Procédures sévères

Soumises à une lésion chirurgicale du nerf sciatique de 45 minutes sous anesthésie, 912 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs nerfs sciatiques. 304 d'entre elles sont d'abord prélevées vers six jours pour génotypage, et toutes passent ensuite des tests de démarche, de récupération motrice et de récupération sensitive de dix minutes chacun. L'objectif déclaré est de confirmer le rôle de l'activateur tissulaire du plasminogène dans la remyélinisation du nerf après lésion. Le porteur classe le projet en souffrance sévère et décrit un simple affaiblissement de la patte arrière gauche qui disparaît en quelques jours, tout en indiquant que le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse selon "l'aisance des expérimentateurs".

Objectifs

Des études préliminaires ont montré que l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) était une molécule impliquée dans les processus de myélinisation, c'est à dire la formation de la gaine de myéline entourant les neurones du système nerveux central. De plus, des études de la littérature ont mis en évidence une implication de cette molécule (tPA) dans la myélinisation périphérique puisqu'elle est exprimée dans les cellules responsables de la myélinisation (cellules de Schwann) et qu'elle joue un rôle dans la récupération fonctionnelle (motrice et sensitive) après lésion du nerf sciatique chez la souris. Ainsi, le tPA est impliqué dans les processus de myélinisation centraux et périphériques, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. C'est pourquoi l'objectif de ce projet est d'étudier l'implication du tPA dans les processus de myélinisation induite après lésion du nerf sciatique chez la souris, ainsi que d'étudier le rôle et les mécanismes impliquant le tPA exprimé par les cellules de Schwann en contexte de remyélinisation.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra alors de confirmer l'implication du tPA en contexte de remyélinisation dans le système nerveux périphérique et de pouvoir définir les mécanismes l'impliquant dans cette remyélinisation en contexte de lésion du nerf sciatique.

Procédures

Tous les animaux à génotyper seront prélevés (vers 6 jours) pour génotypage (n=304) et peuvent présenter une légère douleur de courte durée. Chaque animal fera l'objet d’une lésion du nerf sciatique (n=912, durée de la procédure : 45min) grâce à une chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à des tests fonctionnels qui permettront l'évaluation de la démarche, l'évaluation de la récupération motrice et l'évaluation de la récupération sensitive (n=912, durée de chaque test : 10min). Tous les animaux (n=912) seront mis à mort à l'issue du projet afin de récupérer et étudier les nerfs sciatiques.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement de la patte arrière gauche (correspondant à la zone du nerf sciatique lésée) qui disparaît dans les premiers jours/semaines après lésion du nerf sciatique. Certains animaux peuvent présenter des signes d'inconfort ou de légère douleur (courte durée) au moment des tests permettant l'évaluation de la démarche, de la récupération motrice et de la récupération sensitive.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, ce qui permettra de prélever leurs nerfs sciatiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l'étude de l'expression des protéines dans le nerf sciatique, l'étude de l'ultrastructure des cellules myélinisantes ainsi que la récupération fonctionnelle sont des paramètres qui ne peuvent être étudiés via l'utilisation de méthodes alternatives.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux, déterminé par l'utilisation d'outils statistiques, afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Des points limites seront mis en place afin de réduire ou arrêter toute souffrance occasionnée chez l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l'espèces animale la plus étudiée dans le cas des modèles de lésion du nerf sciatique. Les techniques employées concernant ce modèle animal sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait de ce modèle utilisé dans ce projet une approche expérimentale fiable. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend ces espèces particulièrement intéressantes pour cette étude. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 10 semaines concernant la cohorte corerspondant aux "jeunes adultes" et entre 26 et 30 semaines concernant la cohorte correspondant aux "adultes âgés". L'étude sera réalisé chez le "jeune adulte" et chez "l'adulte âgé" afin de pouvoir comparer la différence de récupération fonctionnelle ainsi que les paramètres histologiques pouvant potentiellement différer entre ces deux stades de développement chez la souris. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles de lésion du nerf sciatique.

Ligaturées définitivement au niveau de l'artère coronaire descendante gauche pour provoquer un infarctus, 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles subissent ensuite des prélèvements de sang à la veine mandibulaire, des échocardiographies, une IRM de 40 minutes, une lymphangiographie et une analyse hémodynamique terminale. Le porteur annonce des douleurs dans la phase aiguë, une insuffisance cardiaque vers trois mois et un œdème pulmonaire transitoire chez 10 à 20 % des animaux, et note que la buprénorphine soulage la douleur sans rendre l'appétit. Il indique limiter à 30 % la mortalité liée au modèle, et annonce des injections de traitements sur animal vigile sans préciser lesquels.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque (IC) est une maladie sévère touchant en Europe environ 15 millions de patients et dont les traitements actuels demeurent insuffisants. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle des cellules immunitaires et des vaisseaux lymphatiques pendant l’inflammation cardiaque aigue ou chronique après un infarctus du myocarde (IDM) afin d’identifier de nouveaux traitements pour prévenir ou traiter l’IC. D’une part, nous avons montré que la lymphangiogenèse pourrait constituer une option thérapeutique après un IDM. D’autre part, l’inflammation cardiaque étant prépondérante dans cette pathologie, il est intéressant d’étudier les molécules de co-signalisation, véritable moyen de communication entre les cellules immunitaires, afin de moduler la réponse immunitaire et donc la symptomatologie. En caractérisant la communication entre les cellules immunitaires infiltrant le cœur et les vaisseaux lymphatiques dans ce modèle, nous souhaitons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de limiter l’inflammation et la dysfonction cardiaques. Ce modèle va permettre d’améliorer notre compréhension de la réponse immunitaire cardiaque lors de maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde et les traitements de l’insuffisance cardiaque (IC) aigue ou chronique suite à un IDM demeurent insuffisants. Par conséquent, notre étude adresse cette catégorie de patient. Nous espérons dans nos études expérimentales identifier des nouveaux traitements afin de limiter la dysfonction cardiaque et lymphatique permettant ainsi, à terme, d’améliorer la qualité de vie de patients. De plus, l’immuno-modulation étant un domaine en plein essor, nous espérons que cette étude nous permettra de guider des essais cliniques, dans le futur, chez les patients atteint d’IC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale invasive avec une ligature définitive de la coronaire descente gauche afin de provoquer un infarctus du myocarde (IDM) (durée de la procédure 30 min). Les animaux subiront ensuite pendant les semaines post-IDM, des prélèvements de sang à la veine mandibulaire sous anesthésie associé à une analyse par échocardiographie (durée 10 minutes). De plus certains groupes seront confrontés à des injections vigiles en i.p (26G) ou i.m (30G) afin d'administrer des traitements qui, nous l’espérons, pourraient améliorer leur fonction cardiaque post-IDM. Leur fonction cardiaque sera évaluée également par IRM (durée 40 minutes) et par lymphangiographie (durée moins de 20 min) en fin d’étude, ou encore par analyse hémodynamique terminale (durée moins de 10 minutes). Tous ces évaluations seront réalisées sous couverture anesthétique et analgésique adéquates.

Impact sur les animaux

Dans la phase aigüe post-IDM, il est probable que les animaux aient des douleurs liées au geste chirurgicale, ce qui se traduiront dans une perte d'appétit. Nos stratégies de couverture analgésique, avec de la buprénorphine, soulagera la douleur mais n’augmente pas l'appétit. Généralement, sous 24h après l'opération, 80-90% des animaux récupérer. Un autre point de souffrance pendant l’étude pourrait être une infection sur les points de sutures. Finalement, en fin du protocole, vers 3 mois post-IDM, nous nous attendons au développement d’une IC à fraction d’éjection réduite. Nous espérons que nos traitements permettront de limiter le développement de la dysfonction cardiaque. Il est possible qu’à ce stade, chez 10-20% des individus, un œdème pulmonaire transitoire (maladie) peut apparaitre. Ceci pourrait influencer la respiration des souris (rythme de respiration accéléré, peu d’activité de locomotion). Ceci est liée au développement de l’insuffisance cardiaque, la pathologie que nous étudions avec ce modèle.

Devenir

L’ensemble des animaux sont mis à mort pour les différentes procédures expérimentales afind 'avoir des données utilisables .

Remplacement

Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous mettrons en place certaines expériences par des études in vitro (prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle d’infarctus du myocarde in vitro

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis des mesures invasives (hémodynamique et lymphangiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex-vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris . En effet, nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 étaient nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. C'est pourquoi dans ce projet nous utiliserons 490 souris qui à etait determiné par des mesures statistique. Par ailleurs, un meilleur suivi post-opératoire permet également de limiter le nombre d'animaux par groupe dans le modèle IDM limitant le taux de mortalité à 30%.

Raffinement

Les souris seront suivies quotidiennement la première semaine post-chirurgie. Une couverture analgésique, sous forme de morphinique par injection et dans l’eau de boisson, sera proposée avant, pendant et après la chirugie avec une évaluation individuelle quotidienne de la douleur basée sur la grimace scale de Langford et sur un tableau permettant une évaluation du bien-être animal. Couplé à un suivi de poids, cela permettra de statuer sur l’atteinte d’un point limite. Pour des scores entre 5 et 9, des granulés humidifiés et de la nourriture gélifiée seront ajoutés dans les cages et l’état de santé global des animaux sera observé (e.g. apathie, état de refroidissement, lésions de la peau et du pelage, respiration, comportement social, etc..). Sans évolution, une hydratation (solution saline en i.p, 26G) sera proposée ainsi qu’une évaluation de la couverture antalgique et si besoin une adaptation du traitement. Tout animal dont le score dépasse 19 sera considéré comme au point limite et sera mis à mort. Afin de limiter le risque de déshydratation et de dénutrition en postopératoire, des gels nutritifs de support seront proposés sur le sol de chaque cage pendant 48h post-IDM. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec les modèles de cardiomyopathies chez celle-ci. La souris à également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, comme certains anticorps monoclonaux qui sont parfois inaccessibles chez le rat. De plus, dans notre laboratoire, nous avons depuis de nombreuses années une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous allons inclure uniquement des souris adultes de 20-24g pour ces études. La taille des souris à cet âge (de 8 à 12 semaines) permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l’induction du modèle

Faire développer une leucémie aiguë lymphoblastique à des souris pour observer des étapes pré-leucémiques inaccessibles chez l'être humain : 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Les souris mutantes développent la leucémie vers 10 ou 11 semaines et en meurent à 20 semaines, avec perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité. Une partie est tuée dès 10 ou 11 semaines, une autre est maintenue en vie au-delà pour une étude de survie, sous analgésiques. D'autres souris dépourvues de système immunitaire reçoivent une xénogreffe de cellules leucémiques humaines par injection rétro-orbitaire, et le porteur ramène ses groupes à six animaux pour répondre aux "exigences des tests statistiques nécessaires pour pouvoir soumettre à publication dans des journaux internationaux réputés".

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération anormale et incontrôlée de cellules immatures à l’origine des lymphocytes T. Malgré l’amélioration de la prise en charge de ces leucémies, le pronostic de ces patients reste péjoratif avec environ 30% de rechute dans les deux ans suivant le diagnostic. Un des défis dans ce domaine est donc d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients et cela passe notamment par une recherche fondamentale qui vise à mieux définir les circuits moléculaires à l’origine de ce développement cancéreux. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’oncogénèse des leucémies aiguës lymphoblastiques T chez la souris en identifiant les réseaux activateurs de tumeur. Pour cela nous utiliserons des souris génétiquement modifiées au niveau d’un gène suppresseur de tumeur, qui est inactivé dans ~20% des leucémies aiguës lymphoblastiques T humaines et évaluerons le rôle d’un facteur de transcription identifié comme étant le régulateur majeur du métabolisme des lymphocytes T agissant sur la même voie de signalisation que ce gène suppresseur de tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de suivre les mécanismes responsables de la transformation d'une cellule sanguine normale en cellule leucémique. Nous pourrons analyser des souris aux étapes pré-leucémiques (absence de signe clinique), ces étapes sont impossibles à étudier chez l’homme. Le modèle murin de LAL-T permettra d’évaluer la fonction de Foxk1 dans ce type de leucémie et identifier dans quelle mesure ce facteur de transcription pourrait être une cible pour le développement de nouvelles thérapies.

Procédures

Les premiers modèles utilisés consistent en des souris déficientes soit uniquement pour un gène suppresseur de tumeur soit pour le gène suppresseur de tumeur et le facteur de transcription d’intérêt dans les lymphocytes T. Ces modèles générés par croisement à phénotype dommageable sont viables mais développent une leucémie aigüe lymphoblastique environ 10-11 semaines après leur naissance dont elles succombent à 20 semaines. Nous nous attendons dans ce modèle double mutant à un phénotype atténué par rapport à la lignée simple mutant et à un ralentissement voire une absence du développement de la leucémie aigüe lymphoblastique et une amélioration de la survie des souris ainsi générées. Le développement de la leucémie pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. Un deuxième modèle consistera en une xénogreffe de cellules humaines leucémiques dans des souris dépourvues de système immunitaire réalisée par injection unique par voie rétro-orbitaire réalisée sous anesthésie gazeuse ne générant pas de stress supplémentaire et de courte durée (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Le développement de la leucémie pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse ne générant aucun stress. Les injections sont des piqures qui entrainent une douleur légère.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, le suivie de la leucémie nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.

Remplacement

L’étude de processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte leucémie ne peut être réalisée à ce jour qu’à l’aide de modèles in vivo. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est indispensable.

Réduction

Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits le plus possible. Nous travaillerons avec des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de réduire la taille des groupes expérimentaux à 6 souris, tout en répondant aux exigences des tests statistiques nécessaires pour pouvoir soumettre à publication dans des journaux internationaux réputés. Nous répéterons chaque expérience de façon indépendante 3 fois.

Raffinement

Les souris mutantes uniquement pour le gène suppresseur de tumeur à phénotype dommageable sont viables mais développent une leucémie aiguë lymphoblastique environ 10 à 11 semaines après leur naissance dont elles succombent à 20 semaines. Elles seront mises à mort dans la plupart des cas dès 10 à 11 semaines pendant les phases précoces de la leucémie sans atteinte particulière. Pour une petite portion d’entre elles impliquées dans une étude de survie, nous traiterons ces animaux avec des analgésiques dès l’âge de 10 semaines pour atténuer les douleurs, et souffrances éventuelles dues au développement de la maladie. Les souris double mutantes pour le gène suppresseur de tumeur et le facteur de transcription d’intérêt dans les lymphocytes T devraient présenter un phénotype atténué par rapport à la lignée simple mutant et à un ralentissement voire une absence du développement de la leucémie aiguë lymphoblastique et une amélioration de la survie de ces souris. Elles seront néanmoins lorsqu’elles seront impliquées dans l’étude de survie (au-delà de 10 semaines) traitées avec des analgésiques dès l’apparition de signes éventuels de souffrance.

Choix des espèces

Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de différentes populations de lymphocytes en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées Dans les modèles de souris doublement déficitaire pour les gènes impliqués dans la leucémie, nous utiliserons des souris entre 4 et 20 semaines. Notre but est d’analyser des souris à différents stades de la transformation d’une cellule sanguine en une cellule leucémique (de pré-leucémique à leucémique). Les souris génétiquement modifiées et injectées seront adultes (8-12 semaines).

Rendus diabétiques par une administration de streptozotocine, 1 080 rats subissent une hyperglycémie persistante qui peut provoquer maigreur, déshydratation, polyurie, dos voûté, yeux mi-clos, cataracte et cicatrisation difficile. Ces procédures relèvent toutes d'un niveau de souffrance sévère, sur 24 semaines, avec jusqu'à trois traitements par jour, des prélèvements sanguins quotidiens et jusqu'à 56 tests comportementaux par animal. Le porteur écrit pourtant que "le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible", et qu'une éventuelle modification des doses se décidera "en accord avec notre client". Tous les rats sont tués à la fin, une partie pour prélèvements, l'autre parce qu'elle ne peut être ni replacée ni réutilisée après avoir reçu des substances aux effets inconnus à long terme.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique caractérisée par une hyperglycémie (taux élevé de glucose dans le sang) due à une production insuffisante d'insuline par le pancréas ou à une mauvaise utilisation de l'insuline par l'organisme. Elle se manifeste souvent par une dysfonction sensorimotrice périphérique (altérations de la sensibilité sensorielle dans les membres affectés) et des problèmes cognitifs et/ou des troubles d’anxiété liés à la neuropathie centrale. Dans le modèle que nous allons mettre en œuvre, les rats développent une hyperglycémie persistante ce qui permet d'étudier les effets de l'hyperglycémie chronique et d'explorer des interventions thérapeutiques. Ainsi dans ce projet, le modèle sera utilisé pour tester l’effet de composés en cours de développement sur plusieurs facettes de la neuropathie diabétique telle que la neuropathie périphérique, l’anxiété et le dysfonctionnement cognitif.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter le diabète. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.

Procédures

Les animaux de ce projet seront amenés à subir une induction d’hyperglycémie. Sur les 24 semaines de la procédure, les animaux auront un maximum de 3 traitements par jour. Ce nombre de traitement se rapproche des prises quotidiennes chez l’Homme, notamment lorsque les médicaments ne sont pas disponibles sous forme à libération prolongée ou dans le cas de la prise de plusieurs types de médicaments. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins journaliers (ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) afin de pouvoir suivre la glycémie et d’autres paramètres plasmatiques. En parallèle les animaux effectueront un maximum de 56 tests de comportements dont le test d’EMG qui est réalisé sous anesthésie alors que les autres le sont sur des animaux vigiles. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée ce temps comprenant systématique une compression finale afin de contrôler l’hémostase.

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. L’hyperglycémie induite peut entrainer les symptômes suivants ; une augmentation de la prise de boisson et de nourriture, une polyurie et des selles plus abondantes d’aspect altéré (molle, couleur claire, …), une maigreur et des signes de déshydratation, une diminution du toilettage, une posture avec un dos vouté et des yeux mi-clos, le développement d’un voile oculaire blanc pouvant aller jusqu’à la cataracte, un abdomen distendu et une cicatrisation difficile.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des effets d’une hyperglycémie nécessite une observation globale, uniquement possible chez l’animal vivant. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Après analyse de puissance statistique, nous envisageons d’utiliser 12 animaux par groupe. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 15 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement du milieu : un tunnel pour leur permettre de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Des que cela est possible, les prélèvements ou les administrations sont effectués sous anesthésie générale de l’animal. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. En raison de la polyurie, à partir d’une semaine après l’induction le change est effectué quotidiennement. De plus, nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si le traitement par le composé à tester induit des souffrances, nous envisagerons, en accord avec notre client, la modification des doses ou l’arrêt du traitement. Si aucune solution n’est possible, l’animal sera euthanasié. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Le diabète pouvant apparaitre à tout âge mais se développant souvent dès l'enfance ou l'adolescence, nous utiliserons des rats de 6-7 semaines lors de l’induction.

90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune suivie vingt et un jours après une injection sous-cutanée unique de bactéries dont on ignore si elles rendent malade. Elles sont observées toutes les quatre heures le premier jour, puis chaque jour. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'elles ne sont plus naïves immunologiquement et pourraient porter l'agent pathogène. Le bénéfice annoncé est de "préciser les conditions de manipulation" de cette souche au laboratoire, alors que le RNT reconnaît qu'en cas de virulence la mort peut survenir en quelques heures et qu'"aucun point limite ne peut donc être défini".

Objectifs

Les bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato rassemblent de nombreuses souches appartenant à des espèces de mieux en mieux caractérisées - 24 espèces actuellement. Dans ce groupe la dénomination ne renseigne pas sur la pathogénicité d’une souche. Les facteurs de virulence sont souvent portés par des plasmides. Chez l’humain, les souches les plus virulentes possèdent des caractéristiques génétiques proches d’une bactérie pathogène, Bacillus anthracis. Plusieurs projets menés ont permis de séquencer et analyser les génomes d’environ 200 souches de Bacillus cereus sensu lato Parmi ces génomes séquencés, celui de la souche B93 ou CRBIP3.5817 a retenu notre attention. La souche est positionnée comme une souche a priori non-virulente. Cependant, il n’est pas connu si par des mécanismes encore inconnus, cette souche pouvait produire des molécules lui conférant une virulence supérieure à la souche, ne correspondant pas au niveau habituel de l’espèce. Ce projet permettra de préciser les conditions de manipulation de cette souche.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont de préciser les conditions de manipulation de la souche B. cereus B93 et, en cas d'expression d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate, les mécanismes encore inconnus mis en oeuvre. Dans le cas où un certain degré de virulence serait observé, les conditions de manipulation seraient réévaluées et les facteurs bactériens en cause seront étudiés, faisant alors l'objet d'un nouveau projet scientifique spécifique.

Procédures

- Injection sous-cutanée (quelques secondes par animal) unique de bactéries, dont la capacité à causer une maladie n’est pas encore connue. Le suivi est de 21 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances seront : - Injection des bactéries (une fois par animal, par voie sous-cutanée ventrale peu douloureuse). - Les données actuelles sur cette souche de B. cereus permettent d'envisager l'absence de virulence, donc de maladie. - En cas de virulence détectable, les symptômes pourront aller jusqu’à ceux de la maladie du charbon, c’est-à-dire que la mort des animaux survient de façon foudroyante, quelques heures au maximum après l'apparition de signes cliniques (prostration); aucun point limite ne peut donc être défini, seule la mise à mort des animaux présentant des signes cliniques lors de l'observation est retenue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne seront plus naïfs immunologiquement, et présenteraient un risque de porter l’agent pathogène et ne peuvent donc être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Afin de satisfaire aux exigences de Remplacement, Réduction, Raffinement, nous avons mené des tests préliminaires in vitro, mais seuls les tests in vivo permettront de confirmer l'absence ou la présence d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate et d’apprécier son impact éventuel sur l'innocuité de la souche. Le projet porte sur des interactions entre l'hôte et une bactérie, et ne peut pas être remplacé par d’autres méthodes. Par exemple, l'expression d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate ne peut être évaluée que dans les conditions très complexes du milieu intérieur de l’hôte (composition complexe, compartiments, etc.) où la bactérie est confrontée à des conditions réelles complexes et encore non maîtrisées in vitro dans l’hôte. Les tests préliminaires in vitro ont évoqué une présence possible de capsule pseudoprotéique de polyglutamate à la surface des bactéries. Les facteurs de régulation connus pour la synthèse d'une telle capsule ne sont cependant pas présents dans la souche étudiée, les stimuli à l’origine de cette expression sont encore inconnus. Le milieu intérieur de la souris est complexe, avec l'existence de nombreux paramètres physiologiques pouvant induire l'expression de facteurs bactériens. S'il existe de telles conditions, leur caractérisation lors d’une suite au présent projet permettra de reproduire ces conditions in vivo dans des modèles in vitro, permettant de s'affranchir à terme des animaux.

Réduction

Le projet a été élaboré dans le souci de réduire le nombre de souris nécessaires à l’expérimentation à une valeur minimale et de valoriser chaque animal. Avec le raffinement des méthodes d’analyse, le nombre d’animaux a été défini et donc réduit au minimum nécessaire par usage des statistiques et l’usage d’une approche progressive d’évaluation afin d’exclure rapidement les tests inutiles. Le nombre d’animaux indiqué dans ce projet ponctuel résulte de l'expertise acquise dans le domaine de la virulence des bactéries étudiées pour l'évaluation de la virulence d'une souche. Il est réduit au minimum tout en permettant d'obtenir des données significatives quant au niveau de virulence de la souche. Dans la mesure du possible les animaux générés en trop par l’animalerie d’élevage de l’institution seront utilisés. L'optimisation des procédures et protocoles sera effectuée au cas où une certaine virulence serait observée initialement afin de coller au plus près à la réalité expérimentale et diminuer in fine le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux objectifs.

Raffinement

Durant les expériences, un suivi strict des animaux sera opéré tout au long de l’expérience via une observation régulière (aux 4 heures le premier jour puis chaque jour) pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précède généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales, comportement prostré. Les animaux présentant un état pathologique (identifié via une grille de score) seront mis à mort. Dès l’apparition des signes cliniques, des actions seront mises en place pour limiter la souffrance et la déshydratation : mise à disposition de nourriture en gel hydrique, réhydratation sous-cutanée.

Choix des espèces

Les souris sont très sensibles à l’infection par le pathogène étudié. Les souris sont utilisées à l'âge de 7-14 semaines afin d’être représentatives de l’espèce à l’âge adulte et par souci d’utiliser des animaux comparables tout au long du projet. Les infections étudiées ne dépendent pas de l’âge. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.

Tatouées une fois, imagées trois fois sous anesthésie, isolées douze fois en cage individuelle pour la récolte des fèces, 17 600 souris développent des cancers du poumon ou du côlon provoqués par des produits chimiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Certaines subissent en plus des micro-biopsies du côlon à la pince flexible, à six jours d'intervalle. Les signes attendus vont de la perte de poids aux lésions cutanées, à la diarrhée sanglante et au prolapsus en phase terminale. Toutes sont tuées par dislocation cervicale sous anesthésie, après un prélèvement de sang par voie intracardiaque, pour récupérer poumon, foie, rein, ganglions et peau.

Objectifs

Le projet regroupe différentes stratégies dont l'objectif d’évaluer des solutions thérapeutiques innovantes dans modèles murins de cancers chimiquement induits. D’après un nombre croissant d'études publiées, le cancer induit par des produits chimiques chez les animaux est le meilleur modèle pour comprendre l'étiologie et la cancérogenèse du cancer, car il reproduit fidèlement l'exposition chronique à des cancérogènes environnementaux. Les modèles décrits permettent un développement tumoral lent, correspondant à la progression des tumeurs humaines, et sont donc pertinents pour étudier l'impact des nouvelles thérapies à tous les stades de développement de la tumeur. De plus, ils présentent des caractéristiques histologiques, pathologiques et moléculaires similaires aux tumeurs humaines. En outre, les modèles induits chimiquement sont reproductibles expérimentalement et se fondent sur l'utilisation des souris immunocompétentes, ce qui permet également d'évaluer l'effet du système immunitaire sur l'efficacité des nouveaux médicaments testés. L’objectif de ce projet est de pouvoir tester à la fois des des thérapies prophylactiques qui peuvent empêcher ou retarder l’apparition de tumeurs mais également des thérapies pouvant bloquer l'évolution de tumeurs d'une phase précoce à une phase avancée (terminale, plus agressive et difficile à traiter).

Bénéfices attendus

Le projet fournira des informations aux agences réglementaires pour les aider à décider de la mise sur le marché d'un médicament chez l'homme ou chez l'animal. Le projet contribuera à la mise sur le marché de médicaments sûrs et protégés chez l'homme et l'animal pour des maladies dont les besoins thérapeutiques ne sont pas encore satisfaits.

Procédures

Procédure 1 : Modèle de carcinome épidermoïde pulmonaire chimiquement induit chez la souris Le prélèvement de différents organes (poumon, foie, rein, ganglions lymphatiques, peau) pour les études ex vivo sera effectué à la fin de l'étude : lorsque les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale après avoir été anesthésiés à l'isoflurane. Au cours de l'étude, des échantillons de sang peuvent être prélevés par microprélèvement au niveau de la queue sur des animaux vigile et dans la phase terminale de l'étude pour injection intracardiaque sur des animaux anesthésiés à l'isofluorane. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélévé sur une semaine qui doit être infèrieure à 20% du volume de sang total. Procédure 2 : Evaluation de nouvelles thérapies sur le modèle cancer colorectal associé à la colite induite par le Azoxymethane (AOM) et Dextran Sulfate Sodium (DSS) chez la souris. Le tatouage est réalisé une seule fois dans l’étude et dure un maximum de 10 secondes. L’imagerie est réalisée 3 fois et dure 15 minutes maximum sous anesthésie. La mise en cage individuelle pour la récolte des fécès est réalisée 12 fois sur toute l’étude pour une durée de 30 minutes maximum par jour. Du microsampling à la veine de la queue est réalisée en fin d’étude sur plusieurs time point, le volume maximum prélevé correspond à 20% du volume total sanguin estimé de l’animal. Les organes sont prélevés en fin d’études sur des animaux préalablement anesthésiés puis euthanasiés. Des micro biopsies (maximum 2 micro biopsies par prélèvement sur le colon qui seront réalisés avec un espacement de 6 jours) pourront être réalisées à l'aide d'une pince flexible (diamètre de 3 Fr.). La durée de l'examen ne durera pas plus de 15 minutes par animal. Le prélèvement de différents organes (poumon, foie, rein, ganglions lymphatiques, peau) pour les études ex vivo sera effectué à la fin de l'étude : lorsque les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale après avoir été anesthésiés à l'isoflurane. Au cours de l'étude, des échantillons de sang peuvent être prélevés par microprélèvement au niveau de la queue . sur des animaux vigile et dans la phase terminale de l'étude pour injection intracardiaque sur des animaux anesthésiés à l'isofluorane. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélévé sur une semaine qui doit être infèrieure à 20% du volume de sang total.

Impact sur les animaux

Après un traitement au NTCU, les souris peuvent présenter une perte de poids, des lésions cutanées, une déficience respiratoire. Après le traitement par l'AOM-DSS, les souris peuvent présenter une perte de poids, une diarrhée, du sang dans les fèces, un prolapsus (dans la phase terminale de l'étude). Ces signes cliniques seront surveillés quotidiennement et, à l'aide d'une fiche de suivi de scores de signes cliniques délétères, il sera décidé si l'animal est suspendu du traitement, si de la nourriture molle sera ajoutée à la cage pour faciliter l'alimentation, ou s'il est euthanasié et retiré de l'étude prématurément.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude car des prélèvements terminaux d'organes sont nécessaires pour réaliser les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Les composés testés auront été sélectionnés en amont par des tests in vitro, in silico ou par modélisation sans recours à l’animal afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les systèmes biologiques mis en œuvre, qui aboutissent au développement de tumeurs, sont des systèmes complexes et ne peuvent pas être remplacés par des méthodes in vitro ou in silico.

Réduction

La sélection de composés d’intérêt pendant la phase in vitro permet de réduire le nombre d’études in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. De plus, des études statistiques, sont menées afin d’optimiser et de réduire le nombre d’animal dans chaque groupe. Enfin, avant de commencer les études sur les deux modèles décrits, une phase de mise en place des deux modèles est prévue pour déterminer les conditions expérimentales optimales et évaluer la possibilité de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans les études futures.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d’enrichissement, dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé et compétent. Des critères d’arrêt anticipé spécifiques pour les animaux porteurs de tumeurs sont mis en place dans les études pour limiter la souffrance des animaux. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress (imagerie, biopsie) se feront sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

Le recours à des animaux est justifié par le besoin de disposer de données pertinentes tant sur la compréhension de l’étiologie et des mécanismes physiopathologiques lors de l’apparition et du développement de certains cancers que sur la mise au point de solutions thérapeutiques innovantes. Selon un nombre croissant d'études, le cancer induit par des produits chimiques chez les animaux est le meilleur modèle pour comprendre l'étiologie et la cancérogenèse du cancer, car il reproduit fidèlement l'exposition chronique à des cancérogènes environnementaux. Les souris seront adultes ou adultes matures. Le stade adulte ou adulte mature est celui où la majorité des pathologies cancéreuses se développent.

1 600 souris mâles vont être utilisées, chacune traversant jusqu'à trente jours de protocole entre une chirurgie cérébrale d'une heure, des passages en IRM sous anesthésie et des injections répétées. Toutes le sont dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées, tissus prélevés. Le protocole inclut aussi des laparo-thoracotomies pour lesquelles le porteur indique qu'un morphinique fort est préconisé par le vétérinaire de l'établissement. L'objet est de déterminer la dose efficace d'un anticorps humanisé dans des modèles d'AVC, de sclérose en plaques et de traumatisme crânien, le développement d'un traitement transposable à l'être humain restant annoncé au conditionnel et "à terme".

Objectifs

L’objectif de cette étude est de déterminer la dose efficace d’un anticorps humanisé (LYS241) bloquant l'interaction de l'activateur tissulaire du plasminogène avec les récepteurs N-Methyl-D-Aspartate (NMDAR) dans des modèles de pathologies neurologiques incluant l’accident vasculaire cérébral, la sclérose en plaques et le traumatisme crânien. Ce projet permettra également de comparer cet anticorps avec des molécules approuvées en clinique dans les différentes pathologies étudiées dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer la dose efficace d'un anticorps monoclonal humanisé dans différentes pathologies du système nerveux central. Ce projet vise également à développer, à terme, un nouvel agent thérapeutique transposable à l'homme.

Procédures

A J0, 150 animaux subiront pendant 1h une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. . A J+1, 150 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l'IRM pendant 15 minutes. A J+5, 50 animaux subiront une anesthésie générale de 30 minutes pour passer à l'IRM et recevront une injection intraveineuse. A J+30, 150 animaux recevront une injection sous-cutanée et seront euthanasiés sous anesthésie générale. A J0, 180 animaux subiront pendant 1h une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v.. A J+1, 180 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l'IRM pendant 15 minutes. A J+5, 60 animaux subiront une anesthésie générale de 30 minutes pour passer à l'IRM et recevront une injection intraveineuse. A J+30, 180 animaux recevront une injection sous-cutanée et seront euthanasiés sous anesthésie générale. A J0, 80 animaux subiront pendant 30 minutes une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. A J+1, 80 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l'IRM pendant 15 minutes puis une injection sous-cutanée avant euthanasie sous anesthésie générale. A J-1, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront 4 injections sous-cutanées. A J0, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront un injection intrapéritonéale. A J+2, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront un injection intrapéritonéale. A J+3, J+10 et J+17, 100 animaux recevront une injection intrapéritonéale. A J+25, 100 animaux recevront une injection sous-cutanée avant euthanasie sous anesthésie générale. A J0, 100 animaux subiront une chirurgie cérébrale pendant 20 minutes sous anesthésie générale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. A J+1, 100 animaux subiront une anesthésie générale pendant 15 minutes pour passer à l'IRM. A J+21, 100 animaux recevront une injection sous-cutanée puis sous anesthésie générale seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirables sont à prévoir sur les animaux. Toutes les douleurs liées à des lésions de la peau des animaux (comme l’insertion d’une aiguille par exemple) seront empêchées par l’utilisation de la lidocaïne en spray ou en crème 5min avant le geste. Ces douleurs seront temporaires et se résorbent sous 48h. Pour les procédures pour lesquelles la douleur est plus importante, nous utiliserons un morphinique en injection sous-cutanée. Enfin, pour les procédures où la chirurgie est estimée la plus sévère, comme la laparo-thoracotomie, sur conseil du vétérinaire affilié à notre laboratoire, un morphinique fort est préconisé. Un morphinique pourrait être utilisé en intra-péritonéal. Le choix se porte sur ce morphinique car il agit en 3-5 minutes et est effectif sur une durée de 20-25 minutes chez la souris, temps suffisant pour effectuer la mise à mort par perfusion intra-cardiaque. Les procédures relatives aux évaluations comportementales ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation.

Devenir

Le sort prévu de tous les animaux de toutes les procédures de cette demande d'autorisation de projet est la mise à mort et tissus récupérés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'informations. Nous avons sélectionné les modèles présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En amont de l'expérimentation animale, des méthodes alternatives in vitro existantes répondant au mécanisme d'action de la molécule d'étude ont déjà été employées, nous permettant de justifier le passage de l'in vitro à l'in vivo.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Conformément à la règle des 3Rs, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, selon nos précédents travaux publiés et la littérature. De plus, n’ayant pas d’intérêt pour une étude de l’impact du sexe des animaux dans le contexte proposé et afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, uniquement des souris du sexe mâle seront utilisés. 1600 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, comprenant la réalisation de tests comportementaux et d’outils d’imagerie permettant d'évaluer la récupération fonctionnelle et anatomique in vivo du système nerveux central des animaux. Tous les animaux seront sujets à ces explorations complètes dans le but de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Bien que chaque animal sera surveillé de près, pendant et après les procédures, peut arriver d’observer une mortalité non attendue ou une l’exclusion d’animaux pour diverses raisons, telles qu’un problème à l’exposition aux agents anesthésiques, une perte de poids trop importante et manque d’appétit de l’animal, d’évènements de dépression respiratoire. Concernant l’approche statistique, nous prévoyons d’employer des tests paramétriques puisque nos échantillons sont indépendants et que nous comparerons, dans la plupart des cas, des groupes entre eux et ce, en fonction de différents temps.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l'hébergement en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux, l'enrichissement de leur environnement (maison, paillettes coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié et cela pendant toute la durée du projet afin de veiller à leur bien-être. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable tels qu'une perte de poids maximale de 15%, un arrêt de prise alimentaire et de boisson, une absence de réaction aux stimuli extérieurs, une échelle de douleur importante, des signes de douleurs extérieurs et une réduction importante de l'activité motrice. Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique adaptée au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure. Enfin, tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun trouble du comportement lié aux protocoles.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des pathologies neurologiques. L’anatomie du système nerveux ainsi que la physiologie de la souris sont également documentées et relativement proches de ceux de l’Homme. C’est donc via l’utilisation d’approches expérimentales fiables et maitrisées, que la souris représente un bon modèle pour ce projet de recherche. En effet, l’ensemble des connaissances dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement adéquate à cette étude. Tous les animaux utilisés pour les expériences de cette demande de projet seront âgés entre 8 et 12 semaines. Ces âges ont été retenus car considérés comme âge « jeunes adultes », l’âge le plus couramment utilisé dans la littérature.