Procédures sévères
Tests de stratégies thérapeutiques pharmacologiques chez des modèles murins du syndrome d’Ondine, une maladie génétique rare.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux porteurs d'une mutation du syndrome d'Ondine, maladie qui interrompt la respiration pendant le sommeil, subissent des gavages, une injection intrathécale sur animal vigile et des mesures cardio-respiratoires répétées de la naissance à trois semaines. Le porteur signale une forte mortalité des souriceaux mutants à la naissance et une vulnérabilité à l'anesthésie qui le conduit à injecter sans anesthésier. Le projet teste deux pistes pharmacologiques pour une maladie sans traitement, en s'appuyant sur une recommandation de l'Agence européenne du médicament de tester sur rongeurs juvéniles.
Objectifs
Le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare, constatée dès la naissance : le nouveau-né́ diminue sa respiration jusqu’à l'arrêter pendant le sommeil. Une caractéristique majeure est l'absence d'un réflexe respiratoire important : l'augmentation de la respiration lorsque l'on inhale du CO2 (sensibilité́ à l’hypercapnie). La maladie est provoquéé par une mutation hétérozygote d'un gène déterminant dans le développement embryonnaire du système nerveux autonome qui contrôle les grandes fonctions vitales comme la respiration. Actuellement, il n'existe aucun traitement pharmacologique et le recours à une ventilation mécanique à vie pendant le sommeil est nécessaire. Ce projet vise à étudier deux pistes de stratégies thérapeutiques pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un traitement pharmacologique réduirait le recours à la ventilation mécanique, l’unique prise en charge actuelle pour cette pathologie et ainsi réduirait les risques dus à un arrêt accidentel pendant le sommeil ou à une ventilation inadaptée. Les retombées de ce projet sont ainsi directement utiles en termes de prévention et d’implications thérapeutiques. De plus, pour des médicaments à visée pédiatrique, l’agence européenne du médicament recommande des tests sur des rongeurs juvéniles pour garantir l’innocuité et l’efficacité du produit sur la population cible.
Procédures
- Gavage en lait réalisé en moins de 2 minutes, fréquence : toutes les deux heures sur les souriceaux dont la poche de lait est vide entre 7h et 19h de la naissance à sept jours de vie (P7) puis 3 fois par jour jusqu'à P14- Gavage en molécule réalisé une fois - Injection intrathécale (injection sous la membrane protégeant le cerveau) de molécule sur animal vigile, réalisé une fois - Mesures cardio-respiratoires répétées 3 fois espacées de 4 heures puis une fois à 4 jours après la seule injection aigue pour une cinétique ventilatoire (évolution de la ventilation après l'injection unique de médicament). Les mesures cardio-respiratoires réalisées une fois par jour à 7, 14 et 21 jour. La durée d'une mesure cardio-respiratoire est d'une heure maximum. A chaque fin d'enregistrement, les souriceaux retournent dans la portée avec leur mère- A noter qu'aucun prélèvement d'organes ou de sang n'est effectué sur animaux vigiles. Le génotypage des reproducteurs s'effectue par prélèvemnt de follicule pileux, une méthode non invasive. Pour les souriceaux, le génotypage est réalisé par prélèvement tissulaire au niveau de la queue vers 4 jors de vie.
Impact sur les animaux
Les mesures cardio-respiratoires sur les souriceaux sont toutes non invasives et la séparation maternelle pour les réaliser n’excède l’heure. Les apnées et l’hypoventilation des mutants avec la mutation constitutive sont accompagnées pour certains mutants d’un défaut de succion/déglutition qui expliquerait en partie leur perte de poids. Ces effets indésirables attendus sont pris en charge par le gavage en lait. Le gavage peut tout de même représenter une gêne pour le souriceau mais nécessaire pour les maintenir en vie. Les modèles dont la mutation est restreinte dans des tissus spécifiques font des apnées et ne répondent pas à l’hypercapnie (hypercapnie : la pression partielle en CO2 dans le sang est augmentée) à la naissance mais leur phénotype respiratoire ne compromet pas leur survie. Leur croissance pondérale est similaire à leurs congénères sauvages. L’administration de traitement par injection sans anesthésie peut induire un stress sur l'animal qui sera de courte durée car le geste est précis et maîtrisé. De plus, les mutants ont une vulnérabilité à l'anesthésie. Le recours à l'anesthésie pourrait conduire à une mortalité précoce ne permettant pas de vérifier l'effet des molécules testées. La nuisance par le génotypage des souriceaux par prélèvement tissulaire au niveau de la queue engendre une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, des prélèvements de sang ou de tissus auront lieu en post-mortem.
Remplacement
L’étude préclinique sur des animaux en développement est un préalable recommandé par l’Agence européenne du médicament pour les stratégies thérapeutiques pharmacologiques notamment pédiatrique, l’utilisation de l’animal ne peut être évitée. Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. De plus, des modèles in vitro ne sont pas adaptés car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge thérapeutique.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et de la forte mortalité des souriceaux mutants à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental (génotype ; dose ; génotype*dose) de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Nos méthodes de mesures étant non invasives, nous privilégions une étude longitudinale ce qui réduit l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Surveillance journalière des cages de souris expérimentées : boissons et nourriture à volonté des mères, papier doux de quantité suffisante pour le nid, vérification du comportement de la mère envers les petits de sa portée (regroupement de la portée), état de la portée – Suivi clinique : présence de lait dans l’estomac les premiers jours de vie, prise de poids, température corporelle et vérification des points limites à l’aide de grilles d’évaluation adaptées à l’âge de l’animal (état du pelage de la souris, sa posture, sa mobilité, l’absence d’automutilation, croissance pondérale). Fréquence de suivi clinique : journalier la première semaine, une fois par jour et en jours de semaine de la deuxième semaine puis deux fois par semaine jusqu'à la fin de la procédure. Les points limites choisis sont suffisament prédictifs pour éviter toute souffrance animale. En cas de point limite atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires par un personnel compétent.
Choix des espèces
Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique. Nous travaillons sur les pistes thérapeutiques pharmacologiques d'une maladie génétique congénitale dont les manifestations cliniques sont précoces et la prise en charge pharmaceutique est encore inexistante. A ce jour, la seule prise en charge des patients est la ventilation mécanique. Nous avons à disposition des modèles murins sur lesquels nous pouvons prendre en charge dès la naissance et tester les stratégies thérapeutiques pharmacologiques. De plus, les études précliniques sur des animaux en développement constituent une recommandation de l'agence européenne du médicament comme préalable à la recherche des médicaments pédiatriques.
Évaluation de l’efficacité d’une nouvelle molécule, administrée par voie intranasale, dans des modèles murins infectés par Pseudomonas aeruginosa ou par le virus de la grippe.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
960 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal est infecté par le virus de la grippe ou par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par voie intranasale sous anesthésie, puis traité ou non par une molécule, l'infection pouvant provoquer perte de poids, hypothermie et léthargie pendant plusieurs jours. Le projet évalue l'efficacité antivirale et antibactérienne de cette molécule déjà active in vitro. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la tolérance d'un "organisme entier" et pourrait ramener le nombre de 960 à 384 souris si la première modalité fonctionne.
Objectifs
Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l’efficacité antivirale et antibactérienne d’une molécule que nous appelerons M, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées. Cette demande d’autorisation de projet est couplée avec une première demande qui évaluera au préalable la tolérance de la molécule M, in vivo, chez la souris saine.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à évaluer l’effet antiviral et antibactérien d’une nouvelle molécule prometteuse ayant une activité in vitro contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Avant d’être évaluées in vivo la molécule M a démontré son efficacité contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa in vitro à des doses non cytotoxiques. Au préalable, une étude de toxicité/tolérance sera réalisée (autre demande d'autorisation de projet). La dose la plus appropriée sera ensuite utilisée pour déterminer l’efficacité antivirale et antibactérienne, dans un modèle murin d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa, en traitement curatif. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa.
Procédures
Les souris seront infectées par le virus de la grippe ou P. aeruginosa, par voie intranasale, sous anesthésie générale, puis traitées ou non par la molécule M, administrée 1 à 3 fois, par voie intranasle, également sous anesthésie générale.La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes par souris jsuqu’à son réveil.
Impact sur les animaux
Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces. Par ailleurs, pour étudier l’efficacité de la molécule M vis-à-vis du virus de la grippe ou de P. aeruginosa, les souris seront infectées et feront donc l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids de chaque souris. Ces deux modèles d’infection peuvent conduire aux effets secondaires suivants : perte de poids, température, perte d’appétit, inactivité ou encore létargie, sur une durée allant jusqu’à 6 ou 7 jours post-infection pour la grippe. Le modèle d'infection pour P. aeruginosa est beaucoup plus court (48h). Afin d’éviter d’infliger une douleur et une souffrance à l’animal, nous avons établi plusieurs critères d’évaluation afin de déterminer très rapidement les points limites.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance et d'efficacité.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que les modèles murins d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa sont bien établis et maîtrisés par l’équipe. De plus, nous tenons à souligner que dans notre étude, la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antivirale contre le virus de la grippe et antibactérienne vis-à-vis de P. aeruginosa, à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.
Réduction
Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques. Ainsi, pour évaluer l’efficacité de la molécule M, vis-à-vis du virus de la grippe et de P. aeruginosa, un total de 960 souris au maximum sera nécessaire. Cependant, ce nombre sera réduit puisque 3 modalités de traitement sont envisagées, mais si la première modalité montre une efficacité antimicrobienne, les 2 autres modalités ne seront pas réalisés, réduisant le nombre de 960 à 384 souris.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.).
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons des souris parce qu’il s’agit d'une espèce animale appropriée pour étudier l’inflammation, les réponses immunitaires et qu’il s’agit d’un modèle bien établi pour l'infection par le virus de la grippe et pour l'infection par P. aeruginosa. D’autre part, le modèle d’infection grippale et le modèle d'infection par P. aeruginosa sont pleinement maîtrisés, chez la souris, au laboratoire et les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Il existe également de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, le choix de cette espèce limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant, et nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles pour rechercher un éventuel "effet sexe".
Évaluation des effets bénéfiques de candidats-médicaments sur la myéline dans un modèle de sclérose en plaques induit par l’injection stéréotaxique de lysophosphatidylcholine dans le corps calleux.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique pour injecter de la lysophosphatidylcholine dans le corps calleux et provoquer une démyélinisation, puis reçoit un traitement quotidien pendant sept jours et un prélèvement intracardiaque terminal. Le porteur, un prestataire travaillant pour des "clients", cherche à évaluer des candidats-médicaments pro-myélinisants dans un modèle de sclérose en plaques. Il indique tester la molécule sur "l'organisme entier" faute de culture cellulaire jugée assez représentative.
Objectifs
La sclérose en plaques demeure une maladie neurologique complexe, caractérisée par des attaques inflammatoires et démyélinisantes touchant le système nerveux central. Actuellement, il n'existe aucun traitement efficace et curatif pour la sclérose en plaques. Les options disponibles se concentrent plutôt sur des traitements de fond destinés à ralentir la progression de la maladie (immunomodulateur/immunosuppresseur), ainsi que sur des traitements symptomatiques visant à soulager les symptômes et à améliorer la qualité de vie des patients, mais ces traitements présentent des limites en termes d'efficacité et d'effets secondaires. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de plusieurs candidats-médicaments sur un modèle murin de sclérose en plaques induit par l'injection de lysophosphatidylcholine (LPC) dans le corps calleux , qui présente l’avantage d’être rapide et centré sur la démyélinisation ainsi que sur la remyélinisation spontanée et après traitement. Cette étude permettra de caractériser les atteintes motrices et les lésions histopathologiques de la myéline provoquées par la LPC, ainsi que d'évaluer les effets bénéfiques (protecteurs et/ou remyélinisants) de ces candidats-médicaments que nous comparerons à un composé aux propriétés pro-myélinisantes, à savoir, la clémastine.
Bénéfices attendus
La découverte de molécules favorisant la myélinisation revêt une importance capitale pour le développement de futurs médicaments destinés aux patients atteints de sclérose en plaques. Étant donné les options thérapeutiques limitées actuellement disponibles pour traiter cette maladie, ce projet vise à évaluer l'efficacité des candidats-médicaments. Les résultats obtenus orienteront les recherches de nos clients, les guidant soit vers des essais cliniques, soit vers un ajustement de leur stratégie de recherche et développement dans le traitement de la sclérose en plaques. De plus, l'identification de biomarqueurs spécifiques pourrait également contribuer à définir une approche plus personnalisée du traitement.
Procédures
L'ensemble des animaux de ce projet subiront la procédure décrite: une chirurgie stéréotaxique (1 fois, 1 heure maximum), sous anesthésie générale, et une analgésie systémique (buprénorphine en voie sous-cutanée, 1 fois) et une analgésie locale (lidocaïne en voie sous-cutanée 1 fois). Leur état clinique sera surveillé pendant cinq jours postopératoire pour détecter un effet indésirable ou des signes de souffrance. La procédure inclue des traitements chroniques (une fois par jour, pendant 7 jours, d'une durée de 30 secondes maximum) par voie intra-péritonéales. Les fonctions motrices seront évaluées avec un test de coordination motrice. Ce test sera rapide (maximum 5 minutes par jour, pendant 1 jour). Les animaux subiront un prélèvement intra-cardiaque sous anesthésie profonde juste avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique susceptible d'engendrer une souffrance post-opératoire. Les traitements quotidiens des souris peuvent induire du stress, en particulier lors des premières administrations. Le test de motricité peut également susciter du stress chez les souris, du fait de leur placement dans des environnements inhabituels. Les injections répétées peuvent éventuellement entraîner des inflammations ou des infections cutanées. L'administration de l'anesthésie à l'isoflurane peut accroître le niveau de stress chez les souris et influencer simultanément la fréquence cardiaque et la respiration.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'étude. Le projet nécessite d'évaluer la démyélinisation/remyélinisation par histologie. Nous aurons donc besoin de collecter des échantillons biologiques à la fin de la procédure.
Remplacement
Notre but est d'évaluer les effets protecteurs et régénérateurs de candidats-médicaments dans un modèle in vivo de sclérose en plaques. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser de façon satisfaisante la complexité de la sclérose en plaques, en particulier la complexité des interactions entre les neurones, leurs axones et la formation de myéline par les oligodendrocytes. De plus, il est nécessaire de tester la molécule sur l'organisme entier afin de rendre compte des effets globaux de la molécule dans un contexte intégré, étant donné l'implication des oligodendrocytes et des neurones dans la maladie. Nous devons donc recourir à un modèle animal pour ce projet de recherche. L'utilisation d'un modèle animal est essentielle pour obtenir un degré de comparaison satisfaisant avec la biologie humaine et la souris partage de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains, cela permet d'obtenir des résultats pertinents pour la prédiction des réponses chez l'Homme.
Réduction
Le nombre de souris inclus dans l'étude a été optimisé pour garantir l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Un analyse de puissance démontre qu'un nombre de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il y aura donc 168 souris dans cette étude (7 groupes x 12 souris x 2). Nous avons choisi de mener notre étude en séparant les groupes expérimentaux selon le sexe, en commençant par les mâles. Cette approche vise à éliminer toute influence potentielle du cycle ovarien sur les résultats initiaux. Si les données obtenues avec les mâles s'avèrent encourageantes, nous réaliserons, par la suite, les mêmes tests sur les femelles. Cette stratégie est motivée par la connaissance des possibles impacts du sexe et du cycle ovarien sur les processus de démyélinisation/remyélinisation. De plus, en évitant de mélanger les sexes dès le départ, nous cherchons à minimiser la variabilité des résultats, ce qui nous permettra d'évaluer plus précisément l'efficacité des composés étudiés. En adoptant cette approche, nous souhaitons réduire le nombre d'animaux inclus dans l'étude, en n'impliquant les femelles que si les résultats préliminaires sur les mâles sont prometteurs, alliant ainsi efficacité scientifique et considérations éthiques.
Raffinement
Le protocole inclura la présence d'objets d'enrichissement tels que des papiers pour nids et des tunnels en carton, l'application d'approches analgésiques avant, pendant et après toute opération, et une anesthésie générale lors de toute intervention chirurgicale. Un contrôle rigoureux des besoins physiologiques des animaux, notamment la température corporelle, sera mis en place pendant et après l'opération pour assurer un rétablissement rapide. Pour atténuer l'anxiété lors des manipulations, une habituation quotidienne au personnel et aux traitements (solution saline) sera réalisée tout au long de la phase d'acclimatation des animaux, d'une durée minimale d'une semaine. De plus, avant le test de l'échelle, une phase préalable d'habituation sera effectuée après la phase d'acclimatation, la veille de la chirurgie. Les animaux auront au minimum une semaine d'acclimatation à leur nouvel environnement après leur arrivée au laboratoire. La souffrance des animaux sera réduite au minimum grâce à une surveillance quotidienne des signes indicateurs de détresse. En cas de perte de poids entre 10 et 15% par rapport au poids initial au début de l'étude, une préparation à base d'eau et de croquettes sera directement introduite dans la cage pour faciliter l'alimentation. Si des signes de détresse sont identifiés, le responsable de l'étude sera informé et un analgésique sera administré (buprénorphine par voie sous-cutanée à une dose de 0,1 mg/kg). Si le traitement analgésique se révèle inefficace, l'animal sera mis à mort. Le projet a établi des points limites, en cas d'atteinte de l'un de ces points, le responsable de l'étude sera informé et l'animal sera euthanasié par surdose d'isoflurane suivie d'une dislocation cervicale.
Choix des espèces
La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la sclérose en plaques. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines. Ce stade de développement chez la souris est approprié pour observer un processus de démyélinisation.
Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies génétiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 480
5 000 souris et rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère, la plupart tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, une partie gardée pour la reproduction. Elles reçoivent des injections répétées par voie intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, orale, oculaire ou intracérébrale avec pose de canule, sur une durée pouvant atteindre 24 semaines, avant une mesure terminale de la contractilité musculaire sous anesthésie. L'objectif est de sélectionner des candidats de thérapie génique ou antisens contre la myopathie de Duchenne, les retombées pour les patients étant renvoyées au long terme. Sur le remplacement, le porteur teste d'abord les molécules in vitro mais affirme que le recours aux modèles animaux reste "indispensable" pour le développement préclinique.
Objectifs
Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent essentiellement sur des pathologies neuromusculaires et en particulier sur la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Au-delà de l’atteinte purement musculaire nécessitant un traitement du corps entier par voie systémique, le système nerveux central (aspect cognitif) représente notamment aujourd’hui les cibles à traiter pour espérer un réel bénéfice thérapeutique. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie neuromusculaire notamment la myopathie de Duchenne. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une biodistribution sur le corps entier et une amélioration significative chez les modèles animaux étudiés, et à plus long terme chez les patients traités.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthésie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée seront plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Afin de permettre l’accumulation progressive, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 2, nous testerons la voie d’administration orale (intra-stomachal) moins invasives; afin de permettre l’accumulation progressive les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Afin de cibler plus spécifiquement certaines zones, nous testerons les voies d’injection oculaire et intracérébrale. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthésie et le réveil. Les injections oculaires pourront être plus brèves de l’ordre de 5 à 10minutes, et les animaux ne seront injectés qu’une seule fois. Pour les animaux en procédure intracérébrale, les injections ne seront pas répétées sauf s’il y a implantation de canules où l’animal pourra recevoir des administrations 1 fois par semaine pendant 6 semaines via la canule après anesthésie gazeuse. Ces ré-administrations seront brèves de l’ordre de 5 minutes. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. après anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxillaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de façon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine. Les animaux ayant recus des injections pourront également suivre la procédure terminale sans réveil de mesure de la contractilité musculaire pour mesurer l’efficacité de notre traitement sur l’amélioration de la force après anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses, les nuisances et effets indésirables sont donc faibles. Les animaux subissant la procédure d’administration intracérébrale pourraient présenter des difficultés d’alimentation et une potentielle douleur dans la première journée suivant la procédure. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoin. Ils seront particulièrement suivis après la chirurgie avec un tableau de suivi quotidien pendant les 3 jours suivants la chirurgie, et observés bi-quotidiennement le jour de la chirurgie avec ré-administration d’analgésie 8h post opératoire si l’évaluation d’après la grille le justifie (score >6). Dans ce cas, une vigilance accrue et une observation biquotidienne sera maintenue. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classés « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs : mobilité réduite et problème cardiaque. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si ces symptômes devaient apparaitre prématurément.
Devenir
Ormis pour la procédure d’élevage où les animaux seront gardés en reproduction, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter l’ensemble des tissus d’intérêt et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques sur cellules, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant une biodistribution au corps entier avec un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.
Réduction
Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations à savoir l’administration par voie orale, par voie occulaire ou intracérébrale.
Raffinement
Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement lors de leur arrivée. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Les procédures se feront majoritairement sous anesthesie, avec analgésie post procédure si besoin. L’évaluation des points limites (poids, mobilité…) se feront selon la grllle de Morton et griffith. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, bien connus et documentés. Les points limites sont similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une procédure d’élevage (procédure 1). Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.
Choix des espèces
Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique préclinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces pouvant être exigée dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique. La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveau-nés à 4 semaines).
Évaluation d’une possible origine développementale de la Sclérose Latérale Amyotrophique et de la fenêtre optimale d’intervention thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
388 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une partie porte une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique et développe une paralysie progressive avec une perte de poids pouvant atteindre 40 %, les animaux étant tués avant la paralysie complète, tandis que d'autres subissent des chirurgies d'implantation d'électrodes cérébrales et des enregistrements sous anesthésie. Le projet cherche à savoir si un traitement administré tôt dans le développement bloque l'apparition de la maladie, à partir d'une observation faite "de manière entièrement fortuite" lors de travaux antérieurs. Le porteur justifie le recours à la souris par la nécessité d'un modèle reproduisant le développement du système nerveux et les symptômes de la maladie.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la plus fréquente des maladies neurodégénératives du neurone moteur adulte. Elle induit une paralysie progressive des patients, due à la perte des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière, et conduit irrévocablement au décès 2 à 5 ans après l’apparition des premiers signes. Elle demeure encore incurable. Environ 10% des patients présentent des mutations dans des gènes qui ont été identifiés (cas familiaux) et ont permis le développement de souris transgéniques qui reproduisent les symptômes de la maladie. A l’instar d’autres maladies neurodégénératives, la SLA est suspectée d’avoir une possible origine développementale. En effet, il existe des cas de SLA juvéniles qui affectent les adolescents, lorsque le système nerveux central est encore en développement. Par ailleurs, les modèles murins de la maladie présentent des altérations du fonctionnement des neurones dès le développement embryonnaire. Notre hypothèse de travail est qu’il existe une origine développementale à la SLA, et qu’un traitement dispensé à un moment clé du développement permettrait de bloquer l’apparition de la maladie. Au laboratoire, nous avons observé il y a quelques années qu’un traitement particulier d’un modèle murin de SLA, dispensé sur quelques semaines, permettait de prévenir intégralement l’apparition de la maladie lorsqu’administré avant l’apparition des symptômes. Cependant, cette observation ayant été faite de manière entièrement fortuite, nous n’avons pu déterminer à quel âge précis les animaux qui ne développaient pas de symptômes avaient été traités. C’est ce que nous cherchons à déterminer à présent, par le biais d’une étude dédiée et contrôlée. Notre premier objectif sera, dans une étude pilote, de déterminer la fenêtre optimale de traitement permettant d’empêcher le déclenchement de la maladie dans un modèle murin de SLA, en traitant différents groupes d’animaux durant différentes périodes de développement. Notre second objectif sera, dans une étude plus approfondie, de comparer le traitement des animaux durant la fenêtre optimale de traitement déterminée lors de l’étude pilote au traitement des animaux durant la phase symptomatique de la maladie. L’ensemble de ces résultats permettra de mettre en évidence une possible origine développementale de la maladie et de déterminer la phase du développement durant laquelle une intervention médicamenteuse aurait le plus de chances d’être bénéfique.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, seul un traitement est proposé aux patients atteints de SLA, lorsque le diagnostic de la maladie est clairement établi, un processus qui peut prendre plusieurs mois. Il s’agit du Riluzole, dont l’efficacité est très faible puisqu’il ne permet d’augmenter la durée de vie des patients que de quelques mois. La SLA est une maladie neurodégénérative, et à l’instar des autres maladies neurodégénératives, elle a toujours été perçue comme une maladie de l’âge adulte, voire même une forme de vieillissement prématuré du cerveau et de la moelle épinière. Cependant, cette vision de la neurodégénérescence est en train d’évoluer, avec une démonstration récente d’altérations développementales dans la maladie de Huntington, et des séries d’arguments en faveur d’une origine développementale des maladies d’Alzheimer, de Parkinson, ainsi que de la SLA. La démonstration d’une composante développementale à ces maladies, et en particulier à la SLA, permettrait d’envisager 1) la recherche de biomarqueurs beaucoup plus précoces, par exemples parmi les familles de patients, 2) une administration des traitements en amont de l’apparition des signes cliniques de la maladie, et 3) éventuellement un enrôlement plus précoce des patients dans les études cliniques dans le but d’améliorer encore les traitements actuels.
Procédures
Les animaux seront soumis à six types d’interventions : - un premier groupe d’animaux sera soumis à un traitement médicamenteux (1) réalisée par 1 injection sous-cutanée quotidienne, sur animaux vigils, pendant 6 à 15 jours (6 à 15 injections totales selon les animaux). La durée d’une injection est de 2 à 3 secondes. Ce même groupe d’animaux sera suivi de manière hebdomadaire (2) pour mesurer leurs capacités motrices (force musculaire, coordination motrice) sur des appareils dédiés afin de déterminer les effets du traitement. L’ensemble des tests moteurs dure 40 minutes au total, entrecoupées de nombreuses phases de repos. - un deuxième groupe d’animaux subira une chirurgie d’une durée de 45 minutes pour implanter des électrodes d’enregistrement cérébral (3). Cette chirurgie sera suivie d’un un maximum de 4 enregistrements d’électroencéphalographie (4) qui requièrent un isolement de 24 heures, et seront effectués à intervalles de 30 jours. Ces animaux seront également soumis à un maximum de 4 enregistrements électromyographiques (5), sous anesthésie générale, réalisés à intervalle de 30 jours, au lendemain des enregistrements d’électroencéphalographie. La procédure dure 10 minutes. - un troisième groupe d’animaux subira une chirurgie permettant l’injection d’un traceur rétrograde dans la moelle épinière (6). La procédure dure 40 minutes.
Impact sur les animaux
Huit types de nuisances sont attendus au cours de cette étude : 1- une partie des animaux aura des altérations motrices évoluant des pattes arrière vers les pattes avant et une perte de poids pouvant aller jusqu'à 40%. 2- Un traitement médicamenteux, susceptible de diffuser dans le cerveau, et pouvant provoquer une somnolence et des désordres des mouvements, mais également une réduction des symptômes de la maladie. 3- Des injections sous-cutanées, pouvant entraîner localement une douleur et une infection, qui peuvent être ressenties comme gênantes ou stressantes, et entraîner des changements comportementaux (apathie, agressivité). 4- Des injections sous-cutanées à de jeunes souris, pouvant en outre perturber la relation mère-petit et entraîner éventuellement une séparation temporaire. 5- Un suivi moteur hebdomadaire des animaux qui peut s’avérer fatiguant. 6- 2 à 4 enregistrements d’électromyographie, à intervalles d’un mois, qui requièrent l’anesthésie générale des animaux et le positionnement sous-cutané de 4 électrodes aiguilles. 7- Des chirurgies qui peuvent entraîner saignements ou infections. 8- L’isolement des animaux durant les 24 heures nécessaires à l’enregistrement de leur activité cérébrale, avant retour dans la cage avec leurs congénères. 2 à 4 (suivant la durée de vie des animaux) enregistrements sont prévus à intervalles d’un mois.
Devenir
Tous les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures. Les animaux transgéniques développant des symptômes moteurs seront mis à mort avant paralysie complète, selon les points limites établis, et les animaux non-transgéniques seront mis à mort aux mêmes âges que les animaux transgéniques pour servir de contrôles aux expériences de biologie moléculaire et d’histologie prévues.
Remplacement
Ce projet consiste à déterminer si la SLA pourrait avoir une origine développementale, et s’il existe une fenêtre optimale d’intervention thérapeutique. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les étapes-clé du développement du système nerveux central ainsi que les caractéristiques de la SLA : déclenchement de symptômes moteurs à l’âge adulte et mort prématurée.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. De plus, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici d’utiliser les mâles pour les suivis longitudinaux de l’activité du cerveau, et les femelles pour les analyses histologiques et moléculaires. Pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles, sachant que le genre n’influence pas la survie de ces animaux.
Raffinement
L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établis. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie pré et post opératoire.
Choix des espèces
Parmi les modèles de SLA, les souris sont les plus appropriées à notre étude car 1) elles présentent le niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat, 2) leur développement pré- et post-natal mime celui de l’homme, 3) il existe plusieurs lignées de souris exprimant une mutation d’un gène causatif de la SLA, dont certaines, reproduisent parfaitement les symptômes de la maladie et sont donc adaptées à l’évaluation préclinique de traitements médicamenteux. Déterminer l’âge du développement durant lequel les animaux entrent en phase présymptomatique de leur maladie est un des objets précis de cette étude. Les stades suivants seront donc ciblés : - Prénatal : de 12 jours de gestation à la naissance - Périnatal : de 15 jours de gestation à 7 jours après la naissance - Postnatal : de la naissance à 14 jours après la naissance - Jeune adulte (troisième mois de vie).
ONCO-AOM/DSS-Colon: Développement d’un modèle murin de cancer colorectal inflammatoire induit par l’azoxyméthane (AOM) et le sulfate de sodium de dextran (DSS)
- Recherche appliquée
- Cancers
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent un agent mutagène puis un composé provoquant une colite dans l'eau de boisson, sur une durée pouvant atteindre quatre mois, pour développer un cancer colorectal servant à tester des molécules pour le compte de clients. Le porteur indique attendre une diarrhée pouvant être hémorragique et des pertes de poids marquées. Il présente ce modèle comme un service de recherche préclinique et affirme que les méthodes de reconstruction de tumeurs en 3D restent "marginales".
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortel (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Il est bien établi que la colite prédispose les individus à la tumorigenèse colorectale. Les patients atteints d'une maladie inflammatoire de l'intestin, par exemple, présentent un risque élevé de développer un cancer du côlon. Bien que la pathogenèse moléculaire du cancer associé à la colite (CAC) reste incomplètement comprise, des progrès significatifs ont été réalisés grâce à l'étude de modèles murins de CAC. C'est pourquoi les études in vivo sur des modèles animaux sont considérées comme nécessaires pour étudier les mécanismes moléculaires de la carcinogenèse colorectale, tester les stratégies préventives et thérapeutiques potentielles, et pour traduire les hypothèses dérivées de l'étude de la carcinogenèse colorectale. L’objectif de ce projet est d’utiliser un nouveau modèle de cancer coliques (CAC) chez les souris, le plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Le modèle AOM/DSS est un modèle d'initiation-promotion qui utilise l'induction chimique de lésions de l'ADN suivie de cycles répétés de DSS pour induire une inflammation colite. Les principales caractéristiques du modèle AOM/DSS sont, son délai relativement court avec un développement de la tumeur en quelques semaines (>10 semaines). En outre, l'histopathologie des tumeurs induites par l'AOM/DSS récapitule les aspects clés de la CAC PCA humaine, tels que les tumeurs à localisation distale et les adénocarcinomes invasifs.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers colorectaux. Ce projet a pour finalité la mise au point d’un modèle de cancer coliques (CAC) chez la souris qui récapitule les aspects clés de la CAC humain. Ce modèle permettra par la suite de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à un modèle préclinique plus prédictifs afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Identification des animaux 1 fois, moins de 1 minute). Traitement mutagène des animaux avant l’induction de la colite La colite sera induite par l’administration composé dans l’eau de boisson des animaux. Ces études dureront au maximum 4 mois. Les animaux seront pesés trois fois par semaine avant induction, puis une fois par jour pendant les inductions de la colite et la fréquence sera adaptée en fonction de l’état des animaux. Des prélèvements de sang ou d’urine ou de fécès pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie La fréquence des prélèvements et les volumes suivront les recommandations du comité d’éthique.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle de cancer colorectale inflammatoire, de la diarrhée, potentiellement hémorragique, est attendue. Des pertes de poids marquées sont attendues. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie injectable et subir des prélèvements de sang à l’aiguille, ce qui pourrait induire une douleur et un stress légers. La douleur générée sera limitée à la piqure d’une aiguille et la déshydratation secondaire aux prélèvements sera mineure compte tenu des volumes prélevés.
Devenir
Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de sang, nécessaires pour évaluer l’effet de induction sur l’apparition de tumeurs colorectales.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. Dans tous ces modèles, il a été démontré que 8 à 11 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres, sauf dans les modèles spontanés sur souris transgéniques dans lesquels 10 à 12 animaux seront nécessaires. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
Le poids des animaux sera suivi trois fois par semaine jusqu’à l’induction et entre les cycles de DSS. Une pesée quotidienne sera réalisée pendant chaque cycle de DSS et jusqu’à la reprise de poids entre les cycles. La diarrhée et le sang dans les selles seront suivis quotidiennement pendant les cycles d’induction au DSS et jusqu’à la reprise de poids entre les cycles. Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité de la procédure est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
- L’administration du DSS dans l’eau de boisson sur des souris est bien documentée dans la littérature. - Pour créer un modèle de cancer colorectal murin, il faut utiliser des souris immunocompétentes. - De plus, diverses souches de souris immunocompétente sont disponibles pour l’établissement de ce modèle. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction de la maladie. Les animaux adultes pourront mieux supporter le l’induction puis développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.
Peptides AntiMicrobiens (PAM) de l’extrême pour combattre les infections pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère pour plus de la moitié. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas par voie nasale sous anesthésie puis suivies jusqu'à quatorze jours, pour tester des peptides antimicrobiens issus d'invertébrés et mesurer leur toxicité. Le porteur indique surveiller perte de poids, prostration et tremblements, et prévoit de tuer les souris avant l'apparition des signes de morbidité. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit l'infection pulmonaire et que la souris constitue un "modèle incontournable".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de valider l’utilisation des Peptides Antimicrobiens (PAM), antibiotiques naturels, produit par des invertébrés issus d’environnement extrême. Ces PAM ont des propriétés physico-chimiques originales qui pourraient créer de nouveaux médicaments actifs, dirigé contre les infections pulmonaires. En amont des expérimentations animales, des expériences menées in-vitro ont permis de démontrer que certains peptides antimicrobiens issus d’environnement extrême, notamment certains membres de la famille des BRICOS-PAM ont obtenus d'excellentes valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) contre six pathogènes bactériens hautement virulents et résistants aux antibiotiques) ainsi qu’une thermostable (toujours actifs après 1h à 90 °C), pas activité hémolytique, activité anti-biofilm et une absence de toxicité sur lignées cellulaires. De ce fait, les résultats donnent une fenêtre thérapeutique très large. Cependant, il reste à évaluer son activité (pharmacologie), décrire son comportement et le devenir de la substance dans un organisme vivant (pharmacocinétique, PK) et déterminer le degré de toxicité (dose maximum tolérée, DMT) dans un organisme. Dans un premier temps, pour évaluer l'efficacité de nos candidats médicaments sur des modèles infectieux pulmonaires pathogène (notamment des genres Pseudomonas), une preuve de concept (POC) sera mise en évidence. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro.
Bénéfices attendus
Détermination de la dose du PAM à administrer par voie pulmonaire, intraveineuse ou par voie intrapéritonéale aux souris pour déterminer la meilleure fenêtre thérapeutique. Connaissance de la stabilité et du devenir de chaque composé dans les organes de la souris après une ou plusieurs administrations. Validation chez la souris de l’effet thérapeutique curatif des composés contre une infection Pseudomonas aeruginosa.
Procédures
Pour les procédures « détermination du degré de toxicité » et « la pharmacocinétique », les composés seront administrés par voie intranasale ou par voie intraveineuse 1 fois par expérience sous anesthésie. L’infection des souris avec Pseudomonas est réalisée par voie intranasale sous anesthésie, 1 fois par expérience de preuve de concept (POC). Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés une ou deux fois par 24h sous anesthésie pour la POC. Les animaux après infection seront suivis jusqu’a 14 jour maximum
Impact sur les animaux
Lors de la détermination du degré de toxicité et de la pharmacocinétique, les souris des temps courts (5, 15, 30 et 60 min) seront étroitement surveillées pendant la première partie du protocole puis surveillées toutes les deux heures par jours par la suite (pour les temps supérieurs à 2h) pour observer l’absence de douleur, de lésions et de maladie. Lors de ces observations la perte de poids sera également surveillée. Dans le cas où l'injection des composés testés entrainerait tout changement de comportement : prostration, tremblement, diminution de l’exploration, et/ou d’aspect physique externe une grille d'évaluation a été mise en place. Pour limiter la peur et le stress physique de l’injection du composé cela sera fait sous anesthésie. Pour limiter la peur, la détresse et le stress physique de l’infection, les souris seront infectées une seule fois par voie intra-nasale en début de protocole expérimental (n°4) , après anesthésie à l’isoflurane 2% et leur état physique et comportemental sera évalué.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d’expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Seules les études in vivo permettent de déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution d’un composé, ainsi que son efficacité face à une infection pulmonaire aigüe. L’efficacité chez la souris constitue un prérequis avant toutes phases cliniques sur l'homme. A ce jour, aucun système in vitro ne permet à ce jour d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à une infection pulmonaire aigüe. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable. En amont, la démonstration de la validité scientifique de méthode in vitro sera effectué sur lignées cellulaires, notamment pour tous les aspects de toxicité.
Réduction
Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, l’analyse de nombreux paramètres se fait simultanément sur une même souris après prélèvement des différents organes (rate, foie, cerveau, poumon, reins, sang). Les expériences sont répétées 3 fois et chaque expérience est analysée de manière indépendante. Ces conditions nous permettent de vérifier la reproductibilité des observations et de générer des résultats statistiquement analysables. La taille minimale de groupe nécessaire pour mener spécifiquement à bien la procédure a été faite. Ce nombre d’individus tient compte de la précision des mesures et de la différence statistique significative entre animaux témoins et animaux testés. Les tests seront réalisés de façon séquentielle plutôt que simultanés. De plus, le premier type d’étude nous permettra de réduire le nombre d’animaux pour les études deux et trois.
Raffinement
Le stress ayant une influence directe sur les mesures réalisées, le bien-être des animaux est impérativement pris en compte à chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toutes douleurs, souffrances, angoisses ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur pendant l’expérience : Les animaux manipulés sont isolés dans une pièce séparée afin d’éviter tout stress aux animaux non manipulés. De façon à réduire le stress, l’inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l’infection ou l’injection du peptide. De plus, la surveillance sera accrue, de façon quotidienne, selon les procédures. L’apparence physique, le poids, l’alimentation et le comportement des animaux seront surveillés, afin de détecter le plutôt possible une éventuelle morbidité. Des grilles de signes cliniques ont été établies et seront utilisées pour évaluer un « score » de douleur et permettre d’évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum à 14 jours post-infection, avant l’apparition des signes de morbidité. Si des signes de morbidité sont observés, les points de cinétiques seront revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocement par rapport à celles initialement prévues.
Choix des espèces
La souris possède d'importantes similitudes génétiques (98% des gènes sont communs à l’Homme) mais aussi immunologiques, physiologiques et pathologiques. Une très bonne connaissance anatomique et physiologique et de nombreux outils sont disponibles pour cette espèce. En particulier, de nombreux anticorps contre les cellules immunitaires, des cytokines, voies de signalisation pro-inflammatoires assurent la réalisation d’expériences clés pour l’étude de la réponse immunitaire. La faible variabilité intra-individuelle et interindividuelle est à prendre en compte. De nombreuses pathologies infectieuses expérimentales ont été validées, notamment lors d'infection par Pseudomonas aeruginosa chez les modèles murins et notamment en C57BL/6 et BALB/c. La différence de gravité de l'infection pulmonaire induite par Pseudomonas aeruginosa peut être déterminée par des différences dans les réponses inflammatoires de l'hôte. Le choix de la souche sera effectué en fonction du choix de l’étude la réponse immunitaire à médiation humorale ou cellulaire. Dans un modèle de pneumonie chez la souris simulant également les concentrations pulmonaires mesurées chez l’Homme. Les modèles chez la souris ont permis d’établir l’efficacité in vivo des molécules mais aussi d’en évaluer les critères d’efficacité microbiologique d’un point de vue pharmacodynamique, indispensable à l’optimisation des doses chez l’Homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8 semaines au moment de la procédure expérimentale. Les souris possèdent un poids d’environ 21g à 8 semaines. Chez les souris, le mâle atteint sa maturité sexuelle à l'âge de 8 semaines et la femelle à seulement 7 semaines. Cet âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Implication de l’hypothalamus dans l’altération de l’homéostasie glucidique induite par l’action centrale des triglycérides inter-estérifiés.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 720 d'entre elles. Elles reçoivent des injections d'huile de palme inter-estérifiée dans la carotide, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, et pour certaines des chirurgies dans le cerveau suivies de perfusions et d'un isolement de un à deux mois. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent entraîner perte de poids, prostration ou agressivité, et vise à préciser les conditions de sécurité alimentaire de ces graisses utilisées par l'industrie agroalimentaire. Il décrit des études sur cultures cellulaires menées en parallèle mais juge l'usage de la souris "encore nécessaire" faute de pouvoir reproduire in vitro les échanges entre organes.
Objectifs
La consommation d’aliments ultra-transformés riches en huile végétale hydrogénée est néfaste pour la santé des individus puisqu’elle contribue à l’obésité et au diabète de type 2 (DT2). Afin de remplacer les huiles végétales hydrogénées, l’industrie agroalimentaire commence à utiliser l’inter-estérification des graisses végétales. Des études récentes suggèrent que la consommation de ces graisses inter-estérifiés peuvent altérer l’homéostasie glucidique et donc favoriser le DT2. Il est donc important de comprendre les effets moléculaires de ces graisses inter-estérifiées sur la régulation de l'homéostasie glucidique. Des résultats préliminaires suggèrent que la consommation d’un régime contenant des graisses inter-estérifiées conduit à l’accumulation dans le foie, le tissu adipeux et l’hypothalamus de dérivés lipidiques comme les céramides. les céramides sont connus pour induire une résistance à l’insuline qui favorise l'installation d'un DT2. L'objectif de ce projet sera de déterminer l’implication du métabolisme des céramides dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la consommation de graisses inter-estérifiées. Pour cela, la synthèse des céramides sera inhibée chez des souris (pharmacologiquement ou génétiquement) qui seront soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Les taux de céramides seront analysés par une approche lipidomique. La régulation de l'homéostasie glucidique sera étudiée chez ces souris soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Une analyse transcriptomique des tissus sera réalisée afin d’identifier les gènes dérégulés par les graisses inter-estérifiées. Cette analyses permettra également de caractériser les cibles moléculaires des céramides dans la dérégulation de l'homéostasie glucidique induite par les graisses inter-estérifiées. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du DT2 et ainsi d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Bénéfices attendus
Ce projet identifiera l’implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du diabète de type 2 et permettra d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Procédures
Les souris de la procédure 1 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. Les souris de la procédure 2 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. La moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. L’autre moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Les souris de la procédure 3 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les souris de la procédure 3, il s'en suivra, 28 jours plus tard d'une deuxième chirurgie pour poser un système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires pendant 28 jours d'émulsions contenant les lipides inter-estérifiés d’intérêt. Les souris de la procédure 4 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les procédures 3 et 4, à la fin des expérimentations nous réalisons un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. 3 jours plus tard nous réalisons un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. S'ajoutent aux nuisances expérimentales, l'isolement des souris des procédures 3 (28 jours pour 360 souris) et 4 (2 mois pour 360 souris).
Impact sur les animaux
Les procédures font intervenir des injections stéréotaxiques dans le troisième ventricule et des perfusions dans le ventricule latéral, chirurgies qui peuvent entrainer des effets indésirables sur les animaux tels qu'une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crane.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les souris seront mises à mort afin d'évaluer l'incorporation des triglycérides inter-estérifiés depuis la périphérie vers le cerveau. A l'issue des procédures 2, 3 et 4, les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus pour réaliser des RTqPCR, des immunohistochomies et des analyses lipidomiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Nous avons aussi réalisé une étude in vivo pour tester les concentrations d'huile de palme inter-estérifiée à utiliser pendant les expériences. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum de souris nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d'informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux données de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons depuis plus de 20 ans sur des modèles murins d'obésité), nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace. En effet les groupes de souris sont générallement très homogènes en terme de tolérance au glucose, données physiologiques ou biochimiques.
Raffinement
Les souris des procédures 3 (360 souris, pendant 28j) et 4 (360 souris, pendant 2 mois) seront exceptionnellement maintenus en cage individuelle afin de contrôler individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (nid, batons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Pour les procédures chirurgicales que nous utiliserons, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes partagent avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d'informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de plasmides dans la veine de la queue pour déclencher des tumeurs du foie, certaines recevant aussi des molécules anticancéreuses, avec un suivi par imagerie tous les quinze jours. Le porteur affirme que la nuisance de la manipulation reste temporaire et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît au stade précoce, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut provoquer des souffrances. Il décrit des tests in vitro sur cellules et organoïdes de foie mais conclut que la validation chez la souris est "indispensable" pour confirmer l'implication des gènes candidats.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une pathologie complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance au traitement. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de cancérisation est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Pour cela, nous envisageons d'injecter par voie intraveineuse des plasmides, qui s'intégreront dans les hépatocytes (cellules du foie). Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs dans un foie sain.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance globale de l'ensemble de la manipulation n'est que temporaire (
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (p
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères : poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’hébergement). La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie de manière longitudinale par imagerie non invasive ("photon counting micro computed tomography" et/ou bioluminescence/fluorescence). En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.
Caractérisation en modèle murin de la pathogénèse de virus respiratoires humains et évaluation de vaccins
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des virus respiratoires humains administrés dans les narines sous anesthésie, avec pesées quotidiennes et prélèvements de sang répétés, jusqu'à un prélèvement terminal par ponction cardiaque, pour caractériser de nouveaux candidats vaccins. Le porteur indique une perte de poids, une accélération respiratoire et une perte d'activité après administration du virus. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" et renvoie aux "guidelines" de l'Agence européenne du médicament pour justifier le modèle murin.
Objectifs
Les virus respiratoires provoquent des infections respiratoires aigües entraînant des pathologies légères à sévères chez l’Homme et constituent la première cause de mortalité chez les jeunes enfants. Les possibilités de traitements ou de vaccinations contre ces virus restent limitées et/ou peu efficaces et le développement et l’approbation de nouveaux vaccins sont freinés par des efficacités de protection faibles et un manque de connaissances des réponses immunitaires induites. Pour les vaccins vivants atténués, la réponse immunitaire locale des muqueuses respiratoires (réponse mucosale) est encore peu décrite à ce jour mais elle contribuerait aussi à limiter la transmission des virus respiratoires. Aussi, de nouveaux candidats vaccins vivants atténués modifiés génétiquement sont en développement et permettraient d’avoir une couverture vaccinale plus large, protégeant contre plusieurs familles de virus respiratoires, à partir d’un seul vaccin. Sur la base de ces constats, ce projet vise à caractériser et valider l’efficacité de nouveaux candidats vaccins vivants atténués pour protéger contre deux familles de virus respiratoires humains, à l’aide d'un modèle expérimental de pneumonie virale chez la souris. Ce projet vise aussi à étudier de manière plus approfondie l’impact de ces candidats vaccins sur l’immunité, avec un focus particulier sur la réponse immunitaire des muqueuses respiratoires.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces études seront utiles pour approfondir la compréhension de l'infection par les virus respiratoires et des réponses immunitaires et inflammatoires induites par ces infections. Cette étude permettra aussi de participer au développement et à la caractérisation de nouveaux candidats vaccins innovants contre ces infections respiratoires, pour lesquelles il n’existe aujourd’hui que peu d’option efficace disponible sur le marché.
Procédures
(1) 80 animaux subiront des prélèvements de sang au niveau de la joue : prélèvement sur animal vigile, jusqu’à 3 prélèvements par animal, 3 semaines d’intervalle entre chaque prélèvement. Durée du geste (contention comprise) : 1 minute ; (2) Tous les animaux (soit 80) seront pesés tous les jours : pesée d’animaux vigiles, une fois par jour pendant 63 jours consécutifs. Durée du geste : 30 secondes ; (3) 80 animaux subiront une injection d’un mélange d’anesthésiques avant chaque administration de virus : injection sur animal vigile, jusqu’à 3 injections réalisées à 3 semaines d’intervalle par animal. Durée du geste (contention comprise) : 30 secondes ; (4) 80 animaux subiront une administration de virus ou vaccin : administration sur animal anesthésié (anesthésie liquide), administration au goutte à goutte sur les narines de l'animal tenu en position dorsale, jusqu’à 3 administrations sur le même animal avec 3 semaines d’intervalle entre chaque administration. Durée du geste : 1 minute ; (5) 20 animaux subiront une injection intramusculaire (cuisse) de vaccin : injection sur animal anesthésié (anesthésie liquide), jusqu’à 2 administrations sur le même animal avec 3 semaines d’intervalle entre chaque administration. Durée du geste : 1 minute ; (6) 24 animaux subiront une injection sous-cutanée d’analgésiques 30 minutes avant anesthésie générale gazeuse et prélèvement de sang terminal (par ponction cardiaque). Analgésie + anesthésie + prélèvement de sang réalisé 1 fois en fin de procédure sur chaque animal. Durée du geste : 40 minutes ; (7) 32 animaux subiront une injection de pentobarbital : injection sur animal vigile, 1 injection par animal. Durée du geste (contention comprise) : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoires : une perte de poids sur une durée de 1 à 10 jours après administration de virus (jusqu'à 3 administrations pendant une étude d’efficacité vaccinale) + une accélération du rythme respiratoire + une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration de virus. Les souris pourraient aussi subir des effets indésirables après la réalisation des gestes techniques de prélèvements sanguins ou d’injections éventuelles de vaccins, d’injection d’anesthésiques ou d’analgésiques. Ces effets indésirables seraient des douleurs locales et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales pour le prelevement de sang total et organes (évaluation de la réponse immunitaire et protection vaccinale).
Remplacement
Toutes les étapes du présent projet et la caractérisation des nouveaux candidats vaccins en modèle murin font suite à des études effectuées et validées auparavant en laboratoire. Malgré le progrès des dernières années dans le développement de modèles d’études alternatifs, l’interaction entre les virus et le système immunitaire d’un individu est beaucoup trop complexe pour être réduit à l’utilisation de lignées cellulaires et requiert l’utilisation du modèle animal. A cet égard, le recours indispensable à l'animal de laboratoire pour la caractérisation de la pathogénèse des souches virales, de la réponse immunitaire globale face à l’infection, ainsi que le niveau de protection induit par un vaccin, figure dans les "guidelines" édictées par l'Agence Européenne du Médicament.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés par groupe expérimental tiendra compte du nombre minimal d'animaux pour atteindre une relevance expérimentale, réaliser des tests statistiques et maintenir des groupes sociaux au sein de chaque cagée, en tenant compte des animaux consacrés aux prélevements terminaux. Dans la mesure du possible, les groupes contrôle d'animaux seront mutualisés pour réduire le nombre total d'animaux.
Raffinement
Après anesthésie générale, un suivi accru sera fait jusqu’à réveil et reprise d’activité de chaque animal. Après chaque administration de virus ou de vaccin, chaque animal fera l'objet d'une surveillance pendant 14 jours au rythme de 1 fois par jour, accrue à 2 fois par jour au besoin, pour réaliser un suivi de poids et de signes cliniques. Pour limiter les effets indésirables dûs aux prélevements de sang au niveau de la joue, le volume de sang prélevé sera limité pour faciliter la compensation de la perte de sang en quelques heures. Pour réduire la douleur provoquée par le prélevement de sang par ponction cardiaque, l’administration d’analgésiques sera réalisée 30 min avant anesthésie gazeuse. Les potentielles nuisances identifiées lors de la réalisation des procédures seront prises en compte pour le raffinement des prochains protocoles incluant d’éventuelles analgésies et anesthésies supplémentaires pour des prélevements douloureux.
Choix des espèces
Bien que les modèles expérimentaux animaux pour l’étude des infections respiratoires se soient diversifiés ces dernières décennies (furets, rat des cotonniers, hamsters, bovins, primates non humains), aucun de ces modèles ne réflètent complètement la pathologie et la réponse immunitaire chez l’humain. La souris reste cependant le modèle sur petits animaux le mieux caractérisé pour l’étude des infections respiratoires virales. A ce stade de notre projet, il n’y a pas de justification à l’utilisation d’un autre modèle animal sans une validation au préalable chez la souris. Nos précédentes expérimentations ainsi que celles d’autres équipes ont montrés que des souris sevrées âgées de 4 à 8 semaines au début du protocole sont bien adaptées aux besoins de ce projet, puisque ce modèle permet non seulement l’observation de signes cliniques liés à l’évolution de la pathologie respiratoire mais aussi de réaliser aisément diverses analyses. De plus, le modèle murin est parfaitement maitrisé depuis plusieurs années par les responsables et manipulateurs.
Étude de la modulation de l’inflammation aiguë par induction de la senescence.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour une partie et sévère pour la majorité, 192 sur 228. Elles reçoivent des injections du vaccin anticovid de Pfizer pour induire des cellules sénescentes, puis des lipopolysaccharides ou une irradiation gamma pour déclencher une inflammation aiguë. Le porteur indique que ces agents peuvent provoquer un choc septique, de la fièvre, des tremblements et une prostration entre 15 et 48 heures après le traitement. Il affirme que la sénescence et l'immunité impliquent trop d'organes pour être reproduites en culture, ce qui rend selon lui le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
En vieillissant, l’organisme accumule des cellules potentiellement toxiques appelées « cellules sénescentes » ou CS. Leur impact sur le corps réduirait l’espérance de vie en favorisant l’apparition de différentes pathologies liées à l’âge. Il est généralement considéré que leur délétion diminuerait les comorbidités associées au vieillissement. Néanmoins, il a également été montré que la délétion de certains types de CS est néfaste pour certains organes, en particulier si les CS concernées font partie du système vasculaire. Leurs rôles et fonctions restent donc largement incompris et controverse. Ces CS s’accumulent soit lentement tout au long de la vie, soit au contraire apparaissent massivement à la suite d’un stress induit par une pathologie. Dans les 2 cas, il semble que ces cellules sénescentes puissent impacter le système immunitaire et notamment avoir des propriétés anti-inflammatoires. Des résultats récents laissent entendre que les cellules immunitaires sénescentes pourraient ainsi inhiber l’inflammation aiguë. L’objectif de ce projet est de déterminer si l’induction de la senescence a des effets protecteurs contre l’inflammation aiguë, permettant ainsi de diminuer les dommages tissulaires qui lui sont généralement associés. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des modèles murins ou nous induirons, dans un premier temps l'apparition des CS en exposant nos souris au vaccin anticovid BNT162b2 de Pfizer. Puis, dans un second temps, nous exposerons les souris à des agents biologiques (lipopolysaccharides ou LPS) et physiques (rayonnement gamma) induisant une l’inflammation et des dommages cellulaires. Nous rechercherons ensuite dans les tissus de ces souris des signes de dommages cellulaires issus de l’inflammation aiguë.
Bénéfices attendus
L'inflammation et la détérioration des tissus qui lui est associée est une pathologie grave. Elle peut être causée par plusieurs facteurs, notamment une infection bactérienne ou virale, des maladies auto-immunes, plusieurs maladies associées au vieillissement comme le diabète ou des interventions cliniques comme la radiothérapie. L'inflammation est causée par une réponse incontrôlée ou prolongée du système immunitaire qui finit par produire des lésions tissulaires. Si nous pouvons trouver une nouvelle façon de contrôler ce processus, comme l’induction de cellules immunitaires sénescentes, nous pouvons établir de nouveaux protocoles pour combattre certains des symptômes les plus agressifs de certaines maladies comme l’infection par le SRAS-CoV-2 (covid) ou la septicémie. De plus, cela peut offrir une protection aux personnes qui subissent une radiothérapie pendant un traitement contre le cancer, en évitant les effets secondaires qui en découlent induits par les dommages tissulaires produits par l'irradiation. En outre, les patients atteints d'une maladie auto-immune comme le lupus peuvent être traités pour réduire ou retarder les symptômes de la maladie. En résumé, les bénéfices que la société recevra de ce projet pourraient avoir un impact sur la vie de nombreuses personnes.
Procédures
Injection intraperitoneale (maximum de 2 par souris, necessite quelques secondes), Irradiation (1 seule, necessite quelues minutes).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans la premiere des cinq procédures, sauf l’injection intrapéritonéal nécessaire pour traiter les souris avec le vaccin BNT162b2. En effet, celui-ci a déjà été testé sur différentes espèces animales aux doses indiquées sans compromettre le bien-être animal, et est couramment utilisé sur des patients humains lors d’essais cliniques dans différents pays. Trois procédures nécessiterons des injections IP de lipopolysaccharides. Les LPS sont de puissants agents inflammatoires pouvant notamment induire un choc septique, de la fièvre et une baisse de la pression artérielle. Nous attendons donc à une possible détérioration de l’état sanitaire de la souris entre 15 et 20 heures après l’injection de LPS. Cela pourrait se traduire par une prostration, des tremblements et une apathie de la souris. Afin de pouvoir intervenir rapidement et limiter au maximum leur souffrance si les souris atteignent un point limites, elles seront suivies au moins une fois par heures de 15H à 24H apres le traitement. Deux procédures nécessitant une exposition ont des rayons gamma induiront des symptômes similaires, mais décalé de 24 à 48H dans le temps.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La senescence et le système immunitaire sont des processus impliquant une communication entre de nombreux tissu et organes différents, il est ainsi impossible de mimer leur interaction en culture cellulaire ou a l'aide d'un ordinateur. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux proposés à utiliser au cours de ce projet a été déterminé pour garantir une population représentative permettant d'effectuer une analyse statistique valide.
Raffinement
Ce projet nécessite d’exposer nos modèles animaux à des traitements qui impacteront leur bien-être. Pour limiter au maximum leur souffrance, les souris seront suivies par les expérimentateurs à l’aide de fiches de scores adaptées aux procédures expérimentales qu’elles subiront, et permettant d’identifier précocement les animaux en souffrances. En effet, tant les signes de mal-être que leurs cinétiques d’apparition varieront suivant qu’on injecte des LPS ou qu’on expose les souris a des rayons gamma. Ces fiches comprennent des points limites qui correspondent à un score maximum prenant en compte les différents paramètres (comportement, état général, neuromusculaire, poids) et seront remplies tout au long de l'expérimentation. On notera en particulier un suivi chaque heure dans le cas des injections de LPS entre 15 et 24 heures post-traitement. Un soin particulier sera aussi apporté au suivi de leurs poids : une baisse de poids ≥15% par rapport au poids de la précédente pesée ou de ≥25% par rapport à la pesé avant traitement entraîneront une mise à mort. D'autre part, nous avons prévu un suivi sanitaire journalier par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnelles techniques). Nous nous assurerons que les souris ont un accès ad libitum a l’eau et la nourriture, qu’elles puissent satisfaire les besoins propres à leur espèce (abris pour souris, papier utilisable pour se faire un nid, petit bout de bois à ronger), litière en copeaux de bois. De plus, par souci de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage et conservés intacts.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude exploratoire et innovante avec l’utilisation de modèles murins récents qui n'existent pas chez d'autres espèces. La souris, qui est l'animal le plus largement utilisé en recherche fondamentale, est particulièrement bien connue à tous les niveaux, a un cycle de reproduction court permettant une optimisation dans la sélection des génotypes d’intérêts. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. La sénescence est un phénomène complexe impliquant plusieurs types cellulaires, voire plusieurs organes différents, comme le prouve sa composante immunitaire. Elle correspond à un processus impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, qui nécessite une étude au niveau de l’organisme entier. Les souris seront des adultes de 2 mois.
Crises épileptiques induites par une substance chimique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2630
5 010 rongeurs, 2 380 souris et 2 630 rats, vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes ou de canules dans le cerveau, puis l'induction de crises d'épilepsie par une substance chimique, et des tests de nage, pour évaluer de nouveaux candidats médicaments. Le porteur décrit des convulsions, une hypersalivation et une perte d'équilibre, et indique que les animaux sont tués dès l'apparition d'une convulsion tonique ou en fin d'observation. Il revendique que la recherche de nouvelles thérapies est "nécessaire" et "indispensable" face à l'épilepsie pharmaco-résistante.
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (où les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte.Les épilepsies peuvent être non-convulsives, on parle alors de crises d'absence. Elles affectent principalement les enfants et correspondent à une perte de conscience (avec un regard dans le vide). Le projet consiste en l'évaluation de l'innocuité et/ou l'efficacité de substances pharmacologiques en développement, par l'utilisation de tests dans des modèles de crises épileptiques induites par des substances chimiques.
Bénéfices attendus
Les modèles de crises généralisées et partielles aigues ou spontanées induites par une substance chimique sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou de l'inefficacité des traitements (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux anti-épileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet anti-épileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Ces procédures peuvent nécessiter une phase chirurgicale pour l'implantation d'une canule cérébrale (60 minutes, 1 fois), d'électrodes cérébrales (2h, 1 fois) ou des 2 simultamément (2h30 à 3h, 1 fois). Une substance réactive est administrée de 1 à 3 bolus rapides qui durent quelques secondes ou par une perfusion de 12 minutes maximum. Une substance réactive est administrée au maximum 3 fois par bolus rapide suivie d'une substance anti-épileptique administrée de la même manière. Le comportement de l'animal sera évalué soit immédiatement après (pendant 30 minutes à 2 heures) soit dans les semaines suivant l'induction de l'état épileptique en le touchant doucement ou en le prenant dans la main (2 sessions par semaine x 5 minutes sur 3 semaines). Après une période de récupération, les mesures électroencéphalographiques sont réalisées par télémétrie sur quelques heures à plusieurs jours consécutifs en fonction des modèles. Des tests comportementaux peuvent aussi être réalisés au lieu de mesures électoencéphalographiques. Les rongeurs sont placés dans une piscine 4 à 5 fois par jour pendant maximum 2 minutes sur 5 à 7 jours ou dans un nouvel environnement pendant 2 essais de 3 à 15 minutes. Des prélèvements sanguins ou d'organes peuvent également être envisagés avant le test (a minima 24 heures avant la stimulation) ou en fin d'étude pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration ou de prélèvement peuvent induire un stress chez l'animal en raison de la contention de ce dernier. Les crises partielles conduisant à l'apparition d'un état épileptique permanent, caractérisé par une hypersalivation, des mouvements de la tête et des pattes avant, un redressement de l’animal et perte d’équilibre dans certains cas. Dans les tests modélisant des crises généralisées, des convulsions toniques peuvent être observées. Ces crises correspondent à un raidissement du corps de l’animal avec perte de conscience dont la durée n’excède pas 2 minutes. Chez les animaux opérés, des problèmes de cicatrisation peuvent être observés, notamment lorsque l'animal se gratte. Les animaux sont parfois hébergés seuls pendant toute ou partie de l'étude ce qui peut causer un stress bien qu'ils conservent un contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères.Un test comportemental est basé sur la nage de l'animal, pouvant conduire à un stress sur de courte durée.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés immédiatement en cas d'apparition de convulsion tonique ou d'un état épileptique permanent pour les tests aigus ou immédiatement après la fin des observations si aucune convulsion n'est notée. Pour l'induction de crises récurrentes convulsives, les animaux recoivent une substance antiépileptique pour stopper les convulsions. Si la substance ne permet pas l'arrêt des convulsions, l'animal est euthanasié. Pour les procédures induisant des crises non convulsives, les rongeurs sont euthanasiés en fin d'expérience. Ceci car les crises épileptiques (convulsives ou non) peuvent conduire à la mort de l'animal ou affecter durablement leur qualité de vie.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et les paramètres physiologiques (température corporelle par exemple).
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données : variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques. Il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique ou la persistance d'un état épileptique ou administré avec un traitement anti-épileptique. Pour les études incluant une chirurgie, une analgésie est assurée par l’administration d'analgésiques injectés par voie systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Un gel ophtalmique est également appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement oculaire. La température corporelle est surveillée pendant toute la durée de l'anesthésie jusqu'au réveil de l'animal. Un suivi des animaux est assuré suite à la chirurgie avec des soins adaptés (prise pondérale, désinfection le cas échéant). Les animaux sont hébergés en groupe dès que possible, et systématiquement avec un enrichissement (bois à ronger, frisure et tunnel si l'animal n'est pas implanté).
Choix des espèces
Les modèles de crises convulsives ou non-convulsives induites par une substance chimique sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur après sevrage jusqu'à l'âge adulte (souris et rat) car les crises chez l'humain sont également détectées chez des sujets jeunes et adultes. Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer l'innocuité et/ou l'efficacité de nouveaux candidats médicaments (efficacité) dans le cadre de l'épilepsie.