Procédures sévères

Soumises à une biopsie de la queue puis à l'induction d'un AVC ischémique ou hémorragique, 2 000 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit des pertes de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels ou cognitifs, avec mise à mort au-delà de 20 % du poids perdu ou d'un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace de la souris. Un groupe de 640 animaux cumule l'AVC provoqué et un diabète de type 1 servant de facteur de comorbidité. Le porteur affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

Le tPA est une sérine protéase principalement connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des AVC ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques dont le développement cérébral, la plasticité synaptique, ainsi que dans des processus d’apprentissage et de mémoire. Grâce à ses différents domaines, le tPA interagit avec différents récepteurs tels que les N-methyl-D-aspartate (NMDAR). Cette interaction était impliquée dans certains processus physiologiques tels que la plasticité synaptique, la corticogenèse et pathologiques (AVC, sclérose en plaques/SEP, inflammation). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction tPA/NMDAR. Ainsi, l’objectif de ce projet est tout d’abord, d’évaluer l’impact du tPA endogène ou l’inhibition de son interaction avec le récepteur NMDA sur les lésions cérébrales, la réponse inflammatoire et la récupération fonctionnelle dans des modèles murins d’AVC ischémique ou hémorragique. De plus, il s’agit de démontrer l'effet ainsi que le potentiel thérapeutique de l’administration d’un anticorps monoclonal (le Glunomab®) dans ces modèles murins.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle crucial (AVC, SEP et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de cette interaction permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.

Procédures

Biopsie de queue faite vers 6 jours pour chaque animal (n=2000). Procédure 1 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 2 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 3 (n=640) : Modèle d’AVC accompagné d’un facteur de comorbidité (diabète de type 1). - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures. -J0+6h : Evaluation de l’inflammation cérébrale par IRM. - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, perméabilisation) post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux. Procédure 4 (n=80) : Modèle d’AVC hémorragique. - J0 : Induction de l‘AVC hémorragique. - J+1, J+3 : Evaluation du volume de lésion hémorragique et de l’œdème, post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : Biopsie de la queue (douleur légère de courte durée), une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines). Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.

Réduction

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires.

Tous tués à l'issue, 231 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère commencées dès les premiers jours de vie. 144 d'entre eux sont opérés de la moelle épinière pendant 45 minutes au maximum, ce qui leur fait perdre l'usage des membres postérieurs, puis reçoivent deux injections quotidiennes pendant cinq jours et une injection par jour d'expérimentation entre le cinquième et le vingt-et-unième jour. Le porteur indique que le stress lié à la paralysie est limité par le maternage et que la prise de poids se normalise après quatre jours. Les tests comportementaux annoncés parmi les moyens réunis pour le projet ne sont pas détaillés, et le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut modéliser la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif principal de ce projet que nous souhaitons atteindre au cours des 5 années à venir est d’établir s’il est possible, et optimiser, le développement de la locomotion à la suite d’une lésion de la moelle épinière survenant au stade néonatal chez le rat. Le choix de la mise en place du projet au laboratoire à cet instant est le fruit d'un travail préparatoire qui a consisté à réunir l'ensemble des moyens matériels (chirurgicaux, tests comportementaux etc.) et l'expertise nécessaire à sa réalisation. En regard de l'absence d'outils non invasifs permettant chez l'homme l'exploration des phénomènes physiopathologiques que nous souhaitons étudier, et du manque de connaissances nécessaires à l'établissement d'outils de modélisation des lésions de la moelle épinière, notre projet ne peut s'abstenir de l'utilisation du modèle animal. Le choix du rat est objectivé par des niveaux de récupérations post-lésionnelles proches de l'humain. Au cours des cinq années, nous utiliserons au maximum 231 rats, chaque groupe expérimental étant constitué de 12 animaux, chiffre qui prend en compte les contraintes statistiques et la nature des expériences/analyses réalisées. Chaque expérience sera lancée dans un premier temps sur un nombre restreint d'animaux afin d'évaluer la pertinence de poursuivre la série expérimentale. Par ailleurs, dans le souci de réduire au maximum le nombre d’animaux dans les projets à venir, nous enrichirons une banque de tissu à partir des animaux utilisés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux appréhender les risques, durant la période périnatale, d’une lésion de la moelle épinière et de développer des protocoles expérimentaux permettant de réactiver les réseaux locomoteurs sous-lésionnels.

Procédures

Les animaux (n = 144) seront soumis à des lésions de la moelle épinière, la durée de l'intervention est au maximum de 45 minutes. Ils recevront également deux injections quotidiennes (un analgésique et un anti-inflammatoire) durant les 5 jours de suivi post-opératoire et une injection sous-cutanée le jour des expérimentations, qui seront quotidiennes entre le jour postnatal 5 et postnatal 21. Enfin tous les animaux recevront une injection d'un analgésique suivi 30 minutes plus tard par l'injection d'un anesthésique le jour de leur euthanasie.

Impact sur les animaux

Les lésions de moelle épinière vont induire une perte de mobilité des membres postérieurs chez les nouveau-nés dont les conséquences en terme de stress notamment physique seront limitées du fait du maternage de la mère et du traitement préventif post-opératoire. Les douleurs inhérantes à l'intervention chirurgicale seront prévenues par la mise en place d'un traitement post-opératoire analgésique et anti-inflammatoire. Les animaux nouveau-nés ayant subi une lésion auront également une prise de poids réduite durant les 4 premiers jours suivant la lésion entrainant un stress physique supplémentaire, cependant leur poids se normalisera les jours suivants, l'alimentation étant assuré par la mère la perte de mobilité n'entraine pas réellement de difficulté pour se nourrir à moyen terme et la récupération fonctionnelle spontanée permet aux animaux de récupérer un niveau de mobilité suffisant pour se nourrir seuls après le sevrage.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à la fin des expériences.

Remplacement

Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, que ce soit les approches in vitro, ou in silico, qui ne peuvent pas reproduire, ou modéliser la complexité d’un organisme entier.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de rats nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes, nombre dépendant de la technique utilisée. En outre animaux mâles et femelles seront utilisés.

Raffinement

Nos animaux seront hébergées dans une animalerie conventionnelle, au sein de laquelle le bien-être et la santé des animaux sont suivis quotidiennement, permettant de détecter toute anomalie physique ou comportementale potentiellement révélatrice de signes cliniques. Les conditions de stabulations (température hygrométrie, cages, nourriture, litière, enrichissement) sont adaptées au modèle rat. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Un soin particulier sera accordé à l’observation des animaux, de plus, des traitements appropriés (anesthésie, anti-douleur) sont utilisés pour pallier la douleur associée aux opérations chirurgicales. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis une fiche de suivi du bien-être animal permettant d'établir des points limites adaptés à l'état de l'animal et permettant la mise en oeuvre de traitements rapides et adaptés. L’ensemble des procédures est encadré et mis en œuvre par du personnel dument formé et habilité aux méthodologies utilisées et au bien-être animal.

Choix des espèces

Le choix du rat comme modèle expérimental est motivé par: 1) l'absence de récupération spontanée d'une activité locomotrice en dessous d'une lésion complète de la moelle épinière observée chez le rat qui est extrêmement proche de la physiopathologie humaine; 2) le fait que le rat, notamment la souche non-consanguine Sprague-Dawley, est un animal docile, facile à manipuler, ayant une bonne qualité maternelle, et résistant aux infections d'une façon générale, ce qui est un plus certain pour la réalisation de projets tels que le notre qui incluent un volet chirurgical associé à un aspect développemental; 3) la possibilité de réaliser des lésions spinales chez le très jeune animal sans risque majeur d'augmenter les niveaux de mortalité, sans risque d'abandon de la mère (pré-conditionnée au cours de la gestation) au retour dans la portée à la suite d'une chirurgie. Les animaux seront utilisés des tous premiers stades néonataux à l'âge adulte. La raison principale est que notre projet propose d'étudier l'impact et les conséquences d'une lésion spinale en fonction du stade développemental au cours duquel elle survient. En effet le degré de plasticité, et probablement la nature des phénomènes plastiques, du système nerveux évolue au cours du temps, ce qui implique que les possibilités de récupération post-traumatique, et/ou les modalités en permettant l'émergence varient avec l'âge. Ainsi la récupération locomotrice après une lésion de la moelle épinière chez le jeune animal est supérieure à celle rapportée chez l'adulte.

Inoculées d'un cancer de la tête et du cou puis traitées par chimiothérapie au cisplatine, 60 souris mâles seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une fonte musculaire massive, une perte de poids, de la léthargie, de l'isolement social et une agressivité accrue, et prévoit des jeûnes de seize heures ainsi qu'une contention en tube pour mesurer la composition corporelle. La mise à mort sert à prélever les muscles squelettiques et la totalité du sang. L'hypothèse testée, un effet protecteur du cannabidiol sur le muscle, repose sur des effets que le porteur décrit comme démontrés "principalement in vitro".

Objectifs

La cachexie est un syndrome caractérisé par une fonte musculaire massive, responsable de 25% des décès chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou (CTC). Cette perte de masse musculaire est prédictive de l’incidence des complications, de l’efficacité des traitements anticancéreux, et de la survie des patients à long terme. La cachexie est également associée à une augmentation de la fatigue et de la fragilité, à une diminution de l'activité physique entraînant une perte d'autonomie et une dégradation de la qualité de vie. Dans ce contexte, le maintien de la masse musculaire chez les patients atteints de cancer est un défi majeur pour l'amélioration de la réponse aux thérapies et l'amélioration de leur qualité de vie.

Bénéfices attendus

D'après la littérature, l'utilisation du cannabidiol (CBD) semble moduler la respiration mitochondriale, ainsi que le développement et le métabolisme musculaire. Il est largement documenté que la cachexie est associée à un dysfonctionnement mitochondrial et à une atrophie musculaire. Enfin, les effets antinéoplasiques du CBD ont été démontrés dans de nombreux types de cancers, principalement in vitro. Par conséquent, nous postulons que dans notre modèle préclinique de CTC, le traitement au CBD limitera l’atrophie musculaire en favorisant le maintien d'une fonction mitochondriale optimale, et ralentira la croissance tumorale. A l’heure actuelle, les indications retenues par la Haute Autorité de Santé pour l'utilisation du CBD concernent des pathologies neurologiques infantiles et un vaste champ d’expérimentations dans la prise en charge des douleurs cancéreuses est en cours. Notre projet s’intéressera à l’utilisation de cette molécule comme adjuvant à la nutrition et aux molécules de chimiothérapie antinéoplasiques. Malheureusement, seule une partie des patients atteints d'un cancer avancé bénéficient de manière optimale de cette chimiothérapie en raison de la résistance tumorale et des effets toxiques (toxicité hématologique, toxicité du tractus gastro-intestinal, neurotoxicité). Dans le présent programme, nous souhaitons utiliser le CBD comme adjuvant dans le traitement des CTC afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de CTC. L’apport de CBD en plus des traitements anti-cancéreux pourrait ainsi favoriser le maintien de la masse musculaire au cours de ces traitements, ce qui améliorerait leur tolérance et ainsi leur efficacité, et impacterait positivement la qualité de vie des patients. L’utilisation de CBD s’est aujourd’hui démocratisée dans le grand public et son utilisation clinique commence à se mettre en place dans le cadre de l’expérimentation du cannabis à usage médical (pilotée par l’ANSM). Certains traitements comme l’Epidyolex (CBD médical) sont disponibles, et de nombreux effets positifs du CBD sont démontrés. Ainsi, l’utilisation clinique du CBD apparait comme une approche thérapeutique adjuvante intéressante et innovante pour la prise en charge des patients atteints de CTC. Cette utilisation pourrait être facile à mettre en œuvre. Seules manquent des résultats précliniques pour organiser rapidement des études cliniques pour démontrer ces effets positifs chez l’Homme.

Procédures

Les souris incluses dans ce projet seront inoculées avec un cancer par une injection unique de cellules cancéreuses. Deux semaines après cette injection tumorale, un traitement de chimiothérapie par injection de cisplatine (une fois par semaine pendant 2 semaines), et un traitement par injection de CBD (trois fois par semaine pendant deux semaines) seront effectués. Les animaux seront soumis à différents tests permettant d'évaluer leur force musculaire et leur capacité locomotrice. A la fin de ce protocole, les animaux recevront une injection unique de traceurs isotopiques stables pour mesurer la vitesse de synthèse des protéines musculaires. Les animaux seront également soumis à des mises à jeun (de 16h) et à une contention en tube pour l'analyse de leur composition corporelle par echo MRI (imagerie par résonance magnétique nucléaire qui permet de déterminer la masse grasse, la masse maigre, l’eau libre et l’eau corporelle totale d’un petit animal).

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental consiste à induire un cancer chez l’animal. Il comprend l'injection de cellules tumorales pour induire un développement tumoral et des injections sous cutanées de cisplatine, cannabidiol et traceurs isotopiques stables. La tumorigenèse peut s'accompagner d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité accrue ou des altérations de la locomotion. Les différentes mesures de fonctionnalité musculaire, et de composition corporelle réalisées ne seront quant à elles que très peu invasives.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer leur statut inflammatoire et réaliser leur bilan sanguin

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, le développement de la cachexie est la résultante d’altérations métaboliques systémiques impactant de nombreux tissus et organes (muscle squelettique, foie, tissu adipeux, système immunitaire…). La complexité tumorale (mélange de cellules tumorales et immunitaires), la complexité du dialogue tumoral avec les différents tissus et la complexité du dialogue entre ces tissus eux même, ainsi que les conséquence de la croissance tumorale sur la fonctionnalité musculaire la mobilité ne peuvent être complètement reproduits in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Le nombre de souris nécessaire à l’étude est calculé pour une variation attendue de 25% du volume tumoral entre les souris porteuses de tumeur traitées au cisplatine ou au CBD et les souris porteuses de la tumeur uniquement. Ainsi, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaire à la réalisation de ce projet est donc de 60 souris.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Un enrichissement de l'environnement sera mis en place, correspondant en divers éléments (tubes en plexiglass, boules métalliques...). Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. L'atteinte d'un point limite grave entrainera la mise à mort de l'animal concerné . Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes.

Choix des espèces

Nous envisageons d'étudier l'impact d'une supplémentation en cannabidiol sur la mise en place de la cachexie en réponse au développement tumoral et à son traitement par chimiothérapie. Nous envisageons d'inoculer des cellules cancéreuse chez des souris pour induire un cancer qui sera ensuite traité par injection de cisplatine +/- cannabidiol. Les cellules cancéreuses utilisées dérivent de métastases pulmonaires produites chez la souris en réponse à l'implantation de carcinome épidermoïde de l'oropharynx. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique. Ce type d'expérimentation ne peut pas être menée chez l'Homme. De plus, ce protocole requière de nombreux prélèvements tissulaires dont certains sont très difficile à obtenir chez l'Homme (en particulier au niveau musculaire) et la recherche de métastases au niveau hépatique et pulmonaire. Pour réalisée ce protocole, nous utiliserons des souris mâles agées de 12 semaines. Des souris de cette âge sont couramment utilisées pour ce type d'inoculation de cancer. Nous avons choisi cet âge afin de valider que l'inoculation du cancer que nous décrivons est bien conforme à ce qui a été publié précédemment et pour faciliter la comparaison des résultats que nous obtiendrons avec ceux pré-cités.

Soumises chaque jour pendant quatre à sept jours à un bruit qui déclenche une crise d'épilepsie généralisée, 1 300 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Les crises tonico-cloniques provoquent des secousses et des raidissements musculaires que le porteur compare à "des crampes multiples", suivis d'une pause respiratoire pendant laquelle les souris sont placées sous respirateur. Elles sont testées entre 21 et 41 jours après leur naissance, soit dès le sevrage, et reçoivent en parallèle des candidats médicaments par voie orale ou par injection. Le porteur reconnaît que des cultures de neurones et des tranches de cerveau permettent de présélectionner les molécules, et écrit que ces procédures "ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions".

Objectifs

L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les pauses respiratoires induites par une crise épileptique, à l'origine de nombreux décès. Ce phénomène est aussi appelé mort subite inattendue et inexpliquée en épilepsie et est la cause de décès la plus courante liée à l'épilepsie. Les crises généralisées de type tonico-clonique correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (où les 2 hémisphères sont touchés). Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieurs et supérieurs accompagnés d'une pause respiratoire temporaire ou définitive. La cause exacte de survenue d'une mort subite suite à une épilepsie n'est actuellement pas connue mais elle pourrait être liée à une insuffisance cardiaque, aux difficultés respiratoires et aux lésions cérébrales consécutives à une crise tonico-clonique. A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour augmenter l'espérance de vie des patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices recherchés sont le développement de médicaments destinés à sauver des vies pour les patients épileptiques et montrant une pharmaco-resistance. Les modèles de pause respiratoire suite à une crise généralisée sont recommandés pour identifier et tester l'efficacité de nouveaux candidats médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour augmenter l'espérance de vie des patients épileptiques.

Procédures

Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments seront administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Les rongeurs seront soumis à un stimulus sonore d'une durée maximale de 60 secondes chez la souris pendant 4 à 7 jours (avec une stimulation par jour). En cas de pause respiratoire, les animaux seront placés sous assistante respiratoire pendant 120 secondes jusqu'à la reprise naturelle de la respiration. Un prélèvement de sang pourra être réalisé sous anesthésie, juste avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, l'induction de crise par un stimulus sonore induit un stress physique chez les rongeurs, également retrouvé chez les patients lors de la survenue d'une crise épileptique. Des douleurs peuvent être également associées à l'apparition de mouvements involontaires saccadés ou un raidissement des membres/du corps (douleurs qui peuvent ressembler à des crampes multiples). La survenue de crises tonico-cloniques peut induire une pause respiratoire, d'un maximum de quelques secondes, qui sera assistée par un respirateur approprié. L'administration de nouveaux candidats médicaments doit se faire par voie systémique (i.v., i.p. ou s.c.) ou orale pour conserver une bonne comparabilité avec les futures études cliniques chez l'homme. Ces interventions peuvent générer un stress transitoire (non répété) lié à la contention et une légère douleur comparable à l'introduction d'une l'aiguille selon l'art et la pratique vétérinaire. Il n'est pas attendue de douleur ou souffrance spécifique par les candidats médicaments eux-mêmes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience ils auront été soumis à plusieurs stimulations sonores et plusieurs crises épileptiques suivies d'une pause respiratoire. Ces procédures ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions.

Remplacement

Il existe des techniques alternatives in silico ou in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et les paramètres physiologiques (reprise rapide de la respiration après une pause respiratoire par exemple).

Réduction

Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude avec une analyse statistique appropriée en fonction des variables analysées. Dans certains projets, il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. La phase de sensibilisation à une pause respiratoire sera évaluée lors de la mise en place du modèle et sera réduite à son minimum (si possible 3 jours de sensibilisation) pour limiter les nuisances chez l'animal. Lors de chaque test, l'animal sera placé sous respirateur, quelques secondes après observation de la pause respiratoire. Pour réaliser un prélèvement de sang, les animaux seront placés sous anesthésie (avec procédure analgésique si approprié).

Choix des espèces

Les modèles d'arrêt respiratoire suite à une crise d'épilepsie sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur. La plupart des modèles sont basés sur l'induction de crises audiogènes chez des souches de souris connues pour leur sensibilité à développer une crise lors d'un bruit ou chez des souris transgéniques montrant des crises de manière spontanée. Les souris sont testés immédiatement après sevrage sur une durée maximum de 20 jours (entre 21 et 41 jours après leur naissance).

Soumises à une lésion du nerf sciatique qui provoque une douleur irréversible, 1 120 souris seront toutes tuées pour prélever des tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent jusqu'à sept injections, subissent neuf prélèvements sanguins en 24 heures et passent deux tests évaluant l'activité et la coordination motrices, pour caractériser la dégradation d'une molécule censée renforcer l'effet analgésique de la morphine. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer œdèmes, inflammation, infection, perte de mobilité et perte de poids, et que les prises de sang à la queue peuvent aboutir à une nécrose de la queue. Il affirme que les cultures cellulaires ne permettent pas d'observer les interactions de l'"organisme entier" et conclut que ses études "nécessitent obligatoirement des animaux".

Objectifs

La douleur chronique (provenant d’une atteinte des nerfs et conduisant à une douleur persistante) affecte 10% de la population. Elle est traitée par des antidépresseurs qui sont peu efficaces. La morphine est aussi utilisée pour soulager ces douleurs. Cependant, des doses importantes de morphine sont nécessaires. Lors de ces douleurs, il existe une activation cellulaire qui augmente la dégradation de la morphine et donc diminue ses effets antidouleurs. Un moyen de diminuer cette dégradation consisterait en l’utilisation de la Stemregenin 1 (SR1) qui bloque l’activation intracellulaire. Ainsi, nos expériences sur des cultures cellulaires de cellules nerveuses montrent que le SR1 inhibe la dégradation de la morphine induite par des conditions inflammatoires. De plus nos résultats obtenus chez la souris douloureuse ont montré que le SR1 inhibe la dégradation de la morphine et induisant une analgésie plus forte. Or, la morphine provoque une hyperlocomotion et l’effet de du SR1 seul sur la motricité est inconnu. Ainsi, le but des tests comportementaux est de déterminer si le SR1 possède des effets locomoteurs et sur la coordination des mouvements. Par ailleurs, le devenir du SR1 dans l’organisme n’a jamais été étudié chez la souris saine et douloureuse chronique. Ainsi, les autres points du projet visent à déterminer la cinétique de dégradation sanguine et cérébrale du SR1. Le but ultime est de pouvoir utiliser le SR1 chez l’homme pour augmenter les effets de la morphine chez des patients douloureux chroniques.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique du SR1 n’a jamais été réalisée. Celle-ci permettra de déterminer les paramètres permettant son utilisation in vivo chez la souris lors d’une prochaine étude préclinique. Par ailleurs, notre étude définira si le SR1 possède des effets bénéfiques intrinsèques sur la neuropathie.

Procédures

Un premier groupe d'animaux contrôle subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes puis 7 injections sur animal vigile d'une durée de 30sec puis 2 tests comportementaux (11min). Les test comportementaux permettront d'évaluer l'activité et la coordination motrice des animaux. Un deuxième groupe subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes puis 1 injection sur animal vigile (30sec) puis 2 tests comportementaux (11min). Un troisième groupe d'animaux contrôle subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes puis 7 injections sur animal vigile d'une durée de 30sec et subira des prélèvements sanguins sur animal vigile (30s) durant 24h (soit 9 prélèvements/24h). Un quatrième groupe d'animaux contrôle subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes puis recevra 1 injection sur animal vigile (30s) et subira des prélèvements sanguins sur animal vigile (30s) durant 24h (soit 9 prélèvements/24h). Un cinquième groupe subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes puis 7 injections sur animal vigile d'une durée de 30sec. Puis, les souris subiront des chirurgies terminales (10min). Un sixième groupe subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes puis 1 injection sur animal vigile d'une durée de 30sec. Puis, les souris subiront des chirurgies terminales (10min, 9 prélèvements de tissus). Les animaux "contrôles" de chaque groupe ne subiront pas la chirurgie mais uniquement le reste des gestes indiqués.

Impact sur les animaux

La lésion du nerf sciatique induit une douleur irréversible. La chirurgie peut provoquer des œdèmes, une inflammation ou une infection locale. Cette lésion conduit à une perte de mobilité, ainsi qu’à une perte de poids. Concernant les injections, elles peuvent entrainer une douleur aiguë, une inflammation locale et une infection. Concernant les prises de sang à la queue, celles-ci peuvent aboutir à des saignements, une inflammation locale ou/et une nécrose de la queue.

Devenir

Pour les 3 procédures, les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus permettant de réaliser des analyses complémentaires.

Remplacement

La chirurgie permettant la mise en place d’une douleur chronique provoque des problèmes moteurs importants. Nos travaux ont montré que le SR1 est capable d’amplifier l’effet analgésique de la morphine. Le but de notre nouveau projet est de déterminer si le SR1 possède des effets intrinsèques sur la motricité in vivo sur un modèle douloureux de souris. De plus, il vise à caractériser in vivo, chez la souris, la dégradation du SR1 au cours du temps car ces données n’existent pas. Nos études nécessitent des animaux car (1) les modèles cellulaires ne permettent pas de caractériser l’action d’un composé sur la physiologie globale et sur les comportements moteurs (2) les modèles de culture cellulaire qui représentent uniquement un type cellulaire ne permettent pas d’observer les interactions existantes dans l’organisme entier et donc de modéliser la dégradation in vivo du SR1. De ce fait, nos études nécessitent obligatoirement des animaux.

Réduction

Un minimum de 560 souris mâles et 560 femelles est nécessaire à la réalisation des études (total de 1120 animaux). Nos études antérieures ont montré que des effectifs de 10 animaux par groupe étaient généralement suffisants pour obtenir des résultats significatifs lors des caracterisations de l’élimination de la morphine par l’organisme des souris. Les effectifs de 10 animaux tiennent également compte de la possibilité de devoir écarter un animal en cours de procédure (par exemple suite à des blessures consécutives à des bagarres). Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle cohorte avec tous les groupes contrôles devra être ajoutée ce qui va à l’encontre de la réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots successifs avec un maximum de 20 animaux répartis sur les différentes conditions à tester dans chaque lot.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes de 5 animaux du même sexe pour respecter leurs besoins d'interactions sociales et leur cage est enrichie avec des bouts de bois et des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunnels pour éviter la prise par la queue et réduire le stress des animaux. Pour aider à la reprise de poids, des aliments sous forme de gel sont déposés dans la cage. Les blessures superficielles sont désinfectées avec une solution antiseptique. Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au contexte du test est réalisée. Dans les tests comportementaux on évalue la motricité et la coordination. Par ailleurs, des points-limites ont été établies pour chacune des procédures réalisées. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et sous analgésie (injection sous cutanée locale d’antidouleur réalisée au lieu de l’incision) et du gel oculaire est appliqué durant la procédure. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.

Choix des espèces

Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés sont réalisées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de cette souche est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme. Le modèle de souris jeune adulte reste la référence dans les études pré-cliniques de dégradation des molécules et pour la déterminarion des effets sur la motricité. Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines afin d’avoir des animaux qui sont physiologiquement matures

Pour étudier la vulnérabilité aux troubles dépressifs et addictifs à l'adolescence, 4 762 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement du cerveau. Elles subissent des épisodes de défaite sociale de dix minutes par jour pendant sept jours, face à des mâles CD1 agresseurs de plus de six mois, une chirurgie cérébrale avec implantation de fibre pour une partie d'entre elles, et des tests comportementaux évaluant l'hédonie, l'anxiété, les comportements sociaux et la prise de risque, sans que ces tests soient nommés. Le porteur écrit que ces stress "n'induisent pas des dérégulations profondes des systèmes douleur" mais provoquent des stress psychologiques, et que certaines souris peuvent ne pas prendre de poids. Il ouvre sa rubrique raffinement par la formule "bien que les procédures de stress soient sévères, le bien-être animal prime", sur un protocole qui expose près de 4 800 souris à la défaite sociale répétée dès l'âge de trois semaines.

Objectifs

Lorsqu'une personne est soumise à des situations stressantes à plusieurs reprises ou qu'elle consomme des substances toxiques comme le tabac, cela peut provoquer des symptômes de dépression et un risque de dépendance aux drogues. De plus, il est courant que les personnes souffrant de dépression développent également une dépendance à la nicotine, qui est la substance principale du tabac. Cela rend compliqué le diagnostic et le traitement de ces problèmes de santé mentale. Une caractéristique commune de ces troubles est que les mécanismes liés à la récompense dans le cerveau sont perturbés. Ces mécanismes sont contrôlés par des circuits cérébraux qui sont essentiels à notre survie, car ils nous motivent à faire des choses importantes pour notre bien-être, comme manger et se reproduire. Comprendre les réseaux de neurones impliqués dans ces systèmes est crucial pour mieux comprendre ces troubles et trouver des traitements. De plus, il est important de noter que la plupart de ces problèmes de santé mentale apparaissent pendant l'adolescence, c'est pourquoi il est essentiel de comprendre les changements moléculaires et neuronaux qui se mettent en place à ce moment-là et ont des répercussions sur le fonctionnement du cerveau adulte. Pour ce projet, nous concentrons nos recherches sur une partie du cerveau, qui joue un rôle dans la gestion des signaux de récompense dans le cerveau des adultes. Cependant, nous avons découvert que cette partie du cerveau réagit de manière différente sous l'effet du stress. Ce que nous ne savons pas encore, c'est comment cette structure cérébrale est impactée à l’adolescence et si ces dérégulations persistent. L'objectif principal de notre projet est de comprendre comment cette région du cerveau influence le développement de problèmes de comportement à l'âge adulte, en particulier les fonctions cérébrales qui dérégulées mènent à des troubles psychiatriques. En comprenant mieux cette partie du cerveau et sa malléabilité pendant l'adolescence, nous espérons trouver de nouvelles pistes pour le traitement de ces troubles.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de notre projet de recherche fondamentale sur les retombées à l'âge adulte d'une exposition à la nicotine ou au stress à l'adolescence sont les suivants : 1. Compréhension approfondie : Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux problèmes de comportement à l'âge adulte liés à l'exposition à la nicotine ou au stress pendant l'adolescence. 2. Développement de traitements : Des informations clés pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à prévenir ou à traiter les troubles liés à la dépendance, la dépression, ou d'autres problèmes de santé mentale. 3. Prévention précoce : Identifications de facteurs de risque potentiels pour mieux cibler la prévention des problèmes de santé mentale chez les adolescents exposés au stress ou à la nicotine. 4. Amélioration des politiques de santé : Des données pour soutenir des politiques de santé publique visant à réduire l'exposition des adolescents à la nicotine et au stress, améliorant ainsi la santé mentale à l'âge adulte.

Procédures

Les animaux seront soumis à des épisodes de stress sociale dans les 5 procédures pour une durée maximale de 10 minutes par jour sur une période de 7 jours. Une chirurgie cérébrale est également pratiquée sur une partie des animaux avec implantation de fibre et/ou d’outils génétique pour l’apport de molécule d’intérêt. Une anesthésie par gaz est également pratiquée pour une partie des souris ainsi qu'une chirurgie avec implantation d’un outil en sous-cutané. Les animaux subiront différents tests comportementaux permettant d’évaluer l’hédonie, l’anxiété, les comportements sociaux, la prise de risque.

Impact sur les animaux

Le projet s’intéresse à la composante émotionnelle et la dimension stressante de l’exposition à des stimuli aversifs au cours de la préadolescence. Ainsi les effets indésirables seront principalement liés à la dérégulation de ces grands systèmes et se pourront se manifester à l’échelle comportementale par des traits anxieux et dépressifs. Ces stress n’induisent pas des dérégulations profondes des systèmes douleur mais provoque des stress psychologiques. Les chirurgies provoqueront des douleurs au niveau du site d'incision cutanée et d'injection par perforation du périoste. Les tests de comportement seront pour la plupart sans douleur et basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone nouvelle ou un nouveau congénère. Certains animaux dans le cas des stress sociaux peuvent ne pas ou peu prendre de poids.

Devenir

Pour 3 des 5 procédures : Après les tests comportementaux, les souris seront mises à mort pour prélèvement de cerveau dans le but de réalisée des études post-mortem. Pour 1 procédure : Après les tests, les souris seront mises à mort afin de prélever leur cerveau et vérifié les résultats des chirurgies. Pour 1 procédure : A la fin de l’acquisition des données, ces animaux seront mis à mort

Remplacement

Notre projet reposant en grande partie sur des approches de physiologie intégrée. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode substitutive qui pourrait remplacer l’utilisation de l’animal dans nos expériences. Les structures étudiées étant très conservée entre l’Homme et la souris, cela en fait un modèle de choix pour notre projet. De même, l’utilisation de virus et de lignée génétiquement modifiée permettent un ciblage précis des structures et circuits altérés par le stress ou l’exposition à la nicotine.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire dans chaque procédure est calculé au mieux afin d’utiliser le moins d’animaux possible mais de maintenir un niveau de significativité statistique suffisante. Le projet requiert des mâles et des femelles afin d’être le plus représentatif possible de la population et éviter un biais lié au sexe.

Raffinement

Bien que les procédures de stress soient sévères, le bien-être animal prime et par conséquent nous faisons attention à l’enrichissement des cages, à limiter au maximum le stress des animaux en dehors de la procédure, définition et suivi de l’animal adapté à chaque situation. En effet, les risques éventuels de blessures ou de déshydratation sont plus élevés lors de l'exposition à la défaite sociale ou à une chirurgie par exemple. C'est pour cela que la fréquence d'observation des animaux seront proportionnés aux potentiels risques encourus Ainsi, lors des chirurgies, une hydratation sous cutanée pré et post opératoire sera réalisée, de même que l’injection d’analgésique avant et une administration d’antiinflammatoire/analgésique pendant 5 jours post-opération. Un tapis chauffant est placé sous l’animal lors de la chirurgie (régulation via sonde rectale) et également sous les cages de réveil afin de faciliter ce dernier et éviter une hypothermie. Les souris auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Chaque cage possède des bâtons en bois à ronger, un abri et des cotons pour la nidification..

Choix des espèces

Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. Elle possède une proximité évolutive, un cycle de vie cours permettant de répéter les expériences afin de s’assurer de la robustesse des résultats, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. C’est un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress et de la nicotine d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension des effets du stress et de l’addiction, et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie). De ce fait, la souris est un bon modèle pour notre étude. Pour les souris adolescentes, la période d’intérêt étant de 3 à 4 semaines, les animaux seront donc utilisés à cette période afin de correspondre à la période de maturation des circuits cérébraux, elles seront gardées par la suite jusqu’à l’âge adulte (8 semaines) où elles effectueront les tests comportementaux ou bien les mesures d’activité cellulaire Les animaux adultes de la discrimination émotionnelle seront utilisés à partir de 8 semaines pour correspondre à l’âge des souris « adolescentes » lors des tests comportementaux. Les CD1 agresseurs sont des anciens mâles reproducteurs de plus de 6 mois.