Procédures sévères

Toutes tuées pour analyses post-mortem, 2039 souris, dont 1845 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, sont utilisées pour reproduire des tumeurs rhabdoïdes, des cancers pédiatriques. Elles subissent des greffes de fragments tumoraux sous la peau ou des injections de cellules dans le cerveau, y compris chez des souriceaux de sept jours, suivies de traitements par gavage et de séances d'imagerie sous anesthésie. Selon le porteur, la localisation cérébrale des tumeurs peut provoquer des troubles moteurs, des difficultés à s'alimenter et une perte de poids. Il annonce des traitements pour les enfants "à relativement court terme", tout en développant en parallèle des organoïdes humains censés réduire le recours aux souris.

Objectifs

Les tumeurs rhabdoïdes sont des cancers très agressifs touchant des jeunes enfants et dont l’origine cellulaire est mal connue. Leur localisation est variée (système nerveux central, tissus mous, reins…) mais elles présentent des caractéristiques cliniques et histologiques communes. A ce jour, trois sous-types de tumeurs rhabdoïdes cérébrales ont été décrits (« MYC », « SHH », « TYR »), probablement en lien avec leurs diverses cellules d’origine. Aucune thérapie standard n’est établie à ce jour, les chimiothérapies fortes et l’irradiation étant peu efficaces et lourdes pour de très jeunes enfants. Il est donc nécessaire de trouver des traitements nouveaux, testés au laboratoire avant d’être donnés aux enfants. Les tests de médicaments sur des lignées cellulaires in vitro sont la première approche du projet. Ensuite, il est nécessaire de vérifier que les molécules candidates ont une efficacité sur des organismes vivants. Pour cela, nous avons développé des modèles dans lesquels des tumeurs murines issues de modèles transgéniques (mis au point il y a plusieurs années) ou issues de patients ont été greffées sur des souris et nous souhaitons traiter les souris greffées avec les molécules candidates afin de retenir celles qui méritent un développement clinique. En parallèle de ces travaux, nous développons des modèles de souris génétiquement modifiées, permettant d’obtenir de façon très sélective des tumeurs précoces, en particulier cérébrales, très similaires aux tumeurs observées chez les enfants. Nous projetons d’isoler des cellules du cerveau des souris à un stade précédant la transformation cancéreuse en les isolant de cerveaux prélevés chez les embryons de souris génétiquement modifiées afin de tenter de les maintenir en culture in vitro, et ex vivo, dans des organoïdes de cerveaux. Par la suite afin de démontrer leur pouvoir oncogénique in vivo, nous injecterons ces cellules dans le cerveau de souris d’âges divers, tenant compte du fait que la maturation du cerveau environnant peut jouer un rôle pour ces cancers cérébraux très précoces : à 7 jours de vie, à la fin du premier mois, à l’âge adulte. Nous savons donc dorénavant cibler avec plus de précision les cellules dans lesquelles les tumeurs prennent naissance et souhaitons approfondir notre compréhension moléculaire des différents sous-types de tumeurs rhabdoïdes obtenues.

Bénéfices attendus

Gains attendus des modèles de greffes de cellules et tumeurs, et des tests réalisés sur ces greffes Le projet permettra d’une part une meilleure compréhension théorique des tumeurs rhabdoides en particulier les étapes de transformation de la cellule d’origine vers la cellule tumorale et d’autre part, de développer des modèles précliniques afin d’évaluer des thérapies. Le développement de modèles de tumeurs orthotopique chez la souris (injection intra-cerebrale comme chez les patients) permettra d’évaluer des traitements expérimentaux en tenant compte de la localisation dans le cerveau comme les 2/3 des tumeurs rhabdoides chez les patients. Ces modèles d’étude ont pour objectif d’aboutir à des traitements contre certaines tumeurs pédiatriques pour les enfants avec la meilleure chance possible d’efficacité, à relativement court terme.

Procédures

Dans une première et deuxième procédure, visant à établir les modèles précliniques pour évaluer les thérapies, les animaux sont greffés soit avec des fragments de tumeurs par voie sous cutanée soit avec des cellules tumorales par voie intracérébrale, sous anesthésie (1x par expérience sur une durée d’environ 30 min). Les animaux vigiles sont ensuite traités avec diffèrents médicaments par injection intrapéritonéale ou gavage (3 fois par semaine, pendant 4 semaines – durée du geste inf à 20sec), Dans une troisième procédure permettant de générer des tumeurs intracérébrales à suivre par imagerie, les souris (de 3 âges différents) seront injectées avec des cellules tumorales en intracérébral. Cette chirurgie s’effectue en 30 min sous anesthésie générale. Puis la croissance tumorale sera suivie par imagerie sous anesthésie générale 1 à 2 fois par semaine au long de l’expérience (durée de l’imagerie : 10min). Dans une quatrième procédure visant à générer des tumeurs murines spontanées au niveau cérébral, . Les croisements entres souches appropriées sont réalisés et les souris ne subissent aucun geste technique de leur vivant. Dans une 5ème procédure utilisant des modèles de tumeurs spontanées, certains animaux vigiles recevront un produit par gavage, 1 seule fois au cours de la procédure. Les autres ne subissent aucun geste technique de leur vivant.

Impact sur les animaux

Les greffes en sous-cutané peuvent induire des douleurs après incision cutanée et suture par agrafes pendant maximum 48h.Le développement des tumeurs en sous-cutané peut occasionnellement gêner la mobilité des animaux. Les greffes intra-cérébrales peuvent induire des douleurs dans les 48h suivant la procédure de chirurgie invasive et la possibilité de complication (infectieuse) de la plaie (évènement rare). Selon la localisation de la tumeur au niveau cérébral,des troubles de la motricité avec des difficultés à s’alimenter et donc une perte de poids peuvent apparaitre. Les nuisances attendues lors de l'administration des traitements (produits non douloureux) seront celles liées à l’injection intrapéritonéale ou au gavage (gène de courte durée).

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Au préalable à chaque étude préclinique chez la souris testant l’efficacité d’un traitement, nous réalisons des tests in vitro sur des lignées cellulaires issues des tumeurs rhabdoides nous permettant de sélectionner les molecules avec les effets les plus prometteurs pour passer ensuite chez l’animal. Il est nécessaire d’utiliser le modèle animal afin de reconstituer toutes les interactions entre tous les types cellulaires.Néanmoins, pour limiter l’utilisation des souris, nous développons également en parallèle des tumoroïdes ainsi que des organoïdes humains à partir de cellules souches. Ce qui permettrait de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales pour ensuite les évaluer sur les souris. Les modèles murins restent les modèles les plus performants pour identifier les cellules d’origine des tumeurs et permettre une description des étapes précoces de la transformation cancéreuse. A ces égards, ils ne restent qu’imparfaitement remplaçables par des modèles ex vivo.

Réduction

1.Greffes et tests sur ces greffes Avant chaque étude thérapeutique préclinique, des tests in vitro nous permettent de sélectionner les molécules à tester sur des lignées cellulaires de tumeurs rhabdoïdes. Nous limitons les expériences in vivo à celles pour lesquelles un rationnel in vitro est établi. - Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum pour des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Nous limiterons le nombre de souris greffées pour chaque modèle tumoral, mais en maximisant le nombre de modèles greffés afin de reproduire la diversité observée en essais cliniques chez l’homme. Chaque tumeur sera coupée en plusieurs échantillons afin de réaliser plusieurs analyses post-mortem sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également un suivi transversal des tumeurs et améliore la significativité des expériences. 2. Etudes de cellules neuronales génétiquement modifiées -Nous limiterons à 3 le nombre maximal de tumeurs obtenues après greffes de cellules issues de cerveaux de nos souris génétiquement modifiées. La procédure d’établissement des tumeurs ne sera pas poursuivie au-delà. - les cellules tumorales exprimeront des marqueurs bioluminescents pour être suivies au cours du temps par une caméra externe à la souris, permettant un suivi de la croissance tumorale en temps réel chez l’animal vivant, afin de limiter le nombre de mises à mort « à l’aveugle ». 3.Modèles transgéniques Pour les nouveaux modèles, le phénotype d’au moins 10 souris ayant le génotype d’intérêt devra être décrit. Si les premiers phénotypes sont très identiques, le nombre de souris étudiées ne dépassera pas 10. La caractérisation des tumeurs attendues dans ces génotypes nécessitera des analyses en histologie et biologie moléculaire ; chaque tumeur sera répartie en plusieurs morceaux pour permettre le plus grand nombre possible d’analyses par échantillon. Après description du phénotype, les lignées seront maintenues avec un génotype n’exposant pas à un phénotype dommageable

Raffinement

1.Greffes Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie par voie gazeuse sera utilisée pour réaliser les gestes techniques nécessaires à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Un gel oculaire serait utilisé pour prévenir le dessèchement de la cornée si l’anesthésie devait durer plus de 5 min. Le réveil de l’animal se fera sur tapis chauffant et sera surveillé par l’expérimentateur. Les animaux seront observés tous les jours jusqu’à ce qu’ils récupèrent de l’intervention, et leur état sera évalué selon la grille de score du SBEA. Pour les greffes sous-cutanées, la croissance tumorale sera mesurée à l’aide d’un pied à coulisse Les souris seront euthanasiées dès que des signes de dégradation clinique seront observés, tels que décrits dans la grille de score Pour les greffes intra-cérébrales : l’injection de cellules dans le cerveau exprimant une fluorescence que l’on peut quantifier par caméra externe à l’animal (marqueur bioluminescent) permettra de suivre la croissance tumorale par une méthode non invasive. Cette quantification par imagerie sera réalisée de 1 à 3 fois par semaine et sous anesthésie gazeuse. 2. Modèles transgéniques Afin d’aider les souris qui souffriraient de troubles de la mobilité empêchant d’accéder à la nourriture, nous veillerons à disposer dans les cages de l’aliment gélifié. L’animal peut être isolé si nécessaire afin d’éviter de mauvaises interactions avec d’autres animaux. Les animaux seront suivis grâce à la grille des scores définissant les points limites et donc la fin de l’expérience.

Choix des espèces

La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes en sous-cutanée et orthotopiques afin de mettre au point des traitements dans les conditions d’un organisme vivant. Par ailleurs, les modèles murins génétiquement modifiés que nous prévoyons d’étudier sont pour certains déjà développés et bien caractérisés : nous savons qu’ils sont très adaptés mais qu’ils ne recouvrent pas toute la diversité moléculaire de la maladie humaine. Les modèles génétiquement modifiés à développer devraient offrir, selon nos hypothèses, un niveau de pertinence plus complet pour l’étude des divers sous-types de la maladie humaine, en ciblant des progéniteurs plus restreints. Les souris immunodéficientes et normales arriveront à l'animalerie âgées de 5 semaines. Après une période d'adaptation d’une semaine minimum à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats. Les animaux issus des lignées génétiquement modifiées seront observés de leur naissance jusqu’à l’âge adulte. Afin d’étudier à quels stades du développement embryonnaire les cellules commencent le processus de transformation cancéreuse, nous sacrifierons des femelles gestantes (pas de phénotype dommageable) et prélèverons les embryons à divers moments de la gestation (entre le 10eme et le 18eme jour post-fécondation) .

9750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection de Toxoplasma dans l'abdomen, développe en trois jours une ascite riche en parasites, puis est mise à mort pour prélever cet antigène destiné à des tests diagnostiques commerciaux de la toxoplasmose. Le porteur décrit cette ascite comme "particulièrement bien supportée par les animaux", alors que la quasi-totalité des souris est classée en souffrance sévère, la complication infectieuse étant la source de cette gravité. Il justifie le recours à la souris par "l'absence d'alternative de bonne qualité" et l'échec des essais in vitro à atteindre les volumes et la sensibilité requis.

Objectifs

Le diagnostic de maladies infectieuses repose sur différents critères : signes cliniques, radiologiques, facteurs de risque associés… et sur les résultats de tests biologiques. L’utilité des tests biologiques est d’autant plus grande que certaines infections présentent peu ou pas de signes cliniques caractéristiques. Un large panel de tests biologiques existe de la culture de prélèvements à la recherche d’anticorps spécifiques dans le sang des patients. Cette recherche d’anticorps spécifiques est dans de nombreuses maladies infectieuses le seul moyen de diagnostiquer et secondairement de traiter certaines maladies. C’est dans ce but qu’une collaboration entre un laboratoire Hospitalo-Universitaire et une entreprise française a été mise en place avec l’objectif de développer des tests diagnostiques de maladies pour l’homme et/ou les animaux. Nous avons mis au point des tests fiables, spécifiques et sensibles de recherche d’anticorps de pathogènes parasitaires comme Toxoplasma gondii responsables de maladies graves et parfois mortelles chez l’Homme, et particulièrement chez les femmes enceintes et les patients immunodéprimés. L’utilisation d’antigènes de ces parasites est la clé de voute de la mise au point de tests sérologiques. En l’absence d’alternative de bonne qualité, l’obtention de tels antigènes passe par l’expérimentation animale. Suite à l’injection d’agents infectieux, l’animal va développer et produire une ascite de volume modéré (< 1 ml) riche en parasites en 3 jours. A noter que cette quantité d’ascite est très inférieure à celle obtenue pour la production d’Ac monoclonaux et est particulièrement bien supportée par les animaux. Ces ascites permettront de produire des antigènes de grande qualité pour développer des tests sérologiques permettant de faire le diagnostic de patients infectés. L’objectif de ce projet est donc de permettre la production de cet antigène spécifique pour pouvoir continuer de rendre accessible aux professionnels de santé les tests de diagnostic correspondants et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.

Bénéfices attendus

La production d’antigènes de toxoplasmose est un élément essentiel à la fabrication de nos tests de diagnostic médicaux. Ces tests, parce qu’ils sont reconnus comme des réactifs de référence, sensibles et spécifiques, sont utilisés par les laboratoires des CHU et des plateformes d’analyses médicales de France et du monde entier. Ils sont destinés aux professionnels de santé dans le cadre de diagnostic de dépistage et de confirmation de la sérologie parasitaire. Les bénéfices attendus du projet sont donc directs et immédiats : permettre de maintenir la production de tests de diagnostic de la toxoplasmose et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.

Procédures

Un seul geste technique sera réalisé sur animal vivant : il s’agit de l’inoculation inaugurale par voie intrapéritonéale. Cela nécessite la contention de l’animal de quelques secondes par un personnel qualifié afin d’éviter au maximum le stress et la douleur des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les nuisances possibles sur les animaux sont les suivantes : Peur et détresse engendré par le changement d’hébergement (arrivée à l’animalerie) (légère). - Peur, détresse, stress physique et/ou thermique engendrés par les conditions d’hébergement (légère). - Peur, détresse, stress physique, douleur causés par leur manipulation (légère). - Stress physique, douleur dus à une complication infectieuse (sévère). Le projet a été conçu de manière à minimiser les dommages causés aux animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’unique procédure expérimentale afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Pour pouvoir ainsi répondre à l’exigence qualitative et quantitative de la demande, l’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du présent projet et la souris reste le modèle le plus adapté. Les essais de production d’antigènes en modèles in vitro précédemment engagés au sein de nos laboratoires n’ont pas permis de retrouver les hautes performances en sensibilité et en spécificité caractérisant nos tests ni même de pouvoir assurer une production dans les volumes requis. Ainsi, pour ces raisons majeures de volume de production, de défaut de reproductibilité et de qualité médiocre de l’antigène obtenu, la culture in vitro ne permet pas une production d’antigène compatible avec le développement et la production d’un test de diagnostic présentant des performances au niveau des tests actuellement commercialisés, soumis au marquage CE, à la conformité avec la norme ISO 13485 et à l’attestation CE de conformité délivrée par un organisme notifié et devant répondre aux exigences du règlement européen. Certains fabricants se sont tournés vers l’utilisation d’antigènes recombinants. Malheureusement, ici aussi les performances des tests en sont fortement impactées tout comme leur spécificité. En conséquence, au regard de toutes ces analyses, ces expérimentations ne peuvent être conduites qu’in vivo.

Réduction

La volumétrie d’animaux utilisée pour la production d’antigènes sera fonction du volume de commercialisation des tests. Malgré une forte croissance de la demande des produits, la réévaluation du nombre d’animaux nécessaires à la production d’Ag par rapport au précédent projet est peu impactée. Ceci s’explique par les analyses réalisées par le laboratoire pour augmenter la qualité des échantillons récoltés et ainsi limiter ceux définis comme non conformes à l’utilisation requise. Une estimation a été réalisée sur la période 2018-2023 : une souris permet de produire suffisamment d’antigène pour la constitution de 1000 tests de confirmation ou de dépistage. Également, le laboratoire possède les compétences pour congeler la souche entre sessions de production d’antigènes. Le parasite n’est pas maintenu en permanence sur souris. De par les volumes de production actuellement nécessaires, cela permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée à l’animalerie, une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront hébergés par groupes d’individus compatibles, dans des conditions contrôlées et avec la mise en place d’un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Aucun des animaux ou groupe d’animaux ne sera traité différemment que ses congénères. Une fiche de suivi sera rédigée pour chaque cage avec un suivi de signes comportementaux, physiques et physiologiques. Chacun de ces critères étant évalué fréquemment, la détermination de point(s) limite(s) bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, permettra immédiatement de déterminer un animal en souffrance. Une fiche suivra le protocole tout au long de son séjour dans notre animalerie et permettra d’identifier l’arrêt du protocole (points limites). Ces points limites seront : souris prostrée et isolée, poils hérissés, manque de toilettage, léthargie, ventilation anormale, tremblements. Nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Les soins et les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel qualifié. Afin d’éviter que le suivi de leur santé ne devienne un stress supplémentaire pour eux, la familiarisation aux manipulateurs sera quotidienne pendant la période d’acclimatation (1 semaine minimum).

Choix des espèces

Cette souche parasitaire de toxoplasmes peut infecter aisément la plupart des animaux de laboratoire, à l’exception du rat qui est particulièrement résistant et qui ne développe jamais d’infection aiguë avec ascite. Néanmoins, la souris est l’espèce intermédiaire naturelle et celle qui présente une sensibilité importante avec une production très riche en parasites. Les souris utilisées seront de jeunes adultes (femelles) de 6 à 18 semaines (de 20 à 30g). Ces animaux sont peu agressifs et la familiarisation aux manipulateurs sera effective.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de modéré à sévère. Une partie subit l'implantation chirurgicale d'une électrode sur le nerf de la rate, puis une induction de sclérose en plaque expérimentale provoquant une paralysie partielle des membres et une perte de poids, d'autres recevant un transfert de lymphocytes. Le projet évalue si l'électrostimulation du nerf splénique agit sur des cellules immunitaires impliquées dans la maladie. Le porteur affirme que ce type d'étude ne s'envisage que sur des "organismes entiers".

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer l'effet de l'électrostimulation du nerf splénique la fonction de cellules immunitaires appélées lymphocytes T CD4+ dans un modèle murin de sclérose en plaque, l’encéphalite autoimmune expérimentale (EAE). Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrotimulation en clinique. La sclérose en plaque est une maladie neuro-dégénerative inflammatoire chronique caractérisée par une atteinte du système nerveux central. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable obligeant à changer souvent de molécule. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement le développement de l’encéphalite autoimmune expérimentale (EAE), modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur la fonction des lymphocytes T CD4, cellules fortement pathogéniques dans ce modèle d'EAE, n’a jamais été évalué. Nous cherchons donc à évaluer l'effet de l'électrostimulation du nerf splénique sur la fonction des lymphocytes T CD4+. Le projet consiste à : 1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique); 2- puis induire une sclérose en plaque expérimentale (modèle d’EAE par injection sous-cutané d’un antigène dérivé de la myéline et d’un adjuvant) ; 3- puis évaluer la fonction des lymphocytes T CD4 de souris électrostimulées ou non en les transférant par injection intraveineuse (= transfert adoptif) dans des souris receveuses atteintes d'EAE. L'évaluation du score clinique sera effectuée tous les jours suivants l'induction de l'EAE. Cette étude comparative chez la souris apportera les éléments nécessaires pour déterminer l’impact sur les fonctions inhibitrices ou pathogéniques des lymphocytes T CD4+.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation du nerf splénique la fonction des lymphocytes T CD4+ dans un modèle murin de sclérose en plaque. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules pathogéniques impliquées dans la sclérose en plaque pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.

Procédures

L’ensemble des animaux seront rasés et l’EAE sera induite par immunisation. Pour ce faire, deux injections d'adjuvant complet de Freund (CFA) et d’un peptide dérivé de la Myéline Oligodendrocyte Glycoprotéine seront administrées par voie sous-cutanée à la base de la queue sous anesthésie générale à l’isoflurane . Le CFA est composé à 50% d’huile minérale et à 50% d’eau. De la toxine pertussis (PTX) sera également injectée par voie intra-péritonéale . La PTX permet la perméabilisation de la membrane hémato-encéphalique. Deux jours après l’immunisation,de la toxine pertussis sera injectée par voie intrapéritonéale sous anesthésie générale à l’isoflurane . Transfert adoptif (300 animaux): Les groupes faisant l’objet d’un transfert adoptif (300 animaux) recevront une injection intra-veineuse d’un million de cellules ou non sous anesthésie générale. Implantation électrode : 120 animaux les animaux recevront un analgésique (Buprénorphine® par voie intra-péritonéale , 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale à l’isoflurane . Après rasage et désinfection, une ouverture de l’abdomen sera réalisée. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique. La paroi abdominale sera suturée avec du monofils résorbable puis le plan cutané sera suturé avec des fils non résorbables. Les fils connectant cette électrode aux connecteurs seront acheminés par voie sous-cutanée jusqu'à la tête de l’animal. Une incision sera pratiquée à l'arrière du crâne permettant l'exposition de la boîte crânienne. Un ciment dentaire sera alors utilisé pour fixer les connecteurs au crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain de l'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire non stéroïdien (Metacam sirop dans l’eau de boisson) maintenu pendant les 3 jours suivants. Animaux classés sans réveil : 60 animaux (Groupes temoins naifs ). Pas de prélèvement sur animaux vigiles

Impact sur les animaux

1- Nuisances associés à l’EAE : L’EAE consiste en l’injection d’un adjuvant avec un peptide de la myéline (petide MOG). Cette injection provoque chez l’animal une réaction auto-immune dirigée contre la myéline du système nerveux central, conduisant à une démyélinisation des fibres nerveuses et un dommage axonal. Entre 8 et 12 jours après l’injection, les premiers déficits moteurs apparaissent, touchant principalement les membres inférieurs. Ces déficits sont caractérisés par une paralysie partielle des membres et sont donc associés à une mobilité réduite et à une perte de poids. Le pic de la pathologie est atteint aux alentours du jour 14 post induction puis les symptômes associés à la maladie vont décroitre progressivement jusqu’à la fin de l’expérimentation. 2- Nuissance associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. Une douleur d’une durée estimée à 48 heure est par contre engendrée par la procédure chirugical permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requière une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 14 ou 21 jours (risques de rognage de fils). 3-Nuissances associées au transfert adoptif des lymphocytes T CD4 L’injection de lymphocytes T CD4 isolés de souris électrostimulées ou non se fera en intraveineuse sous anéthésie gazeuse. Le transfert de lymphocytes T CD4 dans le modèle d’EAE a été largement décrit dans la littérature et peut être associé à une augmentation du score clinique de lordre de 15% au maximum (dans le cas de lymphocytes T CD4 fortement pathogéniques).

Devenir

Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera mis à mort.

Remplacement

Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.

Réduction

Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par par une approche statistique.

Raffinement

Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique et une grille d’observation préétablie prévoyant des mesures correctives et la mise en œuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’EAE a été la mieux caractérisée. Le projet portera sur des souris femelles C57Bl/6 âgées de 8 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20 et 25 gr). De plus, à 8 semaines les souris ont atteints leur maturité. Cet age correspondent à un jeune adulte, qui est l’âge auquel la sclérose en plaque est généralement révélée chez l’homme

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de modéré à sévère. Elles sont isolées pour mesurer leur consommation de sucre ou d'alcool, subissent des prélèvements sanguins répétés et une chirurgie induisant une douleur neuropathique, le porteur indiquant renoncer à tout antalgique pour ne pas fausser ses mesures. Le projet étudie les liens entre douleur, prise excessive de sucre ou d'alcool et addiction. Le porteur affirme que ce travail comportemental et moléculaire n'est possible que sur "l'animal entier".

Objectifs

Dans les pays développés, la consommation alimentaire semble être motivée par le plaisir plus que par le besoin de se nourrir. Ce phénomène, qui consiste à consommer un aliment pour son goût agréable (appétissant), apparaît préoccupant puisqu’il peut devenir la cause de maladies comme l’obésité. Les adaptations comportementales et cérébrales associées à ces troubles de l’alimentation pourraient partager des similitudes avec celles mises en place dans l’addiction à l'alcool. Notre programme de recherche vise à étudier la relation entre les prises excessives de nourriture appétissante et la consommation d'alcool. En particulier, l’apparition de douleur chez des patients souffrant d’addiction à l’alcool a été décrite mais n’est pas bien comprise. Nous faisons l’hypothèse que les troubles de l’alimentation pourraient jouer un rôle dans le développement de douleur, et nous étudions les mécanismes sous-jacents. Les objectifs sont donc dans un premier volet de (1) mesurer les réponsesà la douleur dans nos modèles, et d'effectuer des mesures du bien-être ; (2) caractériser les changements d’expression de gènes et de protéines dans le cerveau. Dans un deuxième volet, nous souhaitons (3) étudier les effets d’une douleur neuropathique sur la consommation de sucre ou d’alcool.

Bénéfices attendus

En identifiant les mécanismes physiologiques, notre recherche permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes centraux impliqués dans les troubles alimentaires et dans l’addiction en général, et en particulier dans le cadre de douleur neuropathique.

Procédures

-Prise de sang à 3 reprises lors du protocole de binge saccharose en PE1 (semaines 1, 4 et 8); Prélèvement sanguin, au maximum tous les 15j, après le début des régimes, en PE2, PE3 et PE5; -Chirurgie, PE5, Modèle douleur neuropathique, 1 fois pour chaque animal, suivi sur 8 semaines maximum

Impact sur les animaux

Nous utilisons des modèles de consommation excessive qui nécessitent l’isolement des animaux pour une précision des mesures. Nous surveillons les animaux quotidiennement. La prise de sang à 3 reprises lors du protocole de binge saccharose peut induire une douleur et un risque d'infection voir de nécrose. Un modèle de douleur neuropathique sera utilisé dans le deuxième volet de l’étude, pour lequel une chirurgie est effectuée sous anesthésie générale. Dans ce modèle, les souris présentent des seuils nociceptifs abaissés, qui sont aussi des symptômes de neuropathie observés en clinique. Cependant nous ne pouvons pas utiliser de moyens pharmacologiques pour réduire la souffrance des animaux car cela risquerait d’interférer avec les mécanismes que nous étudions.

Devenir

PE1 à PE5: Les animaux sont tous mis a mort ( lots détaillés dans chaque PE) pour prélèvements de tissus et analyses moléculaires

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur la caractérisation comportementale et moléculaire d’une consommation excessive d’aliment ou d’alcool, ou d’une douleur, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques pour l’analyse comportementale et l’analyse moléculaire. L’effectif est plus important pour l’expérience de neuropathie, pour prévenir des aléas expérimentaux ainsi qu'une éventuelle variabilité. Les expériences seront menées sur les deux sexes.

Raffinement

La surveillance des animaux est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (sucre ou alcool), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours le choix de consommation (sucre ou alcool) avec de l’eau. Les souris, habituées au dispositif expérimental avant le début des mesures, peuvent se soustraire à la stimulation nociceptive. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Le prélèvement sanguin est effectué sous analgésie locale. Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés sera mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Les procédures regroupent plusieurs tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire l’effectif. De plus, les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires et l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires et de la dépendance aux drogues.