Procédures sévères

1026 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. La moitié subit une électrocautérisation des cinq sixièmes d'un rein et l'autre l'ablation du rein gauche sous anesthésie, induisant de façon certaine une insuffisance rénale chronique, complétée par un régime riche en phosphate, des prélèvements sanguins et des échocardiographies. Le porteur cherche à mettre au point un modèle de calcification de la valve aortique et à évaluer une cible pharmacologique, un traitement chez l'humain étant présenté comme un espoir conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro fiable ne reproduit cette pathologie.

Objectifs

L’objectif central de ce projet est de comprendre le rôle d'Ezh2 (Enhancer Zeste Homologue 2), enzyme épigénétique responsable de la triméthylation de la lysine 27 sur l'histone 3 (H3K27me3), dans le développement du rétrécissement aortique calcifié (RAC). De plus, pour répondre à cet objectif principal nous avons un sous objectif qui est de développer un modèle de calcifications valvulaires suite à l’induction d’une insuffisance rénale chronique supplémentée avec un régime alimentaire riche en phosphate chez la souris. Ce même modèle a précédemment été mis au point chez le rat au sein du laboratoire. La mise au point de ce modèle nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette pathologie et l'implication d'Ezh2.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra, d’une part, de mettre au point un modèle de calcifications valvulaires aortiques chez la souris, permettant par la suite d’être utilisé pour mieux comprendre les mécanismes associés au développement du RAC in vivo. D’autre part, d’étudier l'implication de notre cible thérapeutique, Ezh2 dans le développement du RAC induit par différents types cellulaires (cellules endothéliales valvulaire, cellules inflammatoires etc…) grâce à l’utilisation de modèle de souris génétiquement modifiées. Nous espérons ainsi, si les résultats obtenus sont encourageants, créer une nouvelle stratégie de ciblage pharmacologique de Ezh2 spécifique aux cellules inflammatoires, pouvant faire l’objet d’un traitement innovant de la progression du RAC chez l’Homme.

Procédures

1. Electrocautérisation des 5/6ème du rein droit sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour la moitié des souris soit n=478. La chirurgie dure environ 20 minutes. 2. Néphrectomie, c’est-à-dire exérèse, du rein gauche sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour la moitié des souris soit n=478. La chirurgie dure environ 20 minutes. 3. Pour s’assurer de l’induction de l’IRC, un prélèvement sanguin sera réalisé au niveau du sinus sous mandibulaire au niveau de la veine mandibulaire d’une durée de 1 à 2 minutes, la 4ème semaine post-chirurgie afin de mesurer les paramètres plasmatiques de la dysfonction rénale (créatinine, urée) pour toutes les souris n=956. De plus, pour toutes les souris un prélèvement sanguin comme décrit ci-dessus sera effectué avant toute chirurgie et lors de la mise à mort. 4. Echocardiographie, d’une durée maximum de 20 minutes par souris, (imagerie in vivo) menée sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour toutes les souris. 5. Au total chaque souris (n=956) subira 2 prélèvements sanguins au niveau du sinus sous-mandibulaire, d’une durée de 1 à 2 minutes et un prélèvement sanguin via l’aorte abdominale lors de la mise à mort. La couverture analgésique totale pour la procédure durera 6 heures.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins, les administrations d’analgésique et le traitement avec l'inhibiteur pharmacologique de Ezh2, ainsi que l’exérèse du rein gauche pourront occasionner des effets secondaires. De manière certaine, les animaux, après néphrectomie des 5/6ème (procédure classée sévère) développeront une insuffisance rénale chronique (IRC). Nous nous attendons, si notre modèle fonctionne, à voir des signes de dysfonction cardiaque et plus particulièrement de la valve aortique évalués par échocardiographie.

Devenir

Afin de vérifier si notre modèle d’IRC a induit des calcifications valvulaires, différents types de prélèvements seront effectués : - Prélèvements sanguins 4 semaines après chirurgie et lors de la mise à mort. - Prélèvements de tissus (cœur, rein, poumon, foie) afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques. Ces prélèvements seront réalisés sur les animaux précédemment anesthésiés de manière gazeuse lors de l’échocardiographie correspondant aux analyses fonctionnelles.

Remplacement

Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro car nous avons pour but dans cette étude de mettre au point un modèle d’insuffisance rénale chronique (IRC) associée à un régime riche en phosphate induisant de la calcification valvulaire chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de traitements pharmacologiques inhibant l'activité de Ezh2. Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro fiable récapitulant la physiopathologie du RAC.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échocardiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo durant la procédure et au moment de la mise à mort. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques de Ezh2 est issu d'expériences préalablement réalisées dans des modèles de RAC in vitro. Suite à la procédure de mise au point du modèle animal nous ajusterons le nombre d'animaux nécessaires aux procédures suivantes à l'aide du logiciel G*power version 3.1.9.7 qui s'appuie sur la variabilité statistique des résultats obtenus pour réduire le nombre d'animaux nécessaire. Des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures afin de s'affranchir d'un effet du genre et d'utiliser l'intégralité des animaux OGM produits dans notre animalerie. Une stratégie de reproduction par backcross complémentée par une analyse du génotype de chaque animal nous permettra de nous limiter à l'unique production d'animaux pour les procédures expérimentales. Afin d'éviter la production d'animaux servant au maintien de la lignée OGM dans notre animalerie, une stratégie de cryopréservation de sperme sera mise en place.

Raffinement

Pour raffiner, les animaux seront hébergés en groupes de 5 individus maximum aux normes requises incluant un enrichissement des cages (des plaques de cellulose vierge et des maisons en carton) dans des portoirs ventilés. Des points limites adaptés grâce à notre grille de score (poil ébouriffé, perte de poids ≥ 20%, hypoactivité, prostration, paralysie, dyspnée) associés à une stratégie de réhydratation des animaux par injection sous cutanée de sérum physiologique à 37°C pour une diffusion plus lente et une meilleure hydratation et en cas de besoin, une injection de glucose 5% par voie intrapéritonéale. Un traitement analgésique en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie, ou une fois par jour sur les 48h qui suivent l’opération, est prévu. Si un des points limites est atteint ou si la somme des paramètres de suivi atteint un score de 3, l’animal sera mis à mort. Un suivi quotidien du bien-être animal sera mis en place. Dans le but de réduire la douleur tous les animaux inclus dans cette étude (sauvages et OGM) seront identifiés par puçage.

Choix des espèces

La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, l’utilisation d’animaux pour lesquels un gène est invalidé de manière spécifique dans différents types cellulaires comme cela est le cas dans cette demande concernant la délétion de Ezh2 dans les cellules myéloïdes, qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat (modèle développé au sein de notre laboratoire). Ces modèles sont particulièrement intéressants pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Dans notre laboratoire nous avons, depuis de nombreuses années, une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. La souche de souris (C57Bl/6j) sera utilisée dans cette étude. Nous allons inclure des animaux adultes de 16 semaines et pesant 20-24g pour cette étude. La taille des souris à cet âge permet une réalisation facilitée de la chirurgie.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Une partie subit une chirurgie de greffe de cellules tumorales dans le pancréas sous anesthésie, d'autres une greffe intraveineuse, puis des traitements par injections, avec développement de tumeurs pancréatiques et de métastases pulmonaires pouvant provoquer perte de poids et difficultés respiratoires. Le porteur étudie l'inhibition de la thromboinflammation dans ce cancer très agressif, les nouvelles combinaisons de traitements étant présentées comme un "espoir thérapeutique fort". Il indique développer des modèles cellulaires en 3D en amont, tout en concluant au recours à la souris.

Objectifs

Les carcinomes canalaires pancréatiques sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, l'effet de perte de fonctions des galectines sur le développement de ces tumeurs en combinaison ou pas avec les traitements inhibant le recrutement des cellules thromboinflammatoires. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'effet de cette perte de fonction et ces inhibiteurs sur la dissémination métastatique des tumeurs.

Bénéfices attendus

A ce jour, les ACCP représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale, le microenvironnement tumoral et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.

Procédures

Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min). Des animaux subiront des traitements par injections intraveineuses (durée : 1min) (nombre : 3 fois, espacés de 3 jours ou 5 jours).

Impact sur les animaux

La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés

Remplacement

Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.

Réduction

Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.

102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le protocole repose sur l'induction d'un état dépressif par stress chronique léger imprévisible, avec quatorze mesures de glycémie par animal, des jeûnes et des tests comportementaux, le porteur admettant que perte d'appétit, apathie, déshydratation et perte de poids sont probables. Il reconnaît que "le raffinement sera limité du fait de l'objectif du projet", l'induction d'une symptomatologie dépressive. L'étude vise à explorer le lien entre dépression et résistance à l'insuline, les pistes de traitement étant annoncées comme potentielles.

Objectifs

Les personnes qui souffrent de dépression majeure présentent un risque plus important de maladies cardiovasculaires, d’obésité, et de diabète de type 2. La principale hypothèse expliquant ce risque plus élevé est la perturbation de l’action périphérique de l’une des hormones qui régule l’équilibre du glucose (sucre) dans le sang, à savoir l’insuline. On parle alors de résistance à l’insuline ou insulino-résistance. Cette résistance à l’insuline est fréquente chez les personnes qui souffrent de dépression. Comme autre hypothèse, certains scientifiques ont évoqué le rôle d’un système spécifique impliqué dans la modulation de l’activité des neurones : le système endocannabinoïde (SEC). Le SEC est constitué de molécules appelés ligands (on parle de cannabinoïdes), qui se fixent sur des récepteurs (CB1R et C2BR) et qui peuvent être (les ligands) détruites par d’autres molécules appelées enzymes spécifiques. Certains travaux de recherche ont montré qu’avec l’activation du SEC, on observe les mêmes perturbations (troubles) du métabolisme que l’on rencontre chez les personnes souffrant d’obésité et/ou de diabète. Par contre, les études qui ont évalué le SEC chez les personnes avec dépression (pour savoir s’il était hyperactivé ou l’inverse), ne sont pas tombées sur des conclusions similaires, même si la tendance penche vers une faible activité des récepteurs CB1R dans le cerveau des personnes avec dépression sévère. Au vu des éléments évoqués plus haut, étudier le SEC dans la dépression semble avoir un intérêt, pour déterminer si le SEC ne constitue pas une explication du risque plus élevé de maladies cardiovasculaires / métaboliques en cas de dépression majeure. Une étude de ce type nécessite de pouvoir induire une dépression chez des animaux de laboratoire, notamment des rongeurs, et l’une des méthodes validées dans ce sens est le stress chronique léger imprédictible (SCLI). Ainsi, nous envisageons un travail ayant pour objectif de d’induire une dépression chez des souris (par SCLI), et d’explorer les paramètres métaboliques en lien avec la résistance à l’insuline. Nous pourrons ensuite étudier et modifier l’activité du SEC chez les souris avec symptomatologie dépressive et résistance à l’insuline, tout en évaluant si cette modification du SEC a un effet bénéfique sur le plan métabolique. L’idée est de savoir si en situation de dépression avec troubles cardiométaboliques, une action sur le SEC peut avoir des bénéfices sur la santé cardiovasculaire

Bénéfices attendus

La dépression majeure (encore appelée dépression caractérisée), constitue un problème mondial de santé publique à travers sa morbidité (et le handicap psychique qu’il occasionne), mais également sa mortalité. Cette dernière est relative au suicide mais également aux évènements cardiovasculaires, eux-mêmes liés à des altérations cardiométaboliques ayant comme clé mécanistique la résistance à l’insuline. A l’heure actuelle, les éléments de physiopathologie qui associent l’insulino-résistance à la dépression ne sont pas totalement connus, ce qui pourrait expliquer l’absence de marqueurs biologiques spécifiques à l’association dépression – insulino-résistance. De plus, les axes actuels de prise en soin (pharmacologiques ou non) des perturbations cardiométaboliques (obésité, diabète, dyslipidémie, hypertension artérielle) chez les patients avec dépression majeure semblent insuffisants. L’exploration du SEC sur un modèle murin de dépression, l’analyse de l’association entre les modifications du SEC et la résistance à l’insuline, ainsi que la modulation de ce système, pourraient contribuer à renforcer les connaissances actuelles sur le sujet. Un travail de cet ordre permettrait potentiellement de compléter les notions sur les mécanismes de l’insulino-résistance dans la dépression, mais également d’ouvrir des pistes de traitements pharmacologiques destinés à réduire le fardeau des pathologies cardiométaboliques. Ces traitements seraient des inhibiteurs de l’activité du SEC notamment en périphérie (bloqueurs sélectifs du CB1R) ou alors des activateurs du SEC (agonistes CB1R ou inhibiteurs des enzymes de dégradation du SEC), en fonction des perturbations du SEC qui seront retrouvées.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, un prélèvement sanguin sera effectué afin de doser la glycémie à l’aide d’un glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle). Pour ces tests faisant intervenir une mesure de glycémie, un hébergement individuel de 6h préalable sera nécessaire pour effectuer un jeun. Les tests en eux-même dure 2h, l’hébergement individuel total sera de 8h. Pour les tests comportementaux, ceux-ci sont indispensable afin de pouvoir évaluer l’induction du syndrome dépressif. Aucun prélèvement ne sera effectué, la nuisance principale de ces tests étant l’isolement (30 minutes à 2h en fonction du test). Chaque test n’aura lieu qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Le présent travail a pour base l’induction d’une symptomatologie dépressive, à travers des stress répétés, d’intensité légère, de survenue aléatoire pour les animaux. Il est de ce fait possible voire probable que les animaux que nous enrôlerons présentent des manifestations comportementales telles qu’une perte d’envie, une diminution de l’appétit, une baisse d’énergie, une apathie, une diminution de l’élan vital. Dans le même sens, il subsiste un risque de déshydratation et de perte pondérale. Ainsi, l’état général des souris sera surveillé quotidiennement.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

La dépression et les maladies cardiométaboliques auxquelles elle peut être associée, peuvent être vues dans une approche systémique, avec des conséquences négatives sur de nombreux tissus et organes. Afin d’explorer au mieux cette dimension multi-systémique, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Pour réaliser ce travail, nous avons choisis la souche de souris la plus utilisée dans la littérature (dans d’autres travaux de recherche) dans le sens du SCLI. Aussi, les paramètres morphologiques et l’âge des souris, tout comme les stresseurs et la durée totale du SCLI, sont définis dans notre travail sur la base des études antérieurement publiées. Toutes ces précautions ont pour but de contribuer à réduire au maximum le nombre de souris que nous aurons à utiliser.

Raffinement

Avant la mise en application des épreuves constitutives du SCLI (mise en œuvre de la procédure de stress), et ce pendant deux semaines, les animaux seront placés par groupes de cinq dans des cages avec contrôle de la température et de l’humidité, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, et des alternances lumières/obscurité de 12h. Cependant, le raffinement sera limité du fait de l’objectif du projet, en l’occurrence l’induction d’une symptomatologie dépressive. Toutefois, nous avons mis en place une échelle de points limites adaptés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées dans la littérature scientifique, notamment en ce qui concerne les maladies mentales (dont la dépression et la schizophrénie), ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction de la symptomatologie dépressive par stress chronique léger imprédictible sera réalisée chez des souris de douze semaines. Ce stade correspond à des souris jeunes adultes et est idéal pour induire tout type de conditionnement chez la souris puisque d’après la littérature, ce type d’expérimentation montre son efficacité maximale chez des animaux âgés de 12 à 20 semaines. Considérant une durée de stress de six semaines, les souris CUMS et non-CUMS seront âgées de 18 semaines à la fin de la procédure de SCLI. Les tests comportementaux inhérents à la vérification de la validité du modèle seront réalisés dans les deux semaines après chez toutes les souris, et les prélèvements finals à 20 semaines de vie. De façon pratique, nous travaillerons de façon successive sur des lots de quatre souris. En résumé (pour chaque lot de souris) > Souris sélectionnées à 10 semaines > Phase pré-SCLI de deux semaines > Souris âgées de 12 semaines au début du SCLI > Souris âgées de 18 semaines à la fin du SCLI et au début des tests comportementaux pour tous les animaux > Souris âgées de 20 semaines à la fin des tests comportementaux et mise à mort

2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On les infecte par le virus de la grippe puis, au septième jour, par le pneumocoque, une surinfection qui provoque troubles respiratoires, perte de poids et prostration et tue en deux à trois jours si elle n'est pas arrêtée, les instillations se faisant sous anesthésie parfois par incision de la trachée. Le porteur cherche à comprendre pourquoi les macrophages pulmonaires réagissent différemment chez la souris et chez l'humain, et à tester des molécules immunomodulatrices dont un brevet est en cours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la tolérance d'un "organisme entier", tout en décrivant des travaux sur tranches de poumon humain censés réduire le recours aux animaux.

Objectifs

Chaque année, la grippe saisonnière infecte plus d'un milliard de personnes (environ 20 % de la population mondiale). La versatilité de l’efficacité vaccinale, et l’absence d’antiviraux efficaces, peine à juguler les 500 000 décès annuels dus à la grippe. Cependant, lors d’une infection grippale, la morbi-mortalité n’est pas attribuée seulement au virus influenza, mais aussi à des co-infections bactériennes (40% dans notre service de réanimation). Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque) est le principal agent de ces co-infections, responsable de la sévérité de l’infection et de décès potentiels. Les macrophages alvéolaires (MAs) sont essentiels dans la défense contre les infections à pneumocoque. Une déplétion des MAs chez des souris avant une infection par le pneumocoque entraîne une multiplication bactérienne dans les poumons 100 fois plus élevée par rapport au groupe témoin. Pourtant, une infection grippale chez les souris diminue la population des MAs d’environ 80%. Nous avons mené une étude observationnelle chez l’homme pour confirmer et quantifier la déplétion des MAs après une infection grippale (étude multicentrique). Surprenamment, la quantité de MAs reste stable lors d’infections grippales chez l’homme, remettant en question nos connaissances actuelles sur le rôle des MAs. Notre objectif est de comprendre cette différence souris-homme. Nous souhaitons étudier des modèles de souris plus proches de la réalité humaine : dose virale faible, souris plus âgées, souris avec expérience d’infections antérieures. L’exposition à des composés microbiens façonne le développement et la fonctionnalité du système immunitaire, influant sur la réactivité des MAs aux défis ultérieurs par un phénomène appelé immunité entraînée. Nous avons récemment découvert qu'une reprogrammation métabolique des MAs pouvait altérer leurs propriétés immunitaires, et nous souhaitons étudier ce phénomène chez la souris (et chez l’homme) lors d’une surinfection grippale à pneumocoque. Enfin, nous avons démontré que certaines modifications métaboliques induites par le virus influenza pouvaient être inversées, notamment par l’ajout de succinate ou d’autres molécules immunomodulatrices (Demande de brevet en cours). Nous souhaitons évaluer si ces molécules pourraient représenter une nouvelle piste thérapeutique pour lutter contre les surinfections grippales à pneumocoque.

Bénéfices attendus

L’infection grippale est un problème de santé publique majeure ; chaque avancée dans notre compréhension est importante. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle préférentiel pour l’étude des pathologies respiratoires humaines. Nous avons récemment mis en évidence que l’une des faiblesses de ce modèle réside dans la différence entre les macrophages alvéolaires (MAs) murins et humains. Les MAs sont l’une des cellules les plus impliquées dans l’immunité pulmonaire, notamment dans les co-infections bactériennes, responsables de la gravité des présentations cliniques chez l’homme lors d’une infection grippale. Cette différence peut biaiser les recherches effectuées dans ce domaine et limiter la translation souris-homme des thérapies. Ainsi, nous proposons d’améliorer le modèle murin d’infection grippale et de surinfection bactérienne en nous rapprochant de la relevance humaine. Nous espérons que les résultats issus des expériences décrites ici vont faire rapidement progresser nos connaissances et fournir de nouvelles pistes de compréhension sur le rôle des MAs dans cette pathologie. Ce projet permettra d’améliorer la translationalité des recherches dans le contexte des pathologies respiratoires, et notamment des thérapies antigrippales. De plus, nous possédons déjà des molécules immunomodulatrices qui ont démontrées leur intérêt thérapeutique sur un modèle de cellules épithéliales infectées par le virus de la grippe, ainsi que sur un modèle murin d’infection in vivo. Certaines de ces molécules ont notamment un effet protecteur sur les MAs infectés par le virus de la grippe. Ces molécules proviennent d’un nouveau concept de défense immunitaire, l’immunometabolisme ; présentant plusieurs bénéfices attendus : Ces molécules naturelles et endogènes de l’homme (et non des drogues de synthèse), ont des propriétés antivirales à large spectre ainsi qu’un potentiel anti-inflammatoire puissant. Cette double action diminue le risque de résistance ; et permet de conserver un effet thérapeutique protecteur même dans le cas d’une instillation tardive, à l’inverse des molécules antivirales actuellement sur le marché. Pour l’ensemble de ces raisons, l’étude des MAs représente une avancée majeure pour lutter contre la grippe, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement efficace.

Procédures

Toutes les souris seront anesthésiées, par injection intrapéritonéale, 3 ou 4 fois selon les groupes, pour une durée quelques minutes à chaque fois, durant lesquelles elles recevront soit une instillation intranasale soit une instillation intra-trachéale. Cette dernière nécessite une petite incision en haut de la trachée. Ces instillations ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale nécessite une contention pour l’injection intrapéritonéale ce qui peut engendrer du stress pour les animaux ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection. Cette anesthésie peut également entrainer un refroidissement de l’animal. Les instillations pulmonaires intranasales et intratrachéales provoquent un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. L’instillation intratrachéale nécessite une petite incision en haut de la trachée. Notre modèle d’infection grippale à faible dose virale entraîne des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal à partir du 7ème jour post-infection. La surinfection bactérienne a lieu au 7ème jour chez la souris et provoque une infection qui, si elle n’est pas contrôlée, aboutie à la mort des animaux en 2 à 3 jours. Le cumul de ces infections va induire une altération modérée de longue durée, affectant le bien-être et l'état général des animaux (troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité, température corporelle abaissée, prostration, fermeture totale ou partielle des yeux).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe est bien établi et maîtrisé par l’équipe. Par contre, un effort important est fait pour remplacer certaines explorations in vivo par la mise en place de différents modèles de macrophages alvéolaires in vitro et ex vivo (macrophages alvéolaires), pour étudier les altérations immunométaboliques induites par le virus de la grippe. Enfin, certaines explorations sont directement faites chez l’homme quand cela est possible (culture ex vivo de macrophage alvéolaire humain, coupe de poumon issue de pièce opératoire).

Réduction

Premièrement, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition, nous allons utiliser une technique d’instillation par la trachée. Cette technique permet une instillation dans seulement l’un des deux lobes pulmonaires. De fait, la souris représente son propre contrôle, divisant ainsi par deux le nombre d’animaux requis. Cette technique a été apprise lors d’un séjour d’étude à l’étranger et nous souhaitons la mettre en place dans notre laboratoire pour limiter le nombre d’animaux et les variations interindividuelles. Secondairement, nous allons récupérer les macrophages alvéolaires issus des souris entraînées ou traitées par des métabolites pour les cultiver en laboratoire. Cela permet de réaliser plusieurs types de tests sur des MAs issue d’une seule souris, limitant ainsi l’utilisation des animaux. Ajouté à cela, nous développons actuellement des modèles de tranches de poumons humains et murins. Cette technique, permet de réaliser un grand nombre de tranches de poumons à partir d’un seul donneur (environ 20 tranches par poumon de souris). Ce modèle permet à la fois de conserver la structure pulmonaire et la diversité cellulaire. Ainsi, cela permet la réalisation d’un grand nombre de tests au plus proche de la physiologie pulmonaire, réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).

Raffinement

Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. A l’arrivée des souris dans l’établissement d’hébergement, une habituation de 7 jours sera réalisée avant toute manipulation. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Toutes procédures d’instillation intranasale ou intra-trachéale seront précédées d’une anesthésie des souris par voie intrapéritonéale ou gazeuse pour les animaux déjà infectés. L’état de sédation de l’animal suivant ces anesthésies sera de maximum 20 minutes. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les animaux ayant atteint le point limite seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris. Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris. Cette espèce est la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires, réduisant le besoin d'animaux pour des études préliminaires. Les souris sont facilement infectables par des souches adaptées de virus de la grippe humaine et présentent des symptômes cliniques similaires à l'homme (anorexie, hyperinflammation pulmonaire, perte de poids et mortalité). Les souris sont les plus couramment utilisées dans les études de physiopathologie et mécanistiques, mais également pour le développement d’outils thérapeutiques. Cette souche est appropriée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires et est un modèle bien établi d’infection grippale. Les MAs de ces souris semblent plus résistants à l’infection grippale, se rapprochant de la réponse des MAs humains. Enfin, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour avoir un système immunitaire mature. Afin d’avoir des souris correspondant à l’âge moyen humain de notre étude (64 ans), des souris agées de 24 mois seront également utilisés.

75 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie bariatrique, sleeve gastrectomie ou bypass duodéno-iléal, des injections quotidiennes de semaglutide et des prélèvements sanguins par incision de la queue, pour comparer médicament et chirurgie de l'obésité. Le porteur annonce une mortalité postopératoire jusqu'à 30 %, des douleurs sur cinq jours et un risque de désunion de la cicatrice. Il affirme qu'il est "absolument nécessaire" de comprendre l'ensemble physiologique in vivo et qu'aucune méthode de remplacement n'existe en chirurgie bariatrique.

Objectifs

L'obésité morbide est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, la dyslipidémie et les maladies hépatiques. La chirurgie bariatrique apparaît comme l'alternative thérapeutique la plus efficace chez les patients souffrant d'obésité morbide. En plus de son efficacité pour diminuer le poids corporel, il améliore également les complications métaboliques associées. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ces effets bénéfiques restent parfois peu clairs mais impliqueraient plusieurs facteurs, notamment des changements dans la sécrétion des hormones gastrointestinales, tels que le GLP-1. Des analogues pharmacologiques de ces hormones ont été développés par l’industrie pharmaceutique et ce projet vise à mieux comprendre l’intérêt de ces médicaments dans le cadre d’une bi-thérapie couplée aux chirurgies bariatriques ou de comparer leurs effets par rapport à des procédures chirurgicales innovantes.

Bénéfices attendus

Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets des chirurgies de l’obésité associés aux effets des analogues de GLP-1, nous permettra de mieux cibler les indications opératoires de ces types de chirurgies selon le profil métabolique du patient et son environnement de vie

Procédures

Les souris recevront une injection quotidienne sous cutanée. 30μl de sang seront prélevés par micro-incision à l’extrémité de la queue à J-3, J+21 et J+35 après chirurgie (Dosage cholestérolémie, triglycéridémie, glycémie). A J+28, un test de tolérance au glucose sera réalisé et une mesure de la glycémie sera effectuée à T0, 15, 30, 60 et 120 minutes par micro-incision de la queue. Les temps opératoires moyens des chirurgies sont respectivement de 45 minutes pour la sleeve gastrectomie et de 65 minutes pour le SADI-S ((Single anastomosis duodeno-ileal bypass avec sleeve gastrectomie) ).

Impact sur les animaux

En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : -Une mortalité entre 0 (laparotomie), 10% (Sleeve Gastrectomie) et 30% (SADI-S: Single anastomosis duodeno-ileal bypass avec sleeve gastrectomie) après chirurgie -Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée -Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures afin de récolter des tissus utiles à la caractérisation métabolique et moléculaire des modifications induites par les traitements chirurgicaux et/ou médicamenteux.

Remplacement

Les chirurgies bariatriques induisent de profondes modifications du métabolisme énergétique qui font intervenir des conséquences entremêlées et en cascade sur de nombreux tissus tels que l’intestin, le foie, les tissus adipeux et le cerveau, etc… Les mécanismes moléculaires sont très mal connus et il est absolument nécessaire de comprendre l’impact physiologique dans son ensemble pour développer par la suite d’autres approches. Il n’existe pas à l’heure de méthodes ex vivo/in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

La procédure est classée sévère. Des protocoles péri-opératoire et post-oépratoires ont été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal et palier les risques d'anémie et les carences nutritionnelles. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse ( de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.

Choix des espèces

Les conséquences physiologiques et métaboliques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et dans les pathologies hépatiques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale. A 8 semaines, les souris seront mises sous un régime hyperlipidique pour atteindre (après 12 à 16 semaines) un poids supérieur à 40g compatible avec une bonne tolérance aux chirurgies bariatriques

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur inflige un traumatisme crânien, suivi d'IRM, d'évaluations neurologiques et d'une perfusion intracardiaque létale au trentième jour, pour tester un anticorps censé bloquer une interaction moléculaire aggravant les lésions. Le porteur indique une perte de poids, une hypothermie, des douleurs et des déficits cognitifs, et prévoit une mise à mort si le poids chute de plus de 15 % ou si le score de douleur dépasse un seuil. Il affirme que ces procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées, la stratégie thérapeutique pour les patients restant à proposer.

Objectifs

Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) endogène joue un rôle critique aussi bien dans la circulation sanguine que dans le parenchyme cérébral, notamment en interagissant avec les récepteurs du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Dans ce projet, nous allons définir la participation de cette interaction entre le tPA et le récepteur NMDA dans le cadre des traumatismes crâniens (TC), qui restent mal pris en charge sur le plan clinique. Nous testerons aussi le potentiel thérapeutique d’un anticorps que nous avons produit au laboratoire et qui bloque cette interaction. Nous évaluerons à la fois le bénéfice histologique (inflammation, hémorragie, lésion cérébrale) et le bénéfice fonctionnel à long terme (suivi longitudinal).

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et de proposer une stratégie thérapeutique au bénéfice des patients.

Procédures

Traumatisme crânien (J0) (Durée : 15min ; n=80) + traitements (n=40) + IRM (J3, J15, J30 ; Durée : 60min/Session) + évaluation neurologique (J3, J15, J30 Durée : 30min/Session) + perfusion intracardiaque (J30) (n=80) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J30).

Impact sur les animaux

L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.

Réduction

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ce modèle.

520 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur induit une colite ou une cholangite, avec diarrhées et saignements, avant des injections répétées d'un anticorps candidat, certaines subissant une chirurgie avec ligature du canal cholédoque, pour évaluer un futur traitement des maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que l'induction de la colite peut entraîner une mortalité et une perte de poids, et prévoit une euthanasie précoce si un score clinique se dégrade. Il affirme que la souris est un "passage obligatoire" avant l'humain et un "prérequis indispensable", les bénéfices médicaux restant renvoyés à une éventuelle entrée en clinique.

Objectifs

Mettre au point un anticorps thérapeutique spécifiques susceptibles d'exercer des effets anti-inflammatoires et /ou régénératifs applicables à l'homme .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cette étude sont doubles : 1- valider expérimentalement l’effet thérapeutique de l’anticorps candidat sur les maladies inflammatoires intestinales et sur la cholangite. Cette étape cruciale quant à l’efficacité du traitement, sera le point de départ du second bénéfice à savoir la production à visée médicale de l’anticorps et à plus long terme son entrée en phase clinique.

Procédures

Effet curatif d'un anticorps sur la colite : Injection intrapéritonéale quotidienne d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Effet curatif des anticorps sur la colite : Instillation par voie anale avec une sonde de gavage souple 1 minute une seule fois. Injection intrapéritonéale quotidienne d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Effet pro-régénératif de l'anticorps sur la reconstruction de l'épithélium intestinal post colite : Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection pendant 14 jours ou 21 jours. Effet anti-fibrosant de l’anticorps candidat dans un modèle de fibrose intestinale induite par une colite chronique : Injection intrapéritonéale de l'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection pendant 28 jours et 66 jours 3 fois par semaine. Effet de l'anticorps sur la cholangite : Cholangite induite par l’alimentation : Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Cholangite induite par la ligature du canal cholédoque : Chirurgie comprenant laparotomie et ligature du canal cholédoque 20 minutes. Injection sous cutanée d’analgésie 2 secondes 1fois à deux fois par souris en fonction de la récupération des animaux post opératoire. Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection.

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations. Stress lié à la contention lors de la chirugie et lors des suivis clinique (Perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets des produits induisant la colite ou la cholangite (diarhée, saignement).

Devenir

Lorsque les points limites sont dépassés ou lorsque les temps définis sur les différentes procédures sont atteints nous nous procédons au prélevement des organes afin de réaliser des analyses immunohistologiques

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

L’effectif proposé tient compte de la mortalité possible liée à l’induction de la colite et du fait qu’un effectif plus faible ne permettrait pas de démontrer une différence statistique significative.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être). Les effets du traitement seront contrôlés par des pesées et une surveillance selon un score standardisé de colite clinique. Ce score correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'anesthésiant pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux : l’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).

Choix des espèces

Le modèle murin de colite inflammatoire dans les conditions de ce protocole est largement validé et décrit dans la littérature. Son utilisation est un prérequis indispensable à l'élaboration d'un anticorps à visée thérapeutique de la maladie de Crohn. L'effet thérapeutique potentiel d'anticorps spécifiques susceptibles d'exercer des effets anti-inflammatoires et /ou régénératifs applicables à l'homme ne peut être évalué qu'in vivo sur des modèles validés de colite. L'efficacité des anticorps (spécificité, affinité, etc...) sera préalablement testée in vitro afin de sélectionner les plus performants dans la reconnaissance de leur cible et leur effet bloquant anti-inflammatoire. Les protocoles seront réalisés avec des souris de 6-7 semaines. Notre expérience des traitements pour une colite inflammatoire ou de la cholangite montre que l'âge des animaux influe fortement sur leur réactivité et sur la reproductibilité de la colite induite. L'inflammation colique génère des diarrhées qui participent à la perte de poids des animaux. Des souris utilisées à un âge trop jeune sont plus sensibles et sont susceptibles d'atteindre très rapidement les points limites que nous nous sommes fixés avant la fin de l'expérience. Des souris plus âgées sont moins sensibles et de facto déclenchent des colites plus contrôlables limitant, pour des résultats similaires.

92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit un génotypage par biopsie de la queue, une chirurgie de bypass gastrique ou une simple laparotomie sous anesthésie, des prélèvements sanguins hebdomadaires puis une mesure létale de l'absorption du cholestérol, pour étudier le rôle d'un récepteur intestinal dans les effets de la chirurgie bariatrique. Le porteur indique une mortalité postopératoire de 0 à 30 %, des douleurs sur cinq jours, un risque de désunion de la cicatrice et une dénutrition. Il affirme que ce système biologique intégré ne peut pas être "substitué" par des approches in vitro et ne retient que les expériences jugées "indispensables".

Objectifs

L’obésité, problème majeur de santé publique concernant actuellement plus d’un adulte sur 20 dans le monde, est associée de manière significative à de nombreuses complications métaboliques. La chirurgie bariatrique est le traitement de référence de l’obésité. L’objectif de ce projet est d’étudier la fonction intestinale d’un récepteur présent à la surface des cellules intestinales sur les effets hypocholestérolémiants de ces chirurgies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus d’un tel projet s’inscrivent dans la réflexion, d’actualité, autour des chirurgies métaboliques et de leur indication chez des patients obèses présentant des comorbidités variées. Les retombées attendues d’un tel projet seront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques du bypass gastrique. Ces données pourront permettre, à l’avenir, de mieux adapter le type de chirurgie au profil métabolique des patients, voire de développer des molécules pouvant cibler ces mécanismes pour le traitement des dyslipidémies.

Procédures

Les animaux subiront une biopsie caudale à l'âge de 5-6 jour pour déterminer par PCR leur génotype. Les animaux subiront tous une chirurgie de type By-pass gastrique Roux en Y (RYGB) ou laparotomie seule (Sham) sous anesthésie générale et analgésie appropriée. Du sang sera prélevé à l’extrémité de la queue après anesthésie cutanée locale chez les animaux vigiles avant la chirurgie puis une fois par semaine. A J21 après la chirurgie, une mesure de la tolérance au glucose sera réalisée par gavage d’une solution glucosée. Du sang sera prélevé à la queue chez les animaux vigiles 0, 15, 30, 60 et 120 min après le gavage. Les animaux seront ensuite euthanasiés par ponction cardiaque (prélèvement de 1mL de sang) après mesure de l’absorption et de l’excrétion du cholestérol sous anesthésie générale et analgésie appropriée.

Impact sur les animaux

La biopsie caudale initiale de génotypage induit une douleur légère de courte durée. En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : - Une mortalité entre 0 et 30% après chirurgie - Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée - Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale - Une dénutrition qui nécessite une supplémentation ferrique et vitaminique quotidienne

Devenir

La mesure de l’absorption intestinale et de l’excrétion du cholestérol est une procédure létale.

Remplacement

Les conséquences physiologiques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Il n’existe pas malheureusement à l’heure actuelle de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Des protocole péri-opératoire et post-oératoire ont été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal, et palier aux risques d'anémie et de carences nutritionnelles. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse ( de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront placées en couveuse pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.

Choix des espèces

Les conséquences physiologiques et métaboliques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et dans les pathologies hépatiques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale. A 8 semaines, les souris seront mises sous un régime hyperlipidique pour atteindre (après 12 à 16 semaines) un poids supérieur à 40g compatible avec une bonne tolérance aux chirurgies bariatriques