Procédures sévères
Elevage et caractérisation génétique par prélèvement, de modèles de rongeur permettant l’étude et l’évaluation de composés thérapeutiques ciblant les troubles neurologiques (Projet multi-sites : 2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Rats : 24000
Une puce électronique et une biopsie sur rongeur éveillé, trente secondes chacune, sont les seuls actes décrits pour 72 000 souris et 24 000 rats de lignées mutantes ou génétiquement modifiées, élevées dans deux établissements pour l'étude de maladies neurologiques. Ces 96 000 rongeurs vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère, avec un hébergement isolé des mâles jusqu'à sept jours pour "améliorer l'indice de productivité de la lignée". Le porteur ne mentionne qu'une "douleur légère" pour la biopsie, mais énumère pour ces lignées des crises épileptiques, une dysfonction motrice, une atrophie cérébrale, des cataractes et des troubles rénaux, et écrit que "Aucune approche statistique n'a été réalisée" pour fixer les effectifs. Le champ structuré les déclare tous morts, alors que le porteur indique qu'une partie est expédiée vers d'autres établissements, femelles gestantes comprises, ou gardée pour une "utilisation continue", les rongeurs sans génotype d'intérêt étant tués.
Objectifs
Les troubles neurologiques sont des maladies du système nerveux central ou périphérique, c’est-à-dire qu’elles touchent le cerveau, la moelle épinière, les nerfs crâniens et les nerfs périphériques. Il existe de nombreuses pathologies cérébrales comme la maladie d’Alzheimer, maladie de Huntington, maladie de Parkinson. Les autres troubles neurologiques les plus courants comprennent l’épilepsie, la sclérose latérale amyotrophique (également appelée maladie de Charcot), la schizophrénie et la sclérose en plaques. Un Français sur deux est touché directement ou indirectement par une pathologie cérébrale. De nombreuses maladies neurodégénératives sont toujours incurables et très fréquentes chez les personnes de plus de 65 ans comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson. L’objectif de ce projet est d’élever des rongeurs modèles pertinents pour l’étude de ces pathologies et des complications qui leurs sont associées. Ces modèles peuvent développer spontanément ou via des altérations génétiques une ou plusieurs caractéristiques des troubles neurologiques. Les animaux issus de ces développements seront utilisés afin d’étudier l’apparition, le développement et les complications associées aux pathologies neurologiques mais également de tester de nouveaux traitements. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles murins, au plus proche de la maladie humaine, sont donc très pertinents pour l’étude de l’apparition, du développement et des complications associées aux pathologies neurologiques mais également le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Une puce électronique sera posée sur animal vigile afin de l’identifier. Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de génotyper l’ensemble des animaux obtenus. Chacune de ces interventions ne durera pas plus de 30 secondes. En règle générale, une seule puce et une seule biopsie suffisent pour identifier un animal et établir son génotype. Ces interventions pourront avoir lieu dans les deux établissements utilisateurs.
Impact sur les animaux
Une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies et de la pose associée d’une puce électronique en vue de l’identification et du génotypage de l’animal. En fonction des besoins et afin d’améliorer l’indice de productivité de la lignée, il pourrait être nécessaire d’héberger individuellement des mâles pour une période ne dépassant pas 7 jours avant qu’ils soient présentés aux femelles afin de mettre en place des accouplements. Cela pourrait générer un stress léger. A ces effets indésirables s’ajoutent les phénotypes pouvant être attendus lors de troubles neurologiques (liste non-exhaustive) : des déficits de la mémoire spatiale et de la mémoire de travail, des altérations de la mémoire cognitive, une atrophie cérébrale, une perte neuronale, l’apparition de déficits cognitifs, une dysfonction motrice, des crises épileptiques, une intolérance au glucose, des cataractes, des dysfonctionnements des reins, une diminution de la densité minérale osseuse, un tressautement des vibrisses, macro-orchidie chez les mâles et insuffisance ovarienne chez les femelles.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur soit utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de troubles neurologiques, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi chez nos partenaires ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovules, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
MODIFICATION « Le rôle d’IKAROS dans une forme pédiatrique de leucémie : facteur de la maladie ou cible pour la soigner ? »
- Recherche appliquée
- Cancers
Jusqu'à huit semaines de prises de sang hebdomadaires et, pour 160 d'entre elles, vingt injections de chimiothérapie en quatre semaines attendent des souris immunodéprimées chez qui une leucémie est induite, gardées en cages individuelles ventilées. Au total, 223 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, et toutes sont tuées à l'issue pour analyser leur sang, leur moelle osseuse et leur rate. La maladie peut entraîner des douleurs, une perte de poids et de mobilité, et des changements de comportement comme la léthargie ou l'agressivité. Le projet teste, pour une forme de leucémie de l'enfant, un médicament déjà donné à d'autres patients atteints de cancer, après avoir comparé deux lignées de souris. La modification du projet ajoute un gavage aux injections et aux prélèvements, sans en préciser la substance, la fréquence ni la durée.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle d'une protéine dans un type de leucémie qui touche principalement les enfants. Nos études suggèrent que, contrairement aux autres formes de leucémie, cette protéine d'intérêt pourrait ici aider les cellules cancéreuses à survivre. Nous allons donc examiner si la disparition de la protéine d'intérêt dans ces cellules pourrait freiner la progression de la maladie. Pour ce faire, nous testerons un médicament déjà utilisé chez d’autres patients cancéreux afin de voir s’il pourrait devenir une nouvelle option de traitement pour ce type de leucémie. Auparavant, nous allons comparer deux modèles de souris afin de choisir celui qui se prête le mieux à notre étude. Ce travail pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques afin de mieux traiter certains enfants atteints de leucémie.
Bénéfices attendus
Avantages à court terme : Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans un type spécifique de leucémie chez l’enfant. À court terme, il pourrait permettre d’identifier une nouvelle cible pour le traitement de cette maladie. Cela ouvrirait la possibilité d’utiliser un médicament déjà disponible en clinique, ce qui faciliterait une mise en application rapide pour les patients. Avantages à long terme : À plus long terme, cette recherche pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces et mieux ciblés contre la leucémie, avec moins d’effets secondaires. Cela améliorerait la qualité de vie et les chances de guérison des patients. En réduisant l’utilisation de traitements lourds et généralisés, elle pourrait également limiter l’impact environnemental lié à certains médicaments de chimiothérapie.
Procédures
Dans cette étude, plusieurs procédures sont réalisées sur des souris pour évaluer l’efficacité de traitements contre la leucémie. Jusqu’à 188 souris peuvent être concernées par des prises de sang, effectuées une fois par semaine pendant un maximum de huit semaines. Chaque prélèvement dure environ deux minutes et est réalisé par du personnel expérimenté. Une injection unique est également prévue au début de l’étude, pour chacune des souris. Cette intervention, qui dure environ vingt minutes par animal (temps de préparation compris), est suivie d’une observation quotidienne pour vérifier l’état de santé des animaux. Un autre traitement, sous forme de chimiothérapie, nécessite jusqu’à 160 souris. Il consiste en vingt injections réparties sur quatre semaines. Chaque injection dure environ deux minutes, et les souris sont observées juste après pour s’assurer qu’elles vont bien. Toutes les manipulations sont réalisées par groupes de cinq souris. L’expérimentation peut être arrêtée plus tôt que prévu si des résultats suffisamment clairs sont obtenus, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés MODIFICATION Dans cette étude, plusieurs procédures sont réalisées sur des souris pour évaluer l’efficacité de traitements contre la leucémie. Jusqu’à 211 souris peuvent être concernées par des prises de sang, effectuées une fois par semaine pendant un maximum de huit semaines.
Impact sur les animaux
Douleur : Certaines procédures, comme les prélèvements sanguins ou les injections, peuvent provoquer une douleur légère à modérée. Cette douleur est généralement brève et disparaît quelques minutes après l’intervention. L’apparition de la leucémie peut également entraîner des douleurs quelques jours ou semaines après l’induction, une fois la maladie installée. En cas de signes de douleur après l'établissement de la leucémie, les animaux seront immédiatement euthanasiés et examinés. Perte de poids : Les animaux seront pesés chaque semaine. Perte de poids sera considérée comme un signe de souffrance et un effet sévère, et l’animal concerné sera euthanasié. Réduction de l’activité ou de la mobilité : Certains animaux peuvent devenir moins actifs à cause de la maladie ou si le système nerveux est affecté. Une surveillance quotidienne sera mise en place. Si une forte réduction de la mobilité ou une incapacité à se déplacer persiste plus de deux jours, cela sera considéré comme un signe de détresse. Stress : Des manipulations comme les injections ou les prélèvements peuvent provoquer un stress léger et temporaire. Celui-ci dure en général moins d’une heure après la procédure. Un stress prolongé pourra être suspecté en cas de changements persistants dans le comportement. Changements comportementaux : Des modifications telles que léthargie, agitation ou agressivité peuvent apparaître après certaines interventions. Elles sont en principe transitoires, durant quelques jours. Si ces troubles persistent ou s’aggravent, une évaluation sera faite pour décider d’une éventuelle euthanasie. MODIFICATION Des manipulations comme les injections, le gavage ou les prélèvements peuvent provoquer un stress léger et temporaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et analysés à la fin des procédures. Plus précisément, le sang, la moelle osseuse et la rate seront analysés pour détecter la présence de cellules leucémiques par cytométrie de flux.
Remplacement
Cette analyse in vivo est essentielle pour déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt dans les leucémie aiguë lymphoblastique, car elle permet d’étudier le comportement des cellules leucémiques dans un environnement biologique complexe, ce qui ne peut être réalisé par des techniques in vitro à ce stade du projet. En effet, les modèles in vitro ne reproduisent pas fidèlement les interactions biologiques et les mécanismes physiopathologiques présents dans un organisme vivant, limitant leur pertinence pour cette étude spécifique. Dans ce cadre, la souris constitue un modèle privilégié pour l’analyse des traitements en onco-hématologie, permettant de modéliser les interactions complexes entre les tumeurs, le système immunitaire et le microenvironnement — interactions impossibles à étudier de manière aussi complète avec des cultures cellulaires seules. De plus, les souris présentent des réponses thérapeutiques proches de celles observées chez les patients humains, ce qui les rend particulièrement adaptées pour tester et valider de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux sera ajusté en fonction des besoins expérimentaux, en s’appuyant sur des calculs préalables permettant d’optimiser la taille des groupes. Les expériences d’induction de la leucémie seront réalisées avec des groupes de 5 animaux, répétées 2, 3 ou 4 fois selon les résultats obtenus. Si la première série montre des résultats significatifs, les autres ne seront pas effectuées. Sinon, nous poursuivrons avec la deuxième série, et ainsi de suite, jusqu’à l’obtention de résultats significatifs, avec un maximum de quatre séries. Cette approche séquentielle permet d’interrompre l’étude dès que des données robustes sont disponibles, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires non nécessaires. Ainsi, la conception expérimentale suit rigoureusement le principe de Réduction des 3R : le nombre d’animaux est limité à ce qui est strictement nécessaire pour obtenir des résultats fiables, les données sont exploitées au maximum, et toute expérimentation redondante est évitée. Cette stratégie permet de concilier la validité scientifique avec un impact réduit sur les animaux.
Raffinement
Afin de minimiser les perturbations liées aux prélèvements sanguins, aux injections, au phénotype délétère induit et à l'induction de la leucémie, des mesures spécifiques seront mises en œuvre. Les animaux seront étroitement surveillés afin de détecter tout signe de souffrance ou effet secondaire du traitement avant d'atteindre le seuil de mortalité. Les méthodes suivantes seront utilisées : Suivi du phénotype délétère : Les souris sont immunodéprimées et donc gardées dans des cages individuelles ventilées pour éviter les infections. Induction de la leucémie : Les animaux seront surveillés quotidiennement et toute détérioration de leur état sera immédiatement évaluée. Si des signes de douleur ou de détérioration physique apparaissent (critères de douleur : perte de poids, modifications du pelage, comportement, etc.), les animaux seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance et analysés directement.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l’analyse des traitements en onco-hématologie. Modélisation d'interactions complexes : Les souris permettent d'étudier les interactions entre les tumeurs, le système immunitaire et le microenvironnement de manière bien plus fidèle que les cultures cellulaires seules. Évaluation de la réponse thérapeutique : Les souris présentent des réponses thérapeutiques proches de celles observées chez les patients humains, ce qui les rend précieuses pour tester de nouveaux traitements. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines, ce qui correspond à une phase de maturité du système hématopoïétique comparable à celle de l’adolescence, en accord avec le fait que nous étudions un cancer pédiatrique. Comme les deux sexes sont affectés par le sous-type de leucémie étudié, nous utiliserons des souris mâles et femelles
Mise en place d’un modèle animal d’entérite nécrotique chez le poulet de chair
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
48 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Livrés à un jour et élevés en cages en batterie, ils reçoivent par la bouche une substance non précisée à 14, 19, 20 et 21 jours pour provoquer une entérite nécrotique, avec diarrhée, déshydratation, abattement et plumage ébouriffé attendus, puis une prise de sang de 2 mL avant d'être tués à 23 ou 28 jours. Les retombées annoncées, dont une production "moins dépendante des traitements antimicrobiens", sont renvoyées au "plus long terme". Le projet construit un protocole d'induction de la maladie pour tester ensuite des additifs alimentaires, dans une filière que l'entérite nécrotique expose à d'"importantes pertes économiques".
Objectifs
L’entérite nécrotique est une maladie digestive fréquente chez le poulet de chair qui peut fortement dégrader la santé et le bien-être des animaux, réduire leurs performances de croissance et engendrer d’importantes pertes économiques pour la filière avicole. Dans un contexte de réduction de l’utilisation des antibiotiques en élevage, il est nécessaire de développer de nouvelles approches permettant de prévenir ou de limiter cette maladie. L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle expérimental reproduisant de manière fiable et contrôlée l’entérite nécrotique chez le poulet de chair. Ce modèle permettra d’identifier les paramètres les plus pertinents pour caractériser la maladie et d’évaluer l’efficacité de solutions nutritionnelles destinées à réduire son apparition ou sa sévérité. À terme, ce modèle servira d’outil de recherche pour tester de nouveaux ingrédients ou additifs alimentaires, mieux comprendre leurs mécanismes d’action et sélectionner les candidats les plus prometteurs avant leur évaluation dans des études menées à plus grande échelle en conditions d’élevage.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer un modèle expérimental permettant de reproduire de manière contrôlée l’entérite nécrotique chez le poulet de chair. Disposer d’un tel modèle est essentiel pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition et l’évolution de cette maladie, ainsi que les interactions entre les agents infectieux, l’environnement intestinal et les défenses naturelles de l’animal. Ce modèle permettra également d’évaluer dans des conditions maîtrisées de nouvelles stratégies visant à prévenir ou à réduire les effets de l’entérite nécrotique. Dans un contexte où l’usage des antibiotiques est en diminution, il constitue un outil indispensable pour tester des alternatives telles que les compléments alimentaires et solutions nutritionnelles innovantes modulant la microflore. La standardisation des conditions expérimentales favorisera l’obtention de résultats fiables et reproductibles, facilitant ainsi la comparaison des différentes approches évaluées et l’identification des solutions les plus prometteuses. L’étude permettra également d’améliorer les connaissances sur le fonctionnement du microbiote intestinal et son rôle dans la résistance à la maladie. À plus long terme, les connaissances acquises grâce à ce projet contribueront au développement de stratégies de prévention plus efficaces, à l’amélioration de la santé et du bien-être des animaux, ainsi qu’à une production avicole plus durable et moins dépendante des traitements antimicrobiens.
Procédures
Les animaux seront élevés avec un aliment répondant à leur besoin nutritionnel pendant 28 jours. A 14, 19, 20 et 21 jours d'âge, une seule administration par voie orale à l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 mL de substance sera réalisée sur chaque animal de la cage. Pour chaque administration, le temps de contrainte pour maintenir chaque animal ne dépassera pas 30 secondes et se fera progressivement en fonction de la déglutition de l'animal. Une partie des animaux (24) sera soumise à un prélèvement sanguin à J23 l’autre à J28. Un volume de sang de 2 mL nécessaire et suffisant à l'analyse des différents paramètres sanguins sera prélevé sur chaque animal. Pour chaque prise de sang, le temps de contention ne dépassera pas 1 min.
Impact sur les animaux
Les animaux seront nourris avec un aliment standard répondant à leurs besoins nutritionnels pendant 28 jours. L’induction de l’entérite nécrotique peut entraîner l’apparition de signes cliniques digestifs d’intensité variable. Les nuisances associées au modèle expérimental d’entérite nécrotique chez le poulet de chair sont principalement liées à l’induction contrôlée d’une pathologie digestive pouvant entraîner de l’inconfort, une diminution de l’ingestion alimentaire, un abattement (position en boule), un plumage ébouriffé. Une diarrhée peut également être observée, contribuant à une déshydratation et à une dégradation globale de l’état corporel. Une baisse des performances zootechniques (croissance ralentie, indice de consommation dégradé) est également attendue, reflétant l’impact systémique de la maladie. La manipulation des animaux, incluant leur sortie des cages pour la pesée en groupe, l’administration des agents des substances et le prélèvement sanguin, est susceptible d’induire un inconfort et un stress temporaires. Le prélèvement de sang, effectué une unique fois par animal, peut entraîner une douleur passagère au site de prélèvement.
Devenir
Une partie des animaux seront mis à mort à J23 et l’autre à J28 pour le prélèvement de tissus biologiques.
Remplacement
L’entérite nécrotique est une maladie digestive complexe qui résulte de l’interaction entre une bactérie (Clostridium perfringens), des facteurs favorisant son développement, le microbiote intestinal et les défenses naturelles de l’animal. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble de ces mécanismes de manière fiable sans utiliser d’animaux. Des méthodes de laboratoire (in vitro) seront toutefois utilisées avant les essais sur animaux afin de sélectionner les solutions les plus prometteuses et de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Cependant, ces méthodes ne permettent pas d’évaluer les effets de la maladie sur l’organisme dans son ensemble. Le recours à l’animal reste donc indispensable pour atteindre les objectifs du projet, tout en étant limité aux situations où aucune alternative pertinente n’est disponible.
Réduction
Le projet a pour objectif de mettre au point un modèle expérimental d’entérite nécrotique chez le poulet de chair afin de contribuer au développement de nouvelles stratégies de prévention et d’améliorer la santé et le bien-être des animaux confrontés à cette maladie digestive. Le nombre d’animaux a été défini de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Les effectifs retenus permettent également de garantir des conditions d’élevage adaptées, notamment le maintien des interactions sociales et d’une hiérarchie au sein des groupes, éléments importants pour le bien-être des animaux. Enfin, plusieurs paramètres seront évalués sur chaque animal au cours de l’étude et lors des analyses post-mortem, afin de maximiser les informations recueillies et d’optimiser l’utilisation de chaque animal inclus dans le projet.
Raffinement
La gestion du bien-être des animaux tout au long du projet inclut l’application de points limites spécifiques et précoces. L’inconfort, le stress de la contrainte lors du maintien des animaux dû au gavage, sont réduits par, une manipulation empathique, délicate et compétente des animaux par les applicateurs de la procédure, une administration de la substance par voie orale à l’aide d’une seringue à un volume approprié à la taille de l’animal soit 1 mL et par une surveillance minutieuse quotidienne des animaux à l’aide de la grille d’observation. L’inconfort et le stress dus à la sortie des cages pour les prises de sang sont réduits par une manipulation délicate des animaux, un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. L’état de santé des animaux est suivi quotidiennement. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste en la mise en place de papier filtre à l’intérieur de la cage pour éviter que les animaux se coincent les pattes dans les mailles de la grille tout au long de l’étude et en favorisant l’accès à l’eau et à la nourriture surtout en période de démarrage des animaux (J0-J8). L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de coupelle d’eau en plus des pipettes et des godets récupérateurs d’eau. La première semaine d’élevage, l’accès à la nourriture est affiné en mettant directement dans la cage sur le papier filtre un tas d’aliment. En plus, la hauteur des lignes d’eau ainsi que les ouvertures d’accès aux mangeoires, sont ajustées régulièrement en fonction de l’âge des animaux. L’état de santé des animaux est suivi quotidiennement. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (balles avec grelots), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie) procurent le maximum de confort aux animaux, favorisent les interactions sociales, et correspondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact visuel ou physique avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.
Choix des espèces
L’espèce retenue correspond à l’espèce cible, à savoir le poulet de chair. Ce choix permet de développer un modèle expérimental directement basé sur l’espèce chez laquelle la pathologie d’intérêt, l’entérite nécrotique, se manifeste en élevage, notamment en conditions de production intensive. Ainsi, les observations et résultats obtenus seront représentatifs et transposables aux conditions réelles de production sans biais lié à une extrapolation inter-espèces et exploitables par la filière avicole. Les animaux livrés seront des poussins de 1 jour. Ils seront mis en stabulation en cages en batterie et seront élevés jusqu’à l’âge de 28 jours.
Exploration de nouveaux traitements ciblant la neuroinflammation dans deux modèles murins de la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 064 souris de deux lignées porteuses d'une forme de maladie de Charcot vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, par cohortes de 9 à 26 individus. Elles reçoivent l'une des quatre approches testées, protéines bloquantes, molécule injectée dans le sang, délivrance au système nerveux ou thérapie génique, avec des prises de sang et deux tests moteurs dont seul le tapis roulant est nommé. Dans la lignée à progression rapide, la fonte musculaire entraîne perte de poids et difficultés à se déplacer, et certaines souris sont tuées "une fois que la manifestation de la pathologie est maximale". Le porteur écrit "Comme chez les patients, les souris ne montrent pas de signes de douleur", tout en déclarant une partie des procédures au niveau sévère.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable et mortelle, causée par la perte des neurones moteurs situés dans le cerveau et la moelle épinière, responsables de la contraction des muscles striés. En France environ 7000 patients vivent avec la maladie de Charcot. La maladie débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire, conduisant au décès dans les 3 ans suivant l'apparition des premiers symptômes. De nombreuses données issues de patients et de modèles animaux de laboratoire ont identifié l’inflammation et le système immunitaire comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Ce projet s’inscrit dans une démarche de développement thérapeutique visant à valider des approches et des molécules dont la tolérance et la sécurité d’administration ont déjà été démontrées chez le rongeur et chez l’Homme, mais dans le contexte d’autres pathologies. Nous avons ainsi identifié quatre molécules thérapeutiques et notre objectif est d’explorer leur potentiel sur deux modèles complémentaires de la maladie de Charcot reproduisant l’hétérogénéité de la pathologie. 1. La première approche consiste à bloquer le passage des cellules immunitaires du sang vers le cerveau et la moelle épinière à l’aide de protéines bloquantes. 2. La seconde approche vise à bloquer la capacité des cellules immunitaires à déclencher une réponse inflammatoire dans le système nerveux central et en périphérie, par l’administration d’une molécule dans la circulation sanguine. 3. La troisième approche repose sur la délivrance ciblée au système nerveux d’une autre classe de molécules afin de bloquer l’influence des cellules immunitaires. 4. Enfin, la quatrième approche consiste à bloquer les signaux émis par le système nerveux qui attirent les cellules immunitaires inflammatoires, au moyen d’une approche de thérapie par le géne.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester de nouveaux traitements contre la maladie de Charcot en ciblant le système immunitaire. Ce dernier est relativement accessible aux interventions thérapeutiques, ce qui facilite le développement de nouvelles approches. Nous évaluerons quatre stratégies distinctes, présentant chacune un fort potentiel clinique, car elles ont déjà été testées et validées chez l’humain dans le cadre d’autres pathologies. Pour refléter la diversité des formes cliniques observées chez les patients, nous utiliserons deux modèles différents de la maladie de Charcot. Cette approche devrait permettre d’obtenir des résultats robustes et reproductibles, applicables à divers contextes de la maladie. Les résultats de ce projet feront l’objet de publications dans des revues scientifiques internationales à comité de lecture, de dépôts de brevets et pourraient contribuer à la mise en place d’un essai clinique.
Procédures
Le projet implique de délivrer des molécules thérapeutiques et de réaliser des prélèvements sanguins. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention et celui d’une piqûre. Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture. Deux tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices. Le test du tapis roulant évalue l’endurance à l’effort. Ce test n’excède pas 20 min. Lorsque ce test est réalisé aucun autre test n’est réalisé dans la semaine afin de permettre une bonne récupération. Nous avons besoin de réaliser des études d’histologie du système nerveux. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion ou ponction intra-cardiaque sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable, dont l’issue est inexorablement fatale. Les modèles murins que nous utilisons ont déjà été phénotypés dans de nombreuses publications, ce qui garantit une optimisation de la règle des 3R. Le premier modèle présente une réduction progressive de la masse musculaire, débutant par les membres inférieurs. Cette amyotrophie se traduit par une perte de poids et des difficultés locomotrices. L’espérance de vie de ces souris est réduite. Un suivi rigoureux est assuré pour ces animaux. Le second modèle de souris que nous utilisons perd très lentement ses capacités à effectuer des tâches motrices. Une faible proportion d’individus peut tardivement présenter une posture anormale (dandinement), stable, qui n’entrave pas l’accès à la nourriture et à l’eau. Ces souris suivent un déclin normal lié à l’âge et à la prise de poids. Ce modèle ne présente pas d’atteinte de l’espérance de vie. Comme chez les patients, les souris ne montrent pas de signes de douleur. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs en proposant quatre approches thérapeutiques. Les administrations, de courte durée, sont standardisées, simples, rapides et sûres pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. 2) L’autre nécessité, qui est liée à la pathologie elle-même, est d’euthanasier des animaux une fois que la manifestation de la pathologie est maximale.
Remplacement
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative fatale et incurable, caractérisée par la perte progressive des neurones contrôlant l’activité des muscles squelettiques. L’utilisation de souris reproduisant la pathologie humaine constitue le seul système permettant d’intégrer la complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux. Une telle interaction, qui s’installe sur plusieurs mois ne peut être reproduite in vitro. Ainsi, le modèle animal demeure une étape essentielle pour tout transfert thérapeutique potentiel vers la clinique. Cependant, afin d’explorer les modes d’actions thérapeutiques associés à l’interactions entre globules blancs et neurones moteurs, nous développons des systèmes de cultures in vitro
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans nos études est déterminé en suivant rigoureusement les recommandations internationales et les études définissant les tailles optimales des cohortes pour les modèles murins de la maladie de Charcot. Nous appliquons une approche statistique visant à réduire le nombre d’animaux tout en limitant les risques de faux positifs. Cette méthodologie s’appuie sur des études évaluant l’impact de la taille des groupes sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Répartition des cohortes : • Pour le premier modèle : 26 souris par cohorte pour les études comportementales. 9 souris par cohorte pour les analyses histologiques. • Pour le modèle léger de la maladie : 18 souris par cohorte pour les études comportementales. 9 souris par cohorte par point d’analyse histologique. Par ailleurs, nous utilisons des cohortes mixtes (mâles et femelles), ce qui permet de réduire le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.
Raffinement
Les animaux bénéficient d'une surveillance régulière assurée par les expérimentateurs, en lien étroit avec les zootechniciens et l'équipe dédiée au bien-être animal. Leur environnement est aménagé pour favoriser leur confort et leur repos, avec notamment des litières adaptées, un igloo et du coton pour la confection d'un nid. Les injections utilisées sont rapides (moins de deux minutes), peu invasives et peu douloureuses, conformément aux recommandations en vigueur. Pour limiter le stress lié à la manipulation, la zone d'injection est préparée la veille, et un anesthésique local est administré avant le geste afin d'éviter toute douleur. Après chaque injection, les animaux sont surveillés attentivement. Tout signe inhabituel de mal-être — anxiété, douleur, détresse ou infection — est immédiatement pris en charge afin de garantir une réponse rapide et adaptée.
Choix des espèces
Les animaux modèles de la maladie de Charcot que nous utilisons reflètent l’hétérogénéité clinique de la maladie. Les animaux présentent soit une forme rapide ou très lente de la pathologie, d’origine génétique différente. Les protocoles thérapeutiques que nous proposons nécessitent une expérimentation sur le modèle murin de la pathologie, qui intègre à la fois le système nerveux et le système immunitaire. Notre étude pourra s’inscrire dans une étude à plus grande échelle visant à conduire un essai clinique utilisant des approches ou des molécules déjà employées pour d’autres pathologies. Les outils thérapeutiques que nous étudions, ainsi que leur voie d’administration intrathécale, sont transposables à l’homme. Toutes les procédures sont réalisées chez des animaux adultes. Pour l'ensemble des procédures — donc pour les 4 approches thérapeutiques testées — le traitement est administré à des souris jeunes adultes, à partir de 14 semaines pour le modèle à progression rapide et de 21 semaines pour le modèle à progression lentes, âges auxquels les symptômes de la maladie ne sont pas encore apparus. Un autre stade étudié est celui de l'animal adulte chez qui la maladie est pleinement installée, notamment pour les analyses tissulaires, ce qui va en fonction des procédures et des modèles, de la 20ème à la 42ème semaine.
Évaluation du potentiel émétique et antiémétique de substances d’essai
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Furets : 915
Placés seuls en cage d'observation pendant 60 à 90 minutes, des furets et des chiens reçoivent une substance par voie orale, sous-cutanée ou intraveineuse, puis sont observés jusqu'à 12 heures pour compter leurs haut-le-cœur et leurs vomissements. Pour tester un antiémétique, l'agent qui fait vomir arrive après un prétraitement de quelques jours à plusieurs semaines, et certains individus reçoivent par chirurgie un implant télémétrique qui enregistre la pression abdominale. 1 055 individus, 915 furets et 140 chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, un même individu participant en général à trois à cinq sessions, davantage sur avis du vétérinaire. Le champ structuré déclare 1 045 furets et chiens réutilisés et 10 chiens renvoyés en élevage, aucun tué, alors que le porteur écrit que les individus des procédures sévères sont tués à la fin du test et évoque un reclassement des chiens.
Objectifs
Les nausées et les vomissements constituent des effets indésirables fréquents de nombreux médicaments. Ils peuvent altérer la qualité de vie des patients, compromettre l’observance thérapeutique et conduire à l’interruption de traitements. Ces manifestations sont par exemple observées lors de traitements anticancéreux, après certaines interventions chirurgicales sous anesthésie générale ou encore avec des classes thérapeutiques plus récentes telles que les incrétines utilisées dans le traitement de l’obésité. Malgré les progrès réalisés dans leur prise en charge, les traitements disponibles ne permettent pas toujours un contrôle satisfaisant des nausées et vomissements dans toutes les situations cliniques, justifiant la poursuite des recherches visant à développer de nouvelles approches thérapeutiques et à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués. À l'inverse, le développement de nouveaux médicaments nécessite également d'identifier les substances susceptibles d'induire une réponse émétique, afin de mieux caractériser leur profil pharmacologique et de sécurité. Les rongeurs ne possédant pas les mécanismes neurophysiologiques nécessaires à l’expression du réflexe de vomissement, le furet et le chien sont aujourd’hui considérés comme les espèces de choix pour l’évaluation préclinique de ces effets. Ces espèces présentent une physiologie de la réponse émétique proche de celle observée chez l’Homme et ont démontré leur valeur translationnelle prédictive. L’objectif du présent projet est d’évaluer les effets de substances en développement sur la réponse émétique, soit afin de caractériser leur potentiel à induire des nausées et des vomissements dans le cadre de leur évaluation de sécurité pharmacologique, soit afin d’évaluer leurs propriétés antiémétiques dans le cadre du développement de traitements destinés à prévenir, réduire ou supprimer ces manifestations. Selon les objectifs scientifiques, l’évaluation pourra porter sur une substance administrée seule ou dans des conditions représentatives de son utilisation envisagée, c'est à dire seule ou associée à d’autres composés susceptibles de moduler la réponse observée. Les données générées contribueront à l’évaluation de la sécurité et/ou de l’efficacité pharmacologique des produits étudiés et soutiendront leur développement préclinique en médecine humaine ou vétérinaire.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer des données permettant d'évaluer le potentiel émétisant ou les propriétés antiémétiques de nouvelles substances. Les résultats obtenus contribueront au développement de médicaments plus sûrs et plus efficaces ainsi qu'à l'amélioration de la prise en charge des nausées et des vomissements en médecine humaine et vétérinaire.
Procédures
Dans les études évaluant le potentiel émétisant, les animaux sont placés individuellement en cage d'observation pendant une période d'habituation (généralement 60 à 90 minutes), puis reçoivent une ou plusieurs substances d'essai administrées par voie orale, sous-cutanée, intraveineuse ou autre voie adaptée. Lorsque des administrations intraveineuses sont prévues, un cathéter intraveineux peut, si nécessaire, être mis en place (durée d'environ 10 min). Les administrations durent généralement de quelques secondes à une minute. Les animaux sont ensuite observés pendant 2 à 6 heures (jusqu'à 12 heures chez le furet et 3 heures chez le chien selon les protocoles) afin de quantifier les épisodes de haut-le-cœur et de vomissements. Les animaux sont alors hébergés individuellement lors de la phase d’observation (durée maximale de 6 heures). Lorsque l'observation doit être prolongée, les animaux sont réintégrés dans leur hébergement collectif et leur comportement est enregistré par vidéo. Dans les études évaluant les propriétés antiémétiques, les animaux reçoivent dans un premier temps la substance d'essai (administration unique ou répétée pendant quelques jours à plusieurs semaines selon les objectifs de l'étude). Après une période de prétraitement adaptée, ils sont placés individuellement en cage d'observation puis reçoivent un agent émétisant de référence avant une période d'observation de 2 à 6 heures destinée à évaluer la diminution des événements émétiques. Un même animal peut participer à plusieurs sessions expérimentales, notamment pour l'évaluation de différentes doses ou conditions expérimentales, généralement dans la limite de 3 à 5 sessions séparées par une période de récupération adaptée. Si un nombre supérieur de sessions est scientifiquement justifié, celui-ci est soumis à l'avis préalable du vétérinaire. Certaines études portant sur les effets retardés nécessitent l'implantation chirurgicale unique d'un dispositif télémétrique sous anesthésie générale permettant l'enregistrement continu de la pression abdominale pendant plusieurs jours. Lorsque cela est scientifiquement justifié, jusqu'à trois prélèvements sanguins par session peuvent être réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement dure généralement moins d'une minute. Un prélèvement de liquide cérébrospinal peut également être réalisé sous anesthésie générale (durée d'environ 15 min) lorsque les objectifs de l'étude le nécessitent.
Impact sur les animaux
Les animaux sont temporairement hébergés individuellement pendant les périodes d'habituation et d'observation afin de permettre l'identification et la quantification précise des épisodes émétiques. Cet hébergement individuel de courte durée peut constituer une source de stress. Les procédures réalisées dans le cadre de ce projet visent à évaluer les effets de substances sur la réponse émétique. En conséquence, l'apparition de haut-le-cœur, de nausées et/ou de vomissements est attendue dans ces études. Comme pour toute étude évaluant de nouvelles substances, des effets indésirables non anticipés peuvent exceptionnellement survenir. Les animaux font l'objet d'une surveillance clinique régulière et tout signe clinique observé est documenté et évalué afin de mettre en œuvre les mesures appropriées si nécessaire. Selon les substances évaluées, d'autres effets pharmacologiques transitoires peuvent également être observés, tels qu'une diminution de l'activité, une hypersalivation, des crampes abdominales, une diarrhée ou d'autres signes digestifs compatibles avec leur profil pharmacologique. Selon les objectifs de l'étude, les animaux peuvent également subir les contraintes associées à l'administration des substances testées ou à des prélèvements sanguins (contention de courte durée, injections, administrations ou ponctions veineuses). Dans certains protocoles spécifiques visant à étudier les vomissements retardés, une intervention chirurgicale peut être réalisée afin d'implanter un dispositif télémétrique permettant l'enregistrement continu de paramètres physiologiques. Cette intervention peut entraîner une douleur post-opératoire transitoire, une gêne liée à la cicatrisation et une période de récupération et de surveillance clinique renforcée sont alors nécessaires.
Devenir
Pour les procédures légères ou modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sévères, les animaux sont euthanasiés à la fin du test. Lorsque possible et après avis vétérinaire, un programme de reclassement des chiens est mis en place.
Remplacement
Les procédures décrites dans ce projet visent à évaluer les effets de substances sur la réponse émétique. La réponse émétique résulte de l'intégration de mécanismes complexes impliquant le système nerveux central et périphérique, le tractus gastro-intestinal ainsi que de nombreux médiateurs neurochimiques. A ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet de reproduire l'ensemble de ces interactions physiologiques ni de prédire de manière fiable l'apparition ou l'inhibition d'événements émétiques. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico peuvent contribuer à la compréhension de certains mécanismes d'action mais ne permettent pas de remplacer l'utilisation d'animaux pour l'évaluation intégrée de la réponse émétique. Le recours à l'animal demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet repose en premier lieu sur la réutilisation des animaux entre différentes sessions, lorsque cela est compatible avec leur état de santé et les objectifs scientifiques de l’étude. Les plans expérimentaux sont optimisés afin de maximiser les informations obtenues à partir d’un même groupe d’animaux tout en conservant une sensibilité suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de l’étude. Dans le cadre de l’évaluation du potentiel émétisant de nouvelles substances, une approche séquentielle est privilégiée. Les composés sont évalués progressivement et seules les doses ou conditions pertinentes sont investiguées, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Ces études incluent généralement 6 furets ou 5 chiens par condition expérimentale. Dans le cadre de l’évaluation des propriétés antiémétiques, les études incluent généralement 8 furets ou 5 chiens par groupe, permettant une comparaison statistique appropriée entre les groupes expérimentaux et les groupes contrôles tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, plusieurs objectifs expérimentaux ou prélèvements complémentaires peuvent être intégrés au sein d’une même étude afin d’éviter la réalisation d’expériences supplémentaires.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi du poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Lorsque plusieurs sessions sont prévues au cours d'une même étude, une période de récupération d'au moins une semaine est respectée entre deux sessions afin de permettre un retour à l'état physiologique normal des animaux. Par ailleurs, un enrichissement complet est fourni quotidiennement aux animaux. Celui-ci comprend notamment une litière adaptée, un tunnel, une plateforme, des jouets, des objets à ronger ainsi que la présence de congénères, sauf lorsque l'hébergement individuel est imposé temporairement par la procédure. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le protocole d'anesthésie et d'analgésie est défini par un vétérinaire afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Lorsque cela est possible, un système d’analyse vidéo est mis en place afin de permettre une observation simultanée et non invasive de l’ensemble des animaux, tout en limitant les manipulations nécessaires à leur suivi.
Choix des espèces
Les études seront réalisées chez le furet ou le chien, deux espèces adaptées à l'évaluation préclinique des nausées et vomissements. Le furet constitue le modèle de référence dans ce domaine en raison de sa bonne valeur translationnelle vers l'Homme. Le chien peut également être utilisé selon les caractéristiques de la substance étudiée. Contrairement aux rongeurs, ces deux espèces possèdent un réflexe de vomissement fonctionnel. Des furets et des chiens adultes seront utilisés conformément aux données historiques de l'établissement et aux recommandations de la littérature scientifique. L'utilisation d'animaux adultes permet de garantir la maturité physiologique des animaux et la comparabilité des résultats avec les données de référence disponibles.
Mise en place d’un nouveau modèle d’étude et évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des cancers du sang (leucémie aigüe myéloïde et syndrome myélodysplasique).
- Recherche appliquée
- Cancers
Les 655 souris de ce projet n'ont pas de système immunitaire, ce qui permet d'y faire proliférer des cellules leucémiques de patients sans rejet. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à des temps différents pour prélever les organes du système immunitaire. Irradiées puis greffées par la veine de la queue sans anesthésie, elles subissent des prises de sang éveillées deux fois par mois, jusqu'à trois ponctions de moelle au fémur sous anesthésie, une chimiothérapie de cinq jours et jusqu'à 30 jours de gavage deux fois par jour. Le porteur qualifie ces procédures de "rapides, peu invasives" et les effets secondaires de "minimes", tout en déclarant l'ensemble en gravité sévère et en évoquant perte de poids, réduction de la mobilité et négligence du toilettage à mesure que la leucémie progresse.
Objectifs
Le syndrome myélodysplasique (SMD) et la leucémie aiguë myéloïde (LAM) sont de graves cancers du sang et de la moelle osseuse qui touchent principalement les personnes âgées. Dans le cas de la SMD, la moelle osseuse présente un dysfonctionnement majeur : à cause d'anomalies génétiques qui perturbent la fabrication des protéines essentielles, la production des cellules sanguines devient défaillante et inefficace. Chez environ un tiers des patients, cette maladie s'aggrave et évolue en LAM. Cette forme est un cancer très agressif où des cellules sanguines anormales et immatures se multiplient de manière incontrôlée. Actuellement, les traitements par chimiothérapie sont très lourds, toxiques et insuffisants. La majorité des patients font une rechute avec un taux de survie inférieur à 35 pour cent. Trouver de nouvelles thérapies plus efficaces et mieux tolérées pour bloquer ces rechutes est donc une urgence médicale absolue. L'objectif de ce projet est de reproduire ces maladies chez la souris (modèles précliniques) afin de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses réapparaissent après un traitement et de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. À terme, ces recherches visent à offrir des alternatives thérapeutiques plus ciblées et moins toxiques pour les patients.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes conduisant au cancer doit nous conduire à concevoir des thérapies ciblées. Au terme de notre projet, nous disposerons de modèles spécifiques du SMD et de la LAM permettant de tester des thérapies innovantes et les résultats obtenus devraient contribuer à l’amélioration des traitements proposés aux patients.
Procédures
Nous utiliserons des souris dépourvues de système immunitaire permettant ainsi l'amplification (absence de rejet de la greffe) des cellules tumorales de patients atteints de LAM et SMD. Les souris seront irradiées avec une dose suffisamment faible pour ne pas induire leur mort mais permettant la greffe de cellules humaines (durée de l’irradiation : moins de 2 min). Ces cellules seront injectées quelques heures après l’irradiation. Pour une injection dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l’injection : 30 s). Des échantillons de sang seront prélevés sur souris éveillées de manière bi-mensuelle, la durée d’un prélèvement est inférieure à une minute. Le premier prélèvement sera effectué 8 à 10 semaine après l’injection de cellules. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Des prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau du fémur pourront être réalisés trois fois maximum à 4 semaines d’intervalle. Pour cela, une anesthésie générale sera effectuée, la durée d’un prélèvement est inférieure à 5 minutes. Une analgésie est prévue afin d’éviter la douleur. Les souris recevront un traitement associant une chimiothérapie standard par voies intraveineuse et intrapéritonéale (injection dans l’abdomen) sur une période de 5 jours, ainsi que les composés d'intérêt administrés par gavage oral (2 fois/jour) sur une période maximale de 30 jours. La durée des administrations (dans la veine, dans l'abdomen ou par voie orale) est d'une minute environ.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées sont rapides, peu invasives et maîtrisées par l’ensemble des expérimentateurs. L’irradiation des souris peut causer du stress et des diarrhées. L’implantation des cellules leucémiques peut causer une douleur légère et brève au niveau du site d’injection. L’administration de molécules thérapeutiques peut causer un stress ainsi qu’une douleur légère et brève au site d’injection. L’administration répétée de molécule thérapeutique par gavage peut potentiellement causer une irritation. Les effets secondaires des molécules thérapeutiques sont minimes, ils peuvent entrainer des syndromes gastro-intestinaux et des modifications du rythme cardiaque sans conséquences. Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage pourraient être observés chez les animaux lors de la progression de la leucémie.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à différents temps et les organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Pour comprendre et combattre les cancers du sang, les tests en laboratoire sur des cellules isolées ne suffisent malheureusement pas. D'abord, les cellules tumorales provenant des patients sont très fragiles et meurent en quelques jours si elles sont cultivées dans une boîte de culture. De plus, les cellules de laboratoire "standard" vendues dans le commerce ne ressemblent plus aux vraies tumeurs des patients. Ensuite, la leucémie ne se développe pas seule : elle survit et résiste aux traitements grâce à des "dialogues" très complexes avec son environnement direct, caché au cœur de la moelle osseuse. Il est impossible de reproduire cette configuration en dehors d'un organisme vivant. Enfin, avant de tester de nouveaux médicaments chez l'Homme, nous devons impérativement vérifier qu'ils sont à la fois efficaces contre la maladie et sans danger (non toxiques) pour le reste du corps.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire).
Raffinement
Les souris utilisées n'ayant pas de défenses immunitaires, elles seront logées dans des cages protégées et ventilées pour éviter toute infection. Afin de respecter leurs besoins naturels, elles vivront en colocation par groupes de 5. Pour améliorer leur confort au quotidien, nous ajouterons des cachettes et des jeux (tunnels, papier kraft, morceaux de bois à ronger). Un soigneur et notre équipe vérifieront chaque jour que les animaux vont bien et ne manquent de rien (eau, nourriture, propreté). Deux fois par semaine, nous ferons un examen de santé complet de chaque souris (poids, comportement, aspect du poil). Nous avons fixé des limites strictes : si une souris montre des signes de souffrance, elle sera immédiatement euthanasiée. Enfin, en cas d’affaiblissement, nous leur donnerons une alimentation plus molle et facile à manger directement au sol. Au moindre signe d'inconfort ou de légère douleur (comme un dos courbé ou les yeux plissés), un médicament antidouleur leur sera immédiatement administré et une surveillance plus fréquence sera mise en place.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris immunodéficientes sont décrites dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour greffer des cellules leucémiques humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques dans un microenvironnement tumoral complexe proche de la physiopathologie humaine. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 8 semaines que nous transplanterons avec des cellules de patients atteints de leucémie par voie intraveineuse. Nous utilisons des souris adultes car c’est une maladie qui apparaître chez l’Homme adulte.
Rôle de l’immunité innée et mécanismes de défense de l’hôte dans les infections à méningocoques dans un modèle murin de xénogreffe de peau humaine.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Un morceau de peau humaine est greffé sur le dos de souris immunodéficientes, au cours d'une chirurgie de 30 minutes suivie de sept jours sous bandage, avant qu'on leur injecte le méningocoque dans la veine de la queue. 1 308 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur décrit une septicémie qui mène à la prostration entre 6 et 16 heures après l'infection et assure que ses procédures "ne dépasseront pas 3h post-infection". Il prévoit pourtant des souris infectées "pendant 3 ou 16 heures" avant leur mise à mort.
Objectifs
Le méningocoque est une bactérie pathogène de l’homme responsable de septicémies (infections généralisées) et de méningites (infections du système nerveux). Ces infections graves sont souvent associées à des séquelles importantes, et restent parfois mortelles (10-20% des cas) malgré les traitements disponibles. Le pouvoir pathogène du méningocoque réside dans sa capacité à « coloniser » les vaisseaux sanguins humains. Après 24 à 48 heures, ce processus aboutit à la destruction du vaisseau colonisé. L’étude in-vivo des infections invasives à méningocoques nécessite un modèle murin basé sur la xénogreffe d’un morceau de peau humaine sur le dos de souris du fait de la spécificité de la bactérie pour les vaisseaux humains. Lors de la prise du greffon, les micro-vaisseaux humains contenus dans la peau humaine vont se connecter au réseau vasculaire murin. Ainsi, lorsque l’on injecte par voie intraveineuse des bactéries aux animaux, celles-ci vont se fixer sur la paroi des vaisseaux humains du greffon, se multiplier et induire des lésions vasculaires importantes comme dans la pathologie humaine. Toutefois, une limite majeure de ce modèle est qu’il utilise des souris immunodéficientes, qui sont donc incapables de reproduire la réponse immunitaire complète qui se met en place chez l’Homme. Dans ce contexte, notre projet vise à analyser, au sein de ce modèle de xénogreffe, le comportement des cellules humaines et murines, en conditions infectées et non infectées. Nous étudierons également leurs interactions avec les cellules immunitaires. À terme, une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires en jeu pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces.
Bénéfices attendus
Notre modèle murin avec xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoque observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins, entrainant le déclenchement d’une septicémie. À court et moyen terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment le système immunitaire réagit face à une infection à méningocoque. Il s’intéressera notamment au rôle de plusieurs types de cellules immunitaires qui participent à la défense de l’organisme contre ces agents infectieux. Les résultats obtenus pourraient conduire à des avancées thérapeutiques en identifiant de nouvelles cibles pour moduler la réponse inflammatoire. À long terme, nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme en permettant une prise en charge précoce plus efficace. Sur le plan scientifique, cette étude contribuera également à optimiser les protocoles expérimentaux pour les modèles de greffe et d’infection, tout en fournissant des données précieuses pour la recherche translationnelle. Enfin, ce projet renforcera la collaboration interdisciplinaire entre immunologie, biologie vasculaire et modélisation animale, tout en soutenant la formation de jeunes chercheurs dans un domaine à fort impact médical.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 3 types d’expériences : 1- Des expériences où les animaux seront infectés par l’injection intraveineuse de bactéries. Les injections se feront via la veine caudale sur des animaux vigiles placés dans un tube de contention pendant 2 min. Les animaux seront infectés pendant 3 ou 16 heures puis seront mis à mort. 2- À la suite de l’infection des animaux par l'injection intraveineuse de bactéries, des observations seront réalisées pendant une période maximale de 3h sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : - L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine est une chirurgie qui entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. Cette douleur sera contrôlée par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure chirurgicale. - La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. - Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection intraveineuse de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection). L’introduction de l’aiguille lors de l’injection intraveineuse entraine une douleur légère de courte durée. Nos procédures ne dépasseront pas 3h post-infection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.
Remplacement
Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilise des cellules en culture (i.e. culture et infection de cellules épithéliales ou endothéliales humaines in vitro, les deux types cellulaires sur lesquels la bactérie peut se fixer) ou des organes sur puce (i.e. développement d’un modèle de « vaisseaux sur puce »). Ces études permettent uniquement d’obtenir des informations sur les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité et dynamique du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin avec xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoque.
Réduction
Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude. Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. La répartition des animaux sera faite grâce à un outil de randomisation afin de créer des groupes expérimentaux homogènes. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées grâce à des analyses de variance et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Le recours à l’imagerie a permis un suivi longitudinal des mêmes animaux au cours du temps, offrant une étude dynamique et transversale de l’évolution de l’infection sans nécessiter le sacrifice d’animaux à chaque point expérimental. Cette approche a ainsi contribué à réduire ainsi le nombre total d’animaux requis tout en améliorant la qualité et la robustesse des données obtenues. De plus, plusieurs organes seront prélevés sur un même animal en fin d’étude afin de recueillir un maximum d’informations biologiques à partir de chaque individu et d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Notre expérience sur les procédures mises en œuvre nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs du projet. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle.
Raffinement
Souris immunodéficientes Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ils seront hébergés dans des portoirs ventilés, en cages individuelles autoclavées. Ils disposeront d'eau de boisson autoclavée et d'une alimentation irradiée. Tous les équipements et matériels entrant en contact avec les animaux seront autoclavés ou, lorsque l'autoclave n'est pas possible, décontaminés selon les procédures adaptées. Xénogreffe de peau humaine : 30 minutes avant la chirurgie, les animaux sont prémédiqués par injection sous-cutanée d'un antalgique et d'un anti-inflammatoire non stéroïdien. La chirurgie (~30 min) est réalisée sous anesthésie et sous loupe binoculaire pour une meilleure précision des gestes chirurgicaux, les animaux étant placés sur un tapis chauffant (37°C) pour éviter la baisse de leur température corporelle. Avant d'être placés dans leur cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante, les animaux greffés sont réhydratés par une injection sous-cutanée de sérum physiologique. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 2 jours après la chirurgie malgré le traitement (poils hérissés, changements d'expressions faciales, abattement, perte d'activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont évalués quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie, pendant le port du bandage, afin de détecter d'éventuels signes de souffrance et vérifier l'intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l'animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie ; s'il a lésé le greffon de peau humaine, l'animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l'évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Infection par le méningocoque : L'infection des animaux est réalisée par injection intraveineuse des bactéries. Les animaux sont ensuite placés dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichis en sucres et dont la moitié du sol est chauffée à l'aide de chaufferettes pour aider au maintien de leur température corporelle. Les animaux sont mis à mort à la fin de l'expérience. Hébergement : Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 4 maximum par cage, dans des cages contenant du coton et un igloo.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée et leur coût est relativement faible. Leur système vasculaire est proche du système vasculaire humain, ce qui permet l’interconnexion des deux réseaux lors de la xénogreffe de peau. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre la génération de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe immunitaire humaine efficace et prolongée. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentions sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.
Impact de l’hypergravité (2G) sur les performances mnésiques : contribution du système vestibulaire et adaptations musculaires dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Une semaine d'habituation, puis pour certaines souris une lésion des deux oreilles internes qui provoque désorientation et troubles de l'équilibre, suivie de sept jours d'isolement sans enrichissement : 1 068 souris, adultes, âgées de 19 mois ou issues de lignées à déficit vestibulaire ou de type Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Viennent quatre semaines de centrifugation à 2G, 45 minutes par jour cinq jours par semaine, ou de course sur tapis roulant avec stimulation par faible choc électrique, six injections dans l'abdomen, puis une série de tests : actimétrie, open field, reconnaissance spatiale, reconnaissance d'objet nouveau, suppression alimentaire par nouveauté après 24 heures sans nourriture, splash test. Toutes sont tuées à l'issue par perfusion intracardiaque sous anesthésie, pour prélever leur sang et leurs organes.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de comprendre comment une modification contrôlée des contraintes gravitationnelles peut influencer conjointement les fonctions cognitives et musculaires. Le rationnel repose sur l’idée qu’une stimulation gravitationnelle modérée et répétée constitue une intervention non médicamenteuse innovante, susceptible de prévenir ou de ralentir deux processus majeurs du vieillissement : le déclin cognitif et la sarcopénie. En effet, une augmentation transitoire de la gravité induit une activation à « bas bruit » mais chronique de deux systèmes clés : le système vestibulaire et le système musculaire. Lors d’une exposition à l’hypergravité, le système vestibulaire, via les organes otolithiques de l’oreille interne, détecte les variations du champ gravitationnel et transmet des signaux au cerveau impliqués dans l’équilibre, l’orientation spatiale et certaines fonctions cognitives. Parallèlement, l’augmentation des contraintes mécaniques stimule le système musculaire, favorisant la libération de myokines, reconnues pour leur rôle dans la plasticité synaptique, la neurogenèse et les processus mnésiques. Ce projet de recherche expérimentale vise à évaluer les effets d’une exposition répétée à une hypergravité sur les performances mnésiques et musculaires chez la souris. Afin de dissocier les contributions respectives des voies vestibulaire et musculaire, plusieurs modèles murins seront utilisés : des souris adultes saines et des souris âgées, des souris présentant un déficit vestibulaire, ainsi qu’un modèle murin de la maladie d’Alzheimer. L’étude s’appuiera sur une batterie de tests comportementaux standardisés permettant d’évaluer l’activité locomotrice, les comportements anxieux et les performances mnésiques, notamment à travers des tests de reconnaissance d’objets et de mémoire spatiale. Les résultats attendus permettront de mieux caractériser les interactions entre signaux vestibulaires, activité musculaire et fonctions cognitives dans un contexte de modification du champ gravitationnel. À terme, ce travail pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies non pharmacologiques ciblant simultanément le cerveau et le muscle, avec des perspectives d’application dans la prévention du vieillissement pathologique et des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Notre oreille interne ou système vestibulaire permet de percevoir la gravité, et assure ainsi les fonctions d’équilibre et de contrôle postural. Des études suggèrent son implication dans certaines fonctions cognitives, notamment la mémoire spatiale et les fonctions dépendantes de l’hippocampe, mais les mécanismes reliant les informations vestibulaires aux performances cognitives restent encore mal connus. Ce projet vise à mieux comprendre les effets d’une modification du champ gravitationnel sur les fonctions cognitives et les mécanismes physiologiques sous-jacents. L’exposition à l’hypergravité constitue un modèle expérimental pertinent permettant de stimuler fortement les capteurs gravitationnels de l’oreille interne et d’induire des adaptations physiologiques rapides. Deux voies physiologiques susceptibles de contribuer aux effets observés seront étudiées : la voie vestibulaire, impliquée dans la perception de la gravité et l’orientation spatiale, et la voie musculaire, notamment via la libération de myokines, connues pour influencer la plasticité cérébrale et les processus de neurogenèse. L’utilisation de différents modèles murins permettra de dissocier ces mécanismes. Les souris présentant un déficit vestibulaire génétique ou une lésion vestibulaire bilatérale permettront d’évaluer spécifiquement la contribution du système vestibulaire, tandis que les protocoles d’activité physique permettront d’explorer le rôle des adaptations musculaires. L’étude sera également étendue à un modèle murin de la maladie d’Alzheimer afin d’examiner si les modifications gravitationnelles et les adaptations musculaires peuvent influencer les altérations cognitives associées aux pathologies neurodégénératives. Des analyses comportementales et électrophysiologiques permettront d’évaluer les effets de l’hypergravité, de l’activité physique et des altérations vestibulaires sur les fonctions cognitives, la plasticité synaptique et l’activité des réseaux neuronaux hippocampiques. Ces travaux permettront de mieux comprendre les interactions entre système vestibulaire, activité musculaire et fonctions cognitives, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches préventives ou thérapeutiques ciblant la plasticité cérébrale. Ces travaux pourraient contribuer à améliorer la compréhension des troubles cognitifs associés aux dysfonctionnements vestibulaires observés chez l’humain, ainsi que des mécanismes impliqués dans certaines pathologies neurodégénératives.
Procédures
a) Tapis métabolique (2 fois 1h) : dispositif permettant de mesurer la consommation d’oxygène, la production de CO₂ et l’activité physique. b) Lésion vestibulaire bilatérale (30 min) : cela entraîne temporairement une perte d’équilibre, une désorientation et des mouvements anormaux des yeux. Ces effets sont plus importants durant les premiers jours puis diminuent progressivement, notamment après une dizaine de jours. Un analgésique sera administré (1 injection – 1min). Pendant les 7 jours suivant l’intervention, les animaux seront hébergés individuellement afin de permettre une surveillance rapprochée de leur état de santé sans enrichissement afin de limiter les risques d’étouffement. c) Injections (6 fois 1 minute) : chaque injection intrapéritonéale nécessite de maintenir brièvement l’animal immobile afin de réaliser le geste en toute sécurité. d) Hypergravité (45min/jour, 5 jours/semaine, 4 semaines) : les animaux seront placés dans une centrifugeuse afin de reproduire pendant une durée limitée des conditions de gravité plus élevée que la gravité terrestre habituelle. e) Activité physique sur tapis roulant (45min/jour, 5 jours/semaine, 4 semaines) f) Tests comportementaux : • Actimétrie : mesure de l'activité (24h) • Openfield : test d'exploration d'un espace ouvert (30min) • Reconnaissance spatiale : test d'orientation et de mémoire spatiale (30min) • Reconnaissance d’objet nouveau : test de reconnaissance d'un nouvel objet (30min) • Suppression alimentaire par nouveauté : test de réaction à un environnement nouveau après une période sans nourriture (24h restriction + test 15min) • Splash test : test de toilettage (10min) g) Acte terminal (10min) : prélèvement sanguin et perfusion intracardiaque permettant de récupérer les organes sous anesthésie profonde et analgésie (1 injection 1min), sans réveil.
Impact sur les animaux
a) Tapis métabolique : isolement, stress léger. Stimulation par faible choc électrique. Nuisance modérée. b) Lésion vestibulaire bilatérale. Désorientation, troubles oculomoteurs et posturo-locomoteurs, maximaux les premiers jours, atténués après 10 jours. Isolement post-chirurgical (7 jours) pour surveillance individuelle, aucun enrichissement possible (tumbling). Nuisance sévère. c) Injections intra-péritonéales nécessitant une contention. Stress transitoire et douleur légère. Nuisance légère. d) Hypergravité dans une centrifugeuse. Alourdissement, modifications locomotrices et physiologiques. Transitions rapides augmentent le stress et diminuent temporairement l’activité. Nuisance modérée. e) Activité physique. Confinement, stress modéré. Stimulation par faible choc électrique. Nuisance modérée. f) Tests comportementaux : • Actimétrie : isolement sans enrichissement, stress léger. Nuisance légère. • Openfield : espace ouvert, stress léger à modéré. Nuisance légère. • Reconnaissance spatiale : manipulation, stress léger. Nuisance légère. • Reconnaissance d’objet nouveau : nouveauté, stress léger. Nuisance légère. • Suppression alimentaire par nouveauté : stress modéré. Nuisance modérée. • Splash test : pulvérisation, inconfort léger. Nuisance légère. g) Acte terminal : prélèvement sanguin et perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde avec anesthésie locale et analgésie préalables, sans réveil.
Devenir
À l’issue du projet, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre les prélèvements et analyses ex vivo prévus (analyses histologiques, électrophysiologiques et dosages sanguins).
Remplacement
Ce projet vise à étudier les conséquences d’une altération du champ gravitationnel sur les performances mnésiques dans les modèles murins. L’évaluation des performances mnésiques nécessite un organisme capable d’exécuter des tâches cognitives. Aucun modèle in vitro ou in silico (mathématique ou bio-informatique) ne peut donc remplacer les animaux pour ces tests.
Réduction
Sur la base des données de la littérature et afin d’avoir des résultats significatifs, l’effectif minimal requis est estimé à 12 animaux par groupe. Afin de garantir l’effectif final analysable, les ajustements suivants ont été appliqués : • Les groupes âgés (19 mois) incluent 16 animaux afin de compenser la mortalité attendue liée au vieillissement des souris. • Les groupes soumis à une procédure chirurgicale incluent 16 animaux afin de tenir compte des pertes potentielles liées à la chirurgie et à la récupération post-opératoire. Les autres groupes expérimentaux comprennent 12 animaux par groupe, permettant de respecter l’effectif minimal calculé tout en appliquant le principe de réduction et de raffinement. L’ensemble des expérimentations sera réalisé chez les mâles et les femelles. Les effectifs calculés sont donc appliqués séparément à chaque sexe, conduisant à un doublement du nombre total d’animaux inclus dans l’étude. Des animaux sentinelles supplémentaires seront inclus afin de permettre des analyses électrophysiologiques nécessitant des prélèvements de tissu cérébral frais incompatibles avec l’acte terminal utilisé pour les analyses histologiques. Le nombre de ces animaux a été limité au strict minimum nécessaire (N=10 par groupe, N=14 pour les animaux âgés ou ceux subissant une approche chirurgicale) afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour les comparaisons électrophysiologiques tout en respectant le principe de réduction.
Raffinement
Les cages seront enrichies avec maison en papier mâché et bâtons en bois (sauf la semaine post-chirurgie du au risque d’étouffement). Une semaine d’habituation à l’animalerie sera assurée. Les animaux seront progressivement familiarisés à l’expérimentateur par des manipulations régulières afin de réduire le stress pendant 1 semaine. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Les souris seront placées 30 min dans la pièce de la centrifugeuse avant exposition et avant les tests comportementaux. Pendant l’hypergravité et 15 jours après la chirurgie vestibulaire, nourriture humidifiée et gélatine seront disponibles (également pour les témoins placés dans la même pièce). Les animaux seront surveillés en continu par vidéo pendant la centrifugation par un responsable, qui vérifiera apparence (poils hérissés, blessures) et comportement (prostration, activité réduite, réactions inhabituelles). Des points limites précoces et compatibles avec les objectifs scientifiques seront appliqués. Le site d’injection intrapéritonéale sera alterné. Avant l’acte terminal, réalisé sans réveil, les animaux seront analgésiés et placés sous anesthésie générale profonde, complétée par une anesthésie locale, afin de prévenir toute perception de la douleur..
Choix des espèces
Nous utiliserons des modèles murins pour plusieurs raisons. La souris a déjà été utilisée dans des protocoles impliquant une centrifugation, le modèle de lésion vestibulaire induite est bien validé. Le phénotype des souris hétérozygotes pour les tests choisis est bien décrit dans la littérature. L’étude sera également étendue à un modèle murin de la maladie d’Alzheimer afin d’examiner si les modifications gravitationnelles et les adaptations musculaires peuvent influencer les altérations cognitives associées aux pathologies neurodégénératives. De plus, la petite taille des souris permet d’utiliser les nacelles de centrifugeuse de taille fixe, limitant le nombre de séries expérimentales et réduisant les variations inter-séries. Au début des expérimentations, les souris seront âgées de 3 ou 19 mois (respectivement les groupes d’animaux adultes et âgées). 3 mois d’âge correspond à un stade adulte chez la souris auquel les fonctions locomotrices et cognitives sont complétement matures. L’âge de 19 mois a été choisi car il correspond à un stade de vieillissement où les déficits mnésiques sont établis. Ainsi, cela permettra une évaluation des effets de l’hypergravité, de la lésion vestibulaire ou de l’activité physique (sans biais due à la maturation du système nerveux, croissance corporelle, etc...). Les animaux de 19 mois seront commandés à âge adulte (2 mois) puis vieilliront au sein de notre animalerie.
Etude du métabolisme énergétique dans l’initiation et la progression du glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Endormis par le froid à la naissance, des souriceaux reçoivent une injection dans le cerveau associée à un petit courant électrique, puis à six semaines une nouvelle injection intracrânienne, et à douze semaines une ablation de la tumeur. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce une douleur "modérée à intense pendant quelques jours" après les opérations, puis pendant la croissance de la tumeur des difficultés à bouger, des troubles de la vue, un amaigrissement important ou une accumulation de liquide dans la tête. Un essai sur des cancers de patients est renvoyé "au-delà de 5 ans".
Objectifs
Notre projet porte sur l’étude d’un cancer du cerveau particulièrement agressif chez l’adulte. Malgré les traitements actuels, cette maladie reste difficile à soigner avec des rechutes fréquentes et une survie limitée. Pour mieux comprendre comment ce cancer évolue, nous étudions les interactions entre les cellules cancéreuses et leur environnement dans le cerveau, ainsi que les mécanismes qui permettent leur développement. Les modèles actuels ne reflètent pas toujours fidèlement la réalité chez les patients. Nous souhaitons donc utiliser des modèles plus proches de la situation humaine pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. L’objectif est de voir si ces approches peuvent réduire la croissance de la tumeur et modifier son environnement pour la rendre plus vulnérable aux traitements. Notre but est de trouver de nouvelles façons de lutter contre cette maladie et d’améliorer les chances des patients.
Bénéfices attendus
De nouvelles pistes thérapeutiques sont aujourd'hui indispensables pour traiter ce cancer du cerveau particulièrement agressif et difficile à guérir. Développer des modèles animaux plus proches de la réalité humaine, reflétant la diversité et l'évolution de la tumeur chez les patients, représente une étape clé pour mieux comprendre cette maladie. Cette étude nous permettra d'explorer la complexité de l'environnement et du métabolisme qui favorisent la croissance et la résistance de ce cancer. Notre espoir est de découvrir de nouvelles combinaisons de traitements capables d'améliorer la survie des patients. À court terme (1 à 2 ans), nous chercherons à comprendre comment le cancer du cerveau grandit et devient plus agressif dans notre modèle. À moyen terme (2 à 5 ans), nous testerons des traitements innovants sur les animaux pour ce cancer pour voir s’ils peuvent aider à le soigner. À long terme (au-delà de 5 ans), l’objectif sera de mettre en place un essai pré-clinique sur des cancers de patients pour appliquer les résultats de notre étude sur des patients humains.
Procédures
Les animaux seront soumis à : une injection dans le cerveau à la naissance (5 min, sous anesthésie), une injection intracrânienne à 6 semaines (30 min, sous anesthésie), une résection du cancer à 12 semaines (30 min, sous anesthésie), des injections de traitements entre les semaines 12 et 15 (sans anesthésie, animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Les souris peuvent subir quelques désagréments pendant l’expérience : Endormissement : Risque de difficultés respiratoires ou cardiaques (avec l'anesthésie) ou de baisse importante de la température corporelle (endormissement par le froid à la naissance), avec une surveillance jusqu’à leur réveil complet. À la naissance : Douleur légère à modérée due à une injection d’un produit véhiculée par un petit courant électrique. Opérations dans la tête (injection d’un virus ou ablation de la tumeur) : Douleur modérée à intense pendant quelques jours. Traitements : Stress initial lié aux injections ou à l’administration par la bouche, qui diminue avec l’habitude. Croissance de la tumeur : Inconfort progressif entre 8 et 15 semaines, avec des difficultés à bouger, de la fatigue, des troubles de la vue, un amaigrissement important ou une accumulation de liquide dans la tête.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin d'analyser l'efficacité des traitements.
Remplacement
Ce projet vise à étudier comment le cancer du cerveau progresse et interagit avec son environnement, ainsi que les changements dans le fonctionnement du cerveau. Des tests en laboratoire sur des cellules ont permis de sélectionner les molécules les plus prometteuses avant de les tester sur des animaux. L’étude de ces mécanismes nécessite l’utilisation d’un être vivant entier, car ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites avec des modèles simplifiés en laboratoire.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables. C'est à dire, le moins d’animaux possible pour obtenir des résultats fiables.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera une priorité à chaque étape. Nous prendrons soin d’eux pendant et après les opérations, en utilisant des produits pour les endormir et soulager la douleur. Nous surveillerons leur état (poids, apparence, comportement) pour évaluer leur bien-être. Après l’opération, elles auront de la nourriture humide en plus de leur alimentation habituelle. Si besoin, des mesures supplémentaires seront prises pour les soulager, et des seuils sont fixés pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, modèle le plus pertinent pour permettre l’étude des interactions entre le cancer du cerveau et son environnement. Ces souris ont été choisies car elles présentent des caractéristiques génétiques uniformes, ce qui garantit des résultats plus cohérents et comparables. Les souris seront utilisées dès leur naissance pour concevoir des modèles de cancer du cerveaux plus proches de ceux observés chez les patients, ce qui rend notre étude très pertinente pour tester de nouveaux traitements pour les patients.
Évaluation des effets d’une nouvelle formulation d’un principe actif cyto-protecteur sur la survie et la régénération tissulaire post-irradiation.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
4 906 souris vont être utilisées, chacune subissant jusqu'à 27 gestes en 30 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont irradiées sur le corps entier sans anesthésie ou sur l'abdomen sous anesthésie, puis reçoivent une molécule par sonde ou par injection, avec des pesées tous les un à deux jours et une prise de sang par semaine. Le porteur liste parmi les effets attendus perte de poids, anémie, prostration, déshydratation, "ou la mort", et mesure l'efficacité du traitement à la survie des souris, suivies de 30 jours à six mois puis tuées. Les autres sont tuées à différents temps après l'irradiation pour prélever les tissus touchés. La molécule doit servir de contre-mesure aux irradiations par accident ou lors d'"attaques", pour des militaires, des secouristes et "un grand nombre de victimes".
Objectifs
L’exposition accidentelle ou malveillante à une dose forte ou modérée de rayonnements ionisants en un temps très court provoque un syndrome d’irradiation aiguë (SIA), engageant immédiatement le pronostic vital. À ce jour, les thérapies sont limitées. Si des facteurs de croissance hématopoïétique existent, leur usage est limité par un coût très élevé et la survenue d’effets secondaires à long terme. Les autres options, comme les greffes de moelle osseuse, sont lourdes et invasives. Enfin, les soins de support classiques ne traitent que les symptômes (diarrhées, vomissements, infections) sans garantir la survie. Il existe donc un besoin critique de développer des contre-mesures médicales efficaces et facilement administrables. Ce projet vise à évaluer l’efficacité une nouvelle molécule auto-administrable, capable d’agir en prévention (avant une irradiation) ou en traitement (après une irradiation). L’étude se concentre sur la protection et la régénération de deux tissus vitaux particulièrement sensibles aux rayonnements : 1. la moelle osseuse : garante de la production des cellules sanguines (syndrome hématopoïétique). 2. l’intestin grêle, dont la barrière épithéliale, renouvelée tous les 4 à 5 jours, empêche le passage des bactéries dans le sang (syndrome gastro-intestinal). L’efficacité des traitements sera mesurée par la survie des animaux et la capacité de ces tissus à se reconstituer rapidement après l’irradiation. Le protocole utilise un modèle murin, référence validée et standardisée dans les études radiobiologiques internationales. Ce choix est justifié par la similarité des réponses physiologiques des tissus hématopoïétiques et intestinaux entre la souris et l’homme face aux rayonnements.
Bénéfices attendus
Le projet vise à démontrer l'efficacité de la molécule d'intérêt dans un modèle murin par trois indicateurs concrets : • Amélioration de la survie des animaux exposés aux radiations. • Réduction des effets indésirables associés à l'irradiation. • Accélération de la récupération grâce à une régénération plus rapide des tissus lésés (moelle osseuse et intestin grêle). Si les résultats sont positifs, le projet offre des avantages majeurs pour la prise en charge des populations exposées (accidents nucléaires, attaques, ou professionnels à risque) : • Une solution d'urgence autonome : la possibilité d'une administration rapide et autonome du traitement sur le terrain, sans attendre une infrastructure hospitalière parfois difficile d’accès. • Une approche préventive et curative : • en préventif : protection des personnes à risque (militaires, secouristes, civils en zone sensible) avant l'exposition. • en curatif : amélioration du pronostic vital et de la récupération hématopoïétique et intestinale après l'exposition. • Une alternative aux traitements actuels limités : Le projet répond à un besoin critique car les solutions actuelles sont soit inexistantes (pour l'atteinte gastro-intestinale), soit inapplicables à grande échelle (greffes, facteurs de croissance). Par rapport aux traitements actuels (greffes de moelle, facteurs de croissance), ce nouveau traitement présenterait des avantages décisifs pour une gestion de crise : • Réduction des coûts : alternative aux traitements actuels très coûteux. • Simplification logistique : évite les contraintes lourdes comme la recherche de donneurs compatibles, les traitements immunosuppresseurs à vie et les risques de rejet associés aux greffes. • Gestion de masse : permet une généralisation du traitement à un grand nombre de victimes, ce qui est impossible avec les méthodes invasives actuelles.
Procédures
Dans l’étude du syndrome hématopoïétique induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : Pour 1448 souris sur 3572 : - 1 irradiation sur corps entier en vigile (durée < 10 minutes) Pour 1104 souris sur 3572 : - 1 administration par sonde flexible (4 maximum d’une durée de 2 minutes) Pour 1548 souris sur 3572 : - 1 injection (4 maximum d’une durée de 30 secondes) - Pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) Pour 2612 souris sur 3572 : - 1 prélèvement de sang /semaine sur une durée de 30 jours (4 maximum de 3 minutes), puis 1 prélèvement de sang juste avant l’euthanasie sous anesthésie (35 min). Pour 56 souris sur 3572 : - 3 injections (30 secondes /injection) Pour 960 souris sur 3572 : - 1 injection sous anesthésie gazeuse (10 min en comptant l’effet de l’anesthésie et l’injection) Les souris subiront au maximum 27 gestes techniques sur 30 jours. Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : Pour 996 souris sur 1334 : - 1 irradiation locale au niveau abdominal, sous anesthésie (20 min en comptant l’anesthésie et l’irradiation) Pour 432 souris sur 1334 : - 1 administration (4 maximum d’une durée de 2 minutes chacune) Pour 592 souris sur 1334 : - 1 injection (4 maximum d’une durée de 30 secondes chacune) Pour 1334 souris : - Pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) - 1 prélèvement de sang juste avant l’euthanasie, sous anesthésie gazeuse avec analgésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). Les souris subiront au maximum 23 gestes techniques sur 30 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une anémie, une prostration, de la déshydratation, ou la mort. Un stress est envisagé lors des pesées, et au moment des administrations orales ou injectables des molécules. Des douleurs ponctuelles sont possibles lors des prélèvements et/ou des injections.
Devenir
L’étude de la survie des animaux se fera sur une durée de 30 jours à 6 mois. A terme, ils seront euthanasiés. A différents temps après irradiation, les animaux traités ou non seront euthanasiés afin de prélever les tissus et organes connus pour être très impactés par l’irradiation. Les analyses permettront d’évaluer l’efficacité du traitement sur ces tissus au cours du temps.
Remplacement
1) Pour l’étude de la survie des individus après irradiation, aucune alternative non animale ne peut être mise en place. 2) Dans l’analyse de la reconstitution hématopoïétique après irradiation, il n’est pas possible d’utiliser des alternatives comme par exemple des organoïdes ou des cultures cellulaires. En effet, les cellules souches de la moelle osseuse agissent de concert avec leur microenvironnement, constitué de plusieurs types cellulaires, pour permettre la reconstitution hématopoïétique après irradiation. L’étude sur l’animal corps entier est donc la seule approche possible pour une analyse physiologique des effets d’un traitement après irradiation depuis la cellule souche jusqu’aux cellules matures. 3) Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal aigu, bien que les organoïdes intestinaux constituent un outil pertinent pour des analyses moléculaires ou cellulaires ciblées, ils ne permettent pas d’évaluer la restauration de la barrière intestinale dans un contexte physiologique réel. Le syndrome gastro-intestinal radio-induit (GI-ARS) n’est pas seulement une perte cellulaire locale ; c’est une rupture de l’équilibre gastro intestinal impliquant l’interaction avec le microbiote et le système immunitaire. Notre projet vise à mesurer des paramètres physiologiques critiques, tels que la perméabilité intestinale in vivo, le passage des bactéries vers la circulation sanguine et la réponse inflammatoire associée. Ces phénomènes, qui déterminent le risque de septicémie et de défaillance des organes, nécessitent impérativement un organisme fonctionnel avec une circulation sanguine et un système immunitaire intacts. Par conséquent, l’étude sur l’animal corps entier est la seule approche valide pour démontrer l’efficacité du traitement sur la restauration d’une barrière intestinale fonctionnelle et son impact sur la survie globale.
Réduction
Les modèles de souris que nous utiliserons sont des lignées consanguines montrant moins de variabilité génétique entre les individus. Ainsi, il sera possible d’obtenir des résultats significatifs en utilisant moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. Ceci permet de réduire le nombre de souris. En effet, en utilisant des lignées consanguines (où les individus sont génétiquement quasi identiques), on élimine le « bruit » de fond causé par les différences naturelles entre les souris. Par conséquent, si une différence est observée entre deux groupes expérimentaux, il est beaucoup plus probable qu'elle soit due au traitement testé plutôt qu'au hasard génétique. Nous avons également utilisé un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant par groupe d’étude pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris seront régulièrement pesées et observées (posture, comportement, niveau d’activité, déshydratation). Nous utiliserons une grille de score pour évaluer leur état général et avons établi des points limites. Pour éviter une infection due à une diminution du système immunitaire, les cages seront placées en portoirs ventilés. Les souris seront hébergées en groupe, avec enrichissement (coton, tunnels en carton). Certains gestes pouvant être source de stress, les souris seront anesthésiées. Pour des gestes pouvant être source de douleur, elles recevront un antalgique préalablement à l’anesthésie.
Choix des espèces
Les souris consanguines sont les mieux caractérisées en biomédecine et sont largement utilisées pour étudier le rôle d’un gène spécifique dans un organisme. Elles font l’objet d’un grand nombre d’études pour analyser les effets biologiques des rayonnements ionisants et leur consanguinité réduit les effectifs utilisés car elles montrent moins de variabilité phénotypique. Ainsi, la puissance statistique est obtenue avec moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. De plus, les syndromes d’irradiation que nous souhaitons étudier sont bien caractérisés chez les souris. Tout ceci présente des avantages scientifiques et éthiques. Nous utiliserons des souris adultes de 10 à 15 semaines (une souris est considérée comme étant adulte à l’âge de 7 semaines). Une souris prépubère (moins de 7 semaines) a un environnement de sa moelle osseuse (nécessaire à la production des cellules sanguines et à la préservation des cellules souches) qui n’est pas définitif. Une souris de plus de 7 mois est considérée comme âgée d’un point de vue hématopoïétique. Ceci restreint notre choix à l’utilisation de jeunes souris adultes. Pour des raisons de reproductibilité des expériences, le poids et la taille des souris doivent être identiques entre les groupes, ce qui est le cas chez les jeunes adultes à l’âge choisi.
Étude du rôle d’un récepteur protéique dans la modulation de la perméabilité vasculaire dans différents états de chocs.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un arrêt cardiaque de huit minutes suivi d'une réanimation, ou une injection de suspension de matières fécales dans l'abdomen pour déclencher un choc septique : 6 888 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs tissus. Le choc septique provoque une chute de pression artérielle puis des troubles de conscience jusqu'au coma, l'arrêt cardiaque une encéphalopathie post-anoxique. Deux lignées privées du récepteur d'une protéine, dans les cellules immunitaires ou dans les cellules vasculaires, sont utilisées pour chercher comment cette protéine limiterait la fuite capillaire. Le porteur reconnaît que les doses employées "peuvent davantage engendrer l'apparition de douleurs physiques et psychologiques", et indique que dans les études de survie, le point limite reste "la mort de l'animal".
Objectifs
Les états de choc (septique, cardiogénique, hémorragique ou anaphylactique) s’accompagnent d’une fuite vasculaire majeure, qui correspond à une sortie de liquide des vaisseaux sanguins vers les tissus environnant formant à terme de l'oedème. Celle-ci est due à l’activation de l’inflammation suite aux dommages tissulaires généraux. Elle aggrave le manque d’irrigation des tissus en provoquant une diminution du volume sanguin, et est responsable d’une mortalité de l’ordre de 60%. Rechercher des cibles thérapeutiques pour contrôler cette fuite représente donc un enjeu crucial pour les patients, car il n’existe pas de traitement disponible à l’heure actuelle. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire chez l’Homme, particulièrement dans le cadre du choc septique et du choc cardiogénique post arrêt cardiaque. De précédentes recherches ont permis d’identifier une cible thérapeutique potentielle pour réduire la fuite capillaire ainsi que la mortalité, dans deux modèles murins différents que sont le choc septique et le choc cardiogénique post arrêt cardiaque. Pour aller plus loin dans l’étude des mécanismes d’actions aboutissant à la protection vasculaire que l’on observe suite à l’injection de la protéine cible, notre objectif est d’étudier l’effet de cette protéine en ciblant le récepteur de cette dernière. Cela nous permettra de déterminer si la protéine cible a un effet protecteur direct sur les cellules endothéliales ou un effet protecteur passant par une modulation du profil immuno-inflammatoire. Pour cela, deux lignées de souris ont été générées avec une délétion du récepteur de la protéine cible soit dans les cellules immunitaires, soit dans les cellules vasculaires. Ces deux lignées seront ensuite utilisées dans un modèle de choc septique ou de choc cardiogénique post arrêt cardiaque.
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique et du choc cardiogénique post arrêt cardiaque est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical évident, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients et par conséquent l’augmentation de leur mortalité. L'objectif de ce projet à court et moyen terme est d'étudier les effets protecteurs de cette protéine, de comprendre les mécanismes d'actions aboutissant à l'effet protecteur que l'on observe et mettre en évidence le profil pathologique le plus susceptible de répondre au traitement en fonction du type de choc. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients, que ce soit dans les différents états de chocs ou dans d’autres pathologies comme le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
1)Pour les procédures sepsis : Chaque animal recevra une injection pour induire le choc septique conduisant à la fuite capillaire. Les souris recevront toutes un traitement de nos protéines d’intérêt par injection intrapéritonéale (i.p.) en étant vigiles. De manière à ne s’intéresser qu’à l’inflammation induite par les toxines bactériennes suite à l’induction du choc septique qui sera réalisée en i.p. par injection de suspension de matière fécale (1min), une molécule d’intérêt sera injectée, par voie i.p. (1min), 9h après l’induction du choc septique. Ensuite, une échographie (d'une durée totale de 20 min) sous anesthésie générale suivie d’un prélèvement intracardiaque terminal (typiquement 1 à 2min) seront réalisés sur une partie des souris. Sur une autre partie, une mesure de la pression artérielle (également d’une durée de 20 min) sera réalisée sous anesthésie générale après une microchirurgie (10min). 2) Pour les procédures arrêt cardiaque : Ces procédures comprendront : - la pose d'un abord vasculaire (cathéter veineux) qui sera réalisé sous anesthésie générale (20min). – un arrêt cardiaque long (8min) puis une réanimation cardiopulmonaire. Ensuite, une échographie (d'une durée totale de 20 min) suivie d’un prélèvement intracardiaque terminal (typiquement 1 à 2min) seront réalisés sur une partie des souris. Sur une autre partie, une mesure de la pression artérielle (également d’une durée de 20 min) sera réalisée après une microchirurgie (10min).
Impact sur les animaux
1) Pour les procédures sepsis : l’injection d’une suspension de matières fécales de souris induisant le choc septique entraîne une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma) qui apparaît et s'intensifie progressivement suite à l’infection. 2) Pour les procédures d’arrêts cardiaques : l'arrêt cardiaque induit une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience, les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure.
Devenir
Mise à mort, pour récupération du sang et des tissus.
Remplacement
La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle qui ne peut être étudié sur des modèles in vitro ne reflétant pas la totalité de la complexité d’un organisme entier. Les cibles thérapeutiques testées régulent de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme et l’évaluation de leurs effets potentiels nécessite également le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire.
Raffinement
Le choc induit par l’injection de matières fécales s’accompagne d’un effet sédatif, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédant le coma, une antalgie par injection sous-cutanée sera réalisée. L’inconfort sera dépisté selon une grille d’expression faciale toutes les 2 heures et complétée par une grille de score de point limite. Si ce score est ≥3 un traitement antalgique sera administré par voie sous-cutanée. Si, malgré ce traitement antalgique, l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages (coton, craft, maison) et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal à l’issue d’une intervention ou dans le cadre du suivi, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Lors de l’étude de survie, les animaux seront davantage surveillés (toutes les deux heures). Bien que le point limite dans les études de survie soit la mort de l’animal, nous tenterons, compte tenu de la fréquence de surveillance des animaux, de repérer dès que possible ceux montrant des signes de mort imminente afin de procéder à leur mise à mort compassionnelle sous anesthésie profonde.
Choix des espèces
Le modèle animal souris a été choisi car les protocoles précis de sepsis et d'arrêt cardiaque sont désormais bien établis chez la souris et ont permi de démontrer les effets protecteurs de la protéine cible. Afin d'étudier les mécanismes d'action de la protéine cible plus précisément, les modèles de souris ne possédant pas le récepteur de la protéine cible sur les cellules des vaisseaux sanguins ou les cellules immunitaires est également pertinant afin de pouvoir observer les différences induites par l'absence du récepteur sur la fuite vasculaire. Les expériences seront réalisées sur des souris âgées de 10 à 16 semaines pour d'inscrire dans le contexte pathologique.
Etude des circuits neuronaux de l’encodage de la valence dans la prise de décision
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement dans le cerveau, 360 souris sont ensuite isolées et privées d'eau en partie pour apprendre des tâches de prise de décision en réalité virtuelle, la tête immobilisée, pendant 8 à 12 semaines. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur qualifie la restriction hydrique de contrainte "modérée et prolongée" et conclut que les effets attendus sont "majoritairement légers à modérés", pour un projet qu'il déclare lui-même de gravité sévère. Toutes sont tuées par injection létale sous anesthésie profonde, puis leur cerveau est prélevé pour vérifier l'emplacement des implants.
Objectifs
Le cerveau analyse en permanence son environnement pour adapter le comportement. Les émotions, positives ou négatives, jouent un rôle clé en orientant nos choix vers l’approche ou l’évitement. Ce projet vise à comprendre comment le cerveau traite ces émotions et comment elles influencent la prise de décision chez la souris. Nous étudions en particulier les interactions entre plusieurs régions cérébrales impliquées dans ces processus. Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de troubles comme l’anxiété ou le stress post-traumatique, et pourraient contribuer à développer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet utilise un modèle chez la souris pour mieux comprendre comment le cerveau gère les émotions. À court et moyen terme, il permettra de mieux comprendre comment les émotions influencent nos décisions. À plus long terme, ces recherches pourraient aider à mieux comprendre certaines maladies, comme l’anxiété ou le stress post-traumatique, et à développer de nouvelles pistes de traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour l’implantation des dispositifs nécessaires à l’étude, réalisée une fois par animal, pour une durée d’environ 30 à 60 minutes. Ils participeront ensuite à des tests comportementaux de prise de décision en réalité virtuelle, réalisés plusieurs fois par semaine pendant la durée de l’apprentissage et des enregistrements, sur une période maximale de 8 à 12 semaines. Chaque séance durera environ 1 à 2 heures. Selon les groupes, les animaux pourront bénéficier d’enregistrements de l’activité cérébrale au cours des tests comportementaux, réalisés à plusieurs reprises pendant les séances expérimentales.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sont directement liés aux actes expérimentaux réalisés au cours du protocole. La manipulation répétée en phase d’habituation peut induire un stress léger et transitoire (quelques minutes par jour pendant une semaine), qui diminue progressivement avec l’habituation. Les interventions chirurgicales entraînent une douleur modérée et un risque d’infection, principalement durant les 48 à 72 heures post-opératoires. L’hébergement individuel mis en place pendant la phase expérimentale peut constituer une contrainte modérée liée à la réduction des interactions sociales avec les congénères. Les tests comportementaux en réalité virtuelle, réalisés en condition de tête restreinte et associés à une restriction hydrique, peuvent induire un stress modéré et une frustration, sur des sessions quotidiennes de durée limitée (30 à 60 minutes) pendant plusieurs semaines. La restriction hydrique constitue une contrainte modérée et prolongée, encadrée par un suivi du poids permettant de limiter la perte. Dans l’ensemble, les effets attendus sont majoritairement légers à modérés, transitoires ou contrôlés, en dehors de complications exceptionnelles.
Devenir
À l’issue de la procédure, la totalité des animaux (360 souris, 24 lots) est mise à mort selon une méthode unique : anesthésie générale profonde suivie d’une injection létale par voie intrapéritonéale. Le cerveau est ensuite prélevé, après fixation par perfusion intracardiaque, afin de réaliser les contrôles histologiques indispensables à la validation des sites d’implantation et d’injection. Aucun animal n’est maintenu en vie, réutilisé, replacé ou proposé à l’adoption à l’issue du projet.
Remplacement
Ce protocole nécessite l’utilisation d’animaux. En effet, l’identification des circuits neuronaux impliqués dans les émotions et la prise de décision requiert l’étude d’un cerveau intact chez l’animal vigile. Les méthodes in vitro, telles que les cultures cellulaires ou les coupes de cerveau, ne permettent pas de préserver l’intégrité des connexions neuronales qui constituent le cœur de nos travaux. Il n’existe donc pas, à ce jour, de méthode alternative pertinente.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’estimations quantitatives issues de données préliminaires et de la variabilité attendue pour ce type de mesures, afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. En amont du projet, des études pilotes ont été réalisées afin d’optimiser les paramètres expérimentaux et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Les protocoles comportementaux et les conditions d’enregistrement ont été ajustés sur un nombre restreint d’animaux avant le lancement de l’étude principale. Au cours du projet, plusieurs mesures sont mises en place pour limiter le nombre d’animaux : utilisation de techniques permettant d’obtenir un grand nombre de données par animal (enregistrements répétés, imagerie et électrophysiologie), optimisation des conditions expérimentales pour limiter les pertes de données, analyses intermédiaires permettant d’ajuster les effectifs si nécessaire. Ces stratégies permettent de garantir l’utilisation du nombre minimal d’animaux compatible avec les objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation et sont manipulés régulièrement afin de limiter le stress lié aux interactions avec l’expérimentateur. Lors de leur entrée en procédure, ils sont hébergés individuellement avec un enrichissement permanent et renouvelé associant un matériau de nidification végétal, un tube en carton servant d’abri et de structure d’exploration, et un bâtonnet de bois à ronger, afin de limiter les effets liés à l’isolement. Les cages sont maintenues contiguës afin de préserver les contacts sensoriels entre congénères, et la qualité de construction du nid est contrôlée quotidiennement comme indicateur de bien-être. Une attention particulière est portée à la réduction de la douleur et de l’inconfort lors des procédures chirurgicales. Une analgésie préventive est administrée avant la chirurgie, associée à une anesthésie locale. Les animaux sont maintenus sous anesthésie générale pendant toute la durée de l’intervention. Un suivi post-opératoire rigoureux est assuré. Une analgésie post-opératoire est administrée systématiquement, et une administration supplémentaire d’analgésique est réalisée le lendemain de la chirurgie si nécessaire, en fonction de l’état de l’animal. Des mesures de soutien (alimentation enrichie, surveillance du poids et du comportement) sont mises en place jusqu’à récupération complète. Afin de limiter les contraintes liées à la restriction hydrique, un suivi quotidien est réalisé incluant le poids, l’état général et l’hydratation. Les apports hydriques sont ajustés individuellement, et toute altération de l’état de l’animal entraîne une suspension immédiate de la restriction et la mise en place de mesures correctives adaptées. Des points limites précoces ont été définis et permettent d’interrompre la procédure si nécessaire, afin de limiter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le développement de notre protocol comportemental, associé à la richesse des connaissances scientifiques disponibles sur le fonctionnement du système nerveux central chez la souris, ainsi qu’à la maîtrise de son élevage et de sa génétique, à sa taille réduite et au développement de techniques d’enregistrements électrophysiologiques, en font un modèle de choix pour les études comportementales et d'enregistrement de l'activité des neurones. Son utilisation est largement répandue en neurosciences, en particulier pour l’étude du comportemente et de la mémoire. Pour ces raisons, nous utilisons exclusivement ce modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2 à 3 mois, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’implantation.