Procédures sévères
Validation d’un modèle de leucémie évalué par bioluminescence chez la souris NSG, en vue de traitement par CAR-T cells innovants – EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
24 souris NSG dépourvues de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles reçoivent une injection de cellules leucémiques dans la veine de la queue, développent une leucémie sur plusieurs semaines, puis subissent des séances d'imagerie par bioluminescence sous anesthésie, jusqu'à la mise à mort au 28e jour ou dès qu'un point limite est atteint. Le porteur indique que les souris présenteront poils hérissés, baisse d'activité, perte de poids et parfois un début de paralysie des pattes. L'objectif reste de caler la dose de cellules cancéreuses nécessaire pour installer la leucémie, étape préalable à des tests de cellules CAR-VST, et le porteur affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas le microenvironnement tumoral, jugeant le modèle murin "indispensable".
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse par CAR-T cells permet de traiter la leucémie. Ces cellules sont conçues à partir des cellules du patient et sont modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité reste à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de cellules CAR-T à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. Dans ce projet, nous souhaitons utiliser des cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST). L’une des particularités des VST est qu’elles persistent à long terme chez les patients, ce qui permettrait d’apporter un bénéfice majeur à la production de CAR-T. Après modification génétique, ces nouvelles cellules (CAR-VST) possèdent une double fonction : elles s'attaquent à la leucémie et ciblent également d'autres virus demeurant dans l'organisme après une infection. Ces cellules anti-virales spécialisées ont déjà montré des résultats prometteurs chez les patients, avec une capacité de persistance prolongée, offrant ainsi une alternative potentiellement plus efficace pour lutter contre la leucémie. Le modèle de souris que nous souhaitons utiliser pour prouver notre hypothèse est très bien décrit dans littérature. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette étude préliminaire aidera à déterminer la quantité de cellules cancéreuses nécessaires pour créer une leucémie chez les souris. Cela nous aidera à savoir quand injecter les traitements futurs contre le cancer, qu'ils soient classiques (CAR-T cells) ou nouveaux (CAR-VST). Dans le traitement des cancers du sang, les CAR-T cells ont montré leur efficacité à court terme chez les humains. Cependant, elles disparaissent rapidement, ce qui peut causer des rechutes chez les patients. En utilisant nos cellules anti-virales comme matière première pour créer les CAR-VST, nous pourrions améliorer leur capacité à rester actives plus longtemps et offrir une protection supplémentaire contre les virus chez les patients dont le système immunitaire est affaibli. Les résultats de cette étude préliminaire sont essentiels pour continuer à développer ce traitement innovant en vue de réaliser des tests sur des patients.
Procédures
- Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue (souris vigiles) - développement d’une leucémie sur quelques semaines - injections abdominales d’un produit d’imagerie et suivi régulier (sous anesthésie, durée 30 minutes) de la progression tumorale 1 fois par semaine pendant quatre semaines par imagerie Etablissement utilisateur 1 : -Une injection intraveineuse sur animal vigile des cellules leucémiques au jour 0 (1min) Etablissement utilisateur 2 : - Imagerie des souris par bioluminescence : contention et injection intrapéritonéale (IP) d’une substance permettant de tracer les cellules leucémiques (1min). - retour en cage hébergement pendant le temps où la substance agit (10min) - au bout de 5 min, induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (1min) - acquisition par bioluminescence (3min) avec possibilité de placer 5 souris dans l'appareil en même temps - arrêt de l’expérimentation au dernier jour (28e jour) ou lorsqu’un point limite est atteint et sacrifice des souris
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse n’est pas douloureuse – au pire elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront des signes cliniques tels des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des jambes. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie, suivi des anesthésiques. Pendant la prise d'images, les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur .
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 28 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider la fonctionnalité des cellules humaines anti-leucémiques, de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et le microenvironnement tumoral développé in vivo. Cette saisine permet de valider un modèle de leucémie chez la souris, ce qui nous permettra dans une deuxième saisine de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence. Ces informations sont cruciales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. La détermination des doses de cellules leucémiques à injecter chez la souris permettra de valider un modèle développant une tumeur identifiable sur plusieurs semaines.
Réduction
Nous utilisons le moins de souris possible pour obtenir des résultats statistiquement valables. Nous arrêterons les tests dès que nous verrons une grande différence entre les groupes, avec au moins 3 souris par groupe et au maximum 6.
Raffinement
Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux, avec seulement 3 à 6 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, quelqu'un vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, un guide permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper la souffrance.
Choix des espèces
La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires et l’effet anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 10 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Mise en place d’un modèle porcin de greffe utérine en vue de l’ouverture d’un centre de greffe dans le cadre d’un Programme Hospitalier de Recherche Clinique multicentrique national.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
18 truies vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, neuf donneuses tuées lors du prélèvement de l'utérus et neuf receveuses après la greffe, dans des procédures impliquant pour ces dernières un niveau de souffrance sévère. Les receveuses subissent une transplantation d'utérus, la pose d'un cathéter central, des prises de sang, des injections d'immunosuppresseurs et des biopsies, avec un risque déclaré d'hémorragie, d'infection, de rejet et de douleurs postopératoires. Le porteur présente ce modèle comme un prérequis pour qu'un hôpital devienne centre de greffe et pour former plusieurs chirurgiens. Il indique que la technique peut s'acquérir ailleurs mais que cela ne permet pas de former plusieurs praticiens.
Objectifs
L’infertilité utérine absolue, définie comme l’infertilité par absence d’utérus, peut être d’origine congénitale, ou en lien avec une hystérectomie pour cause obstétricale (hémorragie de la délivrance) ou pour cause gynécologique (cancers). Pour les patientes atteintes d’une infertilité utérine absolue, les moyens d’accéder à la parentalité sont limités. La transplantation utérine, qui connait un essor mondial depuis la 1ère naissance d’un enfant vivant en bonne santé issu de cette technique en 2014, apparaitrait comme une solution intéressante dans cette indication. A ce jour plus de 80 transplantation utérine ont été réalisées dans le monde et plus de 40 enfants sont nés. Le greffon est issu d’une donneuse vivante ou d’une donneuse en état de mort encéphalique. En France, 3 greffes utérines ont à ce jour été réalisées à l’Hôpital Foch à Paris, à partir de donneuses vivantes, conduisant à 2 naissances vivantes chez la même patiente. L’objectif global de ce projet est d’acquérir la technique de greffe utérine, par la réalisation de 3 allo-transplantations utérines avec succès, avec réveil et surveillance sur une durée de 3 mois.
Bénéfices attendus
L’objectif à terme est de pouvoir offrir la greffe utérine chez les patientes atteintes d’infertilité utérine absolue.
Procédures
Les animaux vont subir une transplantation utérine, la pose d’une voie centrale avec accès externe pour réaliser des prises de sang (16, une minute), des injections d’immunosuppresseurs (12 fois, 20 secondes). La réévaluation du greffon se fera par échographie Doppler (8 fois, 15 minutes), biopsies d’endomètres de la paroi de l’utérus et prélèvement de fluide utérin sous sédation (3 fois, 30 minutes).
Impact sur les animaux
- Malgré l’utilisation d’un prolongateur un stress peut être ressentit par l’animal lors de l’injection d’anesthésique pour les prémédications. - Per-opératoire : risque de plaie urologique (uretère, vessie), plaie vasculaire avec hémorragie aigue, plaie digestive - Post-opératoire : hémorragie postopératoire, arrêt du transit, douleur, infection post opératoire (pulmonaire, abcès, ou du site opératoire), infection du greffon (en lien avec le traitement immunosuppresseur), rejet aigu ou chronique, stress physique.
Devenir
Mise à mort des 9 donneurs car la technique de prélèvement ne permet pas de les laisser en vie. Mise à mort des 9 receveurs pour prélèvement et études histologiques du greffon.
Remplacement
L’acquisition de la technique de transplantation peut être réalisée dans d’autre centre, ce qui a été réalisé. Cependant, on ne peut pas former plusieurs chirurgiens ainsi et la mise en place d’un modèle de greffe animale est un prérequis pour un hôpital pour devenir centre de greffe.
Réduction
Les chirurgiens se sont entrainés sur cadavres de porcs d’autres projets et la technique a été récupérée chez un autre centre pour éviter la phase de mise au point.
Raffinement
Des points limites généraux et adaptés au modèle permettront l’arrêt de la procédure si nécessaire. La prémédication sera effectuée à l’aide d’un prolongateur, ce qui permet de réaliser une injection intra musculaire sans contention. Les porcs sont hébergés sans caillebotis et avec de la sciure et du foin et sont promenés dans un espace plus grand que leur cage pour leur permettre de courir. Un système de cathéter avec accès externe permettra de réaliser les prélèvements de sang et les injections de produit anti rejet sans aucune douleur pour l’animal. La chirurgie sera effectuée sur animaux anesthésiés et un protocole antidouleur adapté sera administrée pendant et après la chirurgie.
Choix des espèces
Le porc est un modèle couramment utilisé dans le développement de nouvelles techniques chirurgicales en gynécologie, comme l’illustrent le développement de la chirurgie robotique. En effet, la vascularisation pelvienne de la truie similaire à la vascularisation chez la femme. C’est également pour cette raison que cette espèce a été utilisée à plusieurs reprises afin de construire un modèle pré-clinique de transplantation utérine. L’intervention consistant en l’explantation et la transplantation d’un utérus porcin, les animaux donneurs et receveurs devront être matures sexuellement afin d’avoir des organes génitaux suffisamment développés soit ayant plus de 6 mois.
Thérapie cellulaire à base de cellules gliales entériques dans un modèle de lésion cérébrale chez le rat: comparaison entre la voie intracérébrale et intranasale EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent deux chirurgies, l'une pour provoquer une lésion cérébrale, l'autre pour greffer des cellules, puis des IRM et des tests comportementaux répétés sur une période allant jusqu'à douze mois, pour comparer deux voies d'administration d'une thérapie cellulaire. Le porteur décrit les tests comme des tâches sensori-motrices renforcées positivement, sans les détailler davantage. Il affirme que les résultats ne peuvent être obtenus in vitro ni sur des organoïdes et que la comparaison des deux voies exige des évaluations in vivo.
Objectifs
Ce projet vise à contribuer aux études de réparation tissulaire et récupération fonctionnelle dans un modèle de lésion cérébrale chez le rat. Chez l'homme, après une lésion cérébrale, les moyens de récupération reposent essentiellement sur la réadaptation et la réorganisation cérébrale grâce aux mécanismes de "Plasticité Cérébrale". Ceux-ci sont insuffisants pour obtenir une récupération fonctionnelle totale. L’objectif de ce projet s’inscrit dans une approche cellulaire innovante (cellules gliales périphériques) pour favoriser la régénération tissulaire, jusqu’à atteindre une amélioration fonctionnelle. Ces cellules ont un potentiel neurogénique et neuroprotectif, qui semble intéressant dans le contexte de la médecine régénérative pour favoriser la régénération du tissu nerveux. Dans le but de répondre aux besoins chez les patients atteints de lésions cérébrales, le projet testera la faisabilité d’une voie peu invasive : la voie intranasale, qui sera comparée à la voie intracérébrale.
Bénéfices attendus
Aujourd'hui, les thérapies cellulaires pour la régénération du tissu nerveux sont limitées par leur faible sécurité et efficacité. Nous proposons une nouvelle source de cellules et approche : la greffe de cellules gliales issues du système nerveux entérique. Actuellement, l'utilisation de cellules non souches pour la régénération du tissu nerveux est peu explorée. En outre, nous proposons l'utilisation d'une voie d'administration peu invasive : la voie intranasale, qui aura un impact translationnel important.
Procédures
Dans les deux Procédures, les animaux subiront : 1) Des tests comportementaux (animaux vigiles) : 2 semaines avant les chirurgies, puis 1 semaine, 3 mois, 6 mois et 12 mois post-chirurgie ; 2) IRM (animaux endormis sous anesthésie) : 24h post-chirurgie, puis 3, 6 et 12 mois post-chirurgie ; 3) deux chirurgies (animaux endormis sour anesthésie) : l’une pour induire une atteinte du tissu cérébrale et l’autre pour tester le traitement a base de cellules (greffe). Dans la Procédure 2, l'instillation des cellules se fera par voie intranasale 1 fois par semaine pendant 1 mois (4 instillations en tout), sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables sont dus aux chirurgies. Elles peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : douleur modérée, isolement, diminution du comportement exploratoire, perte de poids. Ces effets peuvent durer jusqu’à 48h. Les tests comportementaux pourraient engendrer un stress léger dû au fait que les animaux sont enlevés de leur environnement habituel. L’instillation du traitement par les nez pourrait engendrer du stress léger parce que les animaux seront vigiles.
Devenir
96 animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux afin de réaliser les analyses histologiques.
Remplacement
La stratégie thérapeutique par greffe de cellules gliales entériques décrite dans ce projet nécessite d'être évaluée sur des animaux vivants, selon les recommandations pour la conduite des études précliniques portant sur les thérapies pour les lésions cérébrales. Les résultats primaires (test comportementaux) et secondaires (IRM et histologie du cerveau) ne peuvent pas être obtenus in vitro sur des cellules ou même sur des organoïdes. De plus, il s'agit d'une étude longitudinale au cours de laquelle les résultats primaires et secondaires seront évalués à différents times points. Enfin, pour la comparaison de deux voies d'administration (intracérébrale et intranasale) le projet nécessite des évaluations in vivo.
Réduction
Nous utiliserons 96 rats femelles adultes âgés de 12 semaines sur 5 ans. Le nombre d'animaux a été calculé sur la base de nos expériences antécédentes et de la puissance statistique obtenue avec un logiciel pour les statistiques. L’étude longitudinal permet un suivi plus personnalisé de l’animal tout en obtenant un nombre conséquent d’informations ce qui nous permet d’en limiter le nombre. Comme l’exige le principe de Réduction, nous utilisons des petits groupes d’individus.
Raffinement
Les animaux seront conditionnés pour la réalisation de taches sensori-motrices toujours renforcés positivement et non anxiogènes. Les animaux seront évalués par les expérimentateurs qui les ont entrainés. Avant les chirurgies, une anesthésie complète est prévue avec présence d'analgésie pour limiter la douleur. Les animaux seront suivis tous les jours 1 fois par jour la semaine suivant la chirurgie et recevront un analgésique pour limiter la douleur post-chirurgie (à 6h), dont la posologie sera adaptée en fonction de chaque animal. 24h avant la chirurgie (habituation) et après la chirurgie, du DietGel sera fourni pour faciliter le nourrissage et l’hydratation et donc favoriser une bonne récupération de l'animal. Aux vues de la durée de l’expérimentation (jusqu'à 12 mois), un système d’enrichissement multiple sera mis en place. Un objet d’enrichissement (tunnel, corde, boules colorées) sera changé tous les mois pour répondre au besoin néophile de l’espèce. Dans le cadre d'implémenter les stratégies de raffinement, nous habituerons les animaux à recevoir une instillation intranasale sans être anesthésiés et/ou contentionnés. Cela évitera un stress répété dû aux anesthésies.
Choix des espèces
Les rats sont un modèle privilégié pour l'étude des lésions cérébrales et pour tester l’efficacité des stratégies thérapeutiques. Le modèle de lésion cérébrale utilisé dans ce projet a été validé et publié par notre équipe et, comparé aux modèles de lésion cérébrale chez les souris, il engendre une mortalité significativement inférieure. Les tests comportementaux prévus dans ce projet ont aussi été adaptés au modèle rat et validés par notre équipe. Animaux adultes (rats femelles) âgés de 12 semaines afin de se rapprocher de la démographique humaine au stade adulte.
Impacts précoces d’une suralimentation postnatale sur le métabolisme et sur la prolifération cellulaire cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Une partie subit une chirurgie cardiaque d'ischémie-reperfusion d'environ 1h15 sous anesthésie et des tests glycémiques avec injections, puis est tuée pour analyser le tissu cardiaque, tandis que douze femelles allaitantes sont replacées ou données à d'autres équipes après prélèvement de lait. Le projet cherche à relier suralimentation juste après la naissance et maladies cardiaques à l'âge adulte. Le porteur affirme qu'apprécier la fonction cardiaque impose de travailler sur "l'organisme entier" et qu'aucun modèle cellulaire ne reflète l'environnement neuro-hormonal.
Objectifs
L’environnement au cours des premières étapes de la vie, pendant les périodes fœtales et postnatales, joue un rôle important dans la détermination de la santé d’un individu. Dans ce cadre, on sait désormais que l’alimentation avant et après la naissance peut influencer non seulement le poids corporel et le pourcentage de masse grasse, mais aussi favoriser à long terme le développement de maladies cardiaques et métaboliques. Un modèle rongeur permettant l’étude des conséquences d’une suralimentation juste après la naissance à été développé et est pertinent car il rassemble plusieurs des critères d’une maladie très commune chez l’Homme : le syndrome métabolique. Le syndrome métabolique est une maladie complexe regroupant plusieurs facteurs de risque très répandus chez l’Homme comme : un tour de taille trop important, des taux élevés de glucose, de lipides et de « mauvais » cholestérol dans le sang, mais aussi une tension artérielle trop importante. Une des originalités du modèle rongeurs de suralimentation postnatale repose sur l’apparition à l’âge adulte d’une diminution de la fonction contractile du cœur qui serait due à une diminution de la capacité des cellules contractiles du cœur, appelées cardiomyocytes, à battre correctement et à permettre au cœur d’envoyer une quantité de sang suffisante à tout l’organisme. Ces cardiomyocytes ont la capacité de se multiplier, c’est-à-dire de proliférer, juste après la naissance et pendant quelques jours encore. Mais cette capacité disparait 10 jours après la naissance, et le nombre de cardiomyocytes est fixe pour le reste de la vie. Notre hypothèse est que des changements au niveau des cardiomyocytes pendant les premiers jours de la période postnatale, aient une répercussion à long terme sur le fonctionnement du cœur et sur sa capacité à faire face à une privation en oxygène. Notre objectif sera de déterminer si la suralimentation postnatale peut altérer la capacité de prolifération des cardiomyocytes dans les jours qui suivent la naissance et quelles voies de signalisation cellulaires sont impliquées.
Bénéfices attendus
En termes de santé publique, ce travail permettra de confirmer que des perturbations nutritionnelles périnatales, c’est-à-dire pendant la grossesse et juste après la naissance, ont un impact à long terme sur la santé cardiovasculaire et métabolique des individus, et que des mesures de prévention appropriées appliquées précocement seraient utiles et nécessaires. Les résultats de nos travaux pourraient apporter de nouveaux messages afin d’accroitre la prise de conscience du Grand Public sur la nécessité de prévenir précocement les maladies cardiovasculaires par des mesures préventives adaptées. D’un point de vue socio-économique, l’impact du surpoids sur des maladies cardiovasculaires est clair, et la prévention du surpoids infantile pourrait aussi améliorer les conditions dans le domaine économique et sociétal.
Procédures
Le prélèvement de lait sera réalisé sur des femelles allaitantes anesthésiées à l’isoflurane et suite à une injection intrapéritonéale d’ocytocine (injection de 2 UI par souris, dans un volume de 100 µL, à l’aide d’une aiguille de 26 gauge). Une chirurgie cardiaque conduisant à une ischémie (privation en oxygène et nutriment d’un tissus) reperfusion du tissu cardiaque sera réalisée sur des souris âgées de 6 mois. La durée moyenne d’anesthésie pour ce type de chirurgie est de 1h15, avec une durée d’ischémie de 45 mins, suivi de 24 h de reperfusion. Les tests glycémiques représentent deux sessions de 2h15 chacune avec le prélèvement d’une faible quantité de sang par souris (20µL approximativement au total) précédés d’une injection intrapéritonéale de glucose ou d’insuline (100µL de solution diluée pour 10g de souris). Une semaine est nécessaire entre les deux tests glycémiques, ce qui représente deux injections IP à une semaine d’intervalle.
Impact sur les animaux
La préhension des animaux lors de l’induction de l’anesthésie pour les chirurgies cardiaques pourrait causer un certain stress. La chirurgie peut provoquer des douleurs per et post opératoires qui seront maitrisées par l’utilisation d’un anesthésique local ainsi que deux injections intrapéritonéales d’analgésique général. De plus, La chirurgie cardiaque peut engendrer chez les souris des difficultés d’accès à l’alimentation pouvant entrainer une perte de poids. Pour faciliter l’accès à la nourriture, de la nourriture en gelée ainsi que des croquettes seront placées dans la cage. Les souris peuvent avoir froid pendant et après la chirurgie par conséquent les animaux se réveilleront en couveuse chauffée et seront ensuite placées dans des cages thermorégulées grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Enfin, la chirurgie peut induire une perte modérée du poids corporel des animaux qui sera méticuleusement suivi et toute perte de poids égale à 20% entrainera l’euthanasie des animaux. Toutes les pièces de manipulation sont dédiées à l’expérimentation animale et sont tempérées et calmes.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 seront replacés (utilisation pour des mises au point, don à d’autres équipes), soit 12 femelles allaitantes. Les animaux issus de la procédure 2 seront euthanasiés afin d’analyser les caractéristiques du tissu cardiaque pour mieux comprendre les altérations cardiaques induites par une Suralimentation postnatale, reflet de la cardiomyopathie induite par le surpoids et l’obésité chez l’Homme.
Remplacement
Le syndrome métabolique est une pathologie multifactorielle. Pour apprécier son incidence sur la fonction cardiaque, il est indispensable de travailler sur un organisme entier mais aussi sur des cardiomyocytes fraichement extraits. De plus, l’étude de la fonction et du métabolisme cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal entier. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).
Réduction
Ne seront utilisés que le nombre d’animaux strictement nécessaire à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes. Le nombre de 9 animaux par groupe est suffisant pour obtenir des résultats statistiques.
Raffinement
Les souris seront constamment hébergées en groupe avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. L’évaluation de la douleur se fera à l’aide d’une grille de score et sa prise en charge sera faite par l’utilisation d’anesthésiques locaux et généraux. Enfin, des points limites ont été définis et seront respectés pour l’ensemble des procédures.
Choix des espèces
La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. De surcroît, les mécanismes physiologiques des souris sont semblables à ceux de l’Homme, ce qui nous permet de réaliser des études translationnelles. Des femelles allaitantes seront nécessaires pour le prélèvement et l’analyse du lait maternel, elles seront âgées au minimum de 8 semaines de vie, âge à partir duquel les animaux sont matures sexuellement et peuvent se reproduire. Pour l’étude de l’impact à plus long terme d’une suralimentation post natale sur le risque cardiométabolique, les animaux auront 6 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris et à l’âge d’apparition des maladies cardiaques chez l’humain.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la cicatrisation
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 550
Cochons d'Inde : 250
Cochons : 300
Pansements, crèmes et sutures sont testés ici pour le compte d'un donneur d'ordre, en vue de leur autorisation de mise sur le marché. 1 500 animaux non-humains, 400 souris, 550 rats, 250 cochons d'Inde et 300 cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour l'examen des tissus au contact du produit. Tous sont opérés sous anesthésie, de 30 minutes à 1 h 30, pour créer les plaies où le produit est appliqué, puis subissent des changements de pansements, avec ou sans anesthésie selon l'espèce, et parfois des prises de sang. Le porteur affirme que leur utilisation est "requise dans la réglementation", et déclare un niveau de souffrance sévère sans dire quelles procédures l'atteignent, les effets décrits se limitant à la douleur opératoire, à la gêne du pansement, au risque d'infection et à une perte de poids de quelques jours.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en cicatrisation (exemple : pansements, crèmes, sutures...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en cicatrisation. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin de créer les plaies et y appliquer le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 30 minutes et 1h30). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et/ou gazeuse) et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Des observations des plaies et des changes de pansements auront régulièrement lieu, avec ou sans anesthésie selon les espèces.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie, contrôlés par la prise d’analgésique (morphinique) et par la réalisation d’une anesthésie générale. Un suivi a minima quotidien des animaux permet de détecter les signes de douleur et d’adapter le traitement analgésique en conséquence pour diminuer autant que possible ces nuisances. - présence d’un pansement secondaire pour protéger les plaies et les articles appliqués ainsi que les risques d’infection. L’intégrité de ce pansement secondaire est vérifiée quotidiennement et peut éventuellement gêner l’animal. - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours, contrôlée par le suivi quotidien du transit et/ou de l’alimentation et la mise en place de mesures de soutien, jusqu’à la reprise d’un comportement alimentaire normal et spontané. Les mesures mises en place peuvent être par exemple : mise à disposition d’aliments plus appétant (friandises), distribution d’un aliment de convalescence (prise spontanées ou assistée) ...
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en cicatrisation.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test". Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, éléments de nidification…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, ces suivis sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance et éventuellement réfection additionnelle des pansements (en plus de ceux prévus les jours de lecture), nettoyage des plaies à chaque réfection de pansement, prolongation du traitement analgésique post-opératoire). La douleur liée aux prises de sang éventuelle peut être maitrisée par la réalisation de la prise de sang sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou locale, ou encore sous sédation légère.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie en fonction des attentes du test et les similarités avec l’homme : - Structure de la peau et processus de cicatrisation similaires chez les porcins. - Plus d’exsudation des plaies chez les porcins que chez les rongeurs. - Processus normal de cicatrisation des rongeurs par contraction, comme certains types de plaies chez l’Homme (par exemple, plaies de brulures) - Lorsqu’un phénotype/génotype diabétique est nécessaire pour une étude, les espèces de petite taille, telles que les rats et les souris, sont privilégiées car ces lignées sont plus facilement générées et maintenues. - Les petits animaux (rat, souris, cobayes) sont souvent utilisés pour des raisons de facilité d’utilisation (actes techniques plus facilement réalisables car animaux moins lourds, hébergement de plus petite taille). Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Etude du système vasculaire intra-nerveux et des effets de molécules vasodilatatrices dans le cas d’une neuropathie périphérique chimiquement induite à des souris développant une carcinose péritonéale, une tumeur intra-caecale ou souscutanée.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Elles reçoivent des injections de chimiothérapie qui déclenchent une neuropathie douloureuse, une greffe de cellules tumorales et une incision exposant le nerf sciatique, puis un test de sensibilité sur plaque froide. Le porteur indique que les symptômes neuropathiques ne seront pas soulagés, aucun traitement efficace n'existant chez les patients, ce qui laisse ces douleurs sans prise en charge. Il affirme que la mesure de paramètres comportementaux et physiologiques ne permet pas de se passer de l'animal.
Objectifs
Nous avons mis au point un modèle murin de neuropathie périphérique induite par la chimiothérapie sur des souris mâles. Le modèle est généré par des injections intraveineuses de cette chimiothérapie car nous étudions l’implication des vaisseaux sanguins intranerveux dans le développement de la pathologie. Nous sommes ainsi surs de ne pas passer à côté d’un éventuel phénotype vasculaire. Nos résultats suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices améliore les symptômes d’une neuropathie périphérique chimiquement induite. Afin d’évaluer cette piste thérapeutique, il est important de vérifier qu’elle n’interfère pas avec l’efficacité anti-tumorale de la chimiothérapie. Pour ce faire, nous souhaitons induire une neuropathie périphérique chez des souris présentant une tumeur abdominale (carcinose péritonéale), sous-cutanée ou intra-caecale par une injection de cellules cancéreuses du côlon murin. Puis, nous pourrons évaluer la taille de la tumeur ou mesurer son développement par bioluminescence car les cellules expriment la luciférase, à savoir si elle est inhibée avec l’administration conjointe de chimiothérapie et de différentes molécules vasodilatatrices, seules ou combinées. Ce projet permettra donc de statuer sur l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par la chimiothérapie aux stades aigus et chroniques.
Bénéfices attendus
Les neuropathies périphériques chimiquement induites sont un problème de santé publique majeur. Pour une chimiothérapie, traitement majoritairement utilisé pour traiter les cancers du côlon, 80% des patients développeront des symptômes neuropathiques à la suite des cycles de chimiothérapie. Ces patients ont une qualité de vie réduite avec des symptômes douloureux qui peuvent devenir insupportables et conduisent alors à la réduction ou à l’arrêt du traitement anticancéreux. Nos données suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices permet d’atténuer les symptômes neuropathiques à un stade aigu. Afin d’évaluer cette piste thérapeutique, il est important de définir si l’administration conjointe d’une chimiothérapie et de molécules vasodilatatrices, seules ou en combinaison, n’interfère pas avec l’efficacité du traitement anti-cancéreux. Ce projet permettra donc de statuer sur l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par une chimiothérapie aux stades aigus et chroniques. Si la taille de la tumeur régresse de la même manière entre les groupes traité à la chimiothérapie et traité à la chimiothérapie et aux molécules vasodilatatrices, nous pourront alors les envisager dans le traitement des neuropathies périphériques induites par cette chimiothérapie.
Procédures
Les animaux recevront plusieurs injections intraveineuses de chimiothérapie ou de glucose pour 2 ou 8 semaines. Ils seront éveillés pendant la procédure d’injection, maintenus dans un dispositif de contention laissant libre accès à leur queue, endroit de l’administration. Ces animaux pourront recevoir, tous les jours ou tous les deux jours, par voie intrapéritonéale ou orale, des molécules vasodilatatrices dans le but de réduire les symptômes neuropathiques induits par la chimiothérapie. L’efficacité anti-tumorale de la chimiothérapie en combinaison avec des molécules vasodilatatrices sera mesurée par l’induction et le suivi d’une tumeur abdominale. Il recevront également une injection de cellules tumorales en intrapéritonéale (IP), sous-cutanée (SC) ou intra-caecal (IC) puis plusieurs injection intrapéritonéale (IP) (3 pour le modèle aigu 8 pour le modèle chronique) afin de suivre la progression tumorale par bioluminescence de façon non invasive. Pour le laser doppler, les animaux seront soumis à une incision cutanée afin d’exposer le nerf sciatique. Enfin,les animaux seront soumis au test de la plaque froide afin d’établir leur sensibilité au froid (maximum 8min, 6 fois pour le modèle aigu, 2 fois par semaine pour le modèle chronique)
Impact sur les animaux
Les souris recevant une dose cumulée de chimiothérapie, nous pouvons nous attendre à une petite perte de poids de nos animaux. Les souris traitées à la chimiothérapie développeront une neuropathie périphérique avec des sensations d’inconfort au niveau des pattes notamment. Nous étudions cette pathologie car il n’y aucun moyen de traiter les symptômes neuropathiques chez les patients. Les souris ne pourront donc pas être soulagées avec des médicaments qui se sont avérés inefficaces. Une sensation d’inconfort pourra être ressentie après l’incision cutanée nécessaire à la réalisation du laser doppler.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chacune des procédures et nous prélèverons les organes (cerveaux, nerfs sciatiques et peaux de pattes) afin de conduire des études post mortem.
Remplacement
Ce projet modélise une pathologie humaine, la neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique et l’effet d’une potentielle solution thérapeutique. Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres comportementaux et physiologiques ; il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifique valide car il prend en compte le risque de 10-15% de non prise de greffe et le risque de mortalité lié aux différents traitements. Statistiquement, nous utiliserons des tests non paramétriques (Wilcoxon et Kurskal-Wallis pour les comparaisons des moyennes). Ces tests ne faisant pas l’hypothèse de normalité de distribution des échantillons, il n’existe pas de nombre minimal d’échantillons pour les utiliser, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat statistiquement pertinent.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine ou plus. Une incision abdominale médiane d’environ 1 cm sera pratiquée sur l’abdomen de la souris. Ce geste nécessitera une anesthésie générale gazeuse et une analgésie en sous-cutanée. Afin de suivre la progression de la maladie en Intrapéritonéale et Intracaecal, les souris feront l’objet d’un examen non invasif par bioluminescence. La sensibilité au froid est mesurée par le test de la plaque froide, test que nous avons adapté afin qu’il soit plus éthique en soustrayant l’animal d’une température qui l’incommoderait. Pour cela, il sera placé sur la surface de la plaque métallique à une température initiale de 20°C. L’acquisition sera alors lancée et la plaque perdra 2°C par minute jusqu’à maximum 4°C. L’électromyogramme et l’analyse laser doppler seront réalisés sur des animaux sédatés par anesthésie gazeuse. Leur température corporelle sera maintenue à 37° à l’aide d’une couverture chauffante couplée à un appareil de thermorégulation. Le développement tumoral en SC sera suivi par la mesure de la taille de la tumeur 2 fois par semaine (3 fois pour le modèle aigu) dont le plus long côté ne devra pas dépasser 2cm sur animal vigile. Dans l’éventualité d’apparitions de points limites, les mesures retenues seront mises en œuvre.
Choix des espèces
Nous utiliserons pour ces expériences des souris mâles immunocompétents Balb/c et C57BL/6, espèces largement utilisées dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. La neuropathie périphérique chimiquement induite est un effet secondaire de nombreux traitement anti-cancéreux. C’est donc une pathologie qui touche majoritairement les adultes. Nous travaillons alors chez la souris adulte, âgée entre de 3 et 6 mois.
Réponse moléculaire de l’endothélium vasculaire à l’irradiation chez la souris : intérêt pour la prédiction du risque de toxicité pulmonaire après une irradiation localisée du thorax à forte dose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
452 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Leur thorax est irradié à forte dose sous anesthésie, puis elles sont gardées une semaine, trois mois ou six mois avant l'euthanasie et le prélèvement des poumons. Le porteur reconnaît qu'au-delà de trois mois les animaux peuvent développer une détresse respiratoire, voire mourir. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour étudier la réponse des cellules des vaisseaux, tout en présentant le projet comme une étape vers un futur modèle in vitro.
Objectifs
L’irradiation localisée à forte dose engendre des lésions tissulaires d’origine plurifactorielle suite à l’altération de nombreux types cellulaires. Pour améliorer les traitements, il faut développer des moyens de limiter ces toxicités tout en conservant/augmentant le contrôle tumoral. Avec les nouvelles pratiques qui utilisent des débits de doses plus importants et des faisceaux de particules de plus grandes énergies, il faut comprendre les mécanismes conduisant aux lésions tissulaires, limiter les toxicités et développer des moyens de prédire la toxicité tissulaire. Un des programmes a pour objectif de concevoir des outils de prédiction des risques de complications liés aux nouvelles pratiques de radiothérapies, en se basant sur la réponse moléculaire à l’irradiation de cellules des vaisseaux sanguins cultivées dans des boites de culture. Nous nous appuierons sur les mesures de paramètres biologiques dans ces cellules (activité des cellules, vieillissement prématuré ou capacité à se multiplier) pour comparer différents rayonnements ionisants. Pour rendre notre modèle plus robuste, nous souhaitons collecter et utiliser des données provenant des cellules des vaisseaux irradiées au sein d’un organisme vivant, car le comportement des cellules étudiées est dépendant de leur environnement tissulaire mais aussi de la physiologie de l’organisme dans son ensemble. Jusqu’à présent, la difficulté d’isoler les cellules vasculaires à partir d’organes rendait difficile l’étude de leur réponse moléculaire. Dorénavant, les études sur cellules isolées sont réalisables. Il est aujourd’hui possible d’étudier des milliers de gènes et des ensembles de protéines d’intérêt dans des cellules isolées les unes des autres par des techniques de pointe. La phase 1 (projet précédent) a permis de choisir le poumon comme organe d’étude. Dans la phase 2 (projet précédent et celui-ci), il s’agit d’exposer le poumon à différentes modalités d’irradiations pour étudier la réponse des cellules des vaisseaux et des cellules immunitaires car elles jouent également un rôle prépondérant. Ainsi nous pourrons comprendre comment les cellules vasculaires répondent à l’irradiation au sein d’un organisme au niveau moléculaire et comment elles communiquent avec les cellules immunitaires, de comparer les résultats obtenus à ceux produits par les études sur les cellules vasculaires cultivées dans des boites de culture, et enfin d’étudier la toxicité de ces modalités d’irradiation chez la souris.
Bénéfices attendus
L’objectif global de ce projet est l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales issues des poumons irradiés in vivo chez la souris afin d’améliorer notre modèle de prédiction du risque de séquelles tardives radio-induites dues à la radiothérapie. Le bénéfice scientifique attendu de ce projet est d’une part une meilleure compréhension de la réponse des cellules endothéliales in vivo, et d’autre part un renforcement de notre modèle d’évaluation des risques de séquelles sur des cellules en culture en comparant les jeux de données obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo chez la souris par des analyses mathématiques et bio-informatiques. Une fois établi, notre modèle aura pour but d’évaluer les risques in vitro sans recourir à l’expérimentation animale. A plus long terme, le bénéfice attendu de ce projet sera principalement pour l’être humain : (i) par une meilleure compréhension de la réponse à l’irradiation et à différentes modalités d’irradiation des cellules endothéliales in vivo, nous pourrons mieux comprendre comment les séquelles radio-induites sont initiées et comment elles se développent ; (ii) par l’établissement d’un modèle de prédiction in vitro du risque de séquelles lié aux nouvelles pratiques de la radiothérapie, nous souhaitons contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des patients après traitement anti-cancéreux, un objectif inscrit dans la stratégie décennale de lutte contre les cancers 2021-2030.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie (durée max de 20 min), maintenus 1 semaine, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis sédatés profondément afin d’être euthanasiés avant le prélèvement des poumons. Certains animaux seront imagés au micro-CT sous anesthésie volatile (isoflurane) juste avant l’euthanasie (durée max de 10 minutes). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Le modèle d’irradiation localisée du thorax est bien caractérisé dans notre laboratoire. Aux temps les plus tardifs (supérieurs à 3 mois après l’irradiation), les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder. Les animaux seront donc attentivement surveillés et devront être euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude. Il est à noter que ce projet vise à contribuer à l’établissement d’un modèle de prédiction du risque de toxicité sur cellules in vitro. A terme, il pourra donc servir à remplacer l’expérimentation animale par un modèle in vitro pour évaluer la toxicité de l’irradiation.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude des lésions pulmonaires tardives radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques sur les analyses histologiques, des groupes de 10 à 12 animaux sont nécessaires. Pour les analyses moléculaires en cytométrie de flux, des groupes de 6 à 8 animaux sont nécessaires. Pour les analyses du matériel génétique des cellules, des groupes de 4 à 6 animaux sont suffisants, car les tests statistiques sont réalisés sur des milliers de cellules par échantillon, ce qui augmente significativement la puissance statistique.
Raffinement
Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine dans les 3 premières semaines après l’irradiation, puis 1 fois par semaine jusqu’aux temps 3 et 6 mois. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 8 à 10 semaines. Ceci correspondant au stade adulte, ce qui permet d’éviter l’hétérogénéité éventuelle liée à l’âge (il s’agit également de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée). Nous utiliserons des souris mâles afin d’avoir des animaux de poids suffisamment important. Nous avons fait le choix scientifique de ne travailler que sur des mâles dans un premier temps, car nous avons au laboratoire un recul conséquent de ce modèle sur des souris de sexe mâle. Nous envisageons un futur projet sur des femelles pour étudier les conséquences de la dose d’irradiation choisie à une modalité d’irradiation. La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, c’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions radio-induites. Nous possédons donc un recul important sur les conséquences de l’irradiation pour ce modèle.
Évaluation par imagerie par résonance magnétique d’une stratégie thérapeutique à base d’apeline 13 dans un modèle d’ischémie cérébrale murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau, suivi d'injections, de prélèvements sanguins répétés et de plusieurs IRM sous anesthésie. Le porteur indique que la chirurgie entraîne une perte de mobilité, des troubles de la déglutition pouvant conduire à une fausse route et au décès, et une perte de poids. Il teste des injections répétées d'apeline-13, approche qu'il présente comme jamais rapportée, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la physiopathologie de l'AVC.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’homme, la 2ème cause de démence et la 3ème cause de mortalité en France. Sa forme ischémique est causée par l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot de sang. L’occlusion de l’artère entraine une crise énergétique, par défaut d’apport en glucose et oxygène et provoque la destruction rapide et définitive d’une zone du cerveau. Malgré l’avancée des traitements de recanalisations (thrombolyse chimique et thrombectomie mécanique), 50% des patients traités gardent des séquelles. La plasticité vasculaire et neuronale constitue le pivot de la récupération post-AVC. En situation post-ischémique, différents mécanismes compensatoires de néovascularisation sont activés. Ces mécanismes physiologiques compensatoires peuvent s’avérer insuffisants pour assurer une reperfusion efficace lors d’épisodes ischémiques aigus, mais également chroniques. Plusieurs pistes expérimentales sont étudiées pour améliorer la récupération post-AVC (thérapies régénératives, agents neuroprotecteurs, entrainement physique + cognitif). L’Apeline et son récepteur APJ sont largement distribués dans différents tissus et organes. La littérature suggère un effet protecteur de l’Apeline sur la neurotoxicité, le stress oxydatif, l’apoptose neuronale et joue un rôle neuroprotecteur après une lésion aigue d’ischémie-reperfusion cérébrale. Cependant, dans ces études, une seule administration d’Apeline est faite le jour de l’ischémie. Par ailleurs, les bénéfices sont évalués à très court terme et l’expression d’APJ au-delà de J1 post-ischémie demeurent non documentés.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d'injections répétées d’Apeline-13 dans un contexte d’accident vasculaire cérébral chez un modèle murin. Ceci n’a jamais été rapporté dans la littérature à ce jour. Les troubles cognitifs pouvant être associés à l’AVC ont des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient, sur le taux de mortalité dans les 4 années suivant l’AVC, et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs. L’Apeline-13 est un peptide dont l’effet neuroprotecteur est décrit en per-opératoire. Dans ce modèle, les conséquences neurovasculaires de l’administration d’apeline sont encore très peu décrites. Dans ce projet l’objectif est de mettre en évidence l’intérêt d’un traitement répété sur une durée de traitement plus longue et d’évaluer l’impact de ce traitement sur la réduction des différents troubles moléculaires, moteurs et cognitifs après la survenue d’un AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire l'ischémie cérébrale. Les animaux seront soumis à des injections dans le but de leur administrer le traitement (de 1 à 3 injections selon le groupe). Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin à J-1, à 3 prélèvements sanguins à J1 (ante, per, post tMCAO) ainsi qu'un prélèvement à J3 avant la mise à mort. Ces prélèvements seront réalisés à la queue lorsque les souris seront endormies pour effectuer les IRM. La première IRM aura lieu pendant l'ischémie pour une durée d'environ 30 minutes. Suite à la reperfusion ainsi qu'à J1, J2 et J3, 4 autres IRM seront effectuées et devraient avoisiner 90 minutes chacunes. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J3. Le cerveau sera finalement prélevé au terme du protocole.
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite des prélèvements sanguins itératifs, de petits volumes, qui seront effectués grâce à une unique incision caudale. La chirurgie a pour conséquence de générer un infarctus cérébral conduisant à une perte de mobilité plus ou moins transitoire et d’intensité variable. Durant les premières heures, l'animal ne sera peut-être pas capable de boire ou manger, car il peut présenter des troubles de la déglutition, entrainant fausse route, asphyxie et décès. Une perte de poids peut être observée dans les jours suivants la chirurgie. L’anesthésie prolongée lors de la chirurgie et des imageries peut induire un risque d’hypothermie qui sera pris en charge par l’utilisation d’une plaque chauffante pour la chirurgie et d’une couverture chauffante compatible IRM pour l’imagerie in vivo. Plusieurs injections intraveineuses seront réalisées dans les sinus rétro-orbitaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure permettant le prélèvement des tissus cérébraux.
Remplacement
Diverses approches peuvent être utilisées pour étudier la physiopathologie de l’AVC. Parmi elles, l’in vitro, permettant d’étudier les effets de l’hypoxie sur différents types cellulaires, régulièrement indépendamment les uns des autres. Néanmoins, la physiopathologie de l’ischémie cérébrale, bien que de mieux en mieux décrite, reste complexe. En effet, celle-ci se compose de différents mécanismes spontanés s’influençant mutuellement sur la durée. Ces mécanismes mettent en jeu différents types cellulaires et évoluent au cours du temps. Pour caractériser l’évolution temporelle de ces divers processus en réponse à un traitement pharmacologique, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental permettant l’interaction de ces mécanismes complexes, indissociables les uns des autres. Par ailleurs, l’AVC étant à l’origine de troubles moteurs comme cognitifs, notre étude vise également à investiguer les bénéfices neuro-comportementaux de notre traitement, d'autant plus que la souris se présente comme une alternative intéressante du fait des nombreuses similitudes observées entre cette espèce et l’Homme en ce qui concerne les grandes artères cérébrales. De plus, le modèle tMCAO murin est un modèle excessivement bien documenté dans la littérature. Enfin, il pourrait néanmoins être utile d’implémenter notre étude de modèles in vitro pour déterminer précisément les mécanismes d’action et les voies moléculaires impliquées au sein des différentes populations cellulaires indépendamment les unes des autres.
Réduction
En l’absence de données dans la littérature, cette étude nous permettra d’évaluer s’il existe ou non, un effet du traitement répété à l’apeline 13 sur la réduction du volume final de l’infarctus/ réduction des troubles cognitifs dû à la survenue d’un AVC. Nous prévoyons un maximum de 60 souris pour cette procédure. La variabilité importante (environ 20%) de la taille de l’infarctus final généré par l’occlusion artérielle justifie que le critère d’évaluation principal (volume de la lésion) soit normalisé au volume d’hypoperfusion, évalué par IRM durant la phase d’occlusion. Cette normalisation doit permettre de limiter la variabilité interindividuelle des mesures et réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les animaux utilisés dans la partie 1 permettront à la fois d’évaluer la perfusion cérébrale après traitement sans et avec ischémie cérébrale. Pour évaluer le modèle ischémie cérébrale transitoire chez la souris au cours du temps nous utiliserons l’IRM, technique permettant des études non invasives, longitudinales, multiparamétriques et quantitatives, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire. Le modèle d'AVC chez le rongeur a des impacts physiologiques et fonctionnels interindividuels très variés. Les études déjà publiées chez la souris utilisent des nombres de souris très variables allant de n=6 à n>20. Dans notre étude nous évaluerons les effets d’un traitement précoce d’apeline-13 sur 3 jours. Il n’existe pas d’études chez la souris, nous nous baserons sur notre expérience du modèle chez le rat pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire. Nous avons donc choisi d'avoir des groupes de 12 animaux pour nous permettre une évaluation statistique fiable à la fin de l'étude (test non paramétrique de wilcoxon pour les comparaisons entre 2 groupes). Ce nombre est suffisant pour prendre en compte la variabilité interindividuelle et permettre de déterminer la meilleure fenêtre d’imagerie pour chaque traceur dans notre modèle.
Raffinement
Les chirurgies, prélèvements sanguins, les injections IV et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress et la douleur et un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale (ropivacaïne) et/ou générale par injection en s.c de morphinique (buprénorphine). Pendant une heure après la chirurgie une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post-opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le modèle d’ischémie cérébrale transitoire chez la souris est bien décrit dans la littérature. Cette technique d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (tMCAO) par un filament de nylon introduit dans l'artère carotide commune via l’artère carotide interne pour occlure l’artère cérébrale moyenne reproduit l’accident vasculaire cérébral ischémique le plus fréquent chez l’humain (par occlusion de l’artère cérébrale moyenne) et il est le plus décrit dans la littérature. Les animaux seront au stade adulte entre 3 et 4 mois conformément au modèle décrit dans la littérature. Après réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au minimum 7 jours avant le début du protocole expérimental.
Plasticité fonctionnelle de la voie descendante réticulo-spinale après lésion de la moelle épinière et stimulation régénérative
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une lésion de la moelle épinière leur est infligée sous anesthésie, avec deux heures de chirurgie et des injections de traceurs, ce qui provoque une paralysie des membres postérieurs et des difficultés à se nourrir et boire au réveil. La moitié reçoit ensuite une stimulation magnétique, et tous les animaux sont tués vingt à soixante-cinq jours après la lésion pour prélever la moelle. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace l'expérimentation in vivo et que le modèle animal reste "nécessaire" pour mesurer la repousse des fibres nerveuses.
Objectifs
Les lésions médullaires traumatiques sont responsables d’une perte des fonctions sensitives, autonomes et motrices liées à une forte inflammation, une démyélinisation ainsi qu’une diminution de la repousse axonale. La thérapie par stimulation magnétique trans-spinale répétitive a permis notament de réduire l’inflammation, induire une remyélinisation et une repousse axonale après lésions médullaires traumatiques. Toutefois, la plasticité et l’identité précises des voies descendantes qui sont influencées par cette stimulation trans-spinale après lésions médullaires ne sont pas connues. C’est pourquoi ici, nous souhaitons mettre en évidence les effets de la lésion médullaire dans un premier temps ainsi que ceux de la thérapie par stimulation magnétique trans-spinale répétitive dans un second temps sur la plasticité des fibres réticulospinales.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse à la plasticité des voies descendantes après lésion médullaire traumatique. Ces connaissances sont essentielles afin de mieux prendre en charge ces pathologies et mettre en place des thérapies qui pourront induire une repousse axonale et donc à terme une récupération fonctionnelle chez les patients souffrant de ce type de traumatismes. Cette étude nous permettra également d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans ce contexte lésionnel. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement dans le cadre de la prise en charge des lésions médullaires chez l’Homme.
Procédures
120 souris (60 males et 60 femelles) seront utilisées sur lesquelles seront réalisées une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. Le jour même après la lésion et afin de mettre en évidence les fibres nerveuses ayant survécu, l’injection d’un premier traceur en dessous de la lésion sera également réalisée, la durée de cette intervention sera de 15 minutes. Puis une seconde injection de traceurs, permettant de visualiser les axones des populations neuronales d’intérêt, sera réalisée au niveau du tronc cérébral, cette intervention durera 1 heures et 15 minutes. De ce fait, à J0 l’ensemble des interventions chirurgicales prendra un temps de 2h par souris. Tous les animaux opérés recevront une injection d’antalgique 20 minutes avant la chirurgie et une seconde 6 heures après la chirurgie. De plus, après la chirurgie, à J0, nous procéderons à une injection de sérum physiologique afin de prévenir les animaux d’une déshydratation. Le lendemain et jusqu’au 14 ème jour après la lésion, sous anesthésie générale, la moitié des souris (soit 60 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes. Le 15ème ou le 60ème jours après la lésion, une troisième injection de traceurs en dessous de la lésion sera réalisée, permettant ainsi de mesurer la repousse des fibres nerveuses, la durée totale de cette intervention prendra 20 minutes. L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié 5 jours après la seconde injection de traceurs, soit 20 et 65 jours maximum après la lésion afin de récupérer la moelle épinière. Cette chirurgie durera 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie - Paralysie des membres postérieurs, de type hémiplégie - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le reveil
Devenir
L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (65 jours maximum après la lésion médullaire) afin de procéder au prélévement de la moelle et du tronc cérébral. Les souris ayant subis des lésions médullaires (120 souris), ne peuvent de ce fait pas, même si cela était possible d’un point de vue expérimentale, faire l’objet d’un don ou bien d’une « réutilisation ».
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer la plasticité des fibres descendantes après lésion de la moelle épinière et mise en place de thérapie comme la stimulation magnétique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux. Il faut prendre en compte dans ces expérimentations le fait que les injections stéréotaxiques au niveau du tronc cérébral peuvent ne pas être effectuées au bon endroit du fait de variations anatomiques inter-individuelles et donc ne pas marquer les fibres d’intérêt. De ce fait, nous prevoyons d’inclure 15 souris par groupe. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés. Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse à la plasticité des voies descendantes après lésion médullaire traumatique. Ces connaissances sont essentielles afin de mieux prendre en charge ces pathologies et mettre en place des thérapies qui pourront induire une repousse axonale et donc à terme une récupération fonctionnelle chez les patients souffrant de ce type de traumatismes. Cela nécessite la mise en place de modèles comparables aux pathologies humaines. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de modèles animaux. Les animaux utilisés seront agées de 8 semaines, les lésions médullaires chez l’Homme concernent le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.
Rôle de l’axe IL33/ST2 dans le cross talk pathologique cardio-rénal.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Elles reçoivent cinq injections pour induire une modification génétique, subissent une chirurgie cardiaque d'une heure provoquant un infarctus, puis une mesure de la fonction rénale de deux heures, avant une mise à mort échelonnée à un, sept ou vingt-huit jours. Le porteur indique des douleurs post-opératoires et présente l'axe IL33/ST2 comme une cible thérapeutique déjà accessible via des anticorps. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le dialogue entre le cœur et le rein et juge le modèle animal "indispensable".
Objectifs
Le syndrome cardio-rénal est un état de santé où une maladie du cœur ou des reins affecte négativement l'autre organe. C'est un phénomène complexe et nous n'avons pas encore une compréhension complète de comment les deux organes interagissent en cas de maladie. Certains progrès ont été faits pour comprendre cela. Par exemple, des recherches récentes ont mis en lumière certaines voies de communication entre le cœur et les reins en cas de maladie. Une molécule appelée Galectin-3 semble jouer un rôle important lorsqu'il y a une maladie rénale qui affecte le cœur, et cette molécule a été associée à un risque accru de maladie et de décès chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque. Une autre découverte récente concerne une molécule appelée IL33 et son récepteur, ST2. Cette molécule semble jouer un rôle important lorsque les reins sont malades et affectent le cœur, mais de manière surprenante, elle semble avoir un effet néfaste sur le cœur, ce qui est contraire à ce que d'autres études avaient suggéré auparavant. Ces découvertes montrent qu'il existe un lien complexe entre le cœur et les reins lorsqu'une maladie se produit, et que comprendre ce lien pourrait être la clé pour traiter ces maladies plus efficacement. Ainsi, l'objectif de ce travail est d'évaluer l'impact d'une crise cardiaque sur la santé des reins à long terme, et d'étudier plus précisément comment la molécule IL33 et son récepteur ST2 jouent un rôle dans les changements que subissent le cœur et les reins en cas de maladie.
Bénéfices attendus
Dans nos précédents travaux, nous avons mis en évidence que l’axe IL33/ST2 était un axe central dans la survenue de remodelage cardiaque à distance d’une agression rénale aiguë. Ce projet permettra d’une part de caractériser les modifications architecturales qui surviennent au niveau rénal après la maladie coronaire aiguë et de mesure l’impact de cet axe sur ces modifications. Il existe déjà un certain nombre de thérapeutiques déjà disponibles pour la modulation de cet axe (anticorps monoclonaux anti-IL33 ou anti-ST2). L’application clinique et son bénéfice pourront donc rapidement être évalués si les hypothèses de travail sont concluantes. Le pool de patient potentiellement traitables est énorme car il s’agit d’un des problèmes de santé publique le plus important et la cause de morbi-mortalité la plus importante de nos sociétés occidentales.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 injections de substance nécessaire à l'obtention du modèle génétiquement modifié d'une minute 5 jours de suite. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d’une durée d’une heure. Les animaux seront soumis à une mesure du débit de filtration glomérulaire (fonction de filtration du rein) d’une durée de 2 heures. Les souris recevant le tamoxifène auront un intervalle libre entre la dernière injection et la chirurgie d'une semaine. Certains animaux subiront une micro-puncture de l'oreille vers J6 pour déterminer leur génotype.
Impact sur les animaux
Durant l’ischémie reperfusion, les nuisances sont une inflammation au niveau des points d'incision pour la thoracotomie et de la douleur à ces mêmes endroits. Les nuisances liées à l'infarctus du myocarde sont essentiellement marquées par les douleurs post opératoires, le modèle n'étant pas un modèle d'insuffisance cardiaque sévère. Pas de nuisances liées à l'atteinte rénale potentielle. Durant l'injection de la substance pour la recombinaison génétique, on peut avoir une douleur au point d'injection et une irritation abdominale transitoire. La procédure de mesure de la fonction rénale n'est pas source de nuisance en soit sinon une gène pour l'animal de porter le dispositif sur le dos pendant la mesure. Durant la puncture pour le génotypage, la nuisance liée à la puncture est de très courte durée et très peu douloureuse.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser des prélèvements d'organes et de plasma pour analyse. Le temps de mise à mort varie selon le groupe entre J+1, J+7 et J+28.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro permettant d’évaluer le dialogue entre le cœur et le rein, puisque par essence, il s’agit d’un modèle physiologique intégré. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d’étudier des mécanismes cellulaires plus complexes qui ne peuvent pas être étudiés sur des modèles ex vivo ou in silico. Par conséquent, l’utilisation du modèle animal apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole. Néanmoins, le laboratoire travail en parallèle sur des modèles cellulaires permettant de mimmer ces conditions et à terme remplacer l'utilisation d'animaux, néanmoins ces modèles n'ont à ce jour pas démontré de résultats satisfaisants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé dans le projet a été calculé pour permette d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ceci, plus notre expérience préalable dans le domaine nous ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux pour ces expérimentations protocole, l’avantage d’utiliser un processus non invasif de mesure de la fonction rénale permet de limiter le recours extensif à un nombre important d’animaux.
Raffinement
La procédure de raffinement a été établie et discutée avec le responsable du bien-être des animaux au sein de notre unité. Les animaux sont stabulés dix jours après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les souris sont hébergées en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). Les animaux sont contrôlés quotidiennement par un animalier formé (afin de s’assurer de leur bien-être), à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites. Lors de la procédure, les animaux sont anesthésiés et une analgésie avant l’intervention sera réalisée pour limiter un peu plus les risques de douleurs ressenties. La phase de réveil se fait dans un incubateur à 37°C pendant toute la nuit. Des points limites clairs ont été établies afin de soustraitre les animaux à la souffrance.
Choix des espèces
Notre équipe a développé les différents modèles d’ischémie-reperfusion sur la souris afin d’éviter de réaliser des expérimentations sur des gros animaux et pour avoir la possibilité de réaliser le modèle sur des souris transgéniques. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines afin d’obtenir un poids de 20-25 grammes.
Essai pré-clinique d’immunothérapie de la fibrose chez le chien modèle de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Jusqu'à 14 chiens vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance sévère, les chiens malades tués en fin de suivi pour prélèvements et les chiens sains compagnons proposés à l'adoption. Les chiens atteints de myopathie de Duchenne subissent 38 prélèvements sanguins, quatre prélèvements urinaires, trois biopsies musculaires, des IRM et une chimiothérapie préparatoire, avec fièvre, perte d'appétit et risque de cystite hémorragique ou de syndrome de relargage de cytokines. Le porteur teste des cellules CAR-T contre la fibrose musculaire, en visant une "preuve de concept" pré-clinique. Il retient le chien comme le modèle reproduisant le mieux la maladie humaine.
Objectifs
En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisées est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T tueurs =sous-population de globule blanc) modifiés artificiellement pour cibler des marqueurs tumoraux spécifiques. Les globules blancs du patient sont isolés par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, puis modifiés ex vivo pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques. Une maladie dans laquelle une fibrose s'installe et entraîne une perte de fonction majeure est la myopathie de Duchenne. Chez le chien modèle de cette maladie, une fibrose s'installe dans les muscles et le coeur, comme chez les patients humains, et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans ces tissus. L'objectif de ce projet est de déterminer si le ciblage de ce marqueur par des cellules CAR-T permet de réduire la fibrose et d'améliorer la fonction musculaire chez des chiens atteints de myopathie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept pré-clinique sur l'efficacité du ciblage d'un marqueur spécifique de la fibrose, pour réduire la celle-ci dans la myopathie de Duchenne. Si cette stratégie s'avère efficace, cette étude ouvrira la voie à la possibilité d'utiliser ce marqueur comme une cible thérapeutique chez les patients atteints par cette maladie.
Procédures
Des prises de sang seront effectuées aux âges de 2, 4 et 5 mois, puis de manière plus rapprochée autour du traitement préparant à l'injection de cellules qui a pour but de faire chuter le nombre de globules blancs circulants, afin de suivre au plus près la formule sanguine des chiens. Puis, des prises de sang seront effectuées lorsque les chiens auront reçu une injection de leurs propres globules blancs, prélevés par une méthode s'apparentant à celle utilisée pour les dons de plaquette, et modifiés ou non. Au total, 38 prélèvements sanguins sont prévus sur les chiens, dont 28 sur chiens vigiles (temps estimé 5 minutes y compris préparation et compression pour éviter la formation d'un hématome), et 10 à un cathéter au cours d'une anesthésie générale (temps estimé moins d'une minute). Quatre prélèvements urinaires sont également prévus (prélèvement directement dans la vessie, sous anesthésie générale, durée 1 minute). Des biopsies musculaires seront prélevées chirurgicalement, à 3 reprises (temps d'intervention 30 minutes environ). En outre, les chiens subiront également, sous anesthésie générale : trois examens IRM (durée 2h00), quatre mesures de force (durée 45 minutes). Vigiles, les chiens subiront des examens cliniques et neuf tests de marche (10 minutes), de fonction respiratoire (10 minutes) et d'enregistrement de l'ECG en holter (24 heures, équipement sans fil porté par le chien).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les chiens au cours de ce projet sont de trois ordres : - Celles liées à la maladie qui touche ces animaux : troubles locomoteurs, faiblesse des muscles respiratoires et de la déglutition. Les signes cliniques seront étroitement surveillés, et les animaux seront mis à mort en cas d'atteinte d'un point limite. - Celles liées au protocole préparatoire qui a pour but de diminuer la quantité de globules blancs circulants pour permettre une meilleure efficacité des cellules CAR-T. Les principales nuisances induites sont une perte d'appétit transitoire en cours de traitement, qui répond à un traitement anti-vomitif et une journée de fièvre avec abattement associée à la baisse des globules blancs dans le sang, environ une semaine après le début du traitement. La formule sanguine et l’état général se normalisent ensuite en quelques jours. Par ailleurs, malgré les mesures préventives recommandées mises en œuvre, il ne peut être exclu qu’un épisode de cystite hémorragique (saignement de la vessie) puisse survenir, s’agissant d’une toxicité connue d’un des agents pharmacologiques utilisés. - Celles liées à la survenue éventuelle d'un syndrome de relargage de cytokines (= état inflammatoire aigu). Il s'agit d'une complication grave connue chez l'Homme des traitements par cellules CAR-T, plus probablement liée à l'action des cellules CAR-T dans un contexte cancéreux donc a priori moins probable dans le contexte présent. Ce syndrome se traduit par une fièvre, une hypotension, une élévation de marqueurs sanguins de l'inflammation et à des stades plus avancés par des troubles respiratoires et/ou neurologiques. Nous serons très vigilants quant à la survenue possible d'un tel syndrome chez les chiens traités, et administrerions un anti-inflammatoire pour traiter ce syndrome s'il survenait.
Devenir
Les animaux inclus dans la procédure 1 (étude pré-clinique proprement dite) seront mis à mort en fin de suivi pour des prélèvements larges de tissus. Les animaux inclus dans la procédure 2 (animaux sains, compagnons de ceux inclus dans la procédure 1) seront mis à l'adoption.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer une stratégie de thérapie anti-fibrose, basée sur une injection de cellules du système immunitaire modifiées pour cibler spécifiquement un marqueur de la fibrose et aller détruire les cellules responsables de cette fibrose dans l'ensemble des muscles striés. Il apparaît donc incontournable de réaliser cette étude dans un organisme entier. Des tests réalisés in vitro ont confirmé que les globules blancs modifiés pour devenir des "CAR-T" détruisent bien d'autres cellules si elles expriment le marqueur de fibrose. Reste à déterminer si dans le contexte d'un organisme entier, le comportement de ces cellules est le même et si ces cellules arrivent bien à atteindre les zones de fibrose et les détruire.
Réduction
Un effectif de 5 chiens traités par des cellules CAR-T sont nécessaires et suffisants pour démontrer une réduction de la fibrose dans les muscles au niveau de celle mesurée chez des chiens malades traités de manière chronique par le traitement de référence actuellement pour la myopathie de Duchenne. Le même effectif de 5 chiens devra être inclus dans le groupe contrôle. Cependant, le projet proprement dit débutant à l'âge de 5 mois, nous envisageons l'éventualité selon laquelle certains chiens engagés sur ce programme à l'âge de 2 mois se seront dégradés sur le plan locomoteur au point d'atteindre un point limite avant l'âge de 5 mois. Nous prévoyons donc deux chiens supplémentaires par groupe afin de nous assurer de pouvoir inclure 5 chiens dans chaque groupe. C'est donc un minimum de 10 chiens et un maximum de 14 chiens qui seront inclus dans le projet.
Raffinement
Les chiens seront évalués à l'aide de nombreuses mesures non invasives développées, pour la plupart d'entre elles, à partir de méthodes utilisées chez les patients et adaptées aux chiens. Les chiens seront hébergés en petits groupes d'âges proches et de tempéraments compatibles, avec accès à un lieu de couchage, des plateformes et des jeux variés. Ils seront sortis quotidiennement en groupes plus larges dans des espaces extérieurs. Cependant, durant une quinzaine de jours entourant le protocole de chimiothérapie et l'injection de cellules, les sorties devront être interrompues pour les protéger d'éventuelles infections opportunistes. Du temps supplémentaire sera passé par les soigneurs avec les chiens afin de remplacer cette activité habituelle par du jeu ou des caresses. Des moments d'intéractions avec l'homme seront ménagés quotidiennement (temps de jeux, caresses). Ils bénéficieront d'un suivi vétérinaire quotidien afin de suivre au plus près les éventuelles complications liées à leur maladie. Des points limites précis, adaptés à cette maladie et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis. Dans le cadre du projet, les gestes potentiellement stressants seront réalisés sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour tout geste potentiellement douloureux. Par ailleurs, des points limites adaptés aux effets secondaires possibles et connus chez le chien du protocole de chimiothérapie ont été déterminés, et permettront, suivant le cas considéré, de soulager la souffrance des animaux le plus précocement possible par des traitements adaptés, ou de les mettre à mort sans délai.
Choix des espèces
Cette étape préclinique de validation d'une approche thérapeutique anti-fibrose en développement est prévue chez le chien. En effet, il s'agit du modèle animal qui reproduit le mieux la maladie humaine notamment sur le plan de la fibrose et de l'expression du marqueur ciblé par cette thérapie. Par ailleurs, le chien permet la mise en oeuvre des mêmes procédures que celles mise en oeuvre chez l'Homme pour le traitement par des cellules CAR-T (prélèvement des lymphocytes T par cytaphérèse et injections autologues en particulier). Dans le cadre de ce projet, les chiens seront suivis de l'âge de 2 mois à l'âge de 6.5 mois, et les injections sont prévues sur des chiens âgés de 5.5 mois. Cette tranche d'âge est basée sur le fait que la protéine cible est fortement exprimée à cet âge là chez les chiens malades, et au fait qu'à cet âge là, les chiens ont atteint une taille compatible avec les procédures mises en oeuvre (prélèvement par cytaphérèse notamment).
Effet de l’activation du système ocytocinergique sur les consequences d’une alcoolisation intermittente de rats mâles et femelles, stressés en période périnatale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
328 rats vont être utilisés, dont 308 tués à l'issue et 20 femelles reproductrices gardées pour réutilisation, dans des procédures classées en souffrance modérée à sévère. Dix femelles gestantes subissent un stress prénatal, et la descendance est soumise à des alcoolisations répétées de l'adolescence à la vieillesse, à des injections quotidiennes et, pour 72 animaux, à une chirurgie d'implantation pour enregistrement du sommeil. Le porteur teste un agoniste de l'ocytocine, la carbétocine, sur les conséquences de l'alcoolisation, en présentant la modélisation animale comme "indispensable". Il décrit ce modèle de rat stressé en période périnatale comme documenté depuis 1995 par l'équipe.
Objectifs
L’alcoolisation est un problème de santé publique majeur et un symptôme majeur et dramatique de l'alcoolisation est représenté par l’altération chronique de la qualité du sommeil, indicateur principal du bien-être d'une personne. A l’heure actuelle, les thérapies pharmacologiques approuvées dans les soins médicaux de l’alcoolisation présentent des nombreux effets secondaires ainsi qu’une efficacité limitée. Pour cette raison, le besoin d'interventions supplémentaires et innovantes à action bio-pharmacologique et donc avec effets secondaires réduit, est très important. Dans ce cadre le ciblage de l'ocytocine qui avec le glutamate, est le neurotransmetteur majeur intervenant dans la régulation de la sensibilité aux addictions et troubles du sommeil, a gagné un intérêt considérable au cours des dernières années en tant que nouveau traitement potentiel de l'alcoolisme. Ce projet se propose d'utiliser un modèle animal translationnel tel que le rat stressé périnatalement (rat PRS) qui présente des troubles du sommeil et une vulnérabilité accrue aux drogues et de developper par des approches interdisciplinaires, de nouvelles interventions thérapeutiques vis-vis de l’alcoolisation ayant une action commune sur le système anti-stress de l’ocytocine. En particulier, nous allons prendre en compte l’efficacité d’une biomolécule comme la carbétocine puissant agoniste de l’ocytocine et ayant comme molécule de référence l’ocytocine. Les objectifs spécifiques du projet sont les suivants : 1) déterminer l'efficacité de la correction par la carbétocine sur l’alcoolisation, et 2) d'explorer la récupération du sommeil et l'augmentation de la résilience en prenant en compte les différences sexuelles dans un modèle de programmation précoce des maladies de l’adulte comme le rat PRS.
Bénéfices attendus
Comprehension de l'impact à long terme de l'alcool et son intéraction avec le système ocytocinergique, le stress précoce et les différences sexuelles.
Procédures
Parmi les 20 femelles reproductrices, 10 d'entr'elles seront soumis au stress gestationnel pendant les 10 derniers jours de gestation.Tous les animaux expérimentaux issus de la réproduction seront exposés au protocole d'alcoolisation et de traitement pharmacologique , soit 288 animaux repartis comme suit : 144 rats PRS, dont 72 mâles et 72 femelles, et 144 rats non- PRS, dont 72 mâles et 72 femelles. Durée alcoolisation -3 alcoolisations : l'alcoolisation aura lieu à l'adolescence, âge adulte et au vieillissement de manière intermittente, 1 jour sur deux pendant 4 heures pour une durée de 3 semaines pour chaque période ; durée traitement pharmacologiques : 3 semaines d'injections i.p 1 fois/jour; temps d'injection prevu 3 minutes ; Un groupe d'animaux sera soumis à des prelevements sanguins par la queue afin de mesurer les hormones dans le sang et à une procédure de chirurgie implantaire pour l'enregistrement polysomnographique. Il s'agit de 72 animaux repartis comme suit : 36 rats PRS, dont 18 mâles et 18 femelles 36 rat non- PRS, dont 18 mâles et 18 femelles. Durée prelevements sanguins par la queue : la procédure entière de stress-retour à la cage dure 2heures pour 4 prelevements à T0-T30-T75-T120; le geste technique du prélévement par la queue ne prends pas plus que 3 minutes ; durée de la chirurgie : 2 heures; Tous les animaux seront soumis a des test comportementaux non invasifs (durée entre 5 et 15 minutes)
Impact sur les animaux
Au niveau des mères gestantes: Le protocole rallentit l'evolution pondérale au cours de la gestation et reduit la qualité du comportement maternel. Au niveau des descendants : Pour les 72 animaux qui subissent la procédure sevère de chirurgie implantive, la douleur potentielle sera évitée en réalisant l'acte chirurgical sous anesthesie génénérale et en réalisant des injections sous-coutanées d'antalgique Meloxicam (METACAM, 0.2 mg/kg) 1 heure avant l'incision chirurgicale, ainsi que dans les 12 apres l'opération. Pour les autres animaux, pas d'effets indésirables attendus.
Devenir
308 animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes/tissus et 20 animaux seront gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
La modélisation animale est indispensable pour recréer les conditions exposées ci-dessus, car il s’agit de mesurer des éléments intégrés de la molecule au comportement chez l'animal in vivo, en associant stress périnatal et exposition à l’alcool à l’adolescence, à l’âge adulte et au cours du vieillissement. Aucune méthode alternative in vitro ou de substitution permet de predire les réponses comportementales et biochimiques que nous souhaitons explorer chez l'animal in vivo.
Réduction
24 rats/groupe/sexe/traitement pharmacologique sont nécessaires pour étudier la variabilité interindividuelle des réponses au traitements à l’alcool et ensuite la réponse au traitement pharmacologique. Les résultats seront groupés par sexe afin de déterminer les différents effets d’une part du stress/non stress et d’autre part de la prise chronique d’alcool. Une comparaison également suivant le sexe sera effectuée. L’analyse statistique de type ANoVA multi-factorielle, ainsi que les comparaisons multiples en post-hoc tiendront compte des effets du stress/sexe/alcool.
Raffinement
Les animaux seront nourris ad libitum avec accès libre à l’eau de boisson. L'enrichissement de cages, consiste en un melange en partie égales de sciure de bois et cellulose et l'ajout d'un batonnet de bois à grignoter toutes les semaines. Les rats, que ce soit lors de la période de reproduction ou lors des traitements, seront surveillés tous les jours jours afin d'évaluer l'état général (peau, poil, muqueuses, yeux), le comportement et le poids (pesée 1/semaine). Pour les 72 animaux qui subissent la procédure sevère de chirurgie implantive, la douleur potentielle sera évitée en réalisant l'acte chirurgical sous anesthesie génénérale et en réalisant des injections sous-coutanées d'antalgique Méloxicam (METACAM) 1 heure avant l'incision chirurgicale, ainsi que dans les 12h apres l'opération. Pour tous les animaux, la présence de signes cliniques sera évaluée regulierement au moment du contrôle et/ou de la manipulation quotidienne, à l'aide d'une grille de scoring precedemment établie en annexe de la saisine. Les points limites seront differenciés selon la gravité par un code couleur. L'exclusion du protocole se fera en presence d'un seul signe clinique " rouge" (prostrations, tremblements, saignements, désydratations averée, perte de poids > 10% du poids corporel ..); en presence de 2 points limites" orange" (lésion superficielle, troubles moteurs, gonflement abdominal, reduction ou absence de prise de boisson et prise alimentaire..) et de 4 points limites "bleu" (agitation, aggression, poils herissé, vocalisations ..) . Dans ce dernier cas, l'animal sera d'abord isolé et surveillé, et si aucune amélioration n'est observée suit à la mise en place de mesures correctives , celui-ci sera mis à mort. L' euthanasie se fera par une augmentation progressive de la concentration en CO2. Enfin, seul le personnel habilité en expérimentation animale réalisera l’ensemble du projet.
Choix des espèces
L'étude des effets comportementaux et neurochimiques de l’alcool ou lors d’un stress au sein d'un organisme entier n'est possible que sur un modèle physiologique intégré. Il est nécessaire de disposer de modèles animaux correspondants aux paramètres et aux symptômes qu'on souhaite étudier. C'est bien ici que repose l'intérêt du modèle de rat PRS présentant par rapport aux animaux témoins une exacerbation des comportements de type émotionnel, vulnérabilité aux drogues et déficits mnésiques et d’apprentissage. Ce type de protocole expérimental permet à la fois d'évaluer la spécificité du traitement à l’alcool sur les symptômes comportementaux et biologiques ciblés. Par ailleurs, il s'agit d'un modèle bien décrit et documenté, développé depuis 1995 par l'équipe.Le comportement d'alcoolisation sera étudié pendant l'adolescence, période critique au cours du quel le processus de maturation n'est pas terminé et donc les effets de l'alcool sont très perturbateurs, à l'âge adulte pour etudier en quel mesure une consommation d'lacool pendant le developpement peut predire le degrée de consommation d'alcool à l'âge adulte ainsi que au vieillissement pour étudier les conséquences à long terme.