Procédures sévères

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit une chirurgie pour greffer des cellules d'adénocarcinome pancréatique directement dans le pancréas, une autre reçoit ces cellules par voie intraveineuse, et le porteur indique que des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons, pouvant entraîner des difficultés respiratoires, ainsi que dans le foie, la rate et les ganglions. Il annonce une perte de poids liée aux tumeurs pancréatiques et un stress lié aux contentions multiples, puis décrit un dispositif de confort, tapis chauffant et protection des yeux sous anesthésie, sans détailler les points limites qui déclencheraient une mise à mort anticipée. Le laboratoire développe des modèles cellulaires en trois dimensions et ne teste chez la souris que les molécules déjà actives in vitro, ce qui n'empêche pas de classer l'ensemble du projet au niveau de souffrance le plus élevé.

Objectifs

Les carcinomes canalaires pancréatiques sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, le rôle d’une nouvelle voie oncogénique dans le développement de ces tumeurs. Dans un deuxième temps, nous étudierons le rôle de cette voie sur la dissémination métastatique des tumeurs.

Bénéfices attendus

A ce jour, les cancers du pancréas représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.

Procédures

Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min).

Impact sur les animaux

La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés

Remplacement

Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.

Réduction

Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.

Opérés du thorax par incision latérale pour créer une insuffisance cardiaque droite, 22 cochons seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit trois anesthésies générales à deux, six et huit mois de vie, une ou deux interventions chirurgicales d'environ une heure, une ponction artérielle et des échocardiographies, avant l'explantation du coeur. Le porteur liste comme nuisances le risque d'hémorragie, la douleur de la thoracotomie dans les premiers jours, un risque infectieux pouvant imposer une reprise chirurgicale, et le stress des transports entre le laboratoire et la ferme d'hébergement. Il affirme que le recours aux gros animaux est "indispensable" pour une application clinique à court terme, tout en menant en parallèle des cultures d'organoïdes cardiaques qu'il présente comme un moyen d'éviter plus tard l'usage d'animaux.

Objectifs

1/ Terminer l’étude de notre thérapie cellulaire sur le rythme cardiaque. Une précédente étude a déjà inclus des animaux traités par des progéniteurs cardiaques, c’est à dire de très jeunes cellules engagées pour former de futures cellules cardiaques matures, administrés grâce à un patch appliqué sur la surface du ventricule droit. Afin de faire une analyse comparative du risque d’anomalies du rythme liées aux progéniteurs, il est nécessaire d’inclure des animaux non traités par cette thérapie cellulaire. 2/ Comprendre le processus de rajeunissement des cellules cardiaques de l’animal receveur (processus appelé reprogrammation cellulaire), déclenché par notre thérapie cellulaire en étudiant l’environnement autour de ces cellules. 3/ Tester dans notre modèle animal d’insuffisance cardiaque, certaines protéines impliquées qui seront administrés sous forme d’ARN messager. On évaluera la faisabilité, la sécurité et l'efficacité de cette technique moins invasive pour obtenir une réponse sur la fonction cardiaque équivalente à celle obtenue par l’administration directe de cellules souches.

Bénéfices attendus

Scientifique : ce projet permettra d’approfondir les connaissances sur les mécanismes d’action de la thérapie cellulaire utilisant les progéniteurs cardiaques qui sont de très jeunes cellules souches immatures engagées pour devenir de futures cellules cardiaques matures. Nos résultats, en découvrant une autre action de ces cellules souches greffées, pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’insuffisance cardiaque (IC) par la découverte de médicaments induisant une reparation du muscle cardiaque. Médical : les perspectives sont d’initier à court terme un essai clinique pour traiter de jeunes patients adultes souffrant d’une IC sévère et évoluée secondaire à une défaillance du ventricule droit. Cette IC est observée dans le suivi à long terme de différentes malformations cardiaques. Certains de ces patients sont orientés vers la transplantation cardiaque. En cas de contrindication à la transplantation ou de délai d’attente du greffon trop prolongé, ces patients pourraient bénéficier de cette thérapie cellulaire afin de prévenir l’IC terminale conduisant au décès. La thérapie cellulaire pourraient être réalisée soit de façon directe par l’administration de patch ou de gel contenant les progéniteurs cardiaques appliqué sur le coeur, soit indirecte par le biais de médicaments produits grâce à l’ARN messager et ayant la même efficacité. Santé publique : l’IC droite des jeunes adultes atteints de malformations cardiaques congénitales apparait comme nouvel enjeu et priorité. En France, 7000 enfants/an naissent avec une cardiopathie dont 90% nécessitera une intervention à la naissance ou au cours des premières semaines/mois de vie. Grâce aux progrès de la prise en charge chirurgicale ces dernières décennies, 90% de ces patients atteignent maintenant l’âge adulte. En France, déjà 350 000 adultes et 4000 enfants naissant chaque année avec une malformation cardiaque complexe qui font croître de manière significative et régulière, (environ de 5% par an) cette population de patients. Un tiers d’entre eux ont des séquelles chirurgicales sévères et/ou des malformations cardiaque sévères qui nécessite pour certains à partir de 30-40 ans une transplantation du coeur en raison d’une insuffisance cardiaque terminale.Les difficultés/le délai d’obtention d’un greffon cardiaque et les moins bons résultats de la transplantation cardiaque dans cette population spécifique justifient la recherche d’alternatives thérapeutiques.

Procédures

Toutes les procédures décrites ci-dessous seront réalisées sous anesthésie générale après prémédication des animaux pour réduire leur angoisse. Néanmoins, tous les animaux devront subir 3 anesthésies générales (à 2 mois, 6 mois et 8 mois de vie afin de réaliser les étapes du protocole, soit selon les groupes 1 ou 2 interventions chirurgicales et une ponction artérielle. Chaque intervention dure environ 1 heure et est précédée d’une échocardiographie (durée 30 minutes environ). En Fin de protocole, les animaux seront euthanasiés selon une méthode conforme à l’Arrêté du 1er février 2013 : sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Les interventions chirurgicales pour créer la pathologie cardiaque et pour administrer la thérapie cellulaire par patch sont effectuées par incision latérale du thorax. Les nuisances sont liées au stress inhérent aux anesthésies générales, au risque d’hémorragie, ainsi qu’à la douleur induite par la thoracotomie dans les premiers jours post-opératoires et au risque infectieux essentiellement local au niveau de la cicatrice pouvant nécessiter une reprise chirurgicale ou des soins sous sédation; les transports entre le laboratoire et la ferme d’hébergement peut être une source de stress.

Devenir

L’euthanasie est rendue nécessaire en fin de protocole chez tous les animaux pour explanter le cœur et réaliser les différentes études tissulaires sur le myocarde.

Remplacement

L’utilisation des gros animaux est dans un premier temps indispensable dans la perspective d’une application clinique à court terme de cette thérapie cellulaire afin d’assurer une sécurité optimale pour le patient (modalité d’administration, tolérance rythmique); par ailleurs le porc a des caractéristiques cardiaques proches de l’Homme ce qui en fait un modèle idéal. Si l’utilisation des animaux est dans un premier temps indispensable dans ce projet préclinique avec un objectif clinique à court terme, une approche in vitro est réalisée parallèlement sur des organoïdes (cardioïdes) obtenu par une technologie de culture de cellules en 3D, conçus pour imiter le scénario potentiel in vivo et éviter ultérieurement l’utilisation des animaux. Les processus de rajeunissement et re- maturation des myocytes (la reprogrammation cellulaire) seront utilisées comme indicateurs avec les mêmes techniques d’étude que chez l’animal.

Réduction

L’étude actuelle étant inscrite dans la suite de notre projet initial, les groupes seront comparés aux animaux déjà utilisés dans nos précédentes études, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux utilisé (N=22) a été déterminé par calcul statistique.

Raffinement

- Respect d’une période d’acclimation de 3 jours avant les procedures expérimentales. - Observations quotidiennes par une personne compétente basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclin aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. - Environnement ( balles, jouets en caoutchouc durs mastiquables...)adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux - Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, cardiologues séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum. - Contrôle biquotidien en postopératoire par une personne compétente avec évaluation de la douleur. L’évolution du score (calculé selon les observations de l’animal et de tout mal être décelé) permet de noter l’amélioration ou l’aggravation de l’état de l’animal et de prendre les mesures appropriées. - Tout constat d’un mal- être est remonté au responsable du projet et au vétérinaire délégué pour des examens approfondis et traitements adaptés. Si la douleur, la souffrance et l’angoisse ne pouvaient être réduites à leur minimum (augmentation du score), une décision d’interruption d’expérimentation et/ou d’euthanasie sera prise. Des médicaments anesthésiques et antalgiques sont utilisés à chaque étape des experimentations.

Choix des espèces

Le niveau de chirurgie complexe nécessaire à la création de notre modèle ne peut pas être réalisé chez le petit animal. Ce projet étant en phase pré-clinique avec une perspective d’application à l’Homme à court terme, il doit être réalisé sur une espèce animale présentant des caractéristiques cardiaques anatomiques et physiologiques communes à l’Homme. Parmi les différentes espèces animales, le Porc a des paramètres physiologiques cardiaques comparables à ceux de l’Homme. Les animaux ont environ 8 semaines à la première intervention de création de la pathologie, en accord avec la pathologie humaine : en effet les patients atteints de certaines malformations cardiaques sévères sont opérés très jeunes, au cours des premiers mois de vie puis l’insuffisance cardiaque droite se développe chez les jeunes adolescents qui sont en phase de croissance. Chez le porc, la défaillance cardiaque s’installe progressivement après 4 mois d’évolution de la pathologie créée, conformément au développement de la pathologie chez l’homme et par rapport à la courbe de croissance du porc domestique.

Soumis à une ligature d'artère coronaire pour provoquer un infarctus, 192 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'acte chirurgical dure une heure et s'accompagne d'injections intraveineuses, de sept mesures de pression artérielle dont certaines sur animal éveillé, et de mesures de température par voie rectale. Le porteur annonce pour l'ensemble des animaux une mobilité réduite, des douleurs post-opératoires et un stress lié aux manipulations, et prévoit un isolement en cage individuelle pendant les 24 heures suivant l'opération. Il décrit une surveillance de la douleur par score de grimace, orbites rétrécies, renflement du nez, oreilles rejetées en arrière, et affirme que la procédure a un caractère de "stricte nécessité" parce que la réponse immunitaire mobilise l'"organisme entier".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires constituent l’une des premières causes de décès dans les pays développés. L’infarctus du cœur est déclenché par l’obstruction des artères coronaires qui alimentent le cœur en sang et donc en oxygène. Sans l’oxygène, les cellules du muscle cardiaque (myocarde) meurent rapidement et le cœur ne réussit pas à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins du corps, ce qui peut conduire à l’arrêt du cœur. La restauration de l'apport sanguin au niveau des artères obstruées est essentielle pour réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. Une approche thérapeutique permettant la reperfusion est de favoriser la dilatation des artères coronaires. Nous avons démontré que l’utilisation de petites vésicules naturelles, appelées microvésicules (MV), portant à leur surface une protéine spécifique, sont capables d’améliorer la fonction vasculaire dans des modèles cellulaires. Cependant, ces modèles d’étude sont limités pour évaluer l’efficacité de ces MV dans l’amélioration de la fonction cardiaque. Ainsi, le but de ce projet est de déterminer si les MV sont capables de réduire les conséquences associées à l’obstruction des artères coronaires en les injectant après l’infarctus du myocarde dans un modèle de ligature d’artère coronaire chez le rat. L’expérimentation animale prévue dans ce projet permettra d’obtenir des données pour mieux comprendre les mécanismes protecteurs des MV ainsi qu’envisager leur utilisation comme un outil thérapeutique potentiel chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Démontrer l’innocuité et efficacité in vivo du traitement avec MV et valider leur participation dans la préservation ou l’amélioration de la fonction des cellules cardiaques lors d’un infarctus de myocarde. En plus, la confirmation des effets in vivo aidera dans la validation de ces MV comme un nouvel outil thérapeutique pour le traitement des conséquences de l’infarctus de myocarde chez l’Homme.

Procédures

Quatre interventions impliquant tous les animaux : induction d’un infarctus de myocarde (durée acte chirurgical : 1 heure), injection intraveineuse réalisée pendant l’anesthésie (durée de chaque injection < 5 minutes), mesure de la pression artérielle (5 minutes, 7 mesures), mesure de la température corporelle (< 1min, 2 mesures).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les rats seront les suivants : 1) Mobilité réduite dans des cages à cause de l’acte chirurgical après l’induction de l’infarctus de myocarde ; 2) Douleurs post-opératoires à cause de l’acte chirurgical ; 3) Stress lié aux manipulations (prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de la température au niveau rectal). Les effets indésirables concernent l’ensemble des animaux.

Devenir

A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux euthanasiés. Il est nécessaire d'analyser la réduction de la taille de l'infarctus par études d'histologie dans le cœur pour valider les doses plus efficaces des MV.

Remplacement

La procédure expérimentale a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet porte sur les effets des MV sur l’infarctus de myocarde, c'est à dire sur un coeur avec une artère ligaturée puis reperfusée et leur impact dans la fonction cardiaque ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les mécanismes cellulaires mis en jeu lors d'un infarctus de myocarde font participer le tissu cardiaque en hypoxie mais également une réponse immunitaire de l'organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats en utilisant des données préliminaires de notre laboratoire pour une procédure similaire de ligature coronaire et des études fonctionnelles au niveau cardiaque chez le rat. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront réalisées sur un même animal.

Raffinement

Nous avons raffiné nos approches afin de réduire au minimum la détresse imposée aux animaux qui seront hébergés dans un milieu enrichi permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Une analgésie pré- et post-opératoire sera réalisée et renouvelée aussi souvent que nécessaire. L’état de santé des animaux sera donc évalué de façon régulière pendant les 24 heures après l’acte chirurgicale en observant leur comportement. Les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses) seront surveillés. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (suivi des cicatrices, formation d’abcès, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores suivants (cicatrice sans saignement = score 0, cicatrice saignante = score 1, cicatrice inflammée = score 3, formation d'abcès = score 4, cicatrice nécrosée = point limite; apparence physique normale = score 0, pas de toilettage = score 1, poil ébouriffé = score 2; doleur post-opératoire = score 3, détresse cardiorespiratoire = point limite; comportement normal = score 0, prostration et apathie = point limite ). Après l’acte chirurgical, les rats seront placés pendant 24h dans des cages individuelles. Dans la cage, chaque animal aurait à disposition des tubes de carton pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture.

Choix des espèces

Ce projet vise à analyser les effets thérapeutiques des MV lors d’un infarctus de myocarde. À cette fin, le choix de l'espèce Rattus norvegicus est basé sur notre connaissance de ce modèle ainsi que la disponibilité de données dans la littérature associées à l’étude de modifications dans la taille de l’infarctus. Les rats seront utilisés à l’âge de 7-8 semaines auquel les animaux sont considérés comme adultes.

Placés en cage à métabolisme sur sol grillagé, mis à jeun jusqu'à seize heures et privés d'eau jusqu'à quatre heures, 1 250 souris et 1 250 rats seront tous tués pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Ils reçoivent des composés chimiques ou biologiques, parfois radiomarqués, par voie orale, intranasale, intratrachéale, intravésicale ou intracérébrale, certaines administrations passant par une minipompe implantée chirurgicalement. La phase sur animaux vivants peut durer douze mois. Le porteur reconnaît que le sol ajouré gêne la locomotion et que ces cages sont plus petites que les cages standard, et conclut que la pharmacocinétique réelle des molécules "devra donc être vérifiée chez le rongeur".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La première procédure de ce projet permettra de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide ou radioactive, avec placement en cage à métabolisme d’une durée maximale de 72h. La deuxième procédure traitera le cas particulier où des placements longs ou répétés en cage à métabolisme seront nécessaires, uniquement pour les souris. Pour les deux procédures et dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc, dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon ); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure . Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages à métabolisme au maximum 168h ou 7 fois 24h espacées de 24h sur 2 semaines glissantes si une mise à jeun n’est pas prévue. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Afin de réaliser certains tests de biodistribution, il pourra être nécessaire de mettre les animaux à jeun d’alimentation, au maximum 16 heures. Pour certaines administration intravésicales, il pourra être nécessaire de les priver d’eau au maximum 4h. Cela pourra générer une sensation de faim, de soif et une légère déshydratation, et une perte de poids légère. Des pertes de poids liées aux composés administrés pourraient être observées. Dans le cas des placements en cage à métabolisme, les animaux pourront être hébergés individuellement (avec les congénères visibles), dans des cages plus petites que les cages standard, avec un fond ajouré gênant modérément la locomotion. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat. Dans le cas du placement en cages à métabolisme, les animaux seront sur un sol grillagé ce qui pourrait gêner leur locomotion.

Devenir

Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupe seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux par groupe devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront effectuées

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : 10% de perte du poids : animaux pesés quotidiennement et des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. 10-15%: animaux réhydratés une fois par jour. > 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% : point limite. En cas de suspicion de toxicité, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront mis en suivi clinique. Ces animaux seront examinés tous les jours et recevront si nécessaire un traitement pharmacologique avec l’objectif de l’étude. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. Toute opération chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie en matinée afin d’assurer un meilleur suivi post-chirurgical (observation toutes les 2 heures durant les 6 heures post opératoires puis au moins 1 fois par jour). La couverture analgésique débutera avant le début de la chirurgie pour une durée minimale de 48h pouvant être rallongée en cas de besoin selon les recommandations du comité d’éthique. En cours d’étude, plusieurs anesthésies seront pratiquées notamment en cas de prélèvements de sang ou d’injections de produits : • Les administrations IV, IM, IP, SC, ID de composés tests se feront si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Les administrations IN, IT, intravésicale, intrathécale, intracérébrale (avec cadre stéréotaxique) de composés tests se feront sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Une administration de buprénorphine sera réalisée avant les administrations IM/ID et avant les administrations intravésicales, intracérébrales et intrathécales. Afin de minimiser les risques d’infection lors d’injections intradermales, une tonte de la peau avec désinfection sera réalisée avant injection. Les injections intradermales se feront sous un volume de 50 µL par site d’injection afin de limiter la douleur.• L’implantation d’une mini pompe (IP, IV ou SC) ou la pose d’implants sous-cutanés seront réalisées sous anesthésie générale Isoflurane et dans des conditions d’asepsie, avec une prise en charge analgésique 30 min avant l’anesthésie, puis jusqu’à 48 heures post chirurgie si besoin. Le suivi de la cicatrisation sera enregistré, et les sutures désinfectées si nécessaire.

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera utilisée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, du fait de son faible poids et car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Dans le cas contraire, le rat sera utilisé. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Toutefois, le rat sera aussi très utilisé en particulier du fait des études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée car il est imposé par la règlementation de réaliser des études sur le rat. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

96 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Chacune subit deux chirurgies sous anesthésie, l'une pour provoquer une lésion du cerveau et l'autre pour y greffer des cellules gliales issues de l'intestin, puis des séances d'IRM et des tests comportementaux étalés sur douze mois. Une partie reçoit en plus des instillations dans le nez une fois par semaine pendant un mois, sur animaux éveillés, le porteur présentant cette voie comme "peu invasive". Les tests comportementaux sont annoncés sans être détaillés, décrits seulement comme des tâches sensori-motrices renforcées positivement.

Objectifs

Ce projet vise à contribuer aux études de réparation tissulaire et récupération fonctionnelle dans un modèle de lésion cérébrale chez le rat. Chez l'homme, après une lésion cérébrale, les moyens de récupération reposent essentiellement sur la réadaptation et la réorganisation cérébrale grâce aux mécanismes de "Plasticité Cérébrale". Ceux-ci sont insuffisants pour obtenir une récupération fonctionnelle totale. L’objectif de ce projet s’inscrit dans une approche cellulaire innovante (cellules gliales périphériques) pour favoriser la régénération tissulaire, jusqu’à atteindre une amélioration fonctionnelle. Ces cellules ont un potentiel neurogénique et neuroprotectif, qui semble intéressant dans le contexte de la médecine régénérative pour favoriser la régénération du tissu nerveux. Dans le but de répondre aux besoins chez les patients atteints de lésions cérébrales, le projet testera la faisabilité d’une voie peu invasive : la voie intranasale, qui sera comparée à la voie intracérébrale.

Bénéfices attendus

Aujourd'hui, les thérapies cellulaires pour la régénération du tissu nerveux sont limitées par leur faible sécurité et efficacité. Nous proposons une nouvelle source de cellules et approche : la greffe de cellules gliales issues du système nerveux entérique. Actuellement, l'utilisation de cellules non souches pour la régénération du tissu nerveux est peu explorée. En outre, nous proposons l'utilisation d'une voie d'administration peu invasive : la voie intranasale, qui aura un impact translationnel important.

Procédures

Dans les deux Procédures, les animaux subiront : 1) Des tests comportementaux (animaux vigiles) : 2 semaines avant les chirurgies, puis 1 semaine, 3 mois, 6 mois et 12 mois post-chirurgie ; 2) IRM (animaux endormis sous anesthésie) : 24h post-chirurgie, puis 3, 6 et 12 mois post-chirurgie ; 3) deux chirurgies (animaux endormis sour anesthésie) : l’une pour induire une atteinte du tissu cérébrale et l’autre pour tester le traitement a base de cellules (greffe). Dans la Procédure 2, l'instillation des cellules se fera par voie intranasale 1 fois par semaine pendant 1 mois (4 instillations en tout), sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables sont dus aux chirurgies. Elles peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : douleur modérée, isolement, diminution du comportement exploratoire, perte de poids. Ces effets peuvent durer jusqu’à 48h. Les tests comportementaux pourraient engendrer un stress léger dû au fait que les animaux sont enlevés de leur environnement habituel. L’instillation du traitement par les nez pourrait engendrer du stress léger parce que les animaux seront vigiles.

Devenir

96 animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux afin de réaliser les analyses histologiques.

Remplacement

La stratégie thérapeutique par greffe de cellules gliales entériques décrite dans ce projet nécessite d'être évaluée sur des animaux vivants, selon les recommandations pour la conduite des études précliniques portant sur les thérapies pour les lésions cérébrales. Les résultats primaires (test comportementaux) et secondaires (IRM et histologie du cerveau) ne peuvent pas être obtenus in vitro sur des cellules ou même sur des organoïdes. De plus, il s'agit d'une étude longitudinale au cours de laquelle les résultats primaires et secondaires seront évalués à différents times points. Enfin, pour la comparaison de deux voies d'administration (intracérébrale et intranasale) le projet nécessite des évaluations in vivo.

Réduction

Nous utiliserons 96 rats femelles adultes âgés de 12 semaines sur 5 ans. Le nombre d'animaux a été calculé sur la base de nos expériences antécédentes et de la puissance statistique obtenue avec un logiciel pour les statistiques. L’étude longitudinal permet un suivi plus personnalisé de l’animal tout en obtenant un nombre conséquent d’informations ce qui nous permet d’en limiter le nombre. Comme l’exige le principe de Réduction, nous utilisons des petits groupes d’individus.

Raffinement

Les animaux seront conditionnés pour la réalisation de taches sensori-motrices toujours renforcés positivement et non anxiogènes. Les animaux seront évalués par les expérimentateurs qui les ont entrainés. Avant les chirurgies, une anesthésie complète est prévue avec présence d'analgésie pour limiter la douleur. Les animaux seront suivis tous les jours 1 fois par jour la semaine suivant la chirurgie et recevront un analgésique pour limiter la douleur post-chirurgie (à 6h), dont la posologie sera adaptée en fonction de chaque animal. 24h avant la chirurgie (habituation) et après la chirurgie, du DietGel sera fourni pour faciliter le nourrissage et l’hydratation et donc favoriser une bonne récupération de l'animal. Aux vues de la durée de l’expérimentation (jusqu'à 12 mois), un système d’enrichissement multiple sera mis en place. Un objet d’enrichissement (tunnel, corde, boules colorées) sera changé tous les mois pour répondre au besoin néophile de l’espèce. Dans le cadre d'implémenter les stratégies de raffinement, nous habituerons les animaux à recevoir une instillation intranasale sans être anesthésiés et/ou contentionnés. Cela évitera un stress répété dû aux anesthésies.

Choix des espèces

Les rats sont un modèle privilégié pour l'étude des lésions cérébrales et pour tester l’efficacité des stratégies thérapeutiques. Le modèle de lésion cérébrale utilisé dans ce projet a été validé et publié par notre équipe et, comparé aux modèles de lésion cérébrale chez les souris, il engendre une mortalité significativement inférieure. Les tests comportementaux prévus dans ce projet ont aussi été adaptés au modèle rat et validés par notre équipe. Animaux adultes (rats femelles) âgés de 12 semaines afin de se rapprocher de la démographique humaine au stade adulte.

Rendus diabétiques par une injection unique puis greffés d'îlots pancréatiques sous anesthésie, 232 souris et 232 rats sont tous tués pour des prélèvements terminaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ une heure suivie d'une semaine d'isolement, des tests de tolérance au glucose avec jusqu'à dix prélèvements sanguins sur trois à six heures, des prises de sang jusqu'à trois fois par semaine pendant six mois, et une évaluation de la neuropathie par stimulation tactile et thermique des pattes. Alors que la gravité déclarée est sévère, le porteur ne décrit que des "effets indésirables légers", perte de poids, épisodes d'hypoglycémie, jeûne de seize heures et stress lié aux administrations. Il affirme que les modèles animaux "restent indispensables" pour valider la tolérance et l'efficacité du dispositif chez l'humain.

Objectifs

Le diabète est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion d'insuline (diabète type 1) ou d'action de l'insuline (diabète de type 2). L’hyperglycémie chronique expose les personnes atteintes à un risque accru de pathologies plus graves telles que la néphropathie, la neuropathie, les complications cardiovasculaires, oculaires (rétinopathie). Aujourd’hui, l’incidence du diabète a atteint une proportion pandémique et les estimations pour les prochaines années sont alarmantes, on estime que d’ici à 2045, le nombre de diabétiques s’élèvera à 700,2 millions dans le monde. Le diabète de type 1 (DT1), résulte d’une réaction auto-immune par une autodestruction progressive des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas, productrices d’insuline. Ainsi, les patients souffrants de DT1 n’ont d’autre choix qu’un apport exogène d’insuline pour pouvoir réguler leur homéostasie glucidique. Aujourd’hui, malgré une amélioration non négligeable de la gestion du DT1 par le développement des analogues à l’insuline et l’utilisation de moniteurs de glycémie, la régulation glucidique reste compliquée pour certains patients. En effet, ces derniers sont souvent exposés à des épisodes d’hypoglycémie iatrogène.Une alternative offrant une meilleure capacité de régulation glucidique serait une greffe d’ilots pancréatiques. Toutefois, le recours systématique aux traitements immunosuppresseurs pour protéger les cellules greffes de la destruction à médiation immunitaire, reste le principal obstacle. Afin d’éviter l’utilisation de traitement immunosuppresseur, qui expose le patient à un risque accru de complications infectieuses, la greffe d’ilots pancréatiques encapsulés représente une stratégie thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules d’ilots de Langerhans sont contenues dans une capsule semi-perméable, les protégeant ainsi du rejet par le système immunitaire, tout en permettant le passage à la fois des nutriments, de l’oxygène et de l’insuline. Ainsi, l’objectif du présent projet est d’évaluer l’efficacité des ilots encapsulés implantés chez les animaux diabétiques sur la régulation métabolique et à prévenir les complications liées au diabète (rétinopathie et neuropathie).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité des implants d’ilots pancréatiques sur la régulation métabolique et leur tolérance locale chez les rats diabétiques. Par ailleurs l'effet préventif des implants sur les complications du diabète (neuropathie, rétinopathie) est également évalué.

Procédures

Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute). Après sélection des animaux diabétiques, les ilots pancréatiques nus ou encapsulés sont injectés ou implantés/explantés par chirurgie sous anesthésie qui dure généralement 1 heure. Par la suite, les animaux sont maintenus isolés avec enrichissement pour une meilleure récupération post-chirurgicale (généralement pour une semaine). Juste avant la chirurgie et durant la période post chirurgicale, anti-inflammatoire et antibiotique sont administrés par bolus rapide (quelques secondes) par voie sous-cutanée ou intramusculaire (de manière générale) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (1/ mois) nécessitent une administration unique par voie orale, intrapéritonéale ou sous cutanée (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 10 prélèvements maximum, sur 3 à 6 h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang peuvent être réalisés de manière répétée par exemple : 3 fois par semaine au maximum pendant la toute durée de l’étude (6 mois au maximum), chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. De plus, un hébergement individuel (durée maximum de 24 h) peut être nécessaire au cours de l'étude pour prélèvement d'urine ou de fèces. L’évaluation de la neuropathie se fait par stimulation tactile et/ou thermique au niveau des pattes de l’animal, la procédure dure quelques minutes et peut être répétée 1 fois par semaine au maximum. Enfin, un examen du fond de l’œil (durée de quelques minutes, répété 1 fois par semaine au maximum) est réalisé par méthode non invasive (ophtalmoscope).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures, ceux-ci sont essentiellement marqués par : (1) une perte de poids suite à l'induction des troubles métaboliques, (2) des phases d’hypoglycémie ou d'hyperglycémie, (3) une courte privation de nourriture (pour une durée n’excédant pas 16h ± 1 h) ou des prélèvements sanguins et/ou urinaires, (4) à un stress lié à l'administration de substance. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, l’atteinte de points limites clairement établis permettraient l'euthanasie de l'animal. Par ailleurs, de courtes périodes d'isolement n’excédant pas 24h ± 1h sont nécessaires au projet (en veillant à conserver le contact olfactif, visuel et sonore entre les congénères). En outre, lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, appétit, excrétion de fécès…).

Devenir

Tous les animaux sont soumis à des prélèvements terminaux ce qui implique leurs euthanasies.

Remplacement

De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires de concept, d’effectuer un tri du matériel d’encapsulation et de ne retenir que les matériaux présentant une certaine efficacité et inocuité.. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne donnent aucune indication sur la tolérance et l’efficacité du complexe (capsule-ilots) chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (Implant sans ilots ou Placébo) et éventuellement à un contrôle positif et négatif (implantation d’ilots par voie intra-portale : ilot allogénique et ilot syngénique) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L’analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à la procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/post-opératoires complets.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du Diabète, il présente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence). Par ailleurs les rongeurs soumis à la procédure d'induction du diabète par injection de streptozotocine seront agés au maximum de 12 semaines en début de traitement et ce afin d'éviter le risque de mortalité.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une lésion chirurgicale du nerf sciatique qui induit une douleur qu'il qualifie d'irréversible, avec perte de mobilité et perte de poids, suivie d'injections sur animal vigile, de prélèvements sanguins répétés à la queue et, pour certains groupes, d'une chirurgie terminale. Les tests de sensibilité ne sont pas nommés, le résumé mentionnant seulement une mesure du seuil de douleur de dix minutes. Le nombre de prélèvements caudaux varie d'une rubrique à l'autre, neuf dans la description des procédures et dix-neuf sur trois heures dans celle du raffinement, et le porteur justifie le recours aux souris en affirmant que les cultures cellulaires ne modélisent pas la dégradation de la morphine dans un "organisme entier".

Objectifs

La douleur neuropathique (atteinte des nerfs provoquant une douleur persistante) affecte 10% de la population et est traitée par des antidépresseurs qui sont peu ou pas efficaces. Les morphiniques sont alors utilisés pour soulager ces douleurs. Or, en comparaison d’autres types de douleur, il est nécessaire d’injecter plus de morphine car celle-ci est moins efficace sur la douleur neuropathique. Lors d’une neuropathie, une voie de signalisation intracellulaire particulière induit une augmentation des quantités d’enzymes de dégradation de la morphine. Il en résulterait une dégradation accrue de la morphine et donc de son effet analgésique. Nos manipulations in vitro montrent que l’inhibition de cette voie diminue la dégradation de la morphine. Notre but est de montrer que l’inhibition de du Récepteur de l'Aryl hydrocarbone (AhR) impliqué dans la détoxification des molécules exogènes) permettrait d’augmenter l’activité analgésique de la morphine lors d’une neuropathie. Ces résultats permettraient de développer de nouveaux traitement pour soulager les patients neuropathiques

Bénéfices attendus

Nous avons montré sur des cellules et chez la souris que l’inhibition du Récepteur de l'Aryl hydrocarbone (AhR) diminuait l’expression des enzymes de détoxification et donc la dégradation de la morphine. Il en résulte une augmentation de l’analgésie de la morphine. L’inhibition d’une nouvelle voie métabolique impliquée dans la dégradation. Il en résulterait beaucoup moins d’effets secondaires. Une telle démonstration permettrait d’envisager de nouveaux traitements contre la douleur neuropathique qui est partiellement résistante à l’effet analgésique de la morphine. Les trois premières procédures permettront de prouver l’implication de l’AhR dans la faible analgésie de la morphine lors de neuropathies, permettant de cibler l’AhR lors du développement de traitements. Les deux dernières procédures mettront en évidence d’une enzyme de dégradation de la morphine qui pourrait aussi représenter une nouvelle cible thérapeutique.

Procédures

Un 1er groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10 min), puis une injection sur animal vigile (30sec) et 1 test de mesure du seuil de douleur (10min). Un 2ème groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10min), puis une injection sur animal vigile (30sec), ainsi que 9 prélèvements de sang à la queue sur animal vigile (30sec). Un 3ème groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10 min), puis une injection sur animal vigile (30sec) et une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min). Un 4ème groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10 min), une injection sur animal anesthésié (5min), une injection i.p. sur animal vigile (30sec) et 1 test de mesure du seuil de douleur (10min). Un 5ème groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10 min), une injection sur animal anesthésié (5min), une injection i.p. sur animal vigile (30sec) et une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min).

Impact sur les animaux

La lésion du nerf sciatique induit une douleur irréversible. La chirurgie peut provoquer des œdèmes, une inflammation ou une infection locale. Cette lésion conduit à une perte de mobilité, ainsi qu’à une perte de poids. Concernant les injections, elles peuvent entrainer une douleur aiguë, une inflammation locale et une infection. Concernant les prises de sang à la queue, celles-ci peuvent aboutir à des saignements, une inflammation locale.

Devenir

Pour chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus.

Remplacement

La chirurgie permettant la mise en place d’une douleur chronique provoque des problèmes moteurs importants. Nos travaux ont montré qu’un composé est capable d’amplifier l’effet analgésique de la morphine via une inhibition du Récepteur de l’aryl hydrocarbone (AhR). Le but de notre projet est de montrer chez la souris que l’AhR qui induit une enzyme de dégradation diminue les quantités de morphine et donc l’analgésie. Nos études nécessitent des animaux car (1) les modèles cellulaires ne permettent pas de caractériser l’action d’un composé sur douleur. (2) les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser la dégradation de la morphine dans l’organisme entier.

Réduction

520 animaux (260 souris mâles et 260 femelles) sont nécessaires à la réalisation des études statistiques. L’effet attendu étant inconnu, une analyse de puissance n’est pas possible. Toutefois, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 10 animaux par groupe étaient généralement suffisants pour obtenir la significativité statistique de l’effet d’un traitement antiallodynique en conditions neuropathiques. Les effectifs de 10 animaux tiennent également compte de la possibilité de devoir écarter un animal en cours de procédure (par exemple suite à des blessures consécutives à des bagarres) ou de la possibilité d’un problème technique (décès pendant la chirurgie). Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle cohorte avec tous les groupes contrôles devra être ajoutée ce qui va à l’encontre de la réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots successifs avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions à tester chaque lot. Les tests statistiques ANOVA à 2 facteurs, suivis de comparaisons multiples, permettront de mettre en évidence des différences statistiques.

Raffinement

d'interactions sociales et leur cage enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunnels pour éviter la prise par la queue et réduire le stress des animaux. Pour aider à la reprise de poids, des aliments sous forme de gel sont déposés dans la cage. Les blessures superficielles sont désinfectées avec une solution de chlorhexidine. Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au contexte du test (i.e. boites du test) est réalisée. Dans les tests comportementaux où on évalue la sensibilité à un stimulus nociceptif, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) même en absence de réaction de l'animal. Par ailleurs des points-limites ont été établies pour pour chacune des procédures réalisées. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et sous analgésie et du gel oculaire est appliqué durant la procédure. Nous réaliserons des injections dans la moelle sous une anesthésie totale. Concernant les prises de sang à la queue des souris, nous réaliserons une anesthésie du bout de la queue 10min avant le 1er prélèvement de sang, puis 19 prélèvement seront réalisés sur 3h. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal. Par ailleurs, lors des tests comportementaux de mesure de seuil de douleur, l’animal peut retirer sa patte librement.

Choix des espèces

Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés sont réalisées chez la souris . Par ailleurs, l’utilisation de cette souche est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus sur le modèle de douleur chronique. Par ailleurs, nous nous sommes focalisé sur cette espèce car c’est le prérequis avant une application des hypothèses chez l’homme qui possède des voie métaboliques similaires. Le modèle de souris jeune adulte reste la référence dans les études pré-cliniques. Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines afin d’avoir des animaux qui sont physiologiquement matures. D’autre part, la mise en place du système opioïdergique est uniquement mature chez l’adulte (i.e., expression des récepteurs Mu à la morphine).