Procédures sévères

Porteuses d'une mutation qui les fait cesser de respirer pendant le sommeil, des souris nouveau-nées reproduisent le syndrome d'Ondine. 1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque souriceau est séparé de sa mère jusqu'à une heure pour une mesure cardiorespiratoire, reçoit un gavage à la naissance et se fait couper un morceau de queue vers le quatrième jour de vie. Le porteur liste l'angoisse de la séparation maternelle, les apnées, l'hypoventilation et un défaut de succion qui fait perdre du poids aux mutants, tout en écrivant que ces mutants se développent sans manifester de souffrance nécessitant une prise en charge spécifique.

Objectifs

Le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare diagnostiquée à la naissance : le nouveau-né diminue sa ventilation jusqu’à arrêter de respirer pendant le sommeil. Une caractéristique majeure est l'absence d’un réflexe important : augmentation de la respiration à l’augmentation du CO2 inhalé. La maladie est provoquée par une mutation d’un gène qui contrôle les grandes fonctions vitales comme la respiration. Ce gène est aussi impliqué dans la différenciation et la maturation des structures qui modulent la respiration. Notre objectif est d’explorer l’impact de la mutation dans ces structures. Les résultats de cette étude permettent de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette maladie et de proposer des pistes thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront également de préciser l’impact de la mutation restreinte dans des structures importantes pour la modulation de la respiration et d’ajouter des cibles pharmaceutiques. L’objectif est de proposer des thérapies ciblées. L’utilisation d’un traitement pharmacologique réduirait le recours à la ventilation mécanique, l’unique prise en charge actuelle pour cette pathologie, et ainsi réduirait les risques dus à un arrêt accidentel (par exemple une coupure de courant ou une défaillance technique) pendant le sommeil ou à une ventilation inadaptée. De plus, pour des médicaments à visée pédiatrique, l’agence européenne du médicament recommande des tests sur des rongeurs juvéniles pour garantir l’innocuité et l’efficacité du produit sur la population cible.

Procédures

1/ Séparation maternelle concernant les souris avant le sevrage : Procédure 1 : une seule administration du traitement par gavage, par souriceau et à la naissance suivie d'une mesure cardio-respiratoire d'une heure réalisée immédiatement après le gavage (mesure non invasive et sans anesthésie, contention liée au gavage moins d'une minute), Procédure 2 : une seule administration du traitement par gavage, par souriceau et à la naissance suivie d'une mesure cardio-respiratoire d'une heure réalisée immédiatement après le gavage, la mesure est ensuite répétée 5 fois pour 5 âges (une mesure par âge, mesure non invasive et sans anesthésie), 2/ Prélèvement d'un morceau de queue pour l'identification du statut génétique de l'animal 3/ Mesure cardio-respiratoire d'une heure nécessitant une séparation maternelle 4/Administration du traitement par gavage, une seule fois et à la naissance 5/ Prise de poids pour évaluer la croissance pondérale

Impact sur les animaux

1/ angoisse par la séparation maternelle d'une heure pour la mesure cadio-respiratoire 2/Perte de poids pour les mutants qui font des apnées, hypoventilent et ont un défaut de succion/déglutition 3/ douleur légère et de courte durée due au prélèvement d'un morceau de queue pour déterminer le statut génétique de l'animal geste réalisé une fois vers quatre jours de vie) 4/ gêne occasionnée par l'administration unique de produit par voie orale grâce à une sonde de gavage (sonde fabriquée spécialement pour les souriceaux nouveau-né). Jusqu'alors, il n'y a pas de lésions/irritations spécifiques occasionnées par l'utilisation unique de la sonde de gavage.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Utilisation en postmortem du cerveau pour l'étude d'expression génique.

Remplacement

Les études à l'échelle cellulaire et/ou moléculaire contribuent à la compréhension des différents acteurs (gènes, structures) dans la compréhension de la maladie. Toutefois, ces modèles sont limitées car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge. Étant dans l’optique de recherche de traitement pharmacologique, l’Agence européenne du médicament recommande l’utilisation de l’animal en développement pour les médicaments notamment à visée pédiatrique. L’expérimentation animale ne peut alors être évitée. Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique.

Réduction

Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle sur les variables observées comme la ventilation, nous avons déterminé un lot expérimental génotype, dose, génotype*dose de 30 animaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. les études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir une puissance statistique. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses. Par ailleurs, les méthodes de mesures utilisées étant non invasives, nous privilégions une étude longitudinale ce qui réduit l’utilisation d’animaux. Génotype : profil génétique de l'individu

Raffinement

Pendant les mesures, la surveillance est constante. Entre les mesures, la surveillance est biquotidienne pour le suivi de la croissance pondérale. De plus, l’équipe de l’animalerie effectue une surveillance quotidienne de toutes les cages. Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux sont décrits et comportent la première semaine de vie le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau et le comportement de la mère envers sa portée. A partir de 7 jours de vie, nous incluons l’aspect du pelage, la posture et la mobilité des souris. Les mutants dont la mutation est restreinte à des régions spécifiques se développent sans manifester de souffrance nécessitant une prise en charge spécifique. Pour les mesures, nous utilisons des techniques non invasives et contrôlées (durée de la mesure, température dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. La durée maximale de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure. A la fin de chaque mesure, les animaux sont remis à la mère. Les cages avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid.

Choix des espèces

Les études à l'échelle cellulaire et/ou moléculaire permettent de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents. L’approche sur un animal entier permet de voir les effets de la mutation dans un contexte physiologique. La souris constitue un modèle de neuro-développement humain et la souris avec modification génétique est largement utilisée dans l'analyse ou l'étude du développement d'une maladie génétique. Dans le cas du syndrome d'Ondine, les modèles animaux existants sont murins. Les modèles murins permettent de préciser les mécanismes physiopathologiques (examiner les processus conduisant à la maladie) du syndrome d'Ondine et de rechercher les traitements pharmaceutiques. A ce jour, la seule prise en charge des patients est la ventilation mécanique. Par ailleurs, les études précliniques sur des rongeurs juvéniles constituent une recommandation de l'Agence européenne du médicament comme préalable pour garantir l’innocuité et l’efficacité de produit/médicament sur la population pédiatrique cible

Une mortalité de l'ordre de 20 % est attendue pendant la chirurgie qui resserre l'artère en sortie du cœur, puis de 5 % pendant le développement de l'insuffisance cardiaque qui s'ensuit. 1 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour que leur cœur et leur sang soient analysés. L'opération dure une trentaine de minutes, l'artère est exposée puis rétrécie, et l'évolution de la maladie est suivie chaque semaine par échographie sous anesthésie, dans un second établissement rejoint à pied. L'effectif de 1 260 souris est rapporté à la littérature du domaine et à l'expérience de l'équipe, sans que le calcul soit détaillé.

Objectifs

Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude du rôle des plaquettes sanguines dans l'évoluton de cette maladie. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons dans une 1ère partie ce modèle à des souris modifiées génétiquement chez lesquelles différents déterminants de surface des plaquettes ont été modifiés. En comparant ces souris à des souris non modifiées génétiquement, nous pourrons déterminer si un ou plusieurs de ces déterminants est important dans l'évolution de la maladie du cœur. Dans une 2ème partie, en fonction des données obtenues dans la 1ère, nous testerons différents traitements pharmacologiques susceptibles de freiner le développement de la maladie chez les souris. L'objectif de ce projet est de trouver de nouvelles approches thérapeutiques qui permettrait de traiter l'insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin de trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si un ou plusieurs des déterminants de surface plaquettaire s'avère(nt) être une (des) cible(s) potentielle(s) (Partie 1), nous testerons alors des traitements pharmacologiques dont nous disposons et qui sont capables de les bloquer (Partie 2). Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.

Procédures

Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).

Impact sur les animaux

Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie induisant l'insuffisance cardiaque, estimée de l'ordre de 20%, puis au cours du développement de la maladie (5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : - une douleur post- opératoire à J0 et pendant 24h - une perte de poids post-opératoire (modérée) - un stress occasionné par les séances d'imagerie

Devenir

Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.

Remplacement

La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti- douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas un certain nombre de molécules d'intérêt, ce qui permet d'étudier leur rôle (partie 1 du projet), comparativement aux souris qui la produisent normalement. D'autre part, des souris qui ne sont pas modifiées génétiquement seront utilisées dans le cadre du test de nouvelles approches thérapeutiques (partie 2 du projet).

800 souris porteuses par modification génétique d'une inflammation des articulations vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour une collecte terminale de sang. L'arthrite s'exprime de la sixième à la dix-septième semaine de vie, avec un pic vers huit à dix semaines, et chaque souris subit trois prélèvements de sang dans la joue en étant éveillée, contenue trois minutes. Le sérum obtenu part vers un autre laboratoire, pour déclencher la même maladie chez d'autres souris. Le porteur présente la répétition des prélèvements sur les mêmes individus comme une contribution à la réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de prélever du sang sur une souche transgénique de souris qui présente une inflammation marquée des articulations et d’en extraire des molécules de l’inflammation pour pouvoir le fournir au scientifique. Le scientifique a pour objectif d’utiliser ces molécules pour déclencher la même maladie chez d’autres souris mais dont l’évolution et la réponse aux traitements se rapprochent plus de ce qui se passe chez l’homme, afin de mieux comprendre la maladie et de trouver de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ce modèle est un des modèles les plus pertinents et stables pour l'induction d’une inflammation marquée des articulations chez la souris afin de pouvoir l’étudier par la suite. Comprendre cette maladie articulaire, comment elle apparaît, quels sont les mécanismes associés permet de mieux apprendre à la soigner et d’identifier notamment de nouveaux traitements, véritable enjeu de santé publique (5 % des maladies humaines sont d’origine articulaire).

Procédures

Chaque souris exprimera l’arthrite de ses 6 semaines à ses 17 semaines d’âge, avec un pic d’expression des symptômes à 8/10 semaines. Chaque souris sera pesée (entre 3 et 6 fois) et subira 3 prélèvements sanguins submandibulaires en étant vigile (durée, 3 minutes), les prélèvements étant espacés d’au moins 2 semaines. Enfin les souris seront euthanasiées au CO2, puis un prélèvement cardiaque sera réalisé en post-mortem.

Impact sur les animaux

Douleur et stress associés à l’expression du phénotype d’arthrite, stress lié à la pesée. Douleur et stress lié au prélèvement sanguin répété et à la contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecte terminale de sang.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de produire un sérum contenant les molécules inflammatoires d’intérêt pour étudier le modèle en question.

Réduction

Afin de pouvoir obtenir le modèle d’arthrite induit, un volume assez conséquent de sang est nécessaire. Par des prélèvements de sang répétés, cela permet la réduction du nombre d’animaux prélevés pour le volume attendu. De plus, la répétition des prélèvements permet une concentration optimale des molécules et par conséquent l’utilisation d’un volume minimal pour induire la pathologie, contribuant à l’utilisation d’un nombre minimal d’animaux pour obtenir ce sérum.

Raffinement

Les cages sont enrichies avec du matériel de nidification. Pour améliorer le confort de ces souris, le niveau de litière est augmenté pour faciliter l’accès à la nourriture, et de l’aliment mouillé est déposé dans la cage. Les souris sont manipulées avec des méthodes limitant le stress (creux de la main, manipulation par le corps). Lors des contentions, un matelas à poils épais est utilisé pour que cette surface molle réduise l’impact de la contention sur les articulations. La voie submandibulaire, nécessitant une contention par la peau du dos, est celle qui exerce le moins de pression sur les articulations en permettant d’obtenir le volume souhaité. Chaque prélèvement est suivi d’une réhydratation sous-cutanée de NaCL 0,9% d’un volume équivalent au volume prélevé.De plus, seuls les techniciens ayant un niveau de maitrise élevé du prélèvement submandibulaire sont autorisés à réaliser ces prélèvements. Lors du transfert vers le laboratoire d’analyse pour le prélèvement terminal, l’enrichissement et le nid sont transférés dans la boite de transport, et le temps de transfert de ces animaux fragiles est planifié et organisé à l’avance pour réduire le temps et les nuisances associées au transport.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est particulièrement adaptée lors de la création de modèles transgéniques par sa reproduction rapide, et l’étendue et la maitrise des méthodes de manipulation génétiques validées chez cette espèce. Dans le cas de ce modèle d’arthrite, le fait qu’il s’exprime chez un animal léger de petite taille permet de réduire la pression et la douleur sur les articulations. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 6 semaines à 17 semaines, car c’est pendant cette période que s’exprime l’arthrite permettant de voir l’inflammation dans le sang, les molécules de l’inflammation étant ce que le scientifique souhaite prélever pour son étude.

Une neurotoxine injectée dans le cerveau, une heure d'intervention, puis vingt et un jours d'injections du traitement de référence qui déclenche des mouvements involontaires anormaux : 2 050 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués et leurs cerveaux prélevés. Les rotations et les stéréotypies ainsi provoquées irritent la peau au frottement de la litière, ce que le porteur compte limiter par une litière en cellulose. Le projet relève d'une activité de service préclinique pour des tiers, et les bénéfices annoncés tiennent en deux phrases, l'identification de "nouveaux outils thérapeutiques". Les mesures du comportement moteur durent jusqu'à trois heures et se répètent deux à quatre fois, sans qu'aucune précision soit donnée sur leur contenu.

Objectifs

La maladie de Parkinson se définit par un dysfonctionnement du système nerveux. Elle touche un nombre important de personnes dans le monde. L'origine de cette maladie est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux. Ils permettent l'amélioration des symptômes moteurs de la maladie de Parkinson mais s'accompagne toutefois d'effets secondaires délétères caractérisés par des mouvements involontaires anormaux chez 90% des patients. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de modèles rongeur de la maladie de Parkinson qui permettent d’en reproduire les symptômes, afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Le bénéfice attendu est l’identification de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux vont subir une injection intracérébrale (1 heure), une injection d'un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson (21 jours, durée de l'injection : 30 secondes), une administration de traitement dans le corps (1 à 2 mois/1 min) ou une chirurgie (1 chirurgie/30 min), des prélèvements de sang (1 à 4 fois/5 min) et des mesures du comportement moteur (2 à 4 fois/3 heures).

Impact sur les animaux

L’injection de neurotoxine peut entraîner une perte de poids. Les mouvements involontaires anormaux induits par les injections répétées de traitement de référence de la maladie de Parkinson provoquent des rotations et des stéréotypies pouvant induire des irritations suite aux frottements sur la litière. Les nuisances possibles pour chaque méthode d'administration sont : Per os : il existe un risque faible de fausse route, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires passagers et un risque faible d’irritation à la suite de gavages répétés. Injections sous-cutané et intrapéritonéale : l'injection peut causer une douleur ou une irritation locale au niveau du site d'injection. Intranasal : elle peut provoquer une irritation des muqueuses nasales de l'animal, entraînant un inconfort temporaire. Intradermique : certains animaux peuvent développer des réactions cutanées locales. L’administration du traitement par injection stéréotaxique ou intrathécale pourra entrainer des douleurs postopératoires qui devraient durer 2 jours en moyenne. La chirurgie entraine également un léger risque d’hémorragie ou d’infection au niveau du site opératoire.

Devenir

A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rats pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme ce qui rend ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf pour les études invasives). -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum d'animaux par groupe à 12, pour des résultats statistiques exploitables. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le liquide céphalorachidien, le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R.

Raffinement

Avant toute manipulation, nous respecterons une période d'acclimatation des animaux de deux semaines. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (2 par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (tunnel, bâton de bois à ronger). Pour les dyskinésies, nous utiliserons une litière en cellulose peu irritante afin d’éviter d’éventuels irritation aux pattes et à la queue. Le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée par un suivi visuel journalier (weekend et jours fériés inclus) et une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d'un analgésique et d'un anesthésique local permettant de réduire la douleur des animaux. Le lendemain de la chirurgie, les animaux reçoivent une injection d'un analgésique. Un suivi post opératoire spécifique de 3 jours est mis en place. Le bien être est scoré via l’observation de différents critères de bien-être. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de neurotoxine est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. La maladie de Parkinson apparait préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 5 semaines d’âge. En effet à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.

Toutes mises à mort au motif que leur souffrance est jugée irréversible, 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Cent quatre d'entre elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses, puis des mesures de bioluminescence sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines. Toutes reçoivent l'anticancéreux qui provoque la neuropathie, dont la douleur est ensuite évaluée en appliquant des filaments sur la patte, au test de von Frey. Le porteur situe le débouché du projet sur le marché du cancer du sein triple négatif et annonce un dépôt de brevet avant tout passage chez l'être humain.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif présente un taux de survie à 5 ans de 77% qui chute à 11% si métastases. Les douleurs associées à ce type de cancer sont de deux types : les douleurs neuropathiques périphériques induites par la chimiothérapie et les douleurs métastatiques. Nous avons montré que le récepteur GPER (pour G protein-coupled estrogen receptor), était impliqué dans le cancer et la douleur. Sur la base de ces résultats, nous émettons l’hypothèse que des molécules modulant le récepteur GPER pourraient améliorer le cancer triple négatif et les douleurs associées. Pour ceci, de telles molécules seront synthétisées. Après plusieurs étapes de screening in vitro, les meilleurs ligands (10 molécules maximum) seront alors évalués par nos soins (objet de cette procédure APAFIS) sur la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies grâce à l’utilisation d’un modèle murin. Le ligand présentant la meilleure efficacité sera alors évalué sur : (1) le développement de la tumeur, (2) la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies et (3) la douleur métastasique grâce à l’utilisation de modèles murins. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant de lutter contre la progression tumorale ainsi que les symptômes neuropathiques, tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies, mais aussi prévenant (lorsqu’il sera co-administré avec les chimiothérapies) l’apparition de neuropathies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, tumeur, dissémination sanguine et système immunitaire. Ces travaux compileront les bases nécessaires au dépôt de brevet de molécule dans le but de passer ensuite à des études chez l’Homme. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.

Procédures

*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’anticancéreux responsable de la mise en place du modèle et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée en quelque secondes sur animal vigil. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile pendant quelques secondes sera réalisée afin d’évaluer la douleur. *104 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation des cellules cancéreuses qui durera environ 5 minutes par animal. *La mesure de la bioluminescence (durée : 5 min par animal) sera réalisée 2 fois par semaines pendant 3 semaines sous anesthésie générale. *Toutes les interventions sont réalisées à l’établissement utilisateur EU1 à l’exception de la mesure de la bioluminescence qui sera effectuée à l’EU2.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie chimio-induite (CIPN) ainsi que de tumeur chez l’animal seront des nuisances à part entière et irréversibles, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN ainsi que les métastases osseuses seront associées à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Une application de quelques secondes de filament au cours du test de von Frey est susceptible d’induire chez l’animal une douleur légère.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.

Remplacement

Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectués afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des molécules designées ou synthétisées subiront : - un screening in silico des dérivés (seules les molécules se fixant sur le GPER seront retenues) - un screening in vitro des dérivés (seules les molécules présentant une action agoniste inverse sur le GPER et une action antiproliférative sur cellules TNBC seront retenues). S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN et de métastases osseuses n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. S'agissant d'étude sur la croissance tumorale, un screening des composés et une étude de l’interaction de ces composés avec le paclitaxel in vitro sera réalisé préalablement au passage chez l’animal. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie. Ce type d'étude sur modèle animal de métastases osseuses est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.

Réduction

*Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. *Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. *De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. *La PROCEDURE 1 est une étape de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celle-ci sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. *Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule ou une chirurgie factice), et menées en aveugle. *L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Le transport des animaux entre l’animalerie (EU1) et le centre d’imagerie (EU2), s’effectuera en voiture. Les animaux seront hébergés dans des boites opaques avec couvercle filtrant. Un document de transport (avis/accord du vétérinaire) accompagnera les animaux. Le transport sera conditionné à l’état des animaux et les conditions climatiques.

Choix des espèces

La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN et la croissance tumorale. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie et le développement tumoral. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

Isolées dix minutes par jour pendant trois jours, puis injectées dans l'abdomen avec un composé qui déclenche une crise d'épilepsie, 96 souris sont ensuite observées seules pendant deux heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit en plus un activateur de canaux potassiques, pour mesurer s'il atténue la crise. Le porteur indique avoir déjà obtenu l'effet de la mutation sur des neurones en culture, et affirme que ces résultats ne suffisent pas parce que le phénotype épileptique fait intervenir plusieurs organes, d'où le "besoin" d'un système intégré. Toutes les souris sont mises à mort dès la fin de la procédure, ce que le porteur présente comme un moyen de limiter leur détresse.

Objectifs

L’épilepsie est une maladie chronique d’origine neurologique caractérisée par la récurrence de crises d’épilepsie. Ces crises sont caractérisées par divers symptômes tels que désorientation, perte de conscience, troubles du mouvement ou des sensations (gustatives, auditives, visuelles) ainsi que de l’humeur ou d’autres fonctions cognitives. Du fait de ces crises, les personnes épileptiques ont tendance à présenter davantage de problèmes physiques (fractures par exemple) et psychologiques (anxiété et/ou dépression) et le risque de décès prématuré est jusqu’à 3 fois plus élevé comparé à la population générale. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, environ 50 millions de personnes sont touchées par cette pathologie avec approximativement 5 millions de personnes diagnostiquées chaque année ; l’épilepsie représentant une part non négligeable de la charge de morbidité à l’échelle mondiale. Malgré le nombre important d’études menées et en cours visant à comprendre les causes de l’épilepsie, celles-ci sont encore inconnues dans 50% des cas selon l’OMS. Dans ce contexte, notre équipe se focalise sur l’étude d’une nouvelle mutation portée par un canal potassique exprimé au niveau du système nerveux central et périphérique. Chez l’Homme, la présence de cette mutation est corrélée à la présence de diverses pathologies dont l’épilepsie. Le but de ce projet est, dans un premier temps, de démontrer le lien de cause à effet entre cette mutation et l’épilepsie dans un contexte physiologique (sur animal vivant), dans un second temps, d’évaluer dans quelle mesure un composé pharmacologique activateur des canaux potassiques est capable de réduire le phénotype épileptique.

Bénéfices attendus

L’épilepsie est un problème de santé publique car, selon l’OMS, environ 50 millions de personnes dans le monde sont affectées par cette pathologie et environ 5 millions de personnes sont diagnostiquées chaque année. De plus, les symptômes associés à l’épilepsie sont importants tels que désorientation, perte de conscience, troubles du mouvement ou des sensations (gustatives, auditives, visuelles) ainsi que de l’humeur ou d’autres fonctions cognitives. Du fait de ces crises, les personnes épileptiques ont tendance à présenter davantage de problèmes physiques (fractures par exemple) et psychologiques (anxiété et/ou dépression) et le risque de décès prématuré est jusqu’à 3 fois plus élevé comparé à la population générale. Cependant, malgré la gravité de cette pathologie, son étiologie est inconnue dans environ 50% des cas, justifiant des études approfondies. Nous pensons que l’étude de cette mutation impactant la fonctionnalité d’un canal potassique sera importante pour la compréhension des origines de l’épilepsie ; une meilleure compréhension permettra un meilleur traitement de cette pathologie. De plus, il est attendu que l’activation des canaux potassiques via ce composé pharmacologique soit en mesure de réduire la gravité du phénotype épileptique et, si tel est le cas, cette étude nous permettra de valider ces canaux comme cibles de choix et ce composé pharmacologique comme outil thérapeutique prometteur pour le traitement de l’épilepsie.

Procédures

Nous induirons un phénotype épileptique à nos souris par une unique injection intrapéritonéale d’un composé épileptogène (l’injection sera rapidement réalisée en quelques secondes). Le but sera d’évaluer le degré de sévérité de la crise chez ces souris durant 2 heures maximum post injection. Sur d’autres lots d’animaux, nous évaluerons dans quelle mesure l’activation de canaux potassiques via une unique injection intrapéritonéale d’un composé pharmacologique (l’injection sera rapidement réalisée en quelques secondes) permet de réduire le degré de sévérité du phénotype épileptique chez nos souris induit par une unique injection intrapéritonéale d’un composé épileptogène (l’injection sera également réalisée rapidement en quelques secondes). Le but sera d’évaluer le degré de sévérité de la crise chez ces souris durant 2 heures maximum post injection.

Impact sur les animaux

Durant la phase d’habituation, les souris seront isolées pendant 10 minutes sur 3 jours consécutifs induisant potentiellement un léger stress. L’acte d’injection peut potentiellement induire de la douleur et des signes démangeaisons et de gonflements. Durant la phase de test, les souris seront isolées pendant 2 heures maximum induisant potentiellement un stress. Par ailleurs, l’induction pharmacologique de l’épilepsie nécessaire à la réalisation de notre projet de recherche, sera dommageable pour l’animal car induisant potentiellement de la douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort immédiatement à la fin de la procédure afin de limiter la détresse des animaux.

Remplacement

Nous avons préalablement mené des expériences in vitro afin de caractériser l’effet de la mutation sur le canal. En exprimant le canal muté dans une lignée cellulaire et en enregistrant son courant, nous avons observé un fort effet délétère de la mutation sur la fonctionnalité du canal. Ce résultat a justifié une étude de l’effet de cette mutation dans un contexte plus physiologique ; pour ce faire, nous avons réalisé des cultures primaires de neurones de souris sauvages et porteuses de la mutation sur le canal. Une analyse des propriétés électriques de ces neurones nous a permis de montrer une hyperexcitabilité neuronale causée par la mutation justifiant la mise en place d’expérience de comportement in vivo. Bien que ces résultats tendent à confirmer notre hypothèse, à savoir que la mutation du canal induit le phénotype épileptique observé chez le patient, ils ne sont pas suffisants pour la confirmer formellement et une étude sur l’animal est requise. En effet, le phénotype épileptique fait notamment intervenir différents organes tels que le cerveau, les muscles etc justifiant le besoin d’un système intégré tel que l’animal vivant pour mieux l’appréhender. Une étude sur l’animal est donc essentielle et ne peut être remplacée à ce niveau.

Réduction

Le nombre d’animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l’obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel de statistiques GPower). Il sera réduit autant que possible et toute expérience rendue inutile par des résultats précédemment obtenus ne sera pas réalisée. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique approprié afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Nos estimations suggèrent que des lots de 10 souris par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 16 souris par groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests et dont l’intensité lumineuse modulable permet la réduction du stress des souris. Ainsi, nous mettrons en place 3 jours d’habituation en amont des tests (10 minutes par jour). Un enregistrement vidéo sera réalisé pour chaque souris en procédure nous permettant notamment de garder une trace du phénotype et d’effectuer d’autres analyses au besoin sans avoir à répéter l’expérience dans un objectif de réduction et de raffinement. Les animaux seront hébergés avec un environnement enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Par ailleurs, au cours de l’expérience d’induction de la crise d’épilepsie, nous avons défini des points limites que nous veillerons à respecter scrupuleusement dans le but de limiter au maximum les nuisances potentielles liées à l’épilepsie.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les souris mutantes correspondent au modèle murin de la mutation trouvée chez les patients épileptiques. Les souris invalidées pour les gènes codant pour les deux autres canaux potassiques ont été choisies car nos résultats préliminaires suggèrent que la mutation sur le canal d’intérêt altère le fonctionnement de ces deux autres canaux et que ceux-ci participent au développement du phénotype épileptique (nous nous attendons à un phénotype épileptique plus sévère comparé aux souris sauvages) notamment car il a déjà été montré que l’invalidation génétique de ces canaux rendent les souris plus sensibles à l’injection du composé épileptogène, avec un phénotype plus sévère. Des animaux âgés de 2 à 4 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l’impact de la mutation portée par le canal TRESK en nous affranchissant de biais potentiels liés au développement et au vieillissement.