit être retrouvée dans le milieu d'étude. Animaux matures des deux sexes pour pouvoir prendre en compte les effets sur la capacité de reproduction de l'espèce.

720 souris femelles vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Leur abdomen est ouvert et l'artère irriguant l'intestin est clampée pendant une heure pour provoquer une ischémie, suivie d'une reperfusion et de prélèvements sanguins, certains animaux recevant un anticoagulant ou un anti-inflammatoire. Le porteur indique que la pathologie provoque des lésions de l'intestin et une contamination du sang par des bactéries, ce qui justifie selon lui l'euthanasie en fin de procédure. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne simule la circulation complexe en jeu et juge la simulation informatique "peu prédictive".

Objectifs

L’ischémie mésentérique aigue est une affection grave provoquée par une obstruction des vaisseaux irriguant l’intestin, diminuant le flux sanguin et l'apport d'oxygène dans ce dernier et entraînant une détresse intestinale. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes de la formation de caillots et de l’inflammation dans les vaisseaux sanguins irriguant l’intestin dans cette pathologie. En effet, l’intervention chirurgicale permettant la désobstruction des vaisseaux sanguins, induit une réoxygénation trop rapide du tube digestif, et conduit paradoxalement à des lésions des vaisseaux et de l’intestin importantes. Certaines études expérimentales animales ont montré́ que les lésions intestinales étaient initiées par le retour du sang oxygéné vers les tissus de l’intestin qui n’étaient plus irrigués. Cela est appuyé par certaines études, utilisant des modèles expérimentaux animaux, qui suggèrent l’idée qu’une réoxygénation progressive du tissu réduiraient les lésions intestinales. Notre hypothèse de recherche est que les mécanismes associés à la formation des caillots obstruant les vaisseaux et l'inflammation sont impliqués dans les lésions vasculaires et intestinales observées dans la pathologie. Nous avons également émis l'hypothèse que l'inflammation dû à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin pouvait être un facteur aggravant, qui pourrait participer à l'amplification des phénomènes observés. Deux objectifs sont décrits pour ce projet : 1) Caractériser les mécanismes conduisant à la formation d’un caillot et à l’inflammation contribuant à l’obstruction des vaisseaux sanguins irriguant l’intestin. 2) Explorer l’intérêt de différents traitements (Anti-coagulants, anti-inflammatoires) dans la limitation des lésions intestinales en thérapeutique expérimentale chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre pourquoi il est difficile de restaurer une circulation sanguine efficace dans les vaisseaux irriguant l’intestin après l’élimination de caillots obstruant ces derniers et empêchant l’apport d’oxygène au niveau de l’intestin. Nous étudierons également, l'intérêt d’utiliser des traitements anti-coagulants et anti-inflammatoires dans cette pathologie. En effet, l’évaluation de nouveaux traitements susceptibles de contrôler les phénomènes responsables des lesions des vaisseaux et de l’intestin est primordiale afin d’améliorer le pronostic des patients atteints d’ischémie intestinale. La perfusion d’anti-thrombotiques tels que l'héparine, d’anti-inflammatoire comme l’aspirine ou des agents limitant les phénomènes d’inflammations dus à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin, pourraient diminuer la mortalité des patients atteints d’ischémie intestinale dans toutes ces applications cliniques encore insuffisamment comprises et efficacement traitées.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique procédure sans réveil. Ils seront opérés sur une table chauffante à 37°C, après une anesthésie générale et un traitement antalgique. Après ouverture abdominale, un clamp sera posé sur l'artère principale permettant l’irrigation de l’intestin (artère mésentérique supérieur) induisant l’interruption temporaire de la circulation sanguine au niveau intestinal. Le clamp sera maintenu en place pendant 1 heure avant d’être retiré afin de rétablir la circulation sanguine intestinale. Nos observations commenceront dès la pose du clamp (ischémie) et jusqu’à 1 heure après le retrait du clamp (reperfusion). Un prélèvement sanguin sera effectué en début et en fin de procédure. Afin d'évaluer l'efficacité de différentes molécules thérapeutiques, certains animaux se verront administrer par injection intra-veineuse un traitement anti-coagulant ou anti-inflammatoire au cours de la procédure. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de la pathologie attendus sont des dommages de l’intestin et une contamination du sang par les bactéries provenant de l’intestin, justifiant l'euthanasie sous anesthésie générale en fin de procédure. Les effets indésirables liés à la procédure sont : une douleur liée à l’injection de l’analgésique et une douleur liée à la procédure chirurgicale en cas de réveil de l’animal (évité avec une surveillance continue et un maintien de l’anesthésie tout au long de la procédure).

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées après la reperfusion intestinale afin de prélever l’intestin grêle pour des analyses des tissus biologiques et d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil.

Remplacement

L’ischémie intestinale et les lésions associées à la reperfusion intestinale sont une maladie grave, d'une mortalité extrême (80% chez l'Homme), avec des formes très hétérogènes et encore très mal connue. L'utilisation d'un modèle non animal n'est pas réalisable et pas pertinent pour cette pathologie. En effet, aucun modèle non animal ne permet de simuler le circuit complexe de circulation et les nombreuses interactions impliquées dans le développement de la pathologie. Ces multiples paramètres et l’hétérogénéité de la pathologie en font un modèle difficilement reproductible en milieu artificiel et peu prédictif via l’utilisation de logiciel informatique.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux a été déterminé d’après une analyse statistique. Nous avons estimé qu’il faut inclure 10 animaux par groupe au minimum pour assurer des résultats statistiquement pertinents. Une revue bibliographique nous a permis de sélectionner les doses pour les traitements ciblés les plus pertinentes afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Avant les procédures expérimentales, les animaux sont dans une cage spacieuse qui permet aux souris de se déplacer librement et d'adopter des comportements naturels, en groupe pour permettre une interaction sociale entre les souris et avec litières (copeaux de bois) et boites pour encourager les comportements de nidification. Les souris seront opérées sur une table chauffante à 37°C sous anesthésie générale. Après une analgésie pour réduire les douleurs durant la procédure, les animaux seront anesthésiés à l'aide d'un gaz (induction dans une chambre dédiée et maintien à l’aide d’un masque). Les effets de l’anesthésie et l’analgésie seront suivis tout au long de la procédure. En cas de signe de réveil, la quantité d’agent anesthésiant sera augmentée. Si les signes persistent ou d’autres signes indiquant une souffrance de l’animal apparaissent, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de l’ischémie mésentérique aigue chez la souris est déjà décrit dans la littérature et notre équipe est déjà formée à la procédure qui a montré des résultats applicables à ce qui peut être observé chez l’homme. Des souris femelles adultes (7 à 9 semaines) seront utilisées pour que les vaisseaux irriguants l'intestin puissent être facilement visualisés sous loupe. Des souris plus âgées ou un autre modèle animal risqueraient de présenter des zones grasses autour des vaisseaux, compromettant leur observation. De plus, notre laboratoire est habitué à travailler avec les souris, et cela à chaque étape de l’expérimentation : soins préalables, maniement et gestion du stress, matériel anesthésique, opératoire et de monitorage, analgésie et euthanasie.

60 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chaque animal subit une chirurgie de trente minutes destinée à mettre au point un geste de prélèvement de liquide céphalo-rachidien, sans objectif de connaissance au-delà de la maîtrise de la technique. Le porteur indique que les animaux, inconscients pendant l'acte, ne devraient ressentir aucune douleur, et précise recourir en partie à des animaux de réforme. Il affirme ne pas pouvoir éviter l'usage d'animaux pour développer ce geste, présenté comme "essentiel" à de futurs projets en neurosciences.

Objectifs

Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est le liquide dans lequel baignent le cerveau et la moelle épinière. Il amortit ainsi les mouvements et les chocs qui risqueraient d’endommager le cerveau, mais permet également le passage de substances du cerveau et de la moelle épinière vers le système nerveux périphérique. Ce liquide présente une importance capitale dans le cadre clinique puisque son analyse permet déjà de diagnostiquer certaines maladies neurodégénératives. Ce liquide est aussi très important dans le cadre de la recherche car son analyse pourrait aider à une meilleure compréhension de différentes maladies du cerveau et de la moelle épinière dont les mécanismes sont encore inconnus. Cependant, son prélèvement est délicat, d’autant plus chez la souris du fait de la petitesse de la zone d’accès. Ainsi, nous proposons de mettre au point une technique de prélèvement de LCR chez la souris anesthésiée pour pouvoir étudier ce liquide, sa composition, et comprendre certains mécanismes sous-jacents aux pathologies du cerveau et de la moelle épinière.

Bénéfices attendus

A l’issue de ce projet, nous maitriserons une nouvelle technique de prélèvement de LCR chez la souris, technique plus précise et permettant l’obtention d’échantillons sans contamination par des cellules sanguines. Plus généralement, la maîtrise d’une technique de prélèvement du LCR sans contamination sanguine chez la souris est essentielle pour le développement des projets dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement pour la compréhension des mécanismes à l’origine des pathologies inflammatoires et neurodégénératives du cerveau et de la moelle épinière. Ce projet permettra donc d’assurer le raffinement maximal et une réduction des animaux dans les futurs projets en améliorant la technique et la qualité des échantillons.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie à l’isoflurane d’une durée de 30 minutes.

Impact sur les animaux

En pré-anesthésie, il peut y avoir stress de contention. Par contre, le restant des actes étant fait sous anesthésie/antalgie adaptées et surveillées tout le temps de la procédure, l'animal inconscient ne doit ressentir aucune douleur.

Devenir

Cette étude servant à la mise au point du geste de prélèvement de LCR, nous mettons à mort à l’issue de la réalisation du geste.

Remplacement

Les études prévues dans cette demande ayant pour finalité de mettre au point, développer et améliorer le geste de prélèvement du LCR chez la souris anesthésiée, nous ne pouvons éviter l’utilisation d’animaux.

Réduction

Nous avons estimé le nombre minimum d’animaux nécessaires à ces mises au point en intégrant le risque de possibles contaminations du LCR lors des prélèvements. De façon générale, et autant que possible, nous utiliserons des animaux de réforme disponibles sur la plateforme d’animalerie. Cette technique permettra également de réduire le nombre d’animaux car il sera possible de prélever le LCR et d’autres organes et tissus à partir d'une même souris.

Raffinement

Les souris seront anesthésiées durant la procédure de prélèvement du LCR. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le réflexe de retrait de la patte ou le pincement de la queue. L’hypothermie due à l’anesthésie sera limitée grâce à l’utilisation d’un tapis chauffant pendant la durée totale du geste. Enfin, du gel ophtalmique sera également appliqué sur les yeux de manière à éviter un dessèchement oculaire. Une période d’acclimatation d’un moins dix jours sera respectée entre l’arrivée des souris dans l’établissement utilisateur où elles seront hébergées en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, coton, frisure, bâton à ronger). Le tunnel servira également à la manipulation des souris éveillées, limitant le stress de la manipulation. Enfin, des points limites ont été définis.

Choix des espèces

La souris étant actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé pour l’étude des neuropathologies, nous réaliserons nos mises au point sur cette espèce à un stade « adulte », à partir de 8-10 semaines, qui correspond au stade de développement des animaux généralement utilisés dans les études de neuropathologies.