Procédures sévères

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent 21 gavages, dont 8 de placebo pendant une phase d'habituation, et boivent pendant huit jours une eau additionnée d'un agent chimique qui déclenche une colite, avec diarrhées, sang dans les selles et douleurs abdominales. Hébergées seules alors que le porteur reconnaît que ce sont des animaux sociaux, elles sont utilisées pour évaluer deux candidats médicaments d'une "société cliente" contre la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Il écrit que le recours à "l'animal entier" reste une étape "nécessaire" à la constitution du dossier d'autorisation des essais cliniques.

Objectifs

Le présent projet vise à tester l'efficacité de deux composés d'intérêt thérapeutique (administrés seuls ou en combinaison) en développement préclinique et visant à traiter les inflammations chroniques de l'intestin (maladie de Crohn ou rectocolite hémorragique). Les données obtenues devraient permettre à la société cliente de détailler l’efficacité et les mécanismes d’action de leur composé et de permettre, dans l'hypothèse d'effets bénéfiques, de poursuivre le développement de ces composés en clinique humaine.

Bénéfices attendus

La présente étude devrait permettre de mettre en évidence une efficacité de deux candidats médicaments en développement à diminuer la colite, et apporter une confirmation de leur mode d'action. Dans ce cadre, les composés X et Y seront testés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourrait, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les souris recevront 21 administrations par gavage (8 administrations de placébo pendant la phase d'habituation au traitement puis 13 administrations dans la phase de traitement elle-même; Durée < 1 minute). Hormis pour les 10 souris du groupe expérimental contrôle du modèle de colite, les animaux seront exposés à un composé chimique induisant une inflammation du colon via leur eau de boisson pendant 8 jours. Les souris seront pesées deux fois par semaine avant traitement et quotidiennement pendant les 13 jours de traitement (durée des pesées < 1 minute). Enfin, à l'issue de l'étude, les souris seront anesthésiées et mises à mort après anesthésie (Durée: 5 min).

Impact sur les animaux

Le modèle employé est un modèle de colite induite par l'administration par l’eau de boisson d'un agent chimique irritant dosé de façon à induire une colite modérée chez la souris. Dans ce cadre, les souris présentent des épisodes de diarrhée, avec une possible présence de sang dans les selles et des douleurs abdominales. L'ensemble des administrations par voie orales (8 administrations de véhicule suivies de 13 administrations de véhicule, ou des candidats médicaments administrés seuls ou combinés) et les pesées quotidiennes à l'état vigile peuvent être source de stress ou de douleurs. Par ailleurs, l'hébergement individuel représente également une nuisance pour les souris qui sont des animaux sociaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les colons qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur l’inflammation colique. En effet, les inflammations chroniques de l'intestin possèdent une étiologie complexe, impliquant des mécanismes inflammatoires et immunologiques. Bien que des modèles in vitro aient été utilisés afin de réaliser les premières preuves de concept de l’efficacité du composé X, le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire à la constitution d'une demande d'autorisation afin de réaliser les études cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de résultats obtenus lors de nombreuses études antérieures menées par le laboratoire. Le nombre de 15 animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum d’animaux à utiliser pour pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés et compte tenu de l'hétérogénéité du modèle employé. Un total de 70 souris sera utilisé, divisé en 1 groupe de 10 souris (groupe contrôle du modèle) et 4 autres groupes de 15 animaux chacun. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 10 animaux puisqu'il ne présente pas de colite, réduisant la variabilité des mesures réalisées. Une analyse statistique sera réalisée.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un agent irritant chez la souris qui est un modèle particulièrement bien caractérisé dans la littérature. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress induit aux animaux (périodes d’acclimatation et d’habituation des animaux aux procédures d’administration) et à établir des points limites appropriés. En cas d'atteinte de scores de souffrance animale spécifiques, une administration d'analgésique sera employée pour s'affranchir de toute douleur induite aux animaux. Les animaux seront hébergés individuellement mais conserveront des contacts visuels et olfactifs entre congénères et une enrichissement renforcé de leur environnement sera mis en place sous forme de briquette de bois spéciales pour rongeurs, de dômes en cartons et de papier de nidification.

Choix des espèces

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un agent irritant chez la souris qui est très bien caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans le cadre d'études précliniques. Les animaux seront réceptionnés à 7 semaines d'âge et les traitements débuterons à 9 semaine d'âge. Cela correspond à un stade de jeune adulte mimant la population cible majoritaire des inflammations chroniques de l'intestin chez l'humain.

Une chirurgie cérébrale d'une heure trente, une chirurgie vestibulaire d'une heure trente quatre jours plus tard, puis cinq stimulations électriques réparties sur trente minutes : 320 des 445 rats de ce projet subissent cette séquence avant une exposition à l'hypergravité pouvant durer quatre semaines. Tous seront tués pour prélever leur cerveau. 400 d'entre eux relèvent d'un niveau de souffrance sévère, contre 45 en modéré. Le porteur qualifie d'"intensité légère" les altérations causées par l'hypergravité, alors qu'il attend après la chirurgie vestibulaire une désorientation, des troubles oculaires, de la posture et de la locomotion pendant une dizaine de jours.

Objectifs

Ce projet est situé dans le domaine de la recherche expérimentale. Il vise à étudier l’implication du système vestibulaire dans les processus de perception temporelle. Le système vestibulaire nous permet en particulier de percevoir la gravité terrestre ainsi que les accélérations de notre organisme (lors de la marche, course ou tout autre activité physique). La perception temporelle est quant à elle réalisé au sein du cerveau par les cellules de l’hippocampe. Une récente étude du laboratoire a permis de mettre en évidence que les astronautes lors de leur séjour au sein de l’ISS (Station Spatiale Internationale), tout comme les patients souffrant de troubles vestibulaires, présentent des déficits de perception temporelle. L’objectif de notre étude est de mesurer plus particulièrement l’influence du système vestibulaire sur la perception temporelle médiée par l’hippocampe.

Bénéfices attendus

La prévalence des pathologies vestibulaires est très élevée. En France, la plainte pour vertige représente le 3ème motif de consultation chez le médecin et 25% de ces vertiges ont pour origine une atteinte vestibulaire. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes cérébraux sous-tendant les troubles vestibulaires, afin d’établir des critères aidant au diagnostic et d’avancer vers des solutions thérapeutiques adaptées et ainsi améliorer la prise en charge de cette pathologie. Par ailleurs, les résultats issus de ce projet seront utiles pour une seconde application qui consiste en la prévention des troubles cognitifs lors de futures missions spatiales – en particulier lors de la campagne Artemis pour les missions lunaires.

Procédures

Sur les 445 rats : - 20 rats seront uniquement exposés à un test comportemental au cours duquel ils recevront 5 stimulations électriques d’intensité modérée répartis sur une durée de 30 minutes. - 25 rats seront exposés à une chirurgie cérébrale (durée d’1h30) sous anesthésie et analgésie profonde. Après une semaine, ils seront exposés au test comportemental décrit précédemment (5 stimulations électriques). - 80 rats seront exposés à une chirurgie cérébrale (durée d’1h30) sous anesthésie et analgésie profonde. Après une semaine, ils seront exposés à une seconde chirurgie vestibulaire (durée 1h30) sous anesthésie et analgésie profonde. Après 4 jours, ils seront exposés au test comportemental décrit (5 stimulations électriques). - 320 rats seront exposés à une chirurgie cérébrale (durée d’1h30) sous anesthésie et analgésie profonde. Après une semaine, ils seront exposés à une seconde chirurgie vestibulaire (durée 1h30) sous anesthésie et analgésie profonde. Après 4 jours, ils seront exposés au test comportemental décrit (5 stimulations électriques) puis à une exposition à l’hypergravité (durée de 24h à 4 semaines). Les 425 rats concernés par les actes chirurgicaux recevront également des injections intrapéritonéales d’analgésiques (au nombre de 2 à 3 le jour de la chirurgie et ensuite à raison de 2 par jour pendant 3 jours, ~1min par injection, sous contention légère).

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les nuisances seront liées : a) A la délivrance de 5 stimulations électriques au cours du test comportemental, susceptible d’induire une douleur temporaire modérée. b) A la chirurgie cérébrale, susceptible d’induire une douleur modérée. Il n’a pas été rapporté d’état de mal-être suivant la chirurgie au-delà des délais de traitement analgésique post-opératoires (3 jours). c) A la chirurgie vestibulaire, susceptible d’induire une douleur modérée. Il n’a pas été rapporté d’état de mal-être suivant la chirurgie au-delà des délais de traitement analgésique post-opératoires (3 jours). Des effets résiduels temporaires (moins de 10 jours) de la chirurgie vestibulaire seront attendus, tels qu’une désorientation des animaux, des troubles oculaires, de la posture et de la locomotion. d) L’exposition à l’hypergravité, qui induit une sensation d’alourdissement / d’allégement modifiant les capacités de l’animal à se déplacer, une modification de la température centrale et une altération de prise alimentaire. Ces altérations d’intensité légère sont visibles pendant les premières heures et peuvent être source d’une augmentation du niveau du stress, avant que les animaux s’adaptent au nouveau référentiel gravitationnel et reprennent une activité normale.

Devenir

L’ensemble des rats seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des investigations post-mortem.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l’implication du système vestibulaire dans les troubles de perception temporelle. La perception temporelle est dépendante de l’activité de l’hippocampe, une structure cérébrale. L’étude de l’activité de cette structure n’est possible qu’à travers une approche invasive, et nécessite de surcroit une évaluation comportementale (perception temporelle). La réalisation de ce projet n’est donc pas compatible avec des expérimentations menées chez l’humain, et ne permet pas de recourir à des modèles in vitro et/ou in silico, justifiant donc d’avoir recours à l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs choisis ont été déterminés, et les résultats seront analysés, avec des tests statistiques adaptés. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, un seul groupe contrôle non-exposé à l’hypergravité sera utilisé.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, souffrance et angoisse infligées, les animaux seront maintenus dans des conditions d’hébergement optimales et stables : température, cycle de lumière, hygrométrie et accès à la nourriture et l’eau ad libitum. Ils seront surveillés quotidiennement par un personnel qualifié et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Les cages d’hébergement seront enrichies avec de la sciure, du kraft, des tunnels en carton ainsi que des bâtons de bois à mâcher et des jouets en plastique. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place sous la forme de handling dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Afin de réduire la douleur et la détresse de nos animaux nous avons choisi un point limite précoce (à l’aide d’une grille de score) et compatible avec les objectifs scientifiques de notre recherche.

Choix des espèces

Des rats adultes âgés de 8 à 10 semaines seront utilisés, âge auquel la maturité cérébrale est atteinte. Le modèle de lésion vestibulaire chez le rat est déjà décrit comme reproduisant de façon fidèle les symptômes observés en clinique chez les astronautes et chez les patients atteints de lésions vestibulaires. Le rat possède également un répertoire comportemental plus large justifiant également sa préférence à la souris dans l’étude des processus de la perception temporelle.

L'induction de crise s'arrête quand la souris convulse ou quand sa température corporelle atteint 43 degrés, selon ce qui vient en premier. 698 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles sont biopsiées à 15 jours pour le génotypage, entrent en procédure à 20 jours, reçoivent une injection intraveineuse sous anesthésie, et une partie subit l'implantation chirurgicale d'électrodes d'électroencéphalographie. Le porteur écrit que les crises spontanées sont "fréquentes et non douloureuses" du fait de la perte de conscience, tout en indiquant qu'elles provoquent une mort subite chez 35 % des animaux avant l'âge de 40 jours.

Objectifs

Le syndrome de Dravet est une épilepsie génétique sévère qui se développe avant l'âge de 1 an. Outre les crises d'épilepsie, ce trouble se caractérise par des comorbidités comportementales, telles qu'un retard cognitif et une déficience motrice. Ce syndrome est causé par un déséquilibre excitation/inhibition qui conduit à des crises d'épilepsie. Une grande partie des patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises, ni d’amélioration des retards cognitifs avec les traitements pharmacologiques actuels. Notre projet vise à évaluer l'efficacité d'un traitement pharmacologique avec trois composés potentiels sur le développement de différents symptômes dans un modèle murin du syndrome de Dravet. Notre modèle murin récapitule les symptômes observés chez les patients ; Les premières crises chez l’Homme apparaissent avant l'âge d'un an et se stabilisent à l’adolescence, chez les souris elles apparaissent dès 20 jours et se stabilise autour de 30 jours. A l’adolescence, le syndrome évolue vers un retard cognitif et moteur visible aussi chez la souris.

Bénéfices attendus

Une grande partie des patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises, ni d’amélioration des retards cognitifs avec les traitements pharmacologiques actuels. Notre projet vise à évaluer l'efficacité d'un traitement pharmacologique avec trois composés potentiels sur le développement de différents symptômes dans un modèle murin de ce syndrome. Nous présentons une nouvelle version de la ligne de traitement existante pouvant améliorer ou modifier la trajectoire à long terme de la pathologie.

Procédures

A 15 jours les animaux sont biopsiés pour analyse du génotype pour la répartition des groupes expérimentaux, puis les souris entrent en procédure à l'age de 20 jours. La totalité des souris recevra une injection intraveineuse sous anesthésie qui peut provoquer une inflammation locale. Un premier lot d'animaux sera implanté avec un système d'enregistrement électrocéphalographique (EEG). Ils seront soumis à une anesthésie générale pour l'implantation par chirurgie du système d'électroencéphalographie (EEG, 20 min). Deux séries d'enregistrements électroencéphalographiques impliquant une contention pour branchement au système. Un deuxième lot subira une induction de crise induite par l'hyperthermie. Il s'agit d'une procédure unique qui dure environ 20 minutes et se termine lorsque l'animal développe une crise d'épilepsie ou lorsque sa température corporelle atteint 43 degrés Celsius. Un troisième lot effectura des tests comportementaux. Les test comportementaux qui seront utilisés, sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront sur deux semaines. Un dernier lot sera soumis à des tests comportementaux (les mêmes que précédement) puis les animaux seront implanté avec un système d'enregistrement EEG comme présenté précédement.

Impact sur les animaux

Les souris entrent en procédure à 15 jours, après une biopsie entraînant une douleur de courte durée. Les souris développent des crises tonico-cloniques spontanées à partir de l'âge de 3 semaines environ (P20), ces crises sont fréquentes et non douloureuses car il y a perte de conscience pendant la crise, comme chez les patients. Les crises sont néanmoins dangereuses pour les souris durant ce stade de développement jusqu'à environ P40 car elles provoquent la mort subite (SUDEP) chez 35% des animaux. Après les crises, les souris reprennent lentement conscience et recommencent à bouger sans aucun signe clair de douleur (pas de posture, de cri ou d'expression faciale de douleur). La fréquence moyenne des crises spontanées dans ce modèle de souris est de 1 crise tous les 2 jours. Les souris seront injectées par voie intraveineuse, ce qui peut provoquer une inflammation locale ponctuelle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de récupérer les organes pour analyses.

Remplacement

L'utilisation d'un modèle animal in vivo mimant le phénotype clinique observé chez les patients atteints du syndrome de Dravet est cruciale pour l'objectif de notre projet qui est de tester l'efficacité de nouveaux traitements pharmacologiques sur l'ensemble des symptômes (épileptiques et non épileptiques) qui surviennent dans ce syndrome, il n'y a pas de remplacement possible.

Réduction

Nous avons minimisé le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des procédures tout en nous assurant d'en avoir suffisamment pour faire l'analyse statistique de nos expériences (analyse a priori à l'aide du logiciel Gpower). Dans toutes les procédures, nous comparerons les souris mutantes avec les souris controles des mêmes portées. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.

Raffinement

Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (plusieurs animaux par cage, abri, buchette, et coton pour le nid). Nous manipulerons les animaux régulièrement pour les habituer à notre présence. Tout au long de chaque procédure, les animaux seront surveillés (hebdomadaire). Nous utiliserons une grille de score pour apporter les réponses adaptées et nous porterons une attention particulière aux critères de poids, de stress et d'hyper-réactivité, décrit dans les points limites. Pour aider à la prise de décision, cette grille de score contient plusieurs critères d’évaluation permettant de déterminer un score qui permet à l’expérimentateur de prendre la décision adaptée pour mettre en place rapidement des mesures visant à éviter ou réduire cette souffrance, et si nécessaire, l’arrêt des souffrances par mise à mort. Ce suivi tout au long de la vie par les expérimentateurs permettra aussi de réduire le stress des animaux qui y seront habitués. En outre, toutes les douleurs opératoires et postopératoires liées aux chirurgies prévues seront prises en compte avec une prise en charge pharmacologique adaptée.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 sont très couramment utilisées en recherche sur l’épilepsie, Le modèle animal que nous utilisons pour le projet (Scn1a mutant) développé par notre collaborateur est le plus utilisé. Il constitue un modèle adapté pour les expériences proposées par notre étude, où l'unité neuro-glio-vasculaire complètement fonctionnelle est requise pour investiguer les effets des crises sur les marqueurs d'inflammation. L'évaluation du potentiel thérapeutique des quatres composés sur le phénotype épileptique et non épileptique débutera après la première crise d'épilepsie, soit entre 20 jours et 30 jours. Les tests comportementaux, les électroencéphalogramme seront eux menés à l'âge adulte

Des chocs électriques sont administrés aux souris pour leur associer un lieu à la peur, deux chocs suffisant à installer l'évitement et la vigilance que le projet mesure ensuite. 632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec une chirurgie cérébrale de près de deux heures sous anesthésie et des injections répétées sur plusieurs semaines. Le porteur qualifie l'intensité du choc de "fortement désagréable mais sans induire de douleur", et décrit les tests comportementaux d'exploration et de mémoire contextuelle comme bien caractérisés et sans effet physiologique indésirable. Toutes les souris sont tuées pour récupérer leur cerveau, d'abord pour vérifier que la lentille optique était bien positionnée, ensuite pour doser des protéines cérébrales.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer l’implication de circuits cérébraux dans les effets protecteurs de la production de nouveaux neurones dans le cerveau, dans une zone appelée hippocampe, sur le comportement de peur. Pour cela, des souris transgéniques chez lesquelles il est possible de favoriser la production de nouveaux neurones chez l’adulte seront évaluées dans des tests comportementaux d’exploration et de mémoire contextuelle. Afin d’identifier quel circuit cérébral porte spécifiquement les éventuels effets positifs de l’augmentation de nouveaux neurones, nous inhiberons certaines voies de sortie de l’hippocampe qui projettent vers d’autres zones du cerveau et évaluerons son impact dans les mêmes tests comportementaux et de mémoire. La caractérisation précise du rôle des nouveaux neurones et l’identification du circuit impliqué dans de tels effets protecteurs pourrait ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les troubles liés au stress.

Bénéfices attendus

Une compréhension approfondie des réseaux neuronaux impliqués dans les réponses comportementales liées à la mémoire contextuelle, au stress et à la résilience, notamment du rôle potentiellement protecteur de la production de nouveaux neurones chez l’adulte, représente un enjeu majeur dans le traitement des pathologies associées au stress aigu et à la peur, telles que le trouble de stress post-traumatique. À ce jour, aucun traitement spécifique n’existe pour ces troubles : les approches actuelles se limitent généralement à l’administration d’antidépresseurs et/ou d’anxiolytiques, des traitements non spécifiques et d’une efficacité souvent limitée pour de nombreux patients. Dès lors, une meilleure compréhension des mécanismes neuronaux sous-tendant la résilience face au stress pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des traitements plus adaptés et efficaces

Procédures

Certaines souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale gazeuse d’environ 2 heures. Les souris subiront plusieurs injections (sous-cutanées et intrapéritonéales) étalées sur plusieurs semaines. Les injections seront réalisées avec soin et tact sur des animaux vigiles par des expérimentateurs expérimentés. Des récompenses appétentes seront offertes à la suite de chaque injection afin de réduire le stress associé. Enfin, les résultats principaux seront obtenus à partir de tests comportementaux basés sur l’exploration d’arènes de tailles et de formes différentes, pouvant être associées à une tâche d’apprentissage ou non. Dans quelques procédures les souris seront soumises à un choc électrique léger et aversif pour produire le conditionnement contextuel lié à la peur. Le choc est paramétré pour avoir une intensité fortement désagréable mais sans induire de douleur mais pouvant induire un stress sur le moment, sans effet néfaste sur la santé ou sur la physiologie à court et long-terme. L’étude évaluera ensuite les comportements associés au rappel de la peur et à l’évitement, comme pour les troubles liés au stress chez l’homme.

Impact sur les animaux

Modèle de conditionnement contextuel de la peur : Le principal risque associé à ce modèle est le stress psychologique et, potentiellement, une gêne ou légère douleur physique chez les souris expérimentales lors des deux chocs électriques. Nous n’anticipons aucune conséquence sur la santé des souris, uniquement de légères répercussions comportementales observables chez les souris notamment dans le contexte d’apprentissage lors de la réexposition au contexte (augmentation des comportements d’évitement, vigilance et peur dans le contexte de conditionnement), et éventuellement une généralisation de ces comportements à d’autres contextes dans les autres tests comportementaux. Tests comportementaux : Les tests comportementaux utilisés sont des tests classiques d’évaluation cognitive, sociale ou d’exploration, bien caractérisés dans la littérature. Bien que ces tests puissent générer un certain stress de manipulation, il est bien établi qu’ils n’induisent pas d’effets physiologiques indésirables immédiats ou à long terme. Souris transgénique. Le phénotype associé est non dommageable (voir ci-dessus). Les souris transgeniques proviennent d’un élevage et seront donc génotypée en amont de leur incorportation dans la saisine. Pour information, ce génotypage est réalisé à partir de prélèvement de bulbes pileux de l'animal au moment du placement de la puce d’identification sous anesthésie. Ainsi, toute nuisance supplémentaire associé au génotypage est évitée. Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la canule optique peuvent entraîner des douleurs post-opératoires légères à modérées, avec un impact limité dans le temps (quelques jours) sur le bien-être des animaux. Ceux-ci seront rigoureusement suivis en phase post-opératoire et traités avec un analgésique, ce qui leur permettra de récupérer rapidement de ce type de chirurgie. Anesthésie gazeuse : La manipulation des animaux peut engendrer un stress. Isolement en cage indivisuelle : après la chirurgie pour une durée pouvant aller jusqu’à 12 semaines, en fonction du temps de récupération post-chirurgicale et du début des injections de tamoxifène. Injection ip/sc : Une douleur légère peut être ressentie au niveau du site d’injection (ip, sc). Des récompenses appétentes seront offertes à la suite de chaque injection afin de réduire le stress associé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celles-ci ont été influencées par les conditions expérimentales.

Remplacement

L’étude des circuits cérébraux, de la production de neurones et de leur implication dans les réponses comportementales, telles que la mémoire ou l’adaptation au stress, ne peut être réalisée qu’à partir d’un cerveau et d’un organisme entier vivant.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés grâce à une approche statistique visant à optimiser leur réduction, conformément aux recommandations éthiques.

Raffinement

Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisées : les injections ou implantations intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale ainsi qu’un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures plus tard. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie, et les cornées seront protégées contre la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est privilégiée afin de mieux contrôler la profondeur de l’anesthésie et pour garantir une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est assurée afin de suivre chaque souris et d’intervenir si nécessaire (par exemple, en cas de perte de poids ou de température élevée nécessitant un traitement antibiotique). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique, et la plaie sera désinfectée par application de bétadine dermique. Une surveillance accrue est mise en place pour les souris montrant des signes de mal-être, avec des interventions si nécessaire, telles que des injections de solution saline pour l’hydratation ou la fourniture de nourriture appétente. Les injections sous-cutanées sont privilégiées par rapport aux injections intrapéritonéales en raison de leur plus grande sûreté et de leur moindre invasivité. Afin de réduire le stress des animaux, une habituation à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure est réalisée avant les tests comportementaux. Les expérimentateurs, experts dans la préhension et la contention des souris, veillent à minimiser tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont définis : en cas de blessures en cage ou d’infections, les animaux sont pesés et examinés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure). La décision d’euthanasie est prise en l’absence d’amélioration au bout d’une semaine.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de cette espèce, qui constitue un modèle de référence pour l’étude des bases neurobiologiques du comportement. Les souris utilisées seront des individus adultes.

Deux injections dans le canal rachidien espacées de quatre semaines, une pompe osmotique implantée sous la peau, un enregistrement musculaire sous anesthésie et jusqu'à trois injections dans l'abdomen. 7 046 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur moelle épinière et leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'objectif déclaré est de comprendre le déclin locomoteur lié à l'âge et aux maladies neurodégénératives, les retombées thérapeutiques restant annoncées au conditionnel. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'a été décrit chez les animaux utilisés, tout en indiquant que le modèle de sclérose latérale amyotrophique reproduit la perte des cellules nerveuses du mouvement et la dégradation des muscles. Les souris sont réparties entre 10 jours, 3 mois et 16 mois, pour comparer un stade jeune et un stade âgé.

Objectifs

Le projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine du déclin locomoteur dans le contexte du vieillissement et des maladies neurodégénératives. La découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques, en lien avec le mécanisme chargé de la dégradation de composants intercellulaires et les neurones, pourrait permettre de prévenir/traiter le déclin de nos fonctions locomotrices lié à l'âge et des maladies associées aux problèmes moteurs. Ces travaux de recherche devraient permettre de tester l’efficacité de ces thérapies. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes impliqués dans le vieillissement et les maladies dégénératives. D'un point de vue biomédical, il pourrait conduire à l'identification de nouvelles stragégies thérapeutiques pour prévenir et/ou traiter le déclin lié à l'âge ou les maladies neurodégénératives, ce qui constitue actuellement un défi prioritaire pour les systèmes de santé du monde entier. Enfin, d’un point de vue thérapeutique, cette étude pourrait conduire à l’identification de cibles thérapeutiques dans le traitement de ces troubles.

Procédures

Les interventions subies par les animaux sont: - Deux injections intrathécales (10 minutes sous anesthésie par intrapéritonéal et sous analgésique en pré (30 minutes avant le début de la procédure) chirurgie puis 24 et 48 heures plus tard) espacées de 4 semaines. Pose d'une pompe osmotique sous-cutanée sous anesthésie et sous analgésie (en pré (30 minutes avant le début de la procédure) chirurgie puis 24 et 48 heures plus tard). Des tests de locomotion seront effectués, ainsi qu’un enregistrement musculaire sous anesthésie par voie intrapéritonéale. Au total, les souris recevront un maximum de 3 injections intrapéritonéal (durée totale de 15 secondes). Ces interventions seront fait dans l'établissement utilisateur 1. De plus, des biopsies de la queue seront effectuées dans l'établissement utilisateur 2 pour génotyper les souris.

Impact sur les animaux

Mobilité altérée liée au modèle sclérose latérale amyotrophique. Injection intrapéritonéale: peut causer une douleur légère due à la piqûre. Chirurgies (injections intrathécales ou pose de pompe osmotique): peut provoquer du stress dû à l'anesthésie et au dessèchement des yeux. Aucun effet indésirable n'a été décrit chez les animaux qui seront utilisés. La biopsie peut provoquer une douleur légère.

Devenir

Chaque animal sera mis à mort afin de prélever des tissus pour l'analyse moléculaire (moelle épinière et muscle).

Remplacement

La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude, car elle présente des similarités physiologiques avec les pathologies humaines. Il n'existe pas de modèle in vitro.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. De plus nous avons déterminé le nombre de souris par groupe en fonction de données de la littérature et grâce à l'utilisation d'un outil statistique.

Raffinement

Les souris bénéficieront de coton, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour notre étude sur les problèmes de locomotion dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique (SLA). Ce modèle, créé en modifiant un gène spécifique, reproduit bien les troubles moteurs observés dans cette maladie. Il permet d’étudier à la fois les formes familiales et non familiales de la SLA, et simule la perte des cellules nerveuses responsables du mouvement, ce qui conduit à une dégradation des muscles. Ce modèle nous aide aussi à étudier comment certains processus biologiques, comme le fonctionnement des cellules, influencent la locomotion à différents stades de vieillissement. Le projet consiste à utiliser des souris âgées de 3 mois et de 16 mois, soumises à des tests pour observer leurs comportements. Ces deux âges ont été choisis pour représenter les stades jeunes et âgés des souris, ce qui permettra de comparer leurs capacités de mouvement et de mieux comprendre comment le vieillissement affecte ces fonctions. À 3 mois, les souris sont en pleine forme physique, tandis qu’à 16 mois, des signes de déclin moteur liés à l’âge commencent à apparaître. Parallèlement, des souris porteuses d’une mutation génétique associée à la SLA (sclérose latérale amyotrophique) seront utilisées à 10 jours et à 3 mois. À 10 jours, l'objectif est de vérifier leur génotype pour déterminer si elles portent ou non la mutation génétique. À 3 mois, les premières altérations motrices liées à la SLA commencent à se manifester, ce qui permet de suivre l’évolution de la maladie au fur et à mesure.

Surnuméraires issus de croisements réalisés pour un autre projet, 192 souris sont transférées d'un site à l'autre sur 2,7 kilomètres avant d'être opérées. 96 d'entre elles subissent une section de la moitié de la moelle épinière, trente minutes sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 96 autres un niveau modéré, toutes tuées pour que leurs tissus soient prélevés. La patte arrière du côté lésé reste paralysée, le contrôle du sphincter urinaire est altéré, des escarres peuvent se former, et les souris passent par des tests de marche, de coordination, de force d'agrippement, de qualité du nid sur vingt-quatre heures et de temps de toilettage, échelonnés de sept jours avant la lésion à six semaines après. Le porteur indique que les cultures de cellules nerveuses ne reproduisent pas la complexité de l'organisme et conclut que le recours aux animaux "demeure crucial" pour envisager des applications cliniques.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les lésions de la moelle épinière touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une lésion de la moelle épinière. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une lésion de la moelle épinière. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Les cellules immunitaires du système nerveux central jouent un rôle prépondérant dans les réponses neuroinflammatoires suite à une lésion de la moelle épinière. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de protéines spécifiques qui sont modulées après lésion de la moelle épinière et associées à la neuroinflammation favorise une meilleure récupération. . Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs

Bénéfices attendus

Les lésions de la moelle épinière induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression de deux protéines spécifiquement dans un type de cellule du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations importantes sur le rôle de ces protéines qui restent méconnues à ce jour dans les lésions de la moelle épinière lors de la mise en place et le maintien de l’inflammation. Cette étude permettra de déterminer précisément leur importance après lésion moelle épinière chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux recevront des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 5 jours à l’âge de 5-8 semaines. Les animaux seront transférés du site 1 vers le site 2 selon la réglementation et avis du vétérinaire. Sur le site 2, les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=96). Les animaux seront évalués au niveau comportemental pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évaluent la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes post-mortem.

Impact sur les animaux

Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Le transport et le changement de site peut induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.

Devenir

A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.

Remplacement

Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression de 2 protéines du système nerveux de manière spécifique dans un type de cellule et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.

Réduction

Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique. Ces animaux sont générés et aussi utilisés dans le cadre d’une autre demande de projet et nous utiliserons les animaux surnuméraires issus des croisements effectués sur le site 1. De plus, cela évitera de développer cette lignée en doublon dans l'animalerie du site 2.

Raffinement

Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 2,7km). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les lésions de la moelle épinière, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces 2 souches de souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central dans un type de cellules associé à la neuroinflammation. Cela en fait donc des modèles de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de ces protéine après une lésion médullaire sur l’inflammation. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.

3 593 souris vont être utilisées, dont 2 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir des injections jusqu'à deux fois par jour et être anesthésiée toutes les deux semaines pour une prise de sang. Des cellules tumorales humaines leur sont greffées sous la peau, dans une veine ou dans un muscle, ce qui produit des tumeurs et des métastases du foie, du péritoine ou des poumons, et, pour l'injection dans le muscle, une tumeur qui peut empêcher la souris de se déplacer. Les souches utilisées sont immunodéficientes, ce qui permet la greffe de cellules humaines, et la taille des tumeurs comme la perte de poids liée à la réaction du greffon contre l'hôte servent de seuils de mise à mort. Les bénéfices annoncés, une détection plus précoce des micro-métastases et un meilleur pronostic, restent au conditionnel, quand le porteur rappelle que la réglementation impose de tester tout médicament chez deux espèces animales avant l'être humain.

Objectifs

Le cancer reste une des principales causes de mortalité dans le monde, malgré des avancées médicales notables. Les traitements conventionnels rencontrent des limitations, notamment face à des tumeurs résistantes, nécessitant l'émergence de nouvelles approches thérapeutiques. L'immunothérapie se présente comme une révolution, mobilisant notre système immunitaire contre les cancers. Depuis vingt ans, les immunothérapies ont connu un développement rapide avec de nouvelles stratégies utilisant des anticorps (Ab). Ces Ab peuvent reconnaître une cible précise sur une cellule cancéreuse et induire une réponse spécifique. Ils peuvent aussi être exprimés à la surface des cellules immunitaires, redirigeant ces cellules spécifiquement vers leur cible tumorale (thérapie cellulaire). Une autre stratégie dans la lutte contre le cancer consiste à perfectionner les méthodes diagnostiques. En identifiant les cellules cancéreuses tôt, nous pouvons réagir rapidement. À un stade avancé, les métastases résultent de la migration de cellules cancéreuses vers d'autres parties du corps, générant de nouvelles tumeurs. Ainsi, les micro-métastases, bien que non détectables traditionnellement, indiquent le début de la propagation. La détection précoce des cellules cancéreuses est cruciale. Les Ab peuvent être liés à des molécules radioactives, et grâce à leur spécificité ils peuvent améliorer la détection radiologique des cancers. Cependant, les Ab classiques ont des limites en termes de taille. De nouveaux formats d'anticorps, ne possédant que la partie active des Ab, appelés anticorps à domaine unique (sdAb), ont été développés. Ils ont l'avantage d'être dix fois plus petits, ce qui leur permet de mieux pénétrer les tumeurs et d’améliorer à la fois les traitements et les diagnostics. Ces sdAb peuvent remplacer les anticorps classiques et augmenter les chances de survie des patients. Des lignées cellulaires dérivées des tumeurs, représentant la diversité de la maladie chez l'homme, seront utilisées pour tester le rôle diagnostique ou thérapeutique de nos sdAb. L'objectif de ce projet est de développer et tester des sdAb synthétiques afin d'offrir une meilleure solution diagnostique et thérapeutique en clinique.

Bénéfices attendus

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde et, malgré les traitements classiques et le développement des nouvelles thérapies ciblées, cette maladie dans ses formes métastatiques reste majoritairement incurable. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est nécessaire et représente un réel défi pour la médecine. En développant et testant de nouveaux anticorps thérapeutiques, plus efficaces et/ou plus spécifiques que les anticorps déjà utilisés en clinique, nous pouvons améliorer le pronostic de certains cancers. Il est également important d’augmenter la connaissance et d'améliorer les différentes immunothérapies déjà utilisées en clinique. Une autre manière d'améliorer le pronostic des patients atteints de cancer est d'améliorer la spécificité et la détection précoce des cellules cancéreuses, par exemple lors de l’apparition des métastases. L'utilisation des anticorps comme outil de diagnostic, en les liant par exemple à des marqueurs radioactifs ou fluorescents, permettra la détection de micro-métastases et surmontera les limites des méthodes de diagnostics classiques. Cela signifie qu'il sera possible d'intervenir à des stades plus précoces du développement du cancer, ce qui contribuera à améliorer le pronostic des personnes atteintes de la maladie.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux seront réparties en deux lots. Pour le premier : Des cellules tumorales seront injectées aux souris vigiles ou anesthésiées (1 fois par expérience). Lorsque les animaux sont anesthésiés, l'anesthésie durera entre 30 et 40 minutes. Si l'injection est faite sans anesthésie, le geste durera également 10 à 30 secondes. Le deuxième lot d'animaux suivra une procédure similaire avec des injections et des traitements supplémentaires pour les traitements. Les injections supplémentaires seront effectuées sans anesthésie et prendront environ 10 à 30 secondes. Les injections peuvent être faites une seule fois ou plusieurs fois, par exemple 1 fois par semaine ou 1 ou 2 fois par jour pour certains diagnostiques ou traitements. Un prélèvement sanguin est effectué une fois toutes les 2 semaines sur les animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie inferieure à 5 min). Par la suite, les animaux seront suivis régulièrement. Le suivi des tumeurs sera fait 1 ou 2 fois par semaine. Il sera fait par le pied à coulisse ou par imagerie sous anesthésie générale (durée 20minutes maximum). 10 minutes avant l’imagerie un produit spécifique pour visualiser les tumeurs est injecté aux souris (injection 10 sec). Le suivi par imagerie peut se faire une fois toutes les 2 semaines pour les tumeurs qui poussent lentement.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des injections de cellules selon différentes voies seront celles liées à la piqûre elle-même (gêne de courte durée). A plus long terme, les souris greffées avec des cellules tumorales sous la peau vont développer des tumeurs primaires in situ mais peuvent selon les pathologies développer des métastases dans le foie, le péritoine ou bien dans les poumons. Les cellules injectées par voie intraveineuse vont notamment développer des métastases au niveau des poumons. Les cellules injectées dans le muscle conduiront au développement de tumeur in situ (= dans le muscle) pouvant empêcher la souris de se déplacer.

Devenir

les animaux sont mises à mort, les organes et les tissus tumoraux sont prélevés pour des analyses post-mortem ultérieures

Remplacement

L’efficacité antitumorale de tous les formats d’anticorps, sera préalablement évaluée sur des cultures cellulaires (système in vitro). Seuls les anticorps ayant montré une efficacité in vitro seront ensuite testés in vivo. En effet il est nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré et tenant compte de la complexité d’un organisme vivant avec les multiples interactions, la durée de l’efficacité du traitement, les doses et la toxicité possible ou encore la difficulté de la molécule à atteindre sa cible. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation en clinique. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets des anticorps et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance.

Réduction

Le nombre de souris utilisées est basé sur notre expérience avec des sdAb et également sur des études bibliographiques. Ce nombre tient compte du taux de la prise tumorale, de l’hétérogénéité d’efficacité des cellules thérapeutiques et de l’hétérogénéité des réponses animales. Le nombre d'animaux par expérience est déterminé à l'aide d'outils statistiques. Pour les mises au point des expériences le nombre de souris est réduit au minimum en fonction des résultats obtenus in vitro. Afin de réduire le nombre de souris pour un modèle donné: - Les souris utilisées pour étudier la croissance des tumeurs peuvent aussi servir pour la mise au point des sdAb diagnostiques. - Plusieurs thérapies pourront être testées en parallèle et par conséquent les mêmes souris "contrôles" seront alors utilisées. - Si au cours des expériences nous constatons que le sexe n'affecte pas la progression de la tumeur ni le traitement, nous pourrons réduire le nombre de souris initialement prévu.

Raffinement

Les injections peu invasives et seront faites sans anesthésie alors que les injections intramusculaires seront faites sous anesthésie avec traitement antalgique associé. Le suivi tumoral d'une tumeur palpable sera fait par le pied à coulisse sans nécessité d’anesthésie. Le suivi tumoral de tous types d'injections sera effectué par imagerie et sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Evaluation de l’état général de la souris : une grille de score déterminera les points limites. Un suivi clinique approfondi sera réalisé au minimum une fois par semaine et les animaux seront mis à mort dès atteinte des points-limite selon la grille de score. Les points de limite comprennent la taille des tumeurs, lorsqu'elle est mesurable au pied à coulisse, ainsi que la perte de poids liée à la maladie du greffon contre l'hôte. Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et c’est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. - La réglementation demande que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première instance et il permet d’acquérir un grand nombre d’informations pour un investissement contrôlé. - L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, entre 5 à 8 semaines, les animaux à cet âge supportent mieux le transport depuis l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que les traitements. Par ailleurs, les résultats ne seront pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux.