Procédures sévères

490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 340 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 150 un niveau modéré. Un saignement est provoqué dans leur cerveau au cours d'une chirurgie de quarante-cinq minutes, suivie de cinq à dix injections, de quatre prises de sang en un mois, d'une IRM de vingt minutes et d'un transport entre deux établissements. Il s'agit de mesurer le risque hémorragique de deux anticorps antiplaquettaires et leur effet sur les micro-caillots, les cerveaux étant prélevés après la mise à mort pour quantifier le saignement. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible" de remplacer la souris par de l'in vitro, quelques lignes après avoir indiqué que l'effet antithrombotique de ces mêmes anticorps a déjà été confirmé in vitro sur du sang humain.

Objectifs

Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont aussi impliquées dans la thrombose, c’est-à-dire la formation d’un caillot, qui se développent dans une artère malade. La paroi de l’artère malade induit le recrutement de plaquettes et la formation du caillot, appelé thrombus. Ce phénomène peut aboutir à un accident vasculaire cérébral (AVC). Nous avons généré deux agents antiplaquettaires. Ils ont montré qu’ils empêchaient la formation de caillot dans un modèle in vitro. De plus, des modèles de saignement ont montré qu’ils augmentaient moins le saignement que les antiplaquettaires actuellement utilisés en clinique. Ces agents pourraient être utilisés dans le traitement des AVC. Les traitements antiplaquettaires actuels sont peu utilisés car ils présentent un risque de saignement trop important qui pourrait être fatal pour le patient. Les options thérapeutiques sont donc limitées. Les agents pourraient présenter moins de risque de saignement et donc être utilisés dans cette pathologie. Les agents pourraient également être utilisés dans le traitement du Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT). Les patients présentant cette pathologie ont des tout petits caillots dans les vaisseaux sanguins ainsi qu’une diminution des plaquettes due à leur consommation des plaquettes lors de la formation de ces caillots, conduisant à des saignements. Nos agents pourraient réduire les petits caillots sans augmenter les saignements chez les patients PTT. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer le risque de saignement des agents dans deux modèles de saignements cérébraux et leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de PTT. Les agents seront comparés à des traitements déjà utilisés en clinique. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet portent sur 2 aspects : - AVC : les agents pourraient présenter un risque de saignement plus faible que les traitements antiplaquettaires classiques et donc représenter un nouveau traitement pour les patients présentant un AVC. - PTT : les agents pourraient réduire la formation de petits caillots chez les patients PTT sans augmenter le saignement, ce qui représenterait un nouveau traitement pour les patients PTT. Ce projet pourrait permettre à long terme de mieux traiter les patients présentant un AVC ou un PTT.

Procédures

Dans les modèles de saignements cérébraux, les animaux seront soumis à une chirurgie (45 min, EU1), à des injections (5 à 10, EU1), à des prélèvements de sang (4 sur 1 mois, EU1) et à un IRM (20 min, EU2). Dans le modèle PTT, les souris seront soumises à des injections (4, EU1) et à des prélèvements de sang (2, EU2).

Impact sur les animaux

Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur la respiration. Concernant les injections, on peut s’attendre à une douleur localisée. Le transport et les anesthésies pourront causer du stress. Le prélèvement de sang peut entrainer un saignement localisé de courte durée. On pourra observer des saignements au site d’incision lors de la chirurgie et, au réveil, on s'attend à un impact sur le comportement, l'apparence physique, la nutrition et la motricité ainsi qu’à des signes de douleur notamment au site chirurgical. Dans le modèle antigène – anticorps, on s’attend à des saignements en cas de blessure, à un impact sur le comportement et sur l’apparence physique.

Devenir

A l’issue de la procédure de saignement cérébraux et d’AVC, les animaux anesthésiés sont mis à mort afin de prélever les cerveaux pour quantifier le saignement cérébral. Dans la procédure de PTT, une grande quantité de sang est prélevée pour évaluer l’impact de nos agents sur le PTT, ce qui nécessite la mise à mort de l’animal.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’agents dans des modèles de saignements cérébraux et de PTT. Dans les deux cas, le processus étudié est complexe et relève du fonctionnement de l’organisme complet (vaisseaux, pression artérielle, circulation du sang…). Il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus. Cependant, l’effet anti-thrombotique de nos agents a déjà été confirmé in vitro dans un modèle de perfusion de sang utilisant du sang humain de donneur sain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 20 à 45 souris/groupe pour la mise au point des modèles et à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats lors des expérimentations.

Raffinement

Les animaux disposent de 14 jours d’acclimatation entre leur arrivée à l’animalerie et leur utilisation en procédure. Une habituation à la contention d’une durée de 5 jours est prévue. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Le changement d’hébergement en fonction des groupes n’est réalisé que si nécessaire. Aucun regroupement n’est réalisé afin d’éviter le risque de conflits, nous séparerons seulement les souris qui ne subiront pas l’expérimentation des souris qui la subiront. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant chaque opération. • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal endormi • Par l’application d’une goutte d’anesthésique local sur l’œil après les injections au niveau de l’oeil • Par injection de sérum physiologique avant les procédures chirurgicales afin d’assurer l’hydratation de l’animal. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés et caractérisés. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant la forme humaine du récepteur plaquettaire ciblé, permettant d’étudier l’effet des agents sur les saignements cérébraux et dans le traitement du PTT. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris adultes et ne présentant pas encore de vieillissement.

La souche C57BL6 a été retenue parce que sa sensibilité à l'insuffisance rénale est jugée adéquate et bien documentée : 32 souris noires de 9 à 10 semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 24 d'entre elles. Une chirurgie de 60 à 75 minutes bloque la circulation rénale pour provoquer la lésion. Suivent cinq jours d'administration orale deux fois par jour, deux incisions au bout de la queue pour recueillir quelques gouttes de sang, et 24 heures passées à deux dans une cage à sol grillagé pour collecter l'urine. Le porteur indique que le degré d'insuffisance rénale provoqué peut être incompatible avec la survie de l'animal dans moins de 20 % des cas, et fait dépendre l'ampleur de la lésion d'une mesure stricte de la durée d'ischémie.

Objectifs

La maladie rénale chronique (MRC) touche 3 millions de français(es). Elle se caractérise par une dégradation progressive de la fonction rénale. Chez ces malades, peu de stratégies sont réellement efficaces pour prévenir le déclin de la fonction rénale et éviter le développement d’une insuffisance rénale chronique terminale. La protéine appelée « Nrf2 » est un acteur essentiel des réponses cytoprotective et antioxydante. Un médicament innovant (la methyl bardoxolone), activateur de la voie de signalisation Nrf2 s’est ainsi révélé très efficace pour limiter la dégradation de la fonction rénale chez les sujets atteints de diabète. L’utilisation de cette molécule a toutefois démontré d’importants effets secondaires (tels l’augmentation des événements cardio-vasculaires) ce qui a amené à interrompre tous les essais cliniques en cours. Ces effets secondaires sont sans doute liés au manque de spécificité de la molécule testée. Nous pensons que si nous sommes capables plus sélectivement activer la voie Nrf2, sans activer d’autres voies de signalisation, nous pourrons protéger les reins sans pour autant augmenter le risque cardio-vasculaire. La protéine nommée « BACH1 » bloque en permanence la voie Nrf2 et cette voie seule. Nous souhaitons inhiber la protéine BACH1 pour augmenter de façon très spécifique l’activité de Nrf2. Nous avons choisi de tester un inhibiteur connu de BACH1 qui a déjà démontré son efficacité sur des modèles précliniques de maladies neurologiques. Nous souhaitons donc tester l’effet protecteur de cette molécule sur un modèle murin d’insuffisance rénale aigue.

Bénéfices attendus

La présente étude est une étude à caractère exploratoire. Si l’administration d’un inhibiteur de BACH1 se révèle efficace pour prévenir la défaillance rénale, d’autre études pourront être menées afin de mieux en préciser les déterminants et d’en mesurer le potentiel thérapeutique. Les inhibiteurs de BACH1 s’ils sont efficaces et dénués d’effets secondaires majeurs pourraient être intéressants pour prévenir les lésions rénales dans les situations telles que les chirurgies vasculaires majeures nécessitant l’arrêt de la circulation l’artère rénale, les chirurgies rénales (ablation de cancers rénaux par exemple). Ils pourraient entre outre être utilisés pour améliorer la conservation des greffons rénaux lors des transplantations rénales . Peu de stratégies de protection rénale sont disponibles et les inhibiteurs de BACH1 pourraient étoffer l’arsenal thérapeutique afin de limiter le développement de situations d’insuffisance rénale terminale.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie de 60-75 min réalisée sous anesthésie générale et analgésie préventive par administration de morphinique. La drogue testée sera administrée aux souris 2 fois par jours par voie orale. Les souris auront deux prélèvements de quelques gouttes de sang à la queue à J2 et J3 (durée

Impact sur les animaux

La lésion rénale sera induite au cours d’une chirurgie de 60-75 min sous anesthésie générale. Cette chirurgie peut être à l’origine de douleurs post-opératoires qui devront seront contrôlées par l’administration de morphiniques. Le degré d’insuffisance rénale induite par la chirurgie peut être incompatible avec la survie de l’animal (

Devenir

La procédure nécessite à l'issue du protocole la collecte de sang et des reins afin d'en étudier les dommages et ainsi de caractériser l'effet protecteur de la molécule testée. Ceci ne peut se faire qu'après l'euthanasie de l'animal. Tous les animaux seront donc euthanasiés à l'issue de la procédure.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans le développement des maladies rénales sont multifactoriels et mettent en jeu plusieurs tissus et plusieurs systèmes biologiques. Un modèle alternatif ne permettrait pas de répondre à notre question scientifique. Une étude clinique chez l’homme n’est pas envisageable à ce stade, car il est impossible d’administrer la molécule testée, qui pour l’instant aucune autorisation d’utilisation chez l’homme. Nous souhaitons réaliser une étude préclinique afin d’évaluer le potentiel pharmacologique et thérapeutique de cette molécule. L’étude de l’effet l’administration d’inhibiteur de BACH1sur le développement et la progression de la maladie rénale ne peut donc, à ce jour, se faire sans l’aide d’un modèle animal.

Réduction

La molécule que nous souhaitons évaluer dans le présent projet jamais été testée dans le cadre des maladies rénales. Nous avons donc pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure. Le nombre de souris par groupe a été calculé au plus juste sur la base des données obtenues dans la littérature afin de garantir une puissance statistique maximale. Un seul groupe contrôle (animaux insuffisants rénaux ne recevant pas de traitement) sera utilisé comme comparateur des 2 expériences réalisées (prévention et traitement) afin de limiter le total nombre d’animaux utiliser. La moitié de ce groupe recevra l’administration du véhicule selon les modalités du groupe “traitement” tandis que l’autre moitié le recevra selon les modalités d’administration du groupe “prévention”. Si aucune différence statistique n’est observée entre ces 2 sous-groupes ils seront rassemblés en un groupe contrôle unique. Un maximum de tissus seront récoltés lors de l'euthanasie des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite à l’obtention des premiers résultats et pourront également être partagés avec d’autres équipes. Nous avons choisi un modèle animal qui permet d'évaluer l'efficacité de ce médicament sur un délai très court (6 jours) et de choisir la meilleure modalité de traitements (prévention ou traitement). Les meilleures conditions d’utilisation pourront être appliquées à des études ultérieures de plus longue durée étudiant par exemple de la transition de l’insuffisance rénale aigue à l’insuffisance rénale chronique.

Raffinement

La randomisation et répartition en cage seront effectuées à la réception des animaux afin de ne pas remanier les groupes sociaux constitués par cage et de limiter l'agressivité entre mâles d'une même cage (maintien des hiérarchies). Une période d'acclimatation de 2 semaines sera mise en place avant le début la procédure expérimentale afin de permettre un temps d'habituation aux conditions d’hébergement et de diminuer le stress lié au transport et/ou aux changement des conditions d'hébergement. La chirurgie sera réalisée selon un protocole optimisé associant anesthésie générale, analgésie préventive à l'aide d'un morphinique et anesthésie locale des sites opératoires. Un système de scoring sera mis en place pour l'évaluation post-opératoire des animaux. Une inversion de l'anesthésie sera réalisée à l'issue de l'intervention afin de favoriser la récupération des animaux anesthésiés. Afin de limiter le stress lié à l’immobilisation pour les administrations orales, les animaux seront préalablement habitués pendant 2 jours à la contention (J-2 et J-1). Les souris recevront le médicament testé par voie orale, 2 fois par jour (à 9h00 et 14h00). Le médicament sera administré à l'aide d'une pipette préalablement trempée dans une solution sucrée (pour la rendre appétissante pour l’animal et favoriser la déglutition). Un volume faible (0.1 mL) sera administré à chaque administration en accord avec les recommandations en vigueur. L’administration orale n’étant pas scientifiquement indispensable dans le groupe contrôle, les animaux de ce groupe n’y seront pas soumis. Les souris seront placées deux par deux dans des cages métaboliques pour réduire le stress lié à l’isolement et au changement d’environnement. Une période d’habituation de 30 minutes à ce nouvel environnement sera réalisée un ou deux jours auparavant pour limiter encore davantage le stress des animaux. Les prélèvements de sang à la queue de l'animal seront réalisés en contention légère après application d’une pommade anesthésique.

Choix des espèces

Les expériences seront réalisées chez la souris car il s'agit d'un modèle classique d'insuffisance rénale. Le degré d'insuffisance rénale atteinte est directement lié à la durée du clampage (fermeture) des pédicules rénaux et est très bien documenté dans la littérature, ce qui nous permet de parfaitement calibrer nos expériences. Il existe de grandes différences de sensibilité à l'insuffisance rénale entre les différentes souches de souris. Les différentes souches de souris sont plus ou moins sensibles à l'insuffisance rénale. Nous avons donc choisi de travailler sur une souche de souris (C57BL6, souris noires) qui présente une sensibilité adéquate et dont le développement d’une insuffisance rénale est très bien documenté. La plupart des études sur l’ischémie rénale utilisent de jeunes souris adultes de 8-12 semaines. Des différences d'âge de plus d'une semaine peuvent entraîner des différences détectables dans les lésions rénales. Nous utiliserons donc des animaux adultes de 9-10 semaines en limitant la différence d’âge à l’induction de l’insuffisance rénale (différence

Poinçonnage des phalanges puis amputation de l'extrémité de la queue, à dix jours de vie et à quelques secondes d'intervalle : 375 souris nées porteuses d'une mutation de la sclérose latérale amyotrophique passent par là, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 347 d'entre elles et sévère pour 28. Ces 28 souris deviendront paralysées d'un ou plusieurs membres vers 110 jours et vivront entre 130 et 150 jours. Il s'agit de croiser deux lignées existantes pour obtenir un modèle où certaines zones du cerveau se voient en imagerie. Le porteur écrit que tous les animaux seront gardés en vie à la fin de la procédure, puis détaille le contraire : 84 souris partent vers une autre animalerie, les 291 restantes sont exploitées pour l'élevage et tuées à 100 jours au plus tard.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), également appelée maladie de Charcot, provoque chez les patients atteints une atrophie musculaire et/ou des contractions musculaires involontaires. A ce jour, il n'existe aucun traitement qui guérit de la SLA, ils prolongent uniquement le temps de vie du patient. L'objectif du projet est de créer une lignée de souris atteinte de la SLA avec des marqueurs du cerveau visibles au colorant en imagerie afin d’explorer les altérations observées aux stades précoces de la maladie et de découvrir de nouveaux marqueurs de cette maladie. Nous produirons donc cette nouvelle lignée de souris en croisant 2 autres lignées existantes : la lignée présentant les symptomes de la maladie et une lignée permettant de marquer des zones du cerveau au colorant. Ce croisement permettra d'étudier un modèle de la maladie avec des zones du cerveau observable en imagerie à trois stades de développement précoces.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des altérations au niveau de plusieurs zones du cerveau à un stade précoce de la SLA et de voir à quel stade de la maladie ces altérations apparaissent et à quel niveau. Ces résultats pourraient permettre de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement de la SLA.

Procédures

375 souris seront porteuses de la maladie à leur naissance mais seulement 28 développeront certainement les premiers symptômes de la maladie. Elles deviennent paralysées d'un ou plusieurs membres vers 110 jours et ont une durée de vie d'environ 130 à 150 jours. Ces animaux devront être identifiés par tatouage et prélevé à la queue à 10 jours pour vérifier la présence de la maladie. L'identification et le prélèvement sont réalisés sur l'animal vigile, composées de deux actes techniques invasifs : - Le tatouage par poinçonnage des phalanges et/ou des coussinets : réalisé une fois, durée d'une minute maximum - La biopsie de queue qui consiste en l’amputation de l’extrémité de la queue : réalisée une fois, durée de 3 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Les souris seront porteuses de la maladie à leur naissance. Ces animaux vont présenter des altérations motrices : ils deviennent paralysés d'un ou plusieurs membres à partir de 110 jours. Les mâles atteints de la maladie sont plus agressifs que la moyenne. Une procédure de génotypage et d'identification est nécessaire pour connaitre le génotype des animaux produits. L'identification est réalisée par tatouage des phalanges, et le génotypage par biopsie de queue. Chacun de ces actes à lui seul n'induit pas de douleur, mais le cumul des 2 actes de manière très rapprochée (quelques secondes d'intervalle) peut induire un inconfort léger et transitoire pour l'animal âgé de 10 jours.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de la procédure (sauf ceux présentant des points limites). 84 animaux seront transférés dans une autre animalerie pour observer les altérations dans le cerveau : 28 animaux à 40 jours, 28 à 70 jours et 28 à 110 jours. Le reste des animaux (291 animaux) seront utilisés pour l'élevage et mis à mort par la suite à 100 jours maximum.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur l’évolution de la maladie (SLA), à des stades pré-symptomatiques. Les mécanismes de cette maladie ne sont pas encore suffissamment connus pour permettre d'autres modelisations.

Réduction

Les plans d'élevage sont prévus au plus précis afin de ne pas surproduire d'animaux. La majorité des animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteur. De plus, le nombre d'animaux optimal utilisé pour chaque lot a été déterminé à l'aide de test statistiques. Ce nombre a été réduit au minimum afin de pouvoir produire suffissamment pour l'expérimentation tout en pouvant obtenir des résultats exploitables, et comparable avec des travaux antérieurs.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages collectives. Les identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié, stérile, permettant de limiter les infections et d’effectuer un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle calme loin des autres animaux afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les animaux sont remis en présence de leur mère dans des cages collectives enrichies : maison rouge, nid, baton à ronger. Le personnel effectue un contrôle visuel des animaux identifiés et génotypés dans l’heure qui suit la réalisation des gestes, le lendemain puis quotidiennement. Les mâles atteints de la maladie sont connus pour être agressifs envers leurs congénères, nous les hébergerons donc par 3 maximum au lieu de 4 avec un bâton à ronger chacun. Des critères pour évaluer la souffrance des animaux sont mis en place au sein de l'animalerie. Une grille de critères a été établie spécifiquement pour les signes cliniques de la SLA à partir de 3 mois.

Choix des espèces

La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. Le choix de l'espèce est lié au fait que le modèle de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) n'existe que chez la souris, tout comme le modèle permettant le marquage de différentes zones du cerveau. Afin d'observer les caractéristiques des altérations précoces au sein de la SLA, des animaux vont être utilisés à différents stades de développement : - entre 35 et 45 jours - entre 65 et 75 jours - entre 100 et 110 jours : apparition des premiers symptômes.

Des rats sont rendus malades d'une hypertension artérielle pulmonaire par l'injection d'un composé qui freine la formation des vaisseaux, puis par trois semaines dans une enceinte appauvrie en oxygène, humide à plus de 80 % et plus bruyante que leur salle habituelle. 1 920 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 1 800 rendus malades et 120 témoins. Pendant six semaines au plus, ils peuvent recevoir un candidat médicament une à deux fois par jour, par gavage ou injection, avant une ouverture du thorax sous anesthésie pour mesurer les pressions dans le cœur et l'artère pulmonaire, puis une mise à mort par surdose. Le porteur prévoit que 15 % des rats malades meurent de la maladie en cours de protocole, et jusqu'à 40 % quand la phase suivant l'enceinte dure plus de trois semaines. Il invoque aussi la "validation de la formation aux techniques de mesures de pressions" pour recourir à des rats vivants.

Objectifs

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire et pulmonaire rare et grave : sa prévalence dans la population générale en France est estimée à 15 cas par million et la survie médiane sans traitement après diagnostic est inférieure à 3 ans. Elle se caractérise par l’augmentation des résistances artérielles pulmonaires, responsable d'une hypertension, et aboutit à une insuffisance cardiaque. Cette maladie peut survenir de cause inconnue, dans un contexte familial ou compliquer l’évolution de certaines pathologies (insuffisance cardiaque). En identifiant et en traitant les patients le plus tôt possible, il est possible de retarder la progression de l'HTAP. Malheureusement, cette maladie est souvent mal diagnostiquée et traitée, car les symptômes initiaux sont légers et peu spécifiques (essoufflements, lipothymie et asthénie). Si les options thérapeutiques ont progressé ces dix dernières années et ont permis d'améliorer les conditions de vie des malades, la prise en charge de l'HTAP demeure incomplète car ne prolonge pas significativement le durée de vie après diagnostic. Ainsi, la recherche de médicaments ciblant de nouveaux mécanismes physiopathologiques reste un enjeu majeur pour les années à venir. Les tests de nouvelles molécules doivent se réaliser sur des modèles animaux suffisamment prédictifs de la maladie, afin d’optimiser la sélection des candidats médicaments qui entreront en phase clinique. Le modèle présenté d'HTAP chez le rat, induit conjointement par l’administration d'un composé diminuant la formation de vaisseaux sanguins et par une hypoxie (diminution des apports en oxygène) chronique, est un modèle qui reproduit l'ensemble des caractéristiques physiopathologiques décrites chez l'Homme, à savoir une atteinte vasculaire qui est associée à long terme avec le développement d'une insuffisance cardiaque droite. De plus, les traitements actuellement proposés chez l'Homme montrent des résultats bénéfiques significatifs dans ce modèle. Ainsi, ce modèle d'HTAP représente un modèle préclinique de choix pour l’étude de l’HTAP. Ce modèle nous permettra d’évaluer, chez le rat, l’efficacité de nombreux candidats médicaments qui s’intéressent à des mécanismes d’actions connus (atteintes vasculaires) et des cibles thérapeutiques nouvelles (atteintes cardiaques). Ce modèle nous permettra également une meilleure compréhension des mécanismes mise en jeu dans la maladie afin d’améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

L’HTAP est une maladie rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitements curatifs efficaces. Si les traitements prescrits actuellement, essentiellement des vasodilatateurs, permettent une amélioration de la qualité de vie des patients et une prolongation de la survie en freinant l’évolution de la pathologie, la moitié des patients décèdent dans les sept ans qui suivent le diagnostic. Compte-tenu de l’évolution de l’HTAP dans ce modèle animal qui mime fidèlement la maladie humaine, la réalisation d’études précliniques utilisant des candidats médicaments novateurs apparait primordiale pour mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.

Procédures

Une injection sous-cutanée (S.C.) du composé diminant la formation des vaisseaux est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines avant de retourner en condition de normoxie (conditions d'hébergement classique) durant 0 à 6 semaines. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Durant la normoxie, des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. A la fin du protocole, une chirurgie sous anesthésie gazeuse et analgésie est réalisée afin de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à une anesthésie gazeuse et reçoivent une injection sous-cutanée pour induire une hypertension artérielle pulmonaire. Ils sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines. L’humidité dans l’enceinte est supérieure à 80%. En hypoxie, les animaux présentent une prise de poids ralentie de 50% par rapport à une stabulation conventionnelle à cause du stress et de l’asthénie provoqués par la déplétion en oxygène. De plus, le confinement dans l'enceinte d'hypoxie génère un inconfort, indépendamment de l'hypoxie elle même, via une humidité élevée et un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2. De plus, le niveau sonore est plus élevé dans les caissons hypoxiques que dans les salles d'hébergements classiques pouvant engendrer du stress et de l'inconfort pour les animaux.A la fin de ces 3 semaines d’hypoxie, ils retournent dans la pièce d’hébergement conventionnelle pendant 0 à 6 semaines, période pendant laquelle la pathologie va s’aggraver et devenir irréversible. A long terme, les animaux peuvent mourir de la pathologie. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Ces administrations répétées peuvent êtres associées à des risques de fausses route, d'irritation ou de lésions de l'oesophage (PO), et d'irritations (I.P., S.C.). Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Des anesthésies gazeuses seront potentiellement réalisées au cours du protocole afin de réaliser des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi. A la fin du protocole, les animaux sont anesthésiés afin de réaliser un acte chirurgical qui permet de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux HTAP seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (cœurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du cœur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux. Un prélèvement de tissu sur les animaux Sham (non porteurs d'un HTAP) est nécessaire pour comparer aux conséquences cardiovasculaires des animaux porteurs de la maladie.

Remplacement

S'il existe un certain nombre de modèles de culture de cellules musculaires lisses, ces modèles in vitro sont utilisés en première intention (modèles de screening) et sont utilisés uniquement pour tester des activités moléculaires et identifier des voies de signalisation. Ces modèles cellulaires in-vitro ne permettent pas de tester l'efficacité d'un candidat médicament sur l'aspect de la restauration hémodynamique et morphologique mais sont utilisés en amont afin de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur nos modèles in vivo. La validation de la formation aux techniques de mesures de pressions nécessite d’avoir recours à des animaux vivants car les phases critiques de l’approche chirurgicale reposent sur les risques hémorragiques qui peuvent entraîner des mesures de pression faussées, voir la mort de l’animal.

Réduction

Pour chaque groupe avec une HTAP, le nombre d'animaux nécessaire par groupe est fixé à 11. Ce nombre a été déterminé par un calcul de N, sur la base de données obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Basés sur les données historiques dans ce modèle d’HTAP, un pourcentage de perte de 15% est attendu jusqu’à 3 semaines de normoxie, correspondant aux animaux qui meurent au cours du protocole à cause du développement de la pathologie. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe en début d’étude est donc de N=13. Lorsque le protocole inclus une période de normoxie supérieure à 3 semaines (jusqu’à 6 semaines), le nombre d’animaux par groupe est fixé à N=18 car le développement de la pathologie entraîne une mortalité plus importante des animaux (jusqu’à 40% de perte). Généralement, le groupe contrôle négatif (non malade) n’est composé que de 6 animaux car il y a peu de variabilité des paramètres cardiovasculaires étudiés. Ainsi, 1800 rats HTAP sont prévus dans le cadre de cette procédure et 120 rats Sham. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus d'animaux sont prélevés à l'issue de certaines séries expérimentales et conservés pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). L'utilisation de ces banques de tissus pour d'autres projets de recherches permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés car il permet de réduire le nombre de séries expérimentales réalisées.

Raffinement

l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. L'administration du composé induisant la pathologie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Pendant les 3 semaines d'hypoxie, les animaux sont hébergés dans des grandes cages en plexiglass prévues à cet effet avec une sciure particulièrement absorbante (8 animaux par cages). Les caissons d’hypoxie sont ouverts et nettoyés tous les jours. De la chaux sodée est placée dans le caisson pour absorber le C02 et changée tous les jours, de l'acide borique permet d'absorber l'ammoniaque générée par les urines et est remplacé toutes les semaines ; et des absorbeurs d'humidité sont présents pour absorber l'humidité assurant des conditions correctes pour les animaux. La ventilation des caissons peut également être adaptée à l’aide d’aérations présentes sur les caissons dont l’ouverture et la fermeture peut être ajustée pour diminuer une humidité excessive. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Des points limites spécifiques au protocole sont également établis (présence de plaies cutanées, fausse route…) Si des prélèvements de sang sont réalisés au cours du protocole, les animaux sont anesthésiés. Une anesthésie locale est également réalisée. Les rats sont placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température, et une réhydratation est réalisée en injectant en S.C. 3 fois le volume prélevé en NaCl ou Ringer Lactate. Si des injections en voie I.V. sont réalisées, les animaux sont anesthésiés avec une analgésie locale et contôle de la température corporelle. Les mesures hémodynamiques réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'analgésiant au minimum 30 minutes avant la première incision. Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux

Choix des espèces

Même si de nombreuses espèces animales sont concernées, la majorité des modèles d’HTAP ont été développés chez le rat adulte parce qu’il permet d’obtenir, après induction de la pathologie, des données hautement reproductibles. De plus, les rats présentent des modifications cardiovasculaires similaires à l’homme : modifications des pressions, remodelage vasculaire et cardiaque, perte de fonction. Finalement, ce modèle d'HTAP développé chez le rat représente un modèle de référence pour l’étude de l’HTAP car la progression de la pathologie est continue au cours du temps et mime ainsi l’évolution délétère de la maladie observée chez l’homme. Des rats de 4/6 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.

750 souris vont être utilisées, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 150 un niveau sévère, chacune pouvant subir jusqu'à quatre mois de suivi avec deux imageries sous anesthésie et un prélèvement de sang à la mandibule chaque semaine. Dépourvues de système immunitaire et irradiées au préalable pour favoriser la greffe, elles reçoivent des cellules cancéreuses humaines dans le sang, ou dans la rate ou le foie par chirurgie abdominale. Le porteur indique que la croissance des tumeurs peut provoquer des douleurs, une paralysie ou une insuffisance respiratoire, et que les souris seront tuées avant l'apparition de ces signes lorsque l'imagerie montre une propagation trop étendue. Toutes sont tuées au plus tard quatre mois après l'injection, pour un projet dont la validation espérée doit "servir de base" au développement de futures stratégies thérapeutiques.

Objectifs

L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, a bouleversé la façon dont nous luttons contre le cancer et d’autres maladies. Contrairement aux traitements traditionnels, tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie, qui ciblent directement les cellules cancéreuses, l’immunothérapie tire parti du système immunitaire du patient (système de défense de l’organisme contre les infections) pour combattre la maladie. Dans notre projet, nous nous concentrons sur plusieurs types de cancers hématologiques (leucémie et lymphome) et de cancers « solides », notamment les cancers du poumon, du sein et du foie. Notre objectif est de trouver une nouvelle approche qui pourrait être utilisée pour traiter ces cancers de manière plus efficace. L’une de nos stratégies consiste à utiliser des cellules du système immunitaire appelées lymphocytes T. Ces cellules sont des gardiens du système immunitaire qui patrouillent dans notre corps pour détecter et éliminer les menaces, y compris les cellules cancéreuses. Cependant, il existe deux types de lymphocytes T : les lymphocytes « conventionnels » et les lymphocytes T « non conventionnels ». Les lymphocytes T « conventionnels » sont des guerriers spécialisés qui sont parfois difficiles à obtenir chez les patients, en particulier s’ils ont déjà reçu des traitements agressifs. De plus, ils peuvent causer des effets secondaires indésirables, comme la destruction de cellules saines de notre corps. Nous explorons donc une approche novatrice en utilisant des lymphocytes T « non conventionnels ». Ces cellules proviennent de donneurs en bonne santé et pourraient être utilisées pour stimuler le système immunitaire du patient afin de lutter contre les cellules cancéreuses. Ce serait une sorte de traitement universel, efficace pour différents types de cancers, indépendamment du patient. Notre travail vise à rendre ces thérapies plus accessibles, moins coûteuses et à réduire les effets secondaires, tout en offrant un nouvel espoir à ceux qui luttent contre le cancer du poumon, du sein, du foie et d’autres types de cancer.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à démontrer la possibilité d’utiliser une autre population de cellules du système immunitaire permettant de traiter les patients atteints de cancer. Cette nouvelle stratégie thérapeutique éviterait les problématiques actuellement rencontrées avec des traitements similaires. La validation de nos hypothèses dans un modèle animal servira de base au développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer les taux de guérison de pathologies cancéreuses graves.

Procédures

Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » applicable à différents cancers (cancer du sang, du poumon, du sein, du foie). Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules cancéreuses soit par voie intraveineuse (veine de la queue, durée moins d’une minute sur souris éveillée) soit par injection dans la rate ou dans le foie (par chirurgie sous anesthésie et analgésie, durée 15 minutes) dans des souris dépourvues de système immunitaire et préalablement irradiées (cela permet d’augmenter la greffe des cellules cancéreuses et leur multiplication). Après l’établissement de la tumeur (en quelques jours), notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie sous anesthésie générale (durée de la session : 15 min) 24h après le début l'injection du traitement puis deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 4 mois maximum. Afin de compléter l’étude sur l’utilisation de cette population de cellules particulière en thérapie des cancers, nous serons également amenés à traiter un lot de souris avec la molécule connue pour activer nos cellules d’intérêt thérapeutique (administration par injection dans l’abdomen ou dans la veine de la queue au maximum tous les 2 jours, sans anesthésie ; durée de l’injection moins d’une minute). Nous testerons aussi la nécessité d’une 2e voire d’une 3e injection de nos cellules « médicament » pour éradiquer la tumeur. Nous évaluerons également la capacité de nos cellules à rester dans l’organisme et à prévenir une rechute en administrant une seconde dose de cellules tumorales. Chaque semaine, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevées au niveau de la veine de la joue sur souris éveillée) sera effectuée pour suivre la présence des cellules thérapeutiques (durée du prélèvement: 30 s; sur une période de 4 mois maximum).

Impact sur les animaux

Dans les différents modèles de cancer utilisés dans ce projet, l’étape d’irradiation rend la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et induire une perte de poids. Le développement des tumeurs peut lui aussi entraîner des nuisances telles que la douleur, une paralysie, une perte de poids, ou une insuffisance respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires). L’injection intraveineuse de cellules tumorales peut également causer du stress et de la douleur au moment de l’injection. En revanche, l’imagerie, bien que non invasive peut provoquer du stress lié à la manipulation. Pour cette procédure, les souris sont préalablement anesthésiées avec de l’isoflurane. L’anesthésie gazeuse peut perturber la régulation de la température corporelle des souris, et la répétition fréquente de ces anesthésies (deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude et à 24h d'intervalle au moment du début du traitement) peut avoir un impact sur leur bien-être. Les prélèvements de sang à la mandibule (réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure) peuvent provoquer une légère douleur temporaire et du stress. Comme leur nom l’indique, ces prélèvements peuvent entraîner un saignement mineur au site de ponction, généralement contrôlé en appliquant une légère pression. La chirurgie nécessaire à l’injection des cellules cancéreuses au niveau de la rate ou du foie implique l’ouverture de la paroi abdominale. Cela peut entraîner des douleurs post opératoires, des problèmes de cicatrisation de la plaie chirurgicale et des effets secondaires tels qu’une infection, une hypothermie, une réaction inflammatoire locale et une altération temporaire du comportement alimentaire.

Devenir

Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes liés au système immunitaire, ainsi que ceux associés à notre population thérapeutique d’intérêt (comme le poumon et les muqueuses intestinales), seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.

Remplacement

Pour tester l’efficacité de nos différentes thérapies, nous avons d’abord réalisé de nombreuses expériences en laboratoire (in vitro). Ces expériences nous ont permis de valider certaines réponses des cellules aux traitements, en utilisant différentes techniques dont des modèles en trois dimensions appelés sphéroïdes. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de notre nouvelle approche thérapeutique sans utiliser un modèle animal entier vivant.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant deux fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple). Les imageries seront réalisées sous anesthésie. Lors de cette mesure de bioluminescence, nous effectuerons un suivi clinique des souris et établirons un score selon des critères de poids, d’apparence des poils, de mobilité, de comportement ainsi que de rythme respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) et des observations post-opératoires telles que l’état de la plaie et les déplacements de la souris après l’opération (pour la tumeur du foie, nécessitant une chirurgie).La chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées et ayant reçu au préalable l’administration d’anti-douleur, administration qui sera poursuivie dans les jours qui suivent.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles murins de cancers du sang, du poumon, du sein ou encore du foie sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.

Pêchées au casier au moment où elles se rapprochent des côtes pour pondre et entrer en sénescence, 180 seiches communes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 45 d'entre elles et sévère pour les 135 autres. La chirurgie consiste à implanter des électrodes dans le cerveau et à fixer sur le dos, au-dessus de l'os de seiche, un boîtier étanche d'enregistrement, sous anesthésie par balnéation et analgésie locale. Trois groupes de quinze animaux servent à mettre au point la technique, dont quinze maintenus vigiles pendant deux heures d'enregistrement. Soixante seiches équipées et soixante sans dispositif passent ensuite une tâche d'apprentissage en labyrinthe en T à 12, 18 ou 24 degrés, avec des enregistrements de douze heures par jour un jour sur deux. Les seiches porteuses d'électrodes sont tuées pour repérer l'emplacement exact des implants, celles restées sans appareil pouvant réintégrer l'élevage selon le porteur, qui juge le recours à des animaux vivants "indispensable" pour relier activité cérébrale et navigation.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les effets de changements de température de l’eau sur le fonctionnement cérébral et les capacités de navigation de la seiche commune (Sepia officinalis). Des perturbations environnementales, à l’image des changements de température, peuvent modifier le fonctionnement cérébral des animaux marins. Cela peut engendrer une diminution de flexibilité comportementale et in fine du taux de survie des espèces impactées. La seiche commune, comme de nombreux autres mollusques céphalopodes, présente des capacités cognitives complexes et une diversité comportementale importante dont dépendent leur survie. Cependant il n’existe à ce jour aucun moyen d’étudier le fonctionnement cérébral in vivo au cours de diverses tâches comportementales. L’objectif de ce projet est donc d’adapter chez la seiche un système d’enregistrement cérébral ayant déjà été utilisé chez le poulpe (céphalopode également) afin d’évaluer la fluctuation de l’activité cérébrale en fonction de la température de l’eau dans laquelle elles évoluent (successivement 12°C, 18°C et 24°C). Il sera alors possible de mesurer l’activité cérébrale au cours d’une tâche de navigation spatiale à de telles températures chez des seiches équipées de ce système.

Bénéfices attendus

Les seiches sont des animaux d'intérêt économique, écologique et scientifique majeurs. Elles représentent en effet une partie importante des stocks de pêche en France, font partie intégrante des écosystèmes marins et sont au centre de nombreuses études en cognition animale et neurobiologie. Comme de nombreuses autres espèces marines, leur survie est en grande partie dépendante de leur flexibilité comportementale. Celle-ci découle d’un fonctionnement cérébral pouvant être sensible à des changements environnementaux. Notre étude vise d’une partà mieux cerner l’impact que peuvent avoir les changements de températures sur les capacités cognitives des seiches et d’autre part de savoir comment l’activité cérébrale associée peut en être modifiée. Associés, ces objectifs permettraient sur le long terme de faire de la seiche un modèle d’étude émergent contribuant à mesurer les effets des pressions anthropiques sur les espèces marines à plus large échelle. Plus globalement ils pallieraient la difficulté actuelle à tisser des liens directs entre conditions environnementales, modification du fonctionnement cérébral et des comportements, en particulier chez des espèces marines.

Procédures

Une mise au point de la technique d’enregistrement d’ondes cérébrales sera faite chez un premier groupe d’animaux anesthésiés à l’aide d’électrodes cérébrales reliées à un amplificateur. L’installation de ces électrodes est faite chez un premier groupe 15 d’animaux sous anesthésie et l’enregistrement dure 40 minutes chez l’animal maintenu en anesthésie continue. Une seconde étape de mise au point de ce protocole sera réalisée cette fois chez 15 animaux vigiles sur deux heures d’enregistrement. Une fois les ajustements de protocole réalisés, un nouveau groupe de 15 animaux sera équipé d’un système d’enregistrement d'électroencéphalographie (EEG) miniature et sans fil appelé neurologger. Celui-ci est contenu dans un boitier étanche fixé sur le dos de l’animal relié à des électrodes d’enregistrement placées au niveau du cerveau. Ces interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie en une fois. Les animaux ainsi équipés évolueront librement dans un bac d’eau de mer à 18°C pendant trois jours puis à 12°C, 18°C ou 24°C pendant les trois jours suivants. Les enregistrements dureront 12h par jour, un jour sur deux. Il sera alors possible de comparer les enregistrements EEG à ces différentes températures. Enfin, le dernier objectif consiste à évaluer les compétences de navigation spatiale à différentes températures. Pour cela deux groupes d’animaux seront constitués, l’un composé d’animaux équipés du neurologger (60 seiches), l’autre non équipé (60 seiches). Les deux groupes seront soumis à une tâche d’apprentissage spatial dans un labyrinthe en T à 18°C durant trois jours. Une tâche de rappel sera réalisée à l’issue de cet apprentissage à l’une des trois températures suivantes (20 animaux par température et par groupe) : 12°C, 18°C ou 24°C.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être attendues sur les seiches suite à l’implantation des électrodes au niveau du cerveau et du neurologger sur leur dos (coquille interne appelée communément os de seiche). Cette chirurgie sera faite sous anesthésie induite préalablement par balnéation. Cette induction est considérée comme étant effective lorsque les critères comportementaux suivants sont observés : perte de mouvements, pâlissement du manteau, perte de réaction suite à une stimulation mécanique (pincement au niveau de la nageoire), diminution d’adhérence des ventouses. Cette anesthésie induite sera accompagnée d'une analgésie locale. Cette chirurgie pourra néanmoins occasionner une gêne temporaire dans les heures suivant l’implantation liées à la cicatrisation des zones d’implants (au niveau de la peau recouvrant le cartilage protégeant le cerveau et au niveau de la peau recouvrant la coquille). Les dimensions (poids et taille) du neurologger seront adaptées à la taille de l’animal de façon à ne pas gêner ses déplacements. Néanmoins les fils reliant les électrodes d’enregistrement (au niveau de la tête) au boitier étanche contenant le neurologger (au niveau du dos) peuvent occasionner une légère gêne lors de certains mouvements de la tête. Ce point sera particulièrement surveillé lors de la mise au point des techniques d’enregistrement afin de limiter au maximum cette gêne (adaptation de la rigidité et longueur des fils). De plus, le boitier étanche dans lequel se trouvera le neurologger sera amovible. Aussi les températures choisies pour étudier l’effet de leur changement se trouve dans les gammes de températures proches des conditions naturelles donc n’occasionneront pas de stress supplémentaire.

Devenir

Tous les animaux impliqués, à l’exception des animaux ne portant pas de dispositif d’enregistrement EEG, seront mis à mort à la fin des derniers enregistrements de chaque procédure, sans délai. Cela permettra de prélever leur cerveau afin de retracer la localisation précise des électrodes utilisées pour les enregistrements.

Remplacement

Le point central de ce projet est de pouvoir mesurer les effets de l’activité cérébrale chez des seiches libres de leurs mouvements, lors de la réalisation d’une tâche de navigation (enregistrements pendant les phases d’apprentissage et de rappel). Il en est de même pour étudier l’effet de changements de température sur la cognition spatiale. Le recours à des animaux vivants est donc indispensable.

Réduction

La mise au point du système d’enregistrement consistera à adapter un protocole de chirurgie pour l’implantation des électrodes au niveau du cerveau et de l’appareil sur le dos des seiches. Il conviendra donc de réaliser ces ajustements de protocole dans un premier temps sur des seiches mortes (pêchées au chalut et achetées à la criée). Les seiches de deux ans utilisées par la suite seront pêchées au casier, après qu’elles se soient rapprochées des côtes pour pondre et entrer en sénescence. Par conséquent le prélèvement de ces animaux n’induit pas de perturbation au niveau de leur population. Concernant les protocoles, des tâches comportementales non invasives seront réalisées chez des animaux ne portant pas d’appareil d'enregistrement afin de constater au préalable l’effet de la température de l’eau sur le comportement “de base” (locomotion, prédation, phases d’activité et de repos) mais aussi sur les capacités de navigation. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés en conditions avec enregistrements (i.e chez qui les étapes d’anesthésie, de chirurgie et de mise à mort seront appliquées) sera réduit et chaque animal ayant fait tests comportementaux pourra réintégrer la structure d’élevage. Les analyses statistiques a posteriori seront faites à l’aide de tests non paramétriques conçus pour des échantillons de faible effectif.

Raffinement

La capture des animaux dans la nature sera faite par du personnel habilité, à l’aide de relevés de casiers en pleine mer. Par ailleurs, les animaux seront hébergés dans des infrastructures adaptées à cette espèce. Les seiches sont des animaux non sociaux et des interactions agonistes peuvent avoir lieu entre les individus évoluant dans le même bac lors de la période de reproduction. Il est donc préférable d’isoler les individus dans des bacs d’élevage pourvus d’enrichissements (plantes artificielles et abri). Les étapes de chirurgie seront toutes précédées d’une phase d’anesthésie adaptée, prolongée jusqu’à la fin des interventions. Une fois l’anesthésie effective, les animaux seront placés sur un support de chirurgie équipé d’un système de circulation d’eau et de solution anesthésiante au niveau de leurs branchies et un film plastique sera placé sur leur dos pour maintenir l’humidité au niveau de leur manteau. La hauteur d’eau sera ajustée pour maintenir la tête et le dos des animaux émergés et permettre les actes chirurgicaux. Une injection de solution analgésiante sera également réalisée localement au niveau des zones d’incision dorsale et de la tête. De manière à n’avoir recours qu’à une seule étape d’anesthésie générale et limiter le nombre de manipulations des animaux, l’implantation des électrodes et du boîtier contenant le neurologger, le cas échéant, se fera au cours de la même procédure. Après la chirurgie, les animaux équipés seront replacés dans leur bac d’élevage et surveillés pendant 48h afin de prévenir toute manifestation de souffrance ou de stress. L’emplacement, les dimensions et le poids du boîtier et du neurologger qu’il contient seront choisis de manière à ne pas limiter les mouvements naturels de l’animal suite à l’implantation.

Choix des espèces

La seiche commune (Sepia officinalis), est une espèce modèle bien étudiée en neuroéthologie. Son anatomie cérébrale, ses capacités cognitives et comportements complexes sont largement démontrés. Il s’agit d’une espèce évoluant dans un milieu fortement soumis aux pressions anthropiques dont font partie les changements de température aquatique. La mise au point d’un système d’enregistrement d’ondes cérébrales au cours d’une tâche comportementale chez cette espèce représente deux intérêts majeurs : mesurer l’impact de changements de conditions environnementales sur des capacités cognitives essentielles à la survie de l’espèce et bénéficier d’un outil permettant plus généralement d’explorer le bon fonctionnement cérébral. De plus, comme chez d’autres espèces de mollusques céphalopodes utilisés dans la recherche, plusieurs critères visuels (patterns liés aux chromatophores, présence ou non de lésions) et comportementaux (comportements de prédation, flottaison, mouvements désordonnés, propulsions, jets d’encre excessifs) sont utilisés chez la seiche commune pour attester de son état physiologique (bien-être, souffrance, stress). Les animaux utilisés seront des seiches adultes âgées de un ou deux ans, de taille assez importante pour faciliter les étapes de chirurgie et dont le développement cognitif (mémoire) est mature. Les individus ayant déjà pondu (en fin de vie) seront privilégiés.