Procédures sévères
Étude des propriétés nucléaire dans la physiologie du muscle squelettique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris utilisées portent une invalidation génétique conditionnelle d'un gène musculaire, activée par cinq administrations orales de tamoxifène. Elles sont 420, dont 84 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 168 modéré et 168 sévère, toutes tuées à l'issue. 168 reçoivent une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle de la patte, et toutes passent une épreuve de course d'environ une heure trente d'endurance ainsi qu'une mesure de force par électrostimulation sous anesthésie. Le cumul de l'électrostimulation et de la course peut induire un stress et de la douleur, reconnaît le porteur, et la mise à mort sert à prélever les muscles pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Objectifs
Près de la moitié de la masse du corps humain est composé de muscles striés squelettiques. Ceux-ci sont composés de milliers de cellules géantes (les fibres musculaires), pouvant atteindre des 10aines de centimètre de long. Nos travaux ont montré que l’intégrité fonctionnelle des fibres musculaires est contrôlée par le positionnement des noyaux le long de la fibre. Les travaux de notre équipe ont permis l’identification d’une protéine impliquée dans le positionnement des noyaux dans les fibres musculaires formées in vitro. Notre étude cherchera à quantifier l’impact de l’absence de cette protéine dans les fibres musculaires sur (1) la fonctionnalité musculaire et (2) au cours de la régénération musculaire chez des souris jeunes et âgées grâce à un modèle de souris invalidé pour notre gène d’intérêt spécifiquement dans les fibres musculaires. A terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels la mécano-transduction nucléaire contrôle la physiologie du tissu musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise la compréhension du contrôle de la fonctionnalité du muscle squelettique dependant d'une protéine nucléaire, qui conditionne les performances musculaires. Les résultats qui découleront de ce projet nous permettront de comprendre le rôle de notre protéine d'interêt dans le tissu musculaire mais également lors de la régénération musculaire. A terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels le noyau contrôle la physiologie du tissu musculaire et d’identifier ainsi une nouvelle cible thérapeutique dans les maladies musculaires associées.
Procédures
- une injection intramusculaire dans le muscle releveur de la patte sera réalisée sur certains animaux (168/420). Elle dure moins de 5 secondes et sera réalisée sur animaux anesthésiés. Deux injections d’analgésique (anti-douleur) seront également réalisées avant et après la lésion musculaire. - administration par voie oral de souris avec un mélange d'huile de maïs contenant du tamoxifène ; il dure moins de 20 secondes et est répété 5 fois (108/420). - Épreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 (toutes les souris). - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 30 minutes. Deux injections d’analgésique (anti-douleur) seront également réalisées avant et après mesure de force (toutes les souris).
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé n’ont pas montré de problèmes détectables sur le comportement, l’activité et ou la prise de poids des souris. L’administration de tamoxifène dans les souris par voie oral pourra causer une douleur légère et brève aux animaux. Aucune faiblesse musculaire, reflétée par des problèmes de locomotion ou activité ne sont observables suite à cette procédure. L’injection de cardiotoxine dans le Tibialis Anterior entraine la destruction du tissu musculaire. Suite à cette injection, le processus de régénération musculaire va se mettre en place instantanément après la blessure et entrainer une régénération complète du muscle en moins de 7 jours. L’injection étant localisée sur un seul des muscles composant la patte, les conséquences fonctionnelles sur la locomotion de la souris sont limitées et ne sont présentes que pendant les premières 24h. En effet, après le réveil, les souris circulent normalement dans la cage. Certaines présentent parfois une rétractation des pattes traitées, qui disparaît en quelques heures, sans modification de la mobilité ni signe de souffrance. Dans tous les cas elles accèdent à la nourriture et à la boisson sans difficulté apparente. Les animaux sont surveillés quotidiennement. En cas de toute anomalie visible locale (gonflement anormal de la patte, infection au niveau du point d’injection, non utilisation de la patte, hémorragie visible) ou générale (prostration de l'animal, démangeaison, lésion, poil hirsute etc..), de mobilité réduite ou d'inconfort visible, l'animal est mis à mort. Des nuisances modérées sont attendues du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation et course sur tapis) qui peuvent induire un stress et de la douleur chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Des études in vitro à partir de cellules primaires murines permettant la formation de myotubes et de myofibres ont été réalisées en présence ou en absence de notre protéine d'interêt. Cette méthode nous a permis de mettre en évidence ses premiers rôles dans la formation des fibres et l’homéostasie musculaire. Il est désormais nécessaire d’utiliser un nouveau modèle murin in vivo afin de confirmer nos résultats précédents. En effet, l’homéostasie musculaire regroupe plusieurs mécanismes complexes d’interaction entre différents acteurs que nous ne pouvons reproduire dans notre système de culture de cellules primaires in vitro précédemment utilisé. De plus, la régénération musculaire repose sur un ensemble d’interactions complexes entre les tissus lésés, le système immunitaire et vasculaire ainsi que sur la coordination efficace de nombreux types cellulaires.
Réduction
Grâce à nos connaissances accumulées sur les tests d’effort chez les souris et les études ex vivo réalisées, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. La taille de l’échantillon (7 souris pour chaque analyse et 12 pour les tests fonctionnel (course, force) a été déterminée par des outils d' analyses statistiques. Pour la mesure de force, nous utilisons un dispositif expérimental utilisable in vivo qui permet de réaliser des protocoles de mesure de force musculaire de manière longitudinale sur les mêmes animaux sur l’ensemble du protocole (force, course, force). Cette innovation réduit également la variabilité expérimentale inter-animale.
Raffinement
Avant le début de chacune des procédures, les animaux suivront une période d’acclimatation à leur environnement d’au moins 1 semaine, nécessaire à l’adaptation de leur comportement et à la réduction du stress. La procédure 2 consiste en une injection intramusculaire simple. C’est la procédure la moins invasive et douloureuse pour étudier la régénération musculaire, ne nécessitant aucune chirurgie. Un analgésique sera administré aux animaux avant le début de cette procédure et l’injection de cardiotoxine sera réalisée sous anesthésie dans le but de réduire au maximum un état de stress et de souffrance chez les animaux. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition : coton et cabanes. Comme la locomotion des animaux sera limitée pendant les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutées au sein des cages pour leur permettre une alimentation et hydratation constante. De l’eau en gel sera également ajoutée au sein des cages. L’analgésie sera poursuivie les jours suivants autant que de besoin. Une analgésie avant et après le test de mesure de force musculaire sera également effectuée. Enfin, pour chaque procédure, des points limites ont éte établis, prenant en compte des critères refletant la souffrance des animaux et permettant ainsi de mettre fin précocément à la procédure.
Choix des espèces
La composition et le fonctionnement du tissu musculaire murin est proche de celui de l’être humain, faisant du modèle murin un modèle pertinent pour l’analyse de gènes impliqués dans l’homéostasie cellulaire. De plus, les modèles transgéniques proposés dans cette étude sont conditionnels et l’un d’eux est inductible, permettant la délétion de notre gène d’intérêt dans un type cellulaire spécifique et à un moment voulu. Des souris jeunes, âgées de 8 à 12 semaines (2 mois) et de 12 mois seront utilisées. Entre 8 et 12 semaines, les souris ont fini leur croissance et atteignent l’âge adulte dit « mature », ce qui permet d’observer la régénération et les performances physiques dans un contexte de muscle squelettique adulte jeune. Un deuxième temps à 12 mois est utilisé car nos données montrent qu’après 12 mois, une nouvelle voie de signalisation contrôle le fonctionnement musculaire en lien avec le postionnement nucléaire.
Rôle du TNF et du TNFR2 exprimé par les lymphocytes T régulateurs dans la physiopathologie des maladies auto-immunes
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Modifiées pour que leurs lymphocytes T régulateurs n'expriment plus le TNF, son récepteur, ou les deux, 2784 souris vont être utilisées, 1788 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 708 un niveau modéré et 288 un niveau léger. Deux maladies leur sont provoquées, l'une proche de la sclérose en plaques, l'autre des maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur décrit une parésie puis une paralysie de la queue et des membres qui s'aggravent jusqu'au dixième ou vingtième jour, des nécroses ou des plaies au point d'immunisation nettoyées chaque jour, et des diarrhées après l'induction de la colite. Toutes sont tuées pour prélever la rate, les ganglions, le colon et le système nerveux central.
Objectifs
Les lymphocytes T régulateurs (appelé ici Treg) jouent un rôle majeur dans le contrôle des maladies auto-immunes. Des expériences chez l’animal montrent que l’injection de réactifs capables des stimuler les Treg ont un effet thérapeutique dans ces maladies. Elles constituent ainsi une cible thérapeutique de choix en médecine et les premiers essais cliniques visant à stimuler les Treg ont démarré. Il reste encore beaucoup à découvrir pour avoir des traitements efficaces et pour en comprendre les mécanismes. C’est pourquoi nous avons encore besoin de faire des expériences chez la souris pour atteindre ces objectifs. Nous avons montré qu’une des façons d’augmenter la fonction et la prolifération des Treg consiste à les stimuler par une cytokine inflammatoire bien connue appelé TNF. Dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris, nous montrons cette cytokine agit de façon directe sur les Treg pour augmenter leur fonction suppressive et ainsi contrôler la maladie. De plus, l’injection d’une molécule stimulant le récepteur au TNF a un effet thérapeutique dans cette maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre par quels mécanismes la stimulation des Treg par le TNF est capable de réguler les maladies auto-immunes. C’est pour atteindre cet objectif que nous avons généré au laboratoire des souris dans lesquelles l’expression de l’une ou l’autre molécule, ou les deux à la fois, est éliminée dans les seules Treg. Ceci est possible grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Nous allons étudier dans un premier temps si l’ablation de ces molécules sur les Treg est susceptible d’induire une maladie auto-immune. Nous allons ensuite induire deux types de maladies auto-immunes chez ces souris. L’une apparentée à la sclérose en plaques avec une atteinte du système nerveux central et l’autre apparentée aux maladies inflammatoires de l’intestin avec une atteinte de cet organe. De plus, du fait de nos résultats obtenus au laboratoire et pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes, nous injecterons également des réactifs pour neutraliser la cytokine TNF ou son récepteur, ainsi que deux autres molécules impliquées dans le fonctionnement du système immunitaire. Ce travail devrait permettre de mieux comprendre comment nous pouvons moduler la fonction des Treg dans les maladies auto-immunes à des fins thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Des études préliminaires ont démontré l’importance de l’expression du récepteur au TNF dans les Treg dans la protection contre le développement de pathologies auto-immunes. Ce projet nous permettra donc d’avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement du rôle du TNF et de son récepteur exprimé par les Treg des tissus lymphoïdes (rate, ganglions lymphatiques) et non lymphoïdes (cerveau, colon…). Ces résultats peuvent ouvrir des voies vers de nouvelles stratégies thérapeutiques ; en particulier chez des patients présentant des pathologies auto-immunes.
Procédures
L’expérience consistera à injecter des médicaments non toxiques par voie intrapéritonéale. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le tronc. On fera aussi des gavages qui dureront moins de 30 secondes par souris dont on fera une contention par le tronc. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Enfin, ces souris, seront euthanasiés quand elles auront 2 mois d’âge (compter 5 à 10 secondes par souris). On effectuera des immunisations des souris par voie sous-cutanée qui dureront moins de 30 secondes et des injections par voie intraveineuse qui dureront moins de 60 secondes. Dans les 2 cas, les animaux seront anesthésiés. On fera également des gavages et des injections par voie intrapéritonéale qui dureront moins de 30 secondes chacun par souris dont on fera une contention par le tronc. On effectuera une chirurgie pour la perfusion intra-cardiaque sur animaux anesthésiés. Une fois anesthésié, l’opération prendra environ 2 minutes. On effectuera un suivi au moins 4 fois par semaine des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 30 secondes par souris. Enfin, pour l’euthanasie des souris, compter 5 à 10 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Dans une étude précédente, nous avons montré que la délétion du récepteur au TNF par les Treg n’induit pas d’inflammation spontanée. Il est maintenant nécessaire de confirmer une absence maladies inflammatoires chez les souris dans lesquelles le TNF ou son récepteur ne sont pas exprimés dans les Treg. Nous n’anticipons pas qu’il y ait d’inflammation dans la mesure où les souris déficientes pour le TNF n’en développent pas mais nous devons tout de même le confirmer. Pour le gavage et les injections par voie sous-cutanées, intrapéritonéale et intraveineuse, nous anticipons un stress et des douleurs légères chez les souris. Les nuisances principales seront observées suite à l’induction du modèle de sclérose en plaques et de colite. Dans le modèle de sclérose en plaques, les animaux peuvent avoir une activité extrême (grattage et léchage anormal) et peuvent présenter une nécrose ou une plaie au niveau du site d’immunisation. Dans ces situations les plaies seront nettoyées avec de la vétédine quotidiennement. Les signes cliniques de de parésie et paralysie de la queue et des membres augmentent progressivement jusqu’à la phase aiguë, 10 à 20 jours après l’induction de la maladie. Puis on a une phase de stabilisation et de lente rémission entre les jours 20 à 30. Suite à l’induction de colite, des diarrhées peuvent être observées durant la première semaine.
Devenir
Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, colon, système nerveux central) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.
Remplacement
Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des Treg et que nous avons développé au laboratoire un modèle de souris génétiquement modifiées unique qui permet de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, nous effectuerons un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Sur les 5 années, nous utiliserons un total de 2784 souris. Du fait de la variabilité interindividuelle entre souris, nous utiliserons 6 à 8 souris par groupe et les expériences seront répétées 3 fois (3 réplicas biologiques). Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les mêmes souris témoins seront utilisées avec différents groupes de souris expérimentales. Pour chaque animal euthanasié nous prélèverons plusieurs organes lymphoïdes et non-lymphoïdes afin de collecter et analyser le plus de données possibles par animal. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Sur les 5 années, nous utiliserons un total de 2784 souris. Du fait de la variabilité interindividuelle entre souris, nous utiliserons 6 à 8 souris par groupe et les expériences seront répétées 3 fois (3 réplicas biologiques). Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les mêmes souris témoins seront utilisées avec différents groupes de souris expérimentales. Pour chaque animal euthanasié nous prélèverons plusieurs organes lymphoïdes et non-lymphoïdes afin de collecter et analyser le plus de données possibles par animal.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les souris seront hébergées selon les conditions de la règlementation de la Directive 2010/63 EU en cages ventilées d'une superficie de 500 cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h et avec accès ad libitum à la nourriture et à la boisson. Le change de la litière sera réalisé 1 fois toutes les 2 semaines et les biberons chaque semaine. Les souris resteront toujours en groupes sociaux (de 2 à 5 souris). L'enrichissement fourni est du sizzlnest pour le nid et une maison rouge dans chaque cage. Les animaux sont vérifiés tous les jours par le personnel du service de zootechnie. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, nous l’euthanasierons. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement. Par ailleurs, un gel ophtalmique analgésique sera appliqué sur l'oeil après injection dans le sinus rétro-orbitaire et les souris seront anesthésiées et mises sur un tapis chauffant dès que possible pour réduire le stress et la douleur lors des procédures.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’Homme et les Treg en particulier. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet de répondre aux questions posées dans ce projet sur le rôle du TNF et du TNFR2 dans la biologie des Treg dans les maladies auto-immunes. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. La plupart des expériences seront initiées chez des jeunes adultes de 8 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature. Les seules exceptions concernent les expériences pour lesquelles les souris seront traitées de la naissance à l’âge de 12 semaine et les expériences de greffes de moelle osseuse pour laquelle les souris seront greffées à l’âge de 8 semaines et analysées 8 semaines après.
Analyse de la reperfusion post-ischémique en fonction de la présence de microthrombi cérébraux dans différents modèles murins d’AVC.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Réveillées pendant que le filament obstrue leur artère cérébrale, avant d'être rendormies pour qu'on le retire, une partie des souris montre à ce moment une posture en boule et les oreilles aplaties. 465 souris au total vont être utilisées, 415 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 50 opérées sous anesthésie sans jamais se réveiller. La chirurgie coupe le muscle masticateur, ce qui gêne l'alimentation les premiers jours, et l'imagerie enchaîne sans réveil intermédiaire, le porteur qualifiant par ailleurs l'affaiblissement de la patte avant gauche de léger et transitoire. Toutes sont tuées par perfusion à travers le cœur, pour l'examen histologique du cerveau.
Objectifs
L’AVC ischémique représente la principale cause de handicap acquis chez l’adulte. Parmi les deux traitements disponibles pour l’AVC ischémique (causé par la présence d’un caillot dans la circulation cérébrale), on retrouve la thrombolyse (injection d’un agent pharmacologique pour dissoudre le caillot) et la thrombectomie (ablation mécanique du caillot). Cependant, même après la réouverture de l'artère touchée, des fragments de caillot peuvent persister, obstruant la microcirculation distale, ou il peut subsister un défaut de reperfusion de cette microcirculation. Ces phénomènes peuvent être attribués à la formation in situ de microthrombi, à un rétrécissement des microvaisseaux dû à la contraction des péricytes, ou encore à l'obstruction par des neutrophiles, ou des globules rouges. Nous avons dans nos travaux précédents synthétiser un agent de contraste composé d’oxyde de fer insérés dans une matrice de polydopamine qui ont permis de révéler les microthrombi en imagerie par résonance magnétique (IRM), technique sensible au fer qui les compose. Or la polydopamine qui forme la matrice de cet agent de contraste possède également des propriétés intéressantes pour l’imagerie ultrarapide par ultrasons. Cette dernière est une technologie permettant d’observer le flux sanguin dans les vaisseaux avec une résolution extrêmement fine, offrant ainsi la possibilité d'analyser la microcirculation cérébrale chez les rongeurs. Ainsi, nous souhaitons développer en nous basant sur nos travaux antérieurs, un agent de contraste pour l’IRM et l’imagerie ultrarapide par ultrasons, capable de cibler les microthrombi. L’association du ciblage des microthrombi en IRM et l’observation des paramètres hémodynamiques de la microcirculation en imagerie ultrarapides à ultrasons nous permettront de mieux comprendre l’interaction entre ces différents phénomènes, en corrélation avec la formation des lésions cérébrales.
Bénéfices attendus
A la fin de ce projet, nous espérons avoir réussi à synthétiser un nouvel agent de contraste efficace pour marquer les microthrombi en imagerie à ultrasons. Nous devrions avoir compris les liens de corrélations entre la présence de microthrombi suite à un AVC, qu’ils soient présents suite à une fragmentation du caillot proximal, une formation au sein de la microcirculation ou leur nombre en fonction de la reperfusion cérébrale. De plus, nous devrions avoir caractérisé comment la reperfusion de la microcirculation est impactée après un traitement thrombolytique (modèle d’AVC thrombo-embolique) ou mécanique (modèle d’AVC par occlusion/retrait d’un filament) au niveau des microthrombi.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale au niveau cérébral pour mimer un AVC : 408 animaux, durée des chirurgies de 30 min à 1h. Le reste de animaux subiront une intervention chirurgicale par voie carotidienne pour mimer l'interruption du flux sanguin (AVC) : 47 animaux, la durée de cette chirurgie est estimée à 30 min, suivie d'un réveil pendant 1h, et une seconde intervention de 10 min sous anesthésie. Tous les animaux (465 animaux) de cette étude passerons une imagerie IRM (durée max de 22 minutes) ou imagerie à ultrasons ultrarapides (uUS) (durée max de 35 min). Selon les procédures, les animaux se verront injecter de manière intraveineuse du sérum physiologique ou des thrombolytiques (n = 160 animaux, diffusion pendant 1h). Une partie des animaux (80 animaux) devra effectuer un test comportemental visant à vérifier une héminégligence (durée = 2 minutes/animal). La totalité des animaux sera mis à mort par perfusion transcardiaque.
Impact sur les animaux
Cette étude comprendra 3 modèles animaux d’AVC. Pour les trois modèles d’AVC, les effets indésirables attendus sont similaires. Ces modèles sont couramment pratiqués dans notre laboratoire et il est généralement observé chez les souris des signes de douleurs juste après la chirurgie, qui seront pris en charge par une couverture analgésiques adaptées (buprénorphine, palier 2). Puis il est fréquemment observé un léger affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC), qui disparait en quelques jours après l’AVC. Cela peut entraîner une difficulté à se maintenir pour atteindre le récipient d'alimentation suspendu de la cage. Ainsi, des granulés seront disposés au sein de la cage pour que les animaux puissent y accéder facilement. La chirurgie implique également une incision du muscle massicateur entraînant une difficulté à manger dans les premiers jours suivants la chirurgie. Pour pallier à ceci, ainsi qu’à une potentiel déshydratation, nous prévoyons de donner des gels alimentaires aux animaux (avant et après la chirurgie). En particulier, dans le cadre de l’AVC par insertion d’un filament, les animaux seront réveillés pendant l’occlusion avant d’être rendormis pour le retrait du filament. Pendant cette période les animaux expriment des signes de douleurs (posture en boule, oreilles aplaties). Ils seront donc étroitement surveillés durant cette période afin de vérifier que la couverture analgésique est adaptée. Juste après l’induction des modèles d’AVC, les souris iront en imagerie par IRM ou par uUS. Il n’y aura pas de réveil entre la fin des chirurgies et l’imagerie. Pour l’administration des produits de contraste, un cathéter veineux sera posé au niveau de la queue des souris. La pose puis le retrait de celui-ci peut entraîner des démangeaisons au réveil des animaux mais cet effet s’estompe rapidement. Pour pallier au risque d’hypothermie lors du réveil des animaux, ceux-ci seront laissés environ 1 heure dans une enceinte de réveil dédiée à cet effet, chauffée à 30°C. Les animaux seront ensuite remis dans leur cage d’origine avec leurs congénères.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort selon ce qui est décrit dans les procédures, ce qui permettra de prélever les tissus pour observation histologiques.
Remplacement
La première partie de ce projet consiste à synthétiser puis injecter dans un modèle animal d’AVC un nouvel agent de contraste. Une approche in vitro à l’aide d’un système microfluidique est prévue pour remplacer l’utilisation des animaux pour l’observation des différents agents de contraste, le réglage des paramètres d’imagerie, et tester le bon ciblage de ces agents de contraste. Ainsi chaque lot de particules ayant démontré une bonne efficacité dans les études in vitro sera alors tester chez la souris.
Réduction
Nous avons examiné attentivement la littérature existante pour nous assurer que les expériences que nous envisageons pour notre étude n'ont pas été déjà réalisées, évitant ainsi les doublons. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. Un même expérimentateur se chargera de chaque modèle au sein d’une même étude afin de limiter la variabilité interindividuelle dans ces modèles, induite par l’expérimentateur, et ainsi permettre une réduction du nombre d’animaux nécessaires. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Ils seront hébergés en petits groupes sociaux stables (n=5) avec de l’enrichissement (un carré de coton (Nestlets) à déchiqueter, dôme en carton et lanière de cartons pour que les animaux puissent se cacher/s’isoler, un morceau de bois à ronger). Une phase d’habituation à l’expérimentateur est prévue pour la bonne manipulation des souris. L’établissement d’un score sur une échelle de douleur sera réalisé après le réveil des chirurgies, et à différents temps post-opératoires (1h, 3h, 24h). Une anesthésie et analgésie adaptée à chaque procédure seront mises en place pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Dans notre projet, l'utilisation de souris est d'autant plus justifiée car la littérature existante repose largement sur des études menées avec ces modèles, ce qui garantit une continuité dans nos investigations et une comparabilité avec les résultats antérieurs. Les souris seront à l'âge adulte : âgées entre 8 et 12 semaines. Poids équivalent : SWISS : entre 30-45g, C57 : entre 20 et 30g. Les modèles sont réalisés sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux au même stade de développement que celui utilisé en majorité dans notre laboratoire et dans la littérature pour les modèles d'AVC, et ainsi pouvoir comparer les résultats entre eux, avec nos précédents résultats dans ce modèle, et avec la littérature.
Evaluation de l’efficacité d’un composé actif administré par voie orale à 2 doses sur le traitement de la colite ulcérative chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Mis à jeun douze heures puis anesthésiés quarante minutes le temps qu'on leur introduise dans le colon une substance qui l'ulcère, 32 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, huit autres servant de témoins avec un produit neutre. Les 40 rats sont tués à la fin pour prélever le colon et son contenu. Le porteur annonce un inconfort et une douleur "notoires", une perte de poids, une posture prostrée, une fourrure hérissée, des yeux moins ouverts, et écrit qu'aucun antidouleur ne sera administré parce qu'il interférerait avec les résultats. L'étude compare deux doses d'un composé anti-inflammatoire à un placebo et à un traitement de référence, dans l'espoir d'un essai clinique chez l'humain.
Objectifs
La colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH) fait partie des deux principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) avec la maladie de Crohn, et affecte l'extrémité distale du tube digestif, côlon et rectum. La colite ulcéreuse se classe parmi les maladies inflammatoires parce qu'elle occasionne une inflammation, des plaies, des saignements et une déstructuration sur les parois internes du côlon. L’inflammation s’accompagne de la formation d’ulcères pouvant saigner et produire du mucus ou du pus. Les personnes atteintes de colite ulcéreuse doivent être attentives au risque d’anémie car lorsque la maladie est grave, les pertes de sang peuvent être abondantes, pertes que l’on peut compenser grâce à des suppléments en fer. Des facteurs génétiques et environnementaux influenceraient l’apparition de cette maladie. Le stress et les intolérances alimentaires peuvent déclencher les symptômes chez certaines personnes, mais ces facteurs ne seraient pas à l’origine de la maladie. Des complications liées à l’usage à long terme de certains médicaments peuvent survenir (ostéoporose, cataracte, hypertension, diabète...), médicaments qui peuvent aussi augmenter le risque d’infection. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité d’un composé actif ayant des propriétés anti-inflammatoires et antidouleur, administré par voie orale à 2 doses, chez des rats soumis à l’induction d’une ulcération colique. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et le colon et la matière fécale qu’il contient seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets d’un composé actif à 2 doses différentes chez le rat soumis à l’induction d’une ulcération colique expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence utilisé pour le traitement de la colite ulcéreuse. Les données des différents paramètres suivis au cours de l’expérimentation, poids corporel, prises alimentaire et hydrique, ainsi que les données comportementales relévées quotidiennement concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux dans la cage d’habitation, l’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation pour mesurer l’activité exploratoire, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur le colon et la matière fécale prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec ce composé actif sur ses activités anti-inflammatoire intestinale et antidouleur chez le rat. Cela permettrait d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec ce composé actif, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de la colite ulcéreuse.
Procédures
Les 40 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront placés à jeun pendant 12 heures avant l’induction de l’ulcération colique. L’ulcération colique sera induite par administration dans le colon d’une substance permettant l’induction de cette pathologie. Elle sera effectuée sur 32 des 40 rats placés sous anesthésie générale et nécessitera environ 40 minutes pour être réalisée. Les 8 autres rats ne subiront pas l’induction de l’ulcération colique mais ils seront également placés sous anesthésie générale pendant 40 minutes environ et recevront une administration de substance neutre dans le colon. Après induction de l’ulcération colique, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué quotidiennement pendant 6 jours sur les animaux vigiles, geste effectué en moins d’1 minute par une personne expérimentée. Un test comportemental sera effectué à la fin de l’expérimentation pour évaluer la douleur ressentie par les animaux. Chaque rat sera placé pendant 5 minutes dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer plusieurs paramètres comportementaux.
Impact sur les animaux
La mise à jeun des animaux la veille au soir de l’induction de l’ulcération colique, pendant une durée de 12 heures, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques et que leur colon soit vide de matière fécale, va induire une légère perte de poids des animaux. L’induction de l’ulcération colique va quant à elle induire un inconfort des animaux et une douleur ressentie notoires, se traduisant par une perte de poids modérée liée à une diminution de la prise alimentaire, voire également de la prise hydrique, et des modifications du comportement des animaux avec une activité moindre, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée et des yeux moins ouverts, ainsi qu’avec une diminution de l’activité exploratoire. Le traitement avec le composé actif à évaluer devrait limiter cet inconfort et cette douleur ressentie et donc les effets sur les différents paramètres mesurés, tout comme le traitement anti-inflammatoire intestinal de référence comme nous l’avons démontré dans de précédentes études. L’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation par la mise en place des animaux individuellement dans un dispositif expérimental pendant 5 minutes, va engendrer un stress modéré des animaux par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères durant ce laps de temps.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 40 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de du colon et de la matière fécale contenue dans celui-ci pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Des études préliminaires effectuées in vitro sur des cultures de cellules intestinales ont permis de sélectionner le composé actif ayant démontré les effets anti-inflammatoires les plus probants. Nous souhaitons donc maintenant confirmer ces effets anti-inflammatoires dans un modèle bien caractérisé de colite ulcérative. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets de substances sur l’inflammation intestinale qui est un processus complexe impliquant le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal, et sur l’évaluation comportementale. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de colite ulcérative ayant montré des effets "forts" de traitements sur l’inflammation intestinale générée, l’évolution pondérale et les paramètres comportementaux évalués dans un test comportemental spécifique à la fin de la période de traitement. Nous utiliserons ainsi 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront placés à 2 par cage dans des cages transparentes avec des briques d’Aspen et du papier kraft comme enrichissement, et ils auront accès à la nourritue et à l’eau ad libitum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’induction de la colite ulcérative, lors de la réalisation des traitements et la réalisation de l’évaluation comportementale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour tout au long de l’expérimentation par du personnel qualifié, week-end et jours fériés inclus. Un suivi quotidien de leur poids et de leurs consommations alimentaire et hydrique sera effectué tout au long de l’expérimentation, de même qu’une observation spécifique de leur comportement dans leur cage pour évaluer le niveau de douleur ressentie au travers de l’observation de leur activité, de leur posture, de l’état de leur fourrure et de l’ouverture de leurs yeux. Cela permettra ainsi d’évaluer l’effet antidouleur du composé actif testé sur la pathologie induite et de la comparer à celui des autres groupes de traitement. L’évaluation de la douleur ressentie se fera également par la réalisation d’un test comportemental 24 heures après le dernier traitement oral et juste avant leur euthanasie, pour évaluer l’activité exploratoire des animaux au travers de différents paramètres. Le but de cette étude étant d’évaluer les effets anti-inflammatoires du composé actif qui sera testé, il ne sera pas possible d’administrer de traitement antidouleur qui interférerait avec les résultats de l’étude et leur interprétation. Cependant, la surveillance de points limites définis permettra d’isoler voire d’exclure éventuellement des animaux avec une prise en charge en conformité avec les recommandations éthiques.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour les études dans le domaine de l’inflammation et notamment le modèle d’ulcération colique induit par le TNBS qui est reconnu par la Communauté Scientifique Internationale. C'est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce type d’étude. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge et au poids de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de colite ulcérative.
Etude du rôle d’une nouvelle protéine du système immunitaire dans l’infection à Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées dans l'abdomen avec une souche de salmonelle qui provoque chez elles une infection généralisée mortelle, 156 souris vont toutes être tuées, 60 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 96 un niveau modéré. Le porteur décrit l'état fébrile, les poils hérissés, le dos recourbé, les écoulements oculaires et la mobilité réduite qui suivent l'infection, et écarte tout traitement de la douleur au motif qu'il modifierait la cinétique de la létalité. L'enjeu est de vérifier si une protéine repérée en culture cellulaire joue le même rôle dans un "organisme vivant intégré et autonome", étape qu'il juge "nécessaire" avant d'envisager des applications contre les bactéries résistantes. Le résumé annonce trois interventions et n'en décrit que deux, l'inoculation et une prise de sang à la joue.
Objectifs
La réponse immune anti-bactérienne dépend de l’activation de récepteurs spécialisés par des molécules bactériennes, résultant en la production de cytokines pro-inflammatoires. Nous avons récemment identifié une protéine, qui participe à une cascade de signalisation de la réponse immunitaire. Nos données in vitro en culture cellulaire indiquent que cette protéine est centrale pour cette cascade de signalisation, notamment lors de l’infection par la bactérie Salmonella. Dans ce projet, nous avons pour objectif d’interroger le rôle de cette protéine dans l’activation de la réponse immune anti-bactérienne durant une infection à Salmonella in vivo. Ce projet répond à la fois à une question scientifique (améliorer notre compréhension de la voie de signalisation de l’immunité innée) mais aussi médicale (la protéine d’intérêt peut-elle être ciblée pour « booster » la réponse anti-bactérienne ? Question d’autant plus importante au vu de l’augmentation du nombre de souches antibiorésistantes.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de comprendre le rôle d’une protéine dans une voie de signalisation de réponse aux infections bactériennes, en utilisant Salmonella comme modèle. Cela va tout d’abord faire progresser la connaissance scientifique en décrivant une voie majeure d’activation de l’immunité chez l’humain. Nos données in vitro avec des cultures cellulaires indiquent que la protéine étudiée participe à cette voie, mais il est nécessaire de questionner ce fait dans un organisme vivant intégré et autonome, ici chez la souris. Il s’agit d’un bénéfice à court terme, obtenu à la complétion du projet. À plus long terme, ce projet ouvre des perspectives cliniques et vétérinaires. En effet, cette voie d’activation de l’immunité est majeure dans le contrôle de l’infection bactérienne, mais aussi dans les pathologies de sur-activation de l’immunité (choc septique). Si ce projet apporte la preuve que la protéine étudiée participe à la la réponse immunitaire in vivo, nous pouvons imaginer des approches thérapeutiques d'activation de cette protéine (dans le cas d’infections bactériennes résistantes aux antibiotiques) ou d’inhibition de celle-ci (dans le cas du choc septique).
Procédures
3 interventions prévues : inoculation d’une bactérie pathogène par voie intra-péritonéale (1 seule fois, moins de 3 min) et prélèvement de sang à la veine submandibulaire (1 seule fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Salmonella Typhimurium cause une infection systémique létale chez la lignée de souris utilisée, reproduisant les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes chez l’homme. Les symptomes suivants apparaissent au cours de l’infection : état fébrile, poils hérissés, dos recourbé, écoulements oculaires, mobilité réduite. La contention peut générer également du stress. L’inoculation par voie intra-péritonéale et la prise de sang dans la veine submandibulaire peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection de l’inoculum et de la prise de sang respectivement.
Devenir
Les animaux de la procédure létalité sont euthanasiés à l’atteinte du point limite. Les animaux qui servent à évaluer le niveau de colonisation des organes et aux prélèvements de sang sont euthanasiés pour faire les prélèvements.
Remplacement
Avant de proposer ce projet, nous avons implementé des approches de remplacement basée sur de la culture cellulaire : 1) Génération d’une lignée de macrophages murins n’exprimant pas la protéine d’intérêt. Il a été observé une perte de la production de cytokines pertinentes et une augmentation de l’infection à Salmonella dans ces cellules comparées aux cellules contrôles. 2) Modèle de sur-expression de la protéine d’intérêt, la production de cytokines pertinentes est augmentée de manière dose-dépendante dans cette lignée. Ces résultats documentent le rôle central de la protéine d’intérêt dans l’activation cytokinique bactério-induite in vitro. Il s’agit maintenant de tester l’importance de la protéine d’intérêt lors d’une réponse immunitaire à l’infection bactérienne in vivo pour démontrer définitivement son rôle essentiel dans un modèle complexe. Il n’existe pas à ce jour de modèle expérimental autre qu’animal récapitulant de manière convaincante une réponse immune.
Réduction
Différents scénari ont été testés avec une ou 2 études pilotes avant l’expérimentation finale. C’est le scénario avec une étude pilote qui utilise le moins d’animaux. L’étude pilote prévue permet de choisir la dose la plus adaptée à notre question scientifique. Elle permet également de déterminer le pic d’infection afin de déterminer les time-points d’autopsies les plus pertinents de l’expérimentation finale. Le nombre d’animaux par lot a été choisi sur la base de la littérature qui montre que 15 souris par lot permettent de voir une différence significative entre les 2 modèles murins que l’on souhaite tester suite à l’infection par Salmonella et sur le calcul de la puissance du test stastistique utilisé lors de la comparaison des résultats obtnenus sur les deux modèles.
Raffinement
Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Les animaux sont hébergés selon les conditions de l’établissement utilisateur agréé, en tenant compte de l’état physiologique des animaux avec contrôle (relevé télémétrique de la température, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général) et enregistrement de la température ambiante. Du papier sopalin est utilisé dans les cages de souris comme raffinement au cours de l’expérimentation. Des igloos, tunnels ont été testés il y a plusieurs années mais ils rendent le suivi des symptomes plus compliqués. Il est alors nécessaire de faire sortir les souris pour les observer. Ce « dérangement » des souris malades nous a paru être plus embêtant que le bien-être que peuvent apporter ces structures en début d’expérimentation lorsque les souris vont bien. Nous avons donc choisi de nous en tenir au papier sopalin comme raffinement. L’utilisation de méthode pour réduire la douleur liée à l’infection par Salmonella n’est pas possible car elle modifierait la cinétique d’apparition des symptômes et la cinétique de létalité et ne reproduirait donc plus la maladie.
Choix des espèces
La lignée de souris inoculées avecSalmonella est un modèle d’infection systémique létale naturel qui reproduit les infections systémiques létales observées chez l’homme et causées par S. Typhi, S. Paratyphi A/B/C ou S. Sendai. Ces souris sont naturellement sensibles à l’infection par Salmonella. Ce modèle est donc particulièrement pertinent pour notre étude. Les souris utilisées sont adultes. Elles ont entre 6 et 8 semaines d’âge, et ce, conformément au modèle publié dans la littérature.
Etude du rôle des NETs dans la progression tumorale du cancer de la peau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une substance cancérigène est appliquée sur la peau du dos de 6 336 souris, deux fois, aux semaines 0 et 8, puis les tumeurs se développent jusqu'à la semaine 30. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec des problèmes de déplacement et des signes de douleur parmi les effets attendus. Le porteur annonce avoir conçu ce projet "en respectant la règle des 3R", tout en écrivant qu'aucun anti-inflammatoire ne sera donné, puisqu'il veut caractériser le rôle de l'inflammation, et qu'aucun morphinique ne sera utilisé, puisque les morphiniques diminuent la prise tumorale. Le suivi se fait trois fois par semaine, un score supérieur à 6 entraînant la mise à mort, et les tumeurs sont disséquées après la mort des animaux.
Objectifs
Objectif : Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact des voies de signalisation responsables du recrutement des neutrophiles (qui sont des cellules imminutaires) dans la progression tumorale des cancers de la peau in vivo.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons a ce que les resultats obtenus avec ce projet nous permette d'etablir de nouvelle strategie dans le but de contrecarrer l'initiation et la progression des cancers de la peau
Procédures
Dans ce modèle, les 6 336 souris sont traitées avec une substance cancérigène (appliquée pour modéliser un cancer de la peau) à la semaine 0 (S0) et à la semaine 8 (S8) sur la peau du dos, et sont analysées jusqu'à la semaine 30 (qui marque la fin de l’expérience). Chaque intervention durera environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus chez les animaux développant des tumeurs incluent des problèmes de déplacement et des signes de douleur. Le bien-être animal sera évalué de manière objective à l'aide de fiches d’évaluation adaptées à cette procédure, qui prennent en compte les éventuelles nuisances et dommages causés, tels que la perte de poids et la douleur. Le suivi des animaux sera effectué trois fois par semaine jusqu'à leur sacrifice, au maximum 30 semaines après l'initiation de la carcinogenèse par une substance cancérigène (S0) ou lorsqu’un point limite sera atteint. Ce projet a été conçu en respectant la règle des 3R. Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux, mais elle pourrait conduire à la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de cancer de la peau. De plus, aucun anti-inflammatoire ne sera donné puisque nous souhaitons caractériser le rôle de l’inflammation dans la résistance et aucun morphinique ne sera utilisé puisqu’ils diminuent la prise tumorale.
Devenir
Les souris seront mises à mort les unes après les autres dans une pièce séparée. Nos expériences nécessitent la mise à mort des animaux car, en fin d'expérience, les tumeurs seront disséquées pour analyser les effets des différents traitements.
Remplacement
Remplacer: L’utilisation de cultures organotypiques en 3D in vitro nous permet de diminuer considérablement l’utilisation de modèles animaux pour mener à bien ce projet de recherche. Celles-ci permettent d’aborder la complexité des interactions entre plusieurs types cellulaires dans un gel de Matrice Extra Cellulaire. Cependant, il est encore impossible de récapituler toute la complexité d’un organe au point de vue cellulaire et matriciel en utilisant ces modèles. Afin de récapituler toute la complexité des interactions multicellulaires et matricielles observées au cours de la progression tumorale, la souris est un excellent modèle car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, la validation des cibles moléculaires identifiées et étudiées in vitro dans le cadre de l’élaboration de thérapies anticancéreuses ne peut se faire qu’à l’aide d’un modèle animal pertinent, comme nous le proposons.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux a été déterminé pour détecter toute différence significative sur le volume tumoral avec un minimum de souris. Ce nombre a été calculé grâce à une analyse statistique prévisionnelle. Il se justifie par la fréquence des lésions tumorales observées 30 semaines après dans ce modèle murin de cancer de la peau. Les résultats obtenus en laboratoire in vitro et in vivo (sous un précédent CIEPAL) permettent de réduire le nombre d’animaux. En effet, nos précédents résultats, ainsi que le fait que ce modèle soit largement utilisé et décrit par la communauté scientifique, nous permettent de connaître la cinétique de développement de la maladie. Ainsi, ces résultats ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Raffiner : En complément des conditions de base d’hébergement conformes à la réglementation européenne (calme, hébergement en A1, 4 souris par cage, rythme nycthéméral de 12h, eau et nourriture à volonté, cages enrichies avec des abris et des carrés de coton), nous mettons en place des mesures spécifiques pour atténuer les contraintes liées à l’expérimentation. Les animaux seront manipulés exclusivement par du personnel formé et expérimenté pour minimiser le stress. La réhydratation, si necessaire, sera assurée après les manipulations par l'apport d'aliments gélifiés enrichis. De plus, les animaux seront placés dans un environnement calme avant et après chaque intervention. La période d’acclimatation sera de 5 jours pour garantir leur bien-être avant l’expérimentation. Un suivi régulier sera effectué via une grille de score et un score supérieur à 6 entraînera une mise a mort.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des neutrophiles dans le développement des cancers de la peau. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes, car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, le modèle proposé, basé sur l'utilisation d'une substance cancérigène pour induire le cancer de la peau, a été bien caractérisé et est largement utilisé pour sa reproductibilité dans la communauté scientifique pour ce type d’étude. Nos résultats préliminaires montrent déjà un nombre anormalement élevé de neutrophiles dans les cancers de la peau chez ces souris. L’application d'une substance cancérigène induisant la carcinogenèse sera réalisée sur des souris âgées de 7 à 9 semaines, âge auquel les follicules pileux sont en phase de repos. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront 30 semaines après le début de l'expérience, correspondant à la formation de cancers de la peau. Les souris seront mise a mort avant les prélèvements.
Etude longitudinale par IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) in vivo de l’effet d’une supplémentation en phosphate sur l’ostéodystrophie dans un modèle de souris d’insuffisance rénale par néphrectomie.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Ablation des deux tiers d'un rein, puis ablation complète du second une semaine plus tard : 173 souris subissent cette double néphrectomie, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent ensuite dans un imageur à résonance magnétique à 22, 26, 28 et 32 semaines, avec un prélèvement sanguin après chaque séance, pour suivre la dégradation osseuse qui accompagne l'insuffisance rénale et tester l'effet d'un régime enrichi en phosphate. Le porteur écrit ne pas prévoir d'analgésique pour l'imagerie, celle-ci n'étant pas douloureuse, et juge négligeable le risque d'infection des incisions chirurgicales. Il indique dans le même temps que le taux de survenue des effets secondaires de ce modèle, hypertension et modifications de la production d'urine comprises, n'est pas mentionné dans les publications.
Objectifs
Nous proposons donc de réaliser une étude prospective longitudinale dans un modèle murin afin d’étudier les corrélations entre plusieurs techniques d’évaluation osseuse - de la biologie à l’imagerie IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et SRM (Spectrsocopie par Résonance Magnétique) hautes résolutions- in vivo. L’objectif principal sera de rechercher la meilleure combinaison de marqueurs, biologiques, imagerie, corrélés entre eux et comparée au gold standard (l’histologie) afin de caractériser le TMO MRC (trouble du métabolisme minéral et osseux de la maladie rénale chronique) en suivant son évolution au cours de la dégradation de la fonction rénale chez la souris, pour se rapprocher des stades 3 à 5 définis chez l’Homme. Le deuxième objectif est d’évaluer l’impact du régime phosphaté sur les marqueurs du remodelage osseux. En effet il a été montré depuis longtemps que le phosphate joue un rôle important dans la minéralisation osseuse. A long terme l’objectif clinique est une meilleure prise en charge thérapeutique des insuffisants rénaux afin de contrôler au mieux la dystrophie osseuse qui est une complication importante de leur maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure prise en charge thérapeutique des insuffisants rénaux afin de contrôler au mieux la dystrophie osseuse qui est une complication importante de leur maladie.
Procédures
Les souris seront soumises deux chirurgies (néphrectomie 5/6eme) : Ablation des 2/3 d'un rein et ablation complète du second rein 1 semaine plus tard. Les souris passeront dans le spectromètre imageur IRM/SRM avant chirurgie (à 22 semaines) et toutes les 4 semaines après (à 26, 28 et 32 semaines). Des prélèvements de sang seront réalisés après chaque IRM/SRM
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à la chirurgie néphrectomie de l’insuffisance rénale et feront l'objet de points limites. La fonction rénale de la souris sera réduite. Comme toute chirurgie, il peut y avoir un risque d’infection au niveau des incisions. Même si ce risque est négligeable vu que la chirurgie sera réalisée dans une salle dédiée à l’expérimentation animale avec des mesures d’asepsie. Dans ce modèle il peut être observé parfois une hypertension ainsi que des modifications de la production d’urine et du métabolisme des protéines. Dans les publications le taux de survenue des effets secondaires n’est pas mentionné. L’injection ntraveineuse (IV) des agents de contraste ne provoque pas de douleur supérieure à celle d'une piqure d'aiguille . Pas d’effets indésirables liés à l’IRM qui est une technique d’imagerie totalement non invasive et atraumatique. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse (isoflurane à 1.5%) pendant toute la durée des acquisitions IRM. Leur rythme respiratoire est surveillé tout au long de l'imagerie par un ballonet placé sous la cage thoracique. De plus la souris est placée sur un petit tapis chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37,4°C.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin des acquisitons IRM/SRM à chaque stade pour l'étude par stade et au dernier stade (36 semaines) pour l'étude longitudinale. La mise à mort est faite pour des études post mortem.
Remplacement
L’ostéodystrophie osseuse ne peut être étudiée autrement que sur un système vivant car elle est une des conséquences de l’insuffisance rénale. Cette pathologie osseuse ne peut être induite sur cellules. Dans la bibliographie il existe plusieurs modèles d’insuffisance rénale ou transgénique mais aucun mais ils n’entraînent pas forcément une ostéodystrophie qui se maintient au cours du temps (pas de remodelage osseux).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi du développement de l’ostéodystrophie ainsi que la SRM permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Ce projet nécessitera 173 souris.
Raffinement
PPendant toute la durée de l’expérimentation, les souris sont hébergées en portoir ventilé. Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Pendant les actes d’imagerie les souris sont sous anesthésie à l’isoflurane. Pas d’analgésique puisque l’IRM n’est pas douloureuse. L’hypothermie est évitée puisque les souris sont placées sur un tapis chauffant (circulation d’eau chaude). Pour la chirurgie, une analgésie préopératoire sera réalisée par injection sous cutanée La souris sera alors anesthésiée à l'isoflurane. En post opératoire, afin d’éviter les douleurs post-opératoires, des injections sous cutanées d'antalgique seront réalisées. Pour la nuit une gelée àd'analgésique sera réalisée.
Choix des espèces
Le modèle d’insuffisance rénale peut être réalisé sur souris ou sur rat. Nous avons choisi la souris pour deux raisons : 1) nous nous sommes appuyés le modèle souris déjà publié et validé (Shobeiri N., Am J Nephrol 31(6), 471-481, 2010) 2) et 2) Notre spectromètre imageur IRM 7T possède tout le matériel optimisé pour réaliser les études chez la souris.
Impact environnemental d’un rejet d’une eau de production industrielle (saumure) : détermination de sa toxicité chez une espèce de poisson plat, le turbot.
- Protection de l’environnement
Transférés à l'épuisette dans des bacs d'exposition, des turbots juvéniles de trois mois, pesant 2 à 3 grammes, passent jusqu'à 96 heures dans une eau de mer salée de 40 à 70 g/L selon les groupes, les 30 témoins restant à 35 g/L. Ces tests de concentration létale, imposés par la réglementation, visent d'abord à trouver la salinité qui tue 10 % des poissons. 10 autres turbots sont ensuite exposés à cette salinité dans une saumure à 30 °C, chargée de phosphonates et de sous-produits de chloration, pour mesurer l'effet des rejets d'une future production d'hydrogène couplée à l'éolien en mer. Au total, 110 turbots, des poissons plats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, avec des troubles de l'équilibre hydrominéral et une accélération de la respiration qui peuvent durer jusqu'à la fin de l'essai. Tous les turbots sont mis à mort à l'issue, et les tissus des témoins sont utilisés pour des dosages enzymatiques.
Objectifs
La production d’hydrogène couplée à de l’éolien en mer soulève un grand nombre de questions sur l’impact environnemental potentiel des rejets d’eau de production associés à ce procédé. Ce rejet est constitué d’une saumure très salée, concentrée en différentes substances chimiques et dont la température est supérieure à celle du milieu aquatique environnant. La règlementation impose d’évaluer l’impact de ces rejets sur l’environnement en réalisant des tests de concentrations létales de ces rejets sur des poissons selon des normes internationales. Dans ce projet, les tests seront réalisés sur des turbots. Etant donné la composition complexe de cette saumure, deux étapes seront nécessaires dans ce projet. La première va être de déterminer les effets d’une sur-concentration en sel dans l’eau de mer. La concentration la plus forte en sel retrouvée dans la saumure sera d’abord testée. Puis, la concentration en sel induisant une mortalité de 10% sera déterminée. La seconde étape sera d’exposer les poissons à une saumure (température élevée et substances chimiques) présentant la concentration en sel induisant une mortalité de 10% et définie dans l’étape 1.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’anticiper les risques environnementaux potentiels consécutifs au déploiement d’une nouvelle technologie (production d’hydrogène sur des champs d’éoliennes en haute mer) correspondant à la volonté publique de décarbonation des activités industrielles. Ces travaux vont ainsi fournir des informations cruciales sur la sensibilité d’une espèce de poisson modèle à la principale pression environnementale liée au déploiement de cette technologie. Plus globalement, les résultats obtenus dans cette étude serviront à caractériser l’impact environnemental du rejet lié à cette production d’hydrogène via une analyse du risque chimique selon la méthodologie décrite dans les normes internationales. Cette étude servira de base à la réflexion des séquences ERC (Eviter, réduire, Compenser) préalable à toute étude d’impact environnemental d’une activité industrielle.
Procédures
Chaque poisson sera exposé à une saumure pendant au maximum 96 heures et une seule fois. 110 poissons seront utilisés dans ce projet. Parmi ces 110 poissons : - 30 poissons témoins seront exposés à une salinité de 35g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 70g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 40g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 45g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 50g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 55g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 60g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 65g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une saumure de salinité correspondant à la concentration entrainant la mortalité de 10% des poissons (déterminée précédemment), une témpérature de 30°C, 2mg/L de phosphonates et 5mg/L de sous-produits de chloration.
Impact sur les animaux
Le transport des poissons dans une épuisette du bac de stabulation aux bacs d'exposition peut induire un stress d’intensité faible et qui dure au maximum 1 minute. Concernant les nuisances des eaux de salinités croissantes et de l’exposition à la saumure, nous pouvons émettre l’hypothèse que des effets indésirables de gravité légère à sévère (difficultés à maintenir son équilibre hydrominéral, modification du métabolisme, se traduisant au niveau symptomatique par une augmentation de la fréquence et de l’amplitude des mouvements ventilatoires) allant au maximum jusqu’à 96h (fin de l’essai) peuvent apparaître.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les animaux exposés ne peuvent pas être utilisés dans le cadre d'autres procédures. Les témoins sont mis à mort et leurs tissus utilisés pour des dosages enzymatiques.
Remplacement
Des analyses de toxicité seront effectuées à l’échelle cellulaire pour permettre d’obtenir des informations sur les effets toxiques des différents éléments des saumures. Elles nous permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués mais ne pourront pas remplacer les observations réalisées à l’échelle de l’organisme. A l’heure actuelle, il n’y a pas de données bibliographiques sur les effets de cette saumure qui impacte tous les niveaux trophiques en milieu naturel. Notre travail global aura pour finalité d’apporter des données complémentaires concernant des microalgues, crevettes, bivalves et sur notre modèle poisson, qui fait l’objet de cette demande de projet expérimental. Chaque niveau apporte des données complémentaires car l’impact des saumures ne sera pas le même en fonction de la capacité d’osmorégulation des organismes : ces travaux expérimentaux seront menés en parallèle les uns des autres.
Réduction
Cette procédure se base sur les normes internationales dont les différentes modifications et mises à jour depuis sa création ont permis de réduire au maximum le nombre d’individu nécessaire à l’obtention d’un résultat fiable scientifiquement et statistiquement.
Raffinement
Les bacs de stabulation bénéficieront d’un enrichissement environnemental structurel approprié par ajout de différentes cachettes et un enrichissement occupationnel par la mise en place de courants d’eau variés. Un enrichissement sensoriel sera mis en place par la création de différentes zones d’ombre dans le bac. Dans les bacs d'exposition, seuls les enrichissements occupationnels par courant d’eau et sensoriels (ombre) seront conservés. Le raffinement spécifique aux procédures expérimentales mises en œuvre consistera, pour les animaux exposés à l’eau de mer sur-salée comme à la saumure, à aménager une phase de transition pendant laquelle la composition et/ou la température de l’eau seront progressivement modifiées pour ne pas produire de choc osmotique et thermique trop importants.
Choix des espèces
Le turbot est une espèce de poisson modèle en écophysiologie et en écotoxicologie. Grâce à la maitrise de son cycle de vie, le turbot est une espèce importante en pisciculture et permet à la recherche expérimentale de disposer d’individus issus d’élevage à tous les stades de son cycle de vie. La norme internationale utilisée dans le cadre de ce projet est applicable à l’espèce choisie. Les procédures seront réalisées sur des individus juvéniles âgés de trois mois, d’un poids d’environ 2 à 3g et une taille approximative de 50 mm. L’étude sur le stade de juvénile est requis dans les normes internationales. Les juvéniles de poissons sont couramment utilisés en écotoxicologie en raison de leur plus forte sensibilité aux variations de certains paramètres environnementaux comme la présence de substances chimiques. L’élevage du turbot a mis en évidence sa forte sensibilité aux différences de température et de salinité lors des premiers stades de son cycle de vie post-métamorphose.
Preuve d’efficacité de candidats vaccins contre le virus de fièvre hémorragique de Crimée-Congo chez le macaque cynomolgus (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Dès qu'un point limite est atteint, les macaques sont anesthésiés puis tués. Ils sont douze, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : implantation abdominale d'une sonde de température, vaccination, jusqu'à douze séances de prélèvements sanguins et d'écouvillonnage, puis inoculation intraveineuse du virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo et neuf séances supplémentaires. Ce volet décrit le même protocole que le résumé déposé par l'autre établissement, pour les mêmes douze animaux répartis entre deux animaleries, l'objectif étant de comparer trois candidats vaccins entre eux. Trois macaques par groupe sont présentés comme "le minimum absolu permettant des résultats statistiquement significatifs", le porteur reconnaissant par ailleurs que les tests statistiques "ne pourront pas être tous hautement significatifs".
Objectifs
A ce jour, aucun vaccin ni traitement antiviral spécifique contre le virus CCHF (fièvre hémorragique de Crimée-Congo) n’est disponible. L’objectif de ce projet est de poursuivre le développement de vaccins contre le virus CCHF. Nous avons premièrement testé nos candidats vaccins dans un modèle souris déficientes pour une partie du système immunitaire afin qu’elles puissent présenter des signes cliniques suite à l’infection par CCHFV (virus de la fièvre hémoragique de Cirmée-Congo). Tous les animaux vaccinés ont survécu à l’infection. Afin de déterminer l’efficacité des vaccins, il faut ensuite démontrer la protection efficace dans un modèle d’infection sans déficience du système immunitaire et présentant naturellement des signes cliniques suite à l’infection par CCHFV, c’est-à-dire en modèle macaque cynomolgus. Cette expérimentation permettra valider l’efficacité de nos candidats vaccins mais également de les comparer entre eux pour définir celui ou ceux qui peuvent être engagés plus avant dans leur développement.
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun traitement spécifique ou vaccin disponible. La vaccination demeure l’approche la plus pragmatique pour enrayer les épidémies à CCHFV. Le but de ce projet est de démontrer que les candidats vaccins ont un pouvoir protecteur après un ou deux immunisations. Le projet met à l’étude des candidats vaccins dont l’innocuité du vecteur a été testée. Dans le cadre de ce projet, nous avons déjà évalué au cours d’une première phase trois candidats vaccins contre le virus CCHF dans un modèle murin (souris déficientes pour le récepteur aux interférons de type 1). Ce protocole permettra de démontrer leur efficacité et leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre l’infection par ce virus en modèle primate non humain (PNH), seul modèle qui reproduit la pathologie observée chez l’Homme. Parmi les trois candidats vaccins qui seront testés au cours de la même expérimentation, et grâce aux échantillons biologiques collectés auprès des animaux vaccinés (ou non) et infectés, nous pourrons évaluer l’efficacité du vaccin, vérifier l’absence de persistance virale, mesurer les taux d’anticorps spécifiques du virus et la réponse cellulaire de l’hôte. L’utilisation des animaux pour cette phase de validation est donc justifiée au vu de l’impact potentiel sur l’Homme de ce virus et pour la mise en place d’une prophylaxie. L’efficacité des vaccins utilisés dans cette étude sera mesurée selon le taux de survie des animaux vaccinés ainsi que par l’analyse des prélèvements biologiques. Les résultats obtenus seront comparés à ceux des animaux non vaccinés pour déterminer l’efficacité de chacun des vaccins testés.
Procédures
Dans l'animalerie 1/2, les animaux seront soumis à une chirurgie d’implantation abdominale d’un dispositif permettant de mesurer la température corporelle en temps réel (durée de la chirurgie: 30 mn), à 1 à 2 injections intramusculaire du vaccin, et jusqu'à 12 prélèvements sanguins et écouvillons nasaux et buccaux (environ 15 min à chaque session de prélèvements) sous anesthésie générale (J0, 3, 6, 9, 15, 21, 63, 66, 69, 71, 78, 83). Dans l'animalerie 2/2, ils seront soumis à 1 injection intraveineuse du virus puis à 9 écouvillons nasaux et buccaux (environ 5 minutes à chaque session de prélèvements) et 9 prélèvements sanguins (J0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21) (20 à 30 minutes) etsous anesthésie générale (prévues au nombre de 10, d’une durée de 1 à 2h, pour la réception et les jours de prélèvement). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis des prélèvements (sang) ainsi que la mise à mort seront réalisés.
Impact sur les animaux
En animalerie ½, les dommages attendus suite à la chirurgie sont la douleur liée à l’ouverture de la paroi ainsi qu’à la cicatrisation de la plaie. Les dommages attendus seront principalement liés aux injections de l’anesthésique et aux conséquences des prélèvements sanguins répétés (potentiels hématomes aux sites de prélèvement). L’innocuité de cette construction vaccinale a déjà été démontrée, il n’est donc attendu aucun effet secondaire. En animalerie 2/2, les nuisances attendues sont une inflammation locale légère et transitoire au niveau de la zone d’injection du virus et une irritation des muqueuses nasales et buccales suite aux différents prélèvements. Les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies générales ce qui peut induire une hypothermie et un stress lié à la contention. Aucun effet n’est attendu pour les animaux vaccinés. Les animaux contrôles non-vaccinés devraient présenter les symptômes décrits chez les humains suite à l’infection par ce virus, à savoir une perte de tonus, une perte de poids, une fièvre et l’observation de signes hémorragiques éventuels.
Devenir
L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et/ou vaccinés. Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.
Remplacement
Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire (classiquement utilisée depuis des décennies). Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Les candidats vaccins utilisés ici ont d’abord fait l’objet de caractérisation in vitro. La réponse immune induite a été testée et une forte réponse a été observée. Dans le cas des fièvres hémorragiques virales dont fait partie la fièvre hémorragique induite par CCHFV, il est impossible de remplacer les modèles animaux afin de réaliser des études sur la physiopathogénèse et les réponses immunitaires dans leur ensemble. Ce projet vise donc à démontrer l’efficacité de candidats vaccins contre l’infection, ce qui nécessite obligatoirement des organismes entiers. De plus, cela s’inscrit dans des études précliniques, indispensables au développement d’un candidat vaccin.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible pour obtenir des résultats interprétables et pertinents. En effet, un effectif de trois animaux par groupe représente le minimum absolu permettant des résultats statistiquement significatifs. Au-delà de la survie, les groupes seront comparés en fonction des valeurs de score au cours de la maladie, des valeurs des paramètres biochimiques, virologiques et autres paramètres physiologiques. Les tests statistiques ne pourront pas être tous hautement significatifs, cependant, la multiplicité des paramètres évalués permet de démontrer de manière fiable les résultats obtenus. Les précédentes études basées sur des expérimentations utilisant des groupes expérimentaux de 3 animaux ont permis d’obtenir des données et résultats significatifs montrant que la présence ou absence de virémie est un critère essentiel.
Raffinement
Animalerie 1 : - Hébergement : En raison de l’hébergement dans l'animalerie 2 et d’optimisation de l’étude, les groupes seront composés en trio compatibles. Un programme d’enrichissement spécifique à l’espèce et à l’âge des animaux est mis en place sur tout le site de l’animalerie 1, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Suivi de la température corporelle : Malgré une chirurgie pour la mise en place de l’implant, le fait d’équiper les animaux avec un tel dispositif représente un raffinement à court, et moyen termes en tant que mesure non invasive et paramètre de surveillance dans le cadre des points limites. - Procédures : Les animaux seront anesthésiés à chaque intervention, afin de limiter le stress lié à la manipulation ainsi que la douleur aigue liée à la chirurgie d’implantation, et aux injections et prélèvements sanguins répétés (piqure d’aiguille). Les animaux seront sous couverture antalgique durant et suivant la chirurgie d’implantation. Afin de limiter l’impact des prélèvements sanguins répétés, les sites de prélèvements seront alternés. En cas d’hématome, un autre site de prélèvement sera utilisé et de la pommade sera appliquée sur l’hématome (Hémoclar). Une grille de points limite est mise en place pour détecter tout problème inattendu. Animalerie 2 : les conditions réglementaires d’hébergement sont appliquées. Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par 3 dans un milieu enrichi afin de permettre aux animaux de mettre en avant le plus possible un comportement naturel (perchoir, jeu, diversification alimentaire…). Une évaluation quotidienne sera réalisée dès l’infection, et des points limites ont été définis. Cela permettra une fin de procédure expérimentale dès l’atteinte d’un point limite. L’enregistrement permanent de la température permet une meilleure analyse de la maladie. Les animaux sont également suivis grâce aux caméras permettant un contrôle visuel en dehors des horaires de présence du personnel en laboratoire. En cas de doute sur l’état d’un animal, une entrée en laboratoire sera programmée pour procéder à une observation et à une possible décision.
Choix des espèces
Il n'existe pas de modèle d’infection chez le rongeur pour la fièvre de Crimée-Congo qui reproduise la pathologie observée chez l’Homme excepté dans des souris génétiquement modifiées. Ces modèles présentent une susceptibilité plus ou moins prononcée et ne reproduisent qu'en partie la pathogénèse et les réponses immunitaires qui ont lieu chez l'Homme. Ce projet ne nécessite pas d'exigences particulières concernant le stade de développement des animaux utilisés hormis le fait de former des groupes homogènes en âge et poids pour pouvoir analyser les résultats sans biais. Les animaux utilisés seront des juvéniles sevrés d’au moins 12 mois et de moins de 3 ans.
Preuve d’efficacité de candidats vaccins contre le virus de fièvre hémorragique de Crimée-Congo chez le macaque cynomolgus (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie abdominale de trente minutes pour implanter une sonde de température, une à deux injections de vaccin, jusqu'à douze séances de prélèvements sanguins et d'écouvillonnage nasal et buccal, puis une injection intraveineuse du virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo suivie de neuf nouvelles séances, l'ensemble sous une dizaine d'anesthésies générales de une à deux heures. Les macaques non vaccinés devraient présenter les symptômes décrits chez l'humain, perte de tonus, perte de poids, fièvre et signes hémorragiques éventuels, et les organes des douze sont prélevés après leur mise à mort. Pour ce virus, le porteur affirme qu'il est "impossible" de remplacer les modèles animaux et que la démonstration d'efficacité "nécessite obligatoirement des organismes entiers".
Objectifs
A ce jour, aucun vaccin ni traitement antiviral spécifique contre le virus CCHF (fièvre hémorragique de cirmée-Congo) n’est disponible. L’objectif de ce projet est de poursuivre le développement de vaccins contre le virus CCHF. Nous avons premièrement testé nos candidats vaccins dans un modèle souris déficientes pour une partie du système immunitaire afin qu’elles puissent présenter des signes cliniques suite à l’infection par CCHFV (virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo). Tous les animaux vaccinés ont survécu à l’infection. Afin de déterminer l’efficacité des vaccins, il faut ensuite démontrer la protection efficace dans un modèle d’infection sans déficience du système immunitaire et présentant naturellement des signes cliniques suite à l’infection par CCHFV, c’est-à-dire en modèle macaque cynomolgus. Cette expérimentation permettra valider l’efficacité de nos candidats vaccins mais également de les comparer entre eux pour définir celui ou ceux qui peuvent être engagés plus avant dans leur développement.
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun traitement spécifique ou vaccin disponible. La vaccination demeure l’approche la plus pragmatique pour enrayer les épidémies à CCHFV. Le but de ce projet est de démontrer que les candidats vaccins ont un pouvoir protecteur après un ou deux immunisations. Le projet met à l’étude des candidats vaccins dont l’innocuité du vecteur a été testée. Dans le cadre de ce projet, nous avons déjà évalué au cours d’une première phase trois candidats vaccins contre le virus CCHF dans un modèle murin (souris déficientes pour le récepteur aux interférons de type 1). Ce protocole permettra de démontrer leur efficacité et leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre l’infection par ce virus en modèle primate non humain (PNH), seul modèle qui reproduit la pathologie observée chez l’Homme. Parmi les trois candidats vaccins qui seront testés au cours de la même expérimentation, et grâce aux échantillons biologiques collectés auprès des animaux vaccinés (ou non) et infectés, nous pourrons évaluer l’efficacité du vaccin, vérifier l’absence de persistance virale, mesurer les taux d’anticorps spécifiques du virus et la réponse cellulaire de l’hôte. L’utilisation des animaux pour cette phase de validation est donc justifiée au vu de l’impact potentiel sur l’Homme de ce virus et pour la mise en place d’une prophylaxie. L’efficacité des vaccins utilisés dans cette étude sera mesurée selon le taux de survie des animaux vaccinés ainsi que par l’analyse des prélèvements biologiques. Les résultats obtenus seront comparés à ceux des animaux non vaccinés pour déterminer l’efficacité de chacun des vaccins testés.
Procédures
Dans l'animalerie 1/2, les animaux seront soumis à une chirurgie d’implantation abdominale d’un dispositif permettant de mesurer la température corporelle en temps réel (durée de chirurgie de 30 min), à 1 à 2 injections intramusculaire du vaccin, et jusqu'à 12 prélèvements sanguins et écouvillons nasaux et buccaux (environ 15 min à chaque session de prélèvements) sous anesthésie générale (J0, 3, 6, 9, 15, 21, 63, 66, 69, 71, 78, 83). Dans l'animalerie 2/2, ils seront soumis à 1 injection intraveineuse du virus puis à 9 écouvillons nasaux et buccaux (environ 5 minutes à chaque session de prélèvements) et 9 prélèvements sanguins (20 à 30 minutes; J0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 et fin de protocole de J28 à 30) et sous anesthésie générale (prévues au nombre de 10, d’une durée de 1 à 2h, pour la réception et les jours de prélèvement). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis des prélèvements (sang) ainsi que la mise à mort seront réalisés.
Impact sur les animaux
En animalerie 1/2, les dommages attendus suite à la chirurgie sont la douleur liée à l’ouverture de la paroi ainsi qu’à la cicatrisation de la plaie. Les dommages attendus seront principalement liés aux injections de l’anesthésique et aux conséquences des prélèvements sanguins répétés (potentiels hématomes aux sites de prélèvement). L’innocuité de cette construction vaccinale a déjà été démontrée, il n’est donc attendu aucun effet secondaire. En animalerie 2/2, les nuisances attendues sont une inflammation locale légère et transitoire au niveau de la zone d’injection du virus et une irritation des muqueuses nasales et buccales suite aux différents prélèvements. Les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies générales ce qui peut induire une hypothermie et un stress lié à la contention. Aucun effet n’est attendu pour les animaux vaccinés. Les animaux contrôles non-vaccinés devraient présenter les symptômes décrits chez les humains suite à l’infection par ce virus, à savoir une perte de tonus, une perte de poids, une fièvre et l’observation de signes hémorragiques éventuels.
Devenir
L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et/ou vaccinés. Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.
Remplacement
Il existe désormais des méthodes in vitro, dérivées de la culture cellulaire qui, bien que très prometteuses, restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Les candidats vaccins utilisés ici ont d’abord fait l’objet de caractérisation in vitro. Dans le cas des fièvres hémorragiques virales dont fait partie la fièvre hémorragique induite par CCHFV, il est impossible de remplacer les modèles animaux afin de réaliser des études sur la physiopathogénèse et les réponses immunitaires dans leur ensemble. Ce projet vise donc à démontrer l’efficacité de candidats vaccins contre l’infection, ce qui nécessite obligatoirement des organismes entiers. De plus, cela s’inscrit dans des études précliniques, indispensables au développement d’un candidat vaccin.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible pour obtenir des résultats interprétables et pertinents. En effet, un effectif de trois animaux par groupe représente le minimum absolu permettant des résultats statistiquement significatifs. Au-delà de la survie, les groupes seront comparés en fonction des valeurs de score au cours de la maladie, des valeurs des paramètres biochimiques, virologiques et autres paramètres physiologiques. Les tests statistiques ne pourront pas être tous hautement significatifs, cependant, la multiplicité des paramètres évalués permet de démontrer de manière fiable les résultats obtenus. Les précédentes études basées sur des expérimentations utilisant des groupes expérimentaux de 3 animaux ont permis d’obtenir des données et résultats significatifs montrant que la présence ou absence de virémie est un critère essentiel.
Raffinement
Animalerie 1 : - Hébergement : En raison de l’hébergement dans l'animalerie 2 et d’optimisation de l’étude, les groupes seront composés en trio compatibles. Un programme d’enrichissement spécifique à l’espèce et à l’âge des animaux est mis en place sur tout le site de l’animalerie 1, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Suivi de la température corporelle : Malgré une chirurgie pour la mise en place de l’implant, le fait d’équiper les animaux avec un tel dispositif représente un raffinement à court, et moyen termes en tant que mesure non invasive et paramètre de surveillance dans le cadre des points limites. - Procédures : Les animaux seront anesthésiés à chaque intervention, afin de limiter le stress lié à la manipulation ainsi que la douleur aigue liée à la chirurgie d’implantation, et aux injections et prélèvements sanguins répétés (piqure d’aiguille). Les animaux seront sous couverture antalgique durant et suivant la chirurgie d’implantation. Afin de limiter l’impact des prélèvements sanguins répétés, les sites de prélèvements seront alternés. En cas d’hématome, un autre site de prélèvement sera utilisé et de la pommade sera appliquée sur l’hématome (Hémoclar). Une grille de points limite est mise en place pour détecter tout problème inattendu. Animalerie 2 : les conditions réglementaires d’hébergement sont appliquées. Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par 3 dans un milieu enrichi afin de permettre aux animaux de mettre en avant le plus possible un comportement naturel (perchoir, jeu, diversification alimentaire…). Une évaluation quotidienne sera réalisée dès l’infection, et des points limites ont été définis. Cela permettra une fin de procédure expérimentale dès l’atteinte d’un point limite. L’enregistrement permanent de la température permet une meilleure analyse de la maladie. Les animaux sont également suivis grâce aux caméras permettant un contrôle visuel en dehors des horaires de présence du personnel en laboratoire. En cas de doute sur l’état d’un animal, une entrée en laboratoire sera programmée pour procéder à une observation et à une possible décision.
Choix des espèces
Certains modèles (souris génétiquement modifiées) présentent une susceptibilité plus ou moins prononcée mais ne reproduisent qu'en partie la pathogénèse et les réponses immunitaires qui ont lieu chez l'Homme. Ce projet ne nécessite pas d'exigences particulières concernant le stade de développement des animaux utilisés hormis le fait de former des groupes homogènes en âge et poids pour pouvoir analyser les résultats sans biais. Les animaux utilisés seront des juvéniles sevrés d’au moins 12 mois et de moins de 3 ans.
Etude du comportement alimentaire chez des souris atteintes de glycogénose de type Ia :EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Observer pendant trois jours comment mangent des souris rendues incapables de produire du glucose : 23 souris sont utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une biopsie de tissu sert d'abord à les génotyper, puis cinq injections sous-cutanées en cinq jours déclenchent la maladie hépatique, avant un transfert vers un second établissement et trois à quatre jours d'isolement dans des cages qui enregistrent chaque accès à la mangeoire. Le porteur indique que ces souris peuvent développer des hypoglycémies se traduisant par de la prostration, une baisse de la température corporelle et parfois la mort, décès observé chez moins de 2 % des souris de l'élevage. En cas d'hypoglycémie, la souris reçoit une injection de sucre et une partie de sa cage est posée sur une plaque chauffante, et les tumeurs hépatiques que ce modèle développe vers 12 à 15 mois ne constitueront pas un point limite puisque les procédures s'arrêtent à six mois.
Objectifs
La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare due à l’absence de production de sucre (glucose) par l’organisme. Cette fonction est essentielle pour maintenir les taux de sucre dans le sang (glycémie) constante en dehors des repas. Contrairement aux diabétiques, les patients atteints de GSDIa développent des hypoglycémies sévères. Une baisse du taux de sucres dans le sang conduit à un mal-être important, qui peut conduire au coma, et à la mort en quelques minutes. Ainsi, les patients doivent manger régulièrement (toutes les 3h environ), y compris la nuit. Ces perturbations du rythme biologique ont un fort impact sur l’ensemble de fonctions physiologiques. Ainsi, la prise de nourriture à un temps inapproprié par rapport au cycle biologique, par exemple durant la période de sommeil, entraine un dérèglement de certaines réactions biologiques, en particulier dans le foie. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle de souris atteintes de GSDIa montrent des dérégulations dans le foie des souris, qui pourraient être entrainées par une modification du rythme biologique. L’objectif de ce projet est d’étudier la prise alimentaire et la structuration des repas de souris atteintes de GSD Ia sur une période de 3 jours, avec un accès continu à la nourriture. Le projet se déroulera dans deux établissements différents, l’un produira les souris et l’autre sera chargé de l’étude du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
L’étude des paramètres des repas (fréquence-quantité) devrait permettre de confirmer que les souris atteintes de GSDIa mangent régulièrement, tout au long de la journée et de la nuit, afin de limiter le développement d’hypoglycémie. Ces données seront utiles pour expliquer les origines des perturbations de l’horloge biologique observées au niveau du foie.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, une biopsie de tissu sera prélevée pour caractériser leurs gènes. Pour obtenir les souris atteintes de glycogénose de type 1a, les souris transgéniques sélectionnées et leur souris contrôles (souris saines) subiront une injection d’un produit chimique par voie sous-cutanée pendant 5 jours de suite à l’âge de 6-8 semaines dans l’établissement utilisateur EU1 Après transfert par un transporteur agréé dans l’EU2, ces souris seront ensuite isolées pendant 3 jours afin d’étudier leur comportement grâce à des cages détectant quand la souris accède à la mangeoire ou au biberon. L’appareillage permet aussi de déterminer la quantité de nourriture et le volume d’eau ingérés sur 24h. Afin de limiter le stress induit par l’isolement des souris, une période d’acclimatation progressive (isolement d’une demi-journée, puis d’une journée, avec remise avec leurs congénères entre chaque période) à leur nouvel environnement sera programmée sur les 3 jours précédents les enregistrements de prises alimentaires. Les animaux seront ensuite regroupés dans leur cage d’origine en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les souris subiront une série d’injections de 5 injections par voie sous-cutanée qui peuvent entrainer une légère douleur liée à la piqure. Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas), et par des atteintes hépatiques menant à long terme au développement de tumeurs du foie. En ciblant la pathologie dans le foie par transgenèse, le modèle de souris atteintes de GSDIa utilisé dans cette étude reproduit toute la pathologie hépatique observée chez l’homme et est viable. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies si elles ne s’alimentent pas régulièrement, car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucres accumulé dans le foie. Les hypoglycémies entrainent un mal-être, observé par la prostration des animaux, une baisse de la température corporelle, et possiblement le décès de l’animal (qui a été observé dans moins de 2% des souris de l’élevage grâce à une observation renforcée des animaux). Les souris développent aussi des tumeurs hépatiques autour de 12-15 mois ce qui ne constituera pas un point limite dans ce projet puisque les procédures seront limitées à 6 mois. Enfin, les souris seront isolées physiquement afin de mesurer leur prise alimentaire et leur rythme de prise de nourriture. Cet isolement sera limité à 4 jours. Il peut entrainer un stress chez l’animal.
Devenir
A l’issu du projet, l’avis vétérinaire désigné sera demandé pour chaque animal afin d’évaluer la gravité réelle subie au cours du projet. Ces animaux mis en procédure sévère ne pourront pas être utilisés dans un autre projet et seront mis à mort.
Remplacement
L’étude du comportement alimentaire des souris atteintes de GSDIa nécessite de travailler sur les animaux vivants. Ce modèle animal reproduit toute la pathologie hépatique de cette maladie rare, y compris les modifications de l’horloge biologique liées probablement aux adaptations des prises alimentaires des souris régulièrement nuit et jour afin d’éviter le développement d’hypoglycémies.
Réduction
Afin de pouvoir réaliser une analyse statistique, le nombre d’animaux a été limité à 11 souris par groupe (avec une souris supplémentaire pour les souris atteintes de glycogénose en cas de décès d’un congénère), soit au total 23 animaux, sur une période de 2 ans. Ce nombre a été calculé pour obtenir une puissance d’étude élevée et tenir compte de la variabilité inter-individus. Les résultats des 2 groupes de souris étudiés seront comparés par un test statistique.
Raffinement
Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDIa, la pathologie a été induite uniquement dans le foie et à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies chez les souris nourries et de passer la période néonatale sans phénotype dommageable (pas de retard de croissance). Pour éviter les réactions inflammatoires liées à l’injection du produit chimique utilisé pour générer les souris transgéniques, les traitements seront réalisés par injections sous-cutanées. La connaissance de ce modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes accessibles directement dans la cage) et au biberon. L’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, morsures...) et du comportement des animaux pour détecter tout mal -être occasionné par une hypoglycémie (fiche de suivi des animaux fournie aux zootechniciens). En cas d’hypoglycémie, la souris sera systématiquement injectée avec une solution de sucre et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. Dans ce projet, aucune souris ne sera mise à jeun. A leur arrivée dans le deuxième établissement, les souris seront hébergées pendant une période de 15j au minimum afin de s’acclimater à leur nouvel environnement. L’enrichissement sera conservé tout au long de l’étude. Les souris seront ensuite hébergées progressivement dans les cages d’enregistrement de la prise alimentaire pour les habituer à l’isolement. Un suivi du poids sera effectué quotidiennement lors de l’isolement de l’animal. Pour réduire le stress de l’isolement, les cages sont transparentes et sans couvercle permettant aux souris un contact visuel sonore et olfactif. Des céréales (type Kellogg’s) seront proposées aux souris à la fin de chaque période d’isolement comme récompense. En cas de petites plaies, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles qui apaise et cicatrise sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Pour cela, un modèle de souris reproduisant la pathologie hépatique de la glycogénose de type Ia a été obtenu par transgenèse en ciblant uniquement la perte de production de sucre par le foie. Ce modèle murin est unique et viable. En effet, l’élevage des deux autres modèles d’animaux atteints de glycogénose de type Ia (souris et chien qui présentent une perte totale de la production de sucre par l’organisme est très complexes car la plupart des animaux meurt avant le sevrage. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 6 mois.
Implication des peptides bioactifs issus de protéines agroalimentaires sur le métabolisme énergétique et glucidique, l’hypertension et le stress oxydatif
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une partie des 768 rats utilisés est génétiquement hypertendue, retenue pour éviter d'avoir à provoquer l'hypertension par un produit chimique. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : un gavage oro-gastrique par jour pendant trois semaines, six prélèvements sanguins par incision de la queue lors des tests de tolérance au glucose, quatre jours en cage métabolique isolée, jusqu'à vingt minutes de contention par mesure de pression artérielle. Le porteur reconnaît que la répétition des gavages peut irriter ou léser l'œsophage et que l'isolement, jusqu'à dix-neuf semaines, induit du stress, tout en qualifiant les cages métaboliques d'"indispensables". L'enjeu déclaré est de confirmer chez le rat des effets de protéines agroalimentaires déjà observés in vitro, et la mise à mort sert à prélever le plasma, la muqueuse intestinale, le cœur, les reins, le foie et les poumons.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : - D’étudier l’effet des protéines issues de l’agro-alimentaire (différentes sources : végétales, animales, poissons) sur le métabolisme énergétique, le métabolisme glucidique intestinal (effet des protéines seules ou couplées à un inhibiteur de l'absorption du glucose), la prise alimentaire, la sécrétion de certaines hormones impliquées dans le métabolisme énergétique ainsi que certains marqueurs de l’oxydation. - De comprendre les mécanismes impliqués dans la digestion des protéines en relation avec la régulation de la prise alimentaire. - D'étudier l'effet des protéines issues de l'agro-alimentaire (différentes sources : végétales, animales, poissons) sur la tension artérielle ainsi que sur le dosage de certaines enzymes impliquées dans l'hypertension artérielle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une confirmation des résultats déjà obtenus in vitro. Cela démontrerait l'effet bénéfique des protéines alimentaires sur la santé, plus particulièrement dans la prévention contre le diabète de type 2, l'hypertension et l'obésité et donc de prévenir ces pathologies en utilisant une alimentation adaptée voire personnalisée.
Procédures
- La mesure de l’effet des protéines sur la régulation de la glycémie est réalisée en donnant les protéines (avec ou sans inhibiteur de l’absorption du glucose), puis 30 min après, du glucose par gavage oro-gastrique à l’aide d’une sonde de gavage. Pendant cette procédure, des prélèvements sanguins sont réalisé sur animaux vigiles au niveau de la queue avant (à min) et après 15, 30, 60 et 90 et 120 min après avoir donné le glucose (soit 6 prélèvements). - Des prélèvements sanguins sont réalisé sur animaux vigiles au niveau de la queue avant et après gavage oro-gastrique de protéines afin de mesurer les niveaux plasmatiques de certaines hormones intervenant dans la régulation de la prise alimentaire (0 ; 30 et 60 min après ingestion des protéines, soit 3 prélèvements), de la tension artérielle (0 min et 4 h après ingestion des protéines, soit 2 prélèvements). - La mesure de la prise alimentaire en utilisant des cages métaboliques pendant 4 jours maximum (un jour d’acclimatation et 3 jours de test avec un gavage oro-gastrique par jour). Les cages métaboliques permettent la mesure en continue de la prise alimentaire, de la prise de boisson et de la dépense énergétique. - Afin de mesurer l’effets des protéines sur la régulation de la prise alimentaire sur du long-terme, les animaux reçoivent les protéines 1 fois par jour par gavage oro-gastrique pendant 3 semaines. - La mesure de la pression artérielle est mesurée de la même façon que chez l’Homme. Pour cela, les animaux sont placés dans des cages de contentions pour limiter leurs mouvements et la mesure est réalisée au niveau de la queue du rat. Cinq mesures de la pression artérielle est prises avant gavage et après gavage (2,4 et 6h). Les animaux sont replacés dans leur cage d’hébergement après chaque mesure. - Afin de mesurer l’effets des protéines sur la régulation de la pression artérielle sur du long-terme, les animaux reçoivent les protéines 1 fois par jour par gavage oro-gastrique pendant 3 semaines. En fin d’expérimentation, les animaux reçoivent les protéines par gavage oro-gastrique et sont mise à mort après anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
- L’incision de la queue lors des prélèvements de sang entraîne une douleur légère de courte durée et sans réitération au cours de la procédure de test oral de tolérance au glucose, il est donc préférable à l’utilisation répétée de l’aiguille pour le prélèvement dans la queue. - L’isolement des animaux sur le long terme (19 semaines maximum), ainsi que la contention répétée pour les prélèvements de sang (moins de 5 minutes par prélèvement de sang), pour la pression artérielle (20 minutes par mesure de la pression artérielle) ou pour les gavages (moins de 5 minutes) induit de l’inconfort et du stress chez les animaux mais il est nécessaire à l’obtention d’une réponse individuelle. - Le gavage oro-gastrique en tant que tel n’entraîne pas de douleur mais la répétition des gavages peut entraîner des lésions ou une irritation au niveau de l’œsophage, en particulier dans les procédures où les animaux reçoivent un gavage journalier pendant 3 semaines. - L’utilisation des cages métaboliques ou l’animal est isolé pour la mesure de la prise alimentaire, de boisson et la dépense énergétique sur 4 jours induit un stress chez l’animal car il change de pièce sur plusieurs jours, avec un accès à la nourriture différent (mangeoire plus petite et suspendue pouvant entraîner une difficulté pour se nourrir). L’utilisation de ces cages est cependant indispensable pour la mise en évidence d’un effet individuel sur la prise alimentaire. - La mesure de la pression artérielle n’entraîne pas de douleur mais peut entraîner une gêne de courte durée (le temps de la mesure) au niveau de la queue car plusieurs mesures sont réalisées pour chaque temps (0 ;2 ;4 et 6h, donc 4 mesures espacées sur la même journée). - En fonction des protéines, il est possible que le gavage atteigne le volume maximal pouvant être donné aux animaux, ce qui est un inconfort supplémentaire pour l’animal de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de récupérer le plasma pour des dosages hormonaux en lien avec la régulation de la prise alimentaire, l’oxydation ou en lien avec la régulation de l’hypertension artérielle. De plus, certains tissus tels que la muqueuse intestinale pour les modifications dans l’expression des gènes induites par les protéines, le cœur, les reins, le foie, les poumons afin de mesurer les marqueurs de l’hypertension artérielle, seront prélevés.
Remplacement
L’objectif de cette expérimentation est de tester l'effet hypoglycémiant, satiétogène, antioxydant et antihypertenseur de protéines agro-alimentaires d'origines variables. Pour cela, des rats seront gavés avec ces différentes protéines et les effets observés seront comparés aux effets chez des rats gavés par une solution sans protéine (eau ou solution isocalorique). Un test in vitro sur une lignée intestinale et des tests biochimiques sont utilisés au laboratoire en parallèle afin de minimiser l’utilisation des animaux mais ces tests, basés sur un dosage hormonal ou enzymatique, ne permettent pas de mettre en évidence l’effet des protéines sur la prise alimentaire. De plus, ces tests in vitro ne permettent pas de prendre en compte le système complexe du corps (interactions intestin-cerveau- pour la régulation de la prise alimentaire, interactions reins-poumons-cœur pour la régulation de la tension artérielle) A cette étape l’utilisation des animaux est indispensable.
Réduction
Des études in vitro au laboratoire ont préalablement été réalisées afin de sélectionner les protéines à tester, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction a été appliqué et le nombre réduit à 8 animaux par groupe, ce qui est un minimum pour les analyses statistiques, compte tenu des possibilités de problème individuel de croissance sur les animaux. Les animaux peuvent recevoir différentes protéines pour une même procédure après un temps de repos suffisant. Ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés mais également de sélectionner les protéines ou les doses données. Enfin, après mise à mort, le plasma et les organes collectés sont divisés et placés dans différents tubes pour réaliser différents tests sur un même individu. De cette façon, le nombre d’animaux est également réduit.
Raffinement
Dans la mesure du possible, les animaux sont automatiquement placés par deux dans les cages d'hébergement afin d'éviter le stress d'isolement de l'animal. Pour les procédures de mesure de la prise alimentaire en cages métaboliques et de prise alimentaire sur le long terme, les animaux sont placés individuellement par cage dès leur arrivée afin de diminuer le stress d’isolement avant le début de l’expérimentation. Cependant, les cages sont placées de telle sorte que les animaux arrivent à se voir entre eux (pas de cage isolée sur le portoir). De plus, toutes les cages contiennent de l'enrichissement (tunnel rouge, litière mais également des rondins de bois pour les animaux qui ne sont pas dans les procédures de prise alimentaire). Afin de diminuer le stress induit par les différentes procédures, les animaux sont entraînés avant le début des expérimentations, au gavage, aux cages métaboliques, à la contention, à la mesure de la pression artérielle. De plus, le choix de travailler sur des animaux génétiquement hypertendus pour mesurer l’effet des protéines sur la pression artérielle, permet de ne pas induire l’hypertension chimiquement, ce qui entre dans le principe de raffinement. Tous les animaux mais en particulier les animaux hypertendus sont surveillés tous les jours et après chaque gavage (dans l’heure qui suit le gavage mais surtout 24h après le gavage). Les périodes de mise à jeun des animaux sont toujours réalisées dans la période de repos (lumières allumées) des animaux lorsque les animaux mangent peu. Ceci permet de diminuer le stress que la privation de nourriture peut engendrer.
Choix des espèces
Le choix du rat est lié à l’abondance de bibliographie sur de telles études mais ce modèle est également préféré à la souris compte tenu du volume de sang pouvant être prélevé, permettant de doser toutes les hormones d’intérêt et de réduire le nombre d’animaux. Des rats mâles sont choisis plutôt que des femelles afin de limiter les effets des cycles hormonaux. Le modèle de rats hypertendus a été sélectionné car il permet d'étudier l'effet des protéines sur un modèle hypertendu sans induction chimique de l’hypertension. Des rats âgés de 12 semaines seront utilisés dans le protocole. A ce stade les rats sont adultes et leur poids est stabilisé. Le facteur croissance n’impactera pas la prise alimentaire. Des rats hypertendus âgés de 16 semaines seront utilisés dans le protocole. A ce stade, ces rats seront tous hypertendus au début de l'expérimentation.