Procédures sévères

3 616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 140 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses de mutations reproduisant un cas familial de trouble autistique, elles subissent des crises déclenchées par un gaz convulsivant, des injections, une ablation de phalange et des tests comportementaux en labyrinthe, y compris sur des souriceaux. Le porteur décrit des points limites entraînant la mise à mort, et une lidocaïne appliquée avant les injections sous-cutanées. Les bénéfices annoncés se limitent à comprendre le mécanisme et à présélectionner des composés candidats.

Objectifs

L’objectif final de ce projet est de comprendre les mécanismes physiologiques, cellulaires et moléculaires responsables des troubles du spectre autistique (TSA) et de mettre au point des traitements thérapeutiques efficaces pour les patients atteints de TSA. Une théorie récente stipule que les perturbations de l'homéostasie neuronale des ions chlorure sont l'un des principaux facteurs contribuant à la formation de la pathologie, mais il n'existe pas de preuves directes de cette théorie. Récemment, un groupe de cliniciens du CHU-Lyon a identifié une famille (ci-après dénommée Dylan) comptant quatre enfants atteints de TSA associés à deux variants faux-sens (ci-après dénommés "D1" et "D2") dans le gène SLC12A5, hérités chacun d'un des parents. La mère et le père, qui ne portent chacun qu'une seule mutation (D1 et D2, respectivement), ne présentent aucune pathologie évidente. Le gène SLC12A5 code pour le co-transporteur potassium-chlorure KCC2 qui contrôle dans les neurones la concentration intracellulaire de chlorure. Notre hypothèse est que les mutations D1 et D2 du gène SLC12A5, lorsqu'elles sont combinées dans un organisme, modifient l'activité du transporteur KCC2 et changent la concentration de chlorure dans les neurones. Pour vérifier cette hypothèse et étudier les mécanismes moléculaires conduisant aux TSA, nous avons créé deux souris transgéniques imitant le génotype des parents de Dylan. La souris ressemblant à la mère porte dans un allèle la mutation D1 et la souris ressemblant au père porte la mutation D2. L'objectif du projet est de générer une souris ressemblant au patient, en combinant les mutations D1 et D2, et d'étudier le phénotype de cette souris. En particulier, nous nous concentrerons sur l'analyse du métabolisme neuronal, de l'activité du réseau neuronal et du comportement animal. Une fois caractérisés, ces paramètres seront utilisés pour cribler des composés ciblant KCC2 et visant à atténuer les symptômes des TSA.

Bénéfices attendus

Compréhension du mécanisme de formation des TSA dépendant du KCC2 et présélection de composés diminuant la gravité des symptômes des TSA.

Procédures

Il y aura deux types de traitements nocifs. Le premier comprend un traitement au gaz flurothyl produisant des convulsions. Le but de ce traitement est de vérifier si les souris transgéniques D1/D2 expriment une plus grande susceptibilité à générer des crises (trois patients Dylan sur quatre ont des crises spontanées), 140 souris. Traitement pendant 3 à 5 minutes. Le deuxième traitement susceptible de produire un effet nocif est la procédure d'injection sous-cutanée du composé anti-leptine. Le composé anti-leptine a montré une grande efficacité pour traiter certaines pathologies chez l'homme et réduire la sévérité de la pathologie dans le modèle murin du symptôme RETT. Dans le présent projet, le traitement anti-leptine sera utilisé pour déterminer son efficacité curative potentielle sur la souris D1/D2. 400 souris, trois injections aux âges postnataux de 8, 12 et 16 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux seront sujets de différents traitements qui peuvent causer de la douleur ou d'autres effets indésirables : i) douleur et nuisance causées par la phalangectomie et/ou par les injections sous-cutanées d'un composé anti-leptine. La phalangectomie et les injections sous-cutanées seront effectuées à l'aide d'instruments chirurgicaux correspondant le mieux à la procédure donnée et destinés à entraîner l'effet indésirable le plus court possible. Après les manipulations, les animaux seront examinés pour détecter des changements de comportement, de mobilité et de perte de poids. Dès les premiers signes d'effets indésirables les animaux seront euthanasiés. ii) crises tonico-cloniques produites par l'exposition au flurothyl, un gaz convulsivant. Après l'exposition au flurothyl, toutes les souris seront euthanasiées. iii) les nuisances causées par le retrait des souriceaux de la portée pour les tests comportementaux. Les cages contenant les portées seront placées dans la salle d'expérimentation 20 minutes avant le début de l'expérience. Les souriceaux seront délicatement pris et manipulés pendant le temps le plus court possible par le technicien expérimenté. Le même technicien pour le même type d'expériences (mesure du poids, tests ultrasoniques, autres repères de développement...). iv) les nuisances causées par les tests comportementaux appliqués à des souris juvéniles (>20 jours). Les animaux seront manipulés quotidiennement dans la salle d'expérimentation par le même technicien afin de les habituer à l'expérimentateur et au dispositif expérimental. Pendant l'expérience, l'animal sera placé dans le labyrinthe expérimental pendant une durée bien définie. Avant et après l'expérience, tous les animaux auront un accès illimité à l'eau et aux aliments et seront hébergés dans des cages ventilées avec une température et un cycle de lumière jour/nuit contrôlés.

Devenir

À la fin de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de disséquer les cerveaux pour des analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Le projet a pour objectif de comprendre les origines de l'incapacité sociale et l'organisation du réseau neuronal dans le modèle de souris du cas humain d'autisme, avec la perspective de développer un traitement. Les études que nous proposons portent sur l'organisation des réseaux neuronaux et le comportement animal, lesquels ne peuvent être reproduits dans des modèles de cultures neuronales ou lignées cellulaires in vitro.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, chaque animal servira à plusieurs évaluations comportementales et/ou ex-vivo. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres (comportementaux et ex-vivo (électrophysiologiques ou biochimiques ou histologiques), réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements électrophysiologiques, 3 chercheurs seront mobilisés. Pour les analyses biochimiques et histologiques plusieurs protéines et/ou ARN seront étudiés par échantillons prélevés et par animal. Pour les expériences d’électrophysiologie, nous enregistrerons plusieurs cellules par tranche, plusieurs tranches par animaux, ce qui permettra d’avoir une puissance statistique importante. Les tests statistiques utilisés seront non-paramétriques, adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Un raffinement sera rigoureusement appliqué tout au long de la procédure d'étude, en commençant par le mode d'hébergement et d'élevage, en poursuivant par les manipulations expérimentales avec les animaux et en terminant par l'exploitation optimale des données expérimentales. L'hébergement se fera dans l'animalerie INMED récemment rénovée, avec une température contrôlée et un cycle jour/nuit inversé. Les animaux sont élevés dans des cages ventilées comprenant des éléments d'enrichissement et avec un accès illimité à la nourriture et à l'eau. Les animaux sont habitués à être manipulés par l'expérimentateur et sont habitués avec le matériel destiné aux études de comportement. En particulier, trois jours avant le début des expériences de comportement, la souris sera placée quotidiennement dans l'arène expérimentale pour s'habituer. Par la suite, au cours de la journée expérimentale, le même expérimentateur placera délicatement l'animal dans l'arène et commencera à surveiller le comportement de l'animal par vidéo et audio. Le même jour, une seule tâche sera effectuée avec une souris donnée. Après le test de comportement, l'animal sera remis dans sa cage. Une application de lidocaïne sera réalisée avant les injections sous cutanées pour réduire la douleur. Les animaux (injectés ou non) seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être prenant en compte l'apparence de l'animal, des difficultés respiratoires sévères et prolongées, une léthargie de l'animal (immobile, ne répondant pas aux stimuli), et une prise ou perte de poids excessive (supérieure à 20 % de son poids initial). Les animaux présentant des signes de souffrance seront euthanasiés. L'anesthésie à l'isoflurane (5%) sera utilisée pour minimiser la douleur des animaux avant les manipulations désignées pour isoler le cerveau pour les études post-hoc.

Choix des espèces

Les expériences sont réalisées sur des souris car ces petits rongeurs sont largement utilisés dans les laboratoires de neurobiologie en raison de leur petite taille et de leur cycle de reproduction court. Concernant nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour en tirer des conclusions générales sur la mise en place développementale de la dynamique des réseaux corticaux. De plus, le modèle murin est couramment utilisé en neurosciences rendant nos résultats intéressants pour une large communauté scientifique et permettant de mieux les confronter aux résultats déjà publiés. D'autre part, le modèle souris présente l’avantage d’être très permissif à la transgenèse, c'est donc une espèce privilégiée pour l'obtention d'OGM, elle est facile à élever (reproduction rapide des animaux et conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes) et elle permet une possible application à l'homme des résultats obtenus (proximité physiopathologique avec l’Homme et donc transférabilité des résultats). Le principal sujet d'étude est la souris transgénique D1/D2, un nouveau modèle de TSA imitant le génotype du patient atteint de TSA comorbide avec l'épilepsie. Des études antérieures ont montré que des changements majeurs dans le réseau de la souris ASD-like se produisent au cours du premier mois postnatal. Nous analyserons donc la plupart des paramètres caractérisant le réseau neuronal et le comportement social à différents stades de développement. Les résultats seront ensuite regroupés et comparés pour différentes tranches d'âge (par exemple P6-P8 ; P12-P15 ; P18-P22 ; P28-P32 ; P45-P50).

10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe des tumeurs du sein ou du mélanome et des métastases pulmonaires, avec des injections répétées de nanoparticules et des séances d'imagerie sous anesthésie, pour sélectionner les particules les plus prometteuses. Le porteur décrit des signes comme la prostration, la détresse respiratoire et des réactions du greffon, et annonce des souris tuées "immédiatement" aux premiers signes. Il expose ses objectifs et bénéfices en quelques lignes, pour un projet portant sur plus de dix mille souris.

Objectifs

L’objectif du projet est de sélectionner les meilleures Nano-Particules (assemblage chimique de très petite taille, inférieur à 1/10 de mm) pour une possible utilisation thérapeutique dans les cancers du sein et du mélanome.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'améliorer les traitement des cancers du sein et du mélanome. L'utilisation des meilleures Nano-Particules devrait permettre de réduire les effets secondaires des chimiothérapies actuelles.

Procédures

Injections des Nano-Particules sur des souris anesthésiés, durée 1mn/souris. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, quelques minutes, fréquence 5 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, quelques minutes, fréquence 5 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, fréquence 10 fois. Imagerie en bioluminescence sur des souris anesthésiées, durée quelques minutes, fréquence 7 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, fréquence 10 fois. Imagerie en bioluminescence sur des souris anesthésiées, durée quelques minutes, fréquence 7 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Prélèvement de sang, sur des souris anesthésiées, 100µl, une seule fois. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris une seule fois.

Impact sur les animaux

La majorité des effets délétères attendus seront dû à la formation de tumeurs mammaire, de mélanome et de métastases pulmonaires donc avec des signes cliniques comme prostration, troubles du comportement, agressivité, détresse respiratoire, troubles métaboliques. Pour certains modèles, il pourrait y avoir une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids, de possible lésions cutanés (irritations, sècheresse localisée). Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont une irritation des voies respiratoires et une légère tendance au spasme laryngé dû à l’âcreté du produit employé. Les injections répétées pourraient entrainer localement une inflammation.

Devenir

Les animaux ayant subi ces interventions ne pourront pas servir pour d'autres expérimentations et seront mis à mort pour prélèvements.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Les études in silico et in vitro ne permettant pas de reproduire la complexité d'un environnement tumoral. Le modèle animal est donc nécessaire pour récapituler les étapes complexes de la progression tumorale.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente en tenant compte de la puissance du test statistique qui sera utilisé. De plus l'emploie d'un système d'imagerie en fluorescence et bioluminescence du petit animal permettant un suivi dans le temps pour chaque animal, réduit le nombre d'animal requis et renforce la fiabilité des résultats.

Raffinement

Les protocoles expérimentaux prennent en compte les conséquences l’impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les animaux ne rentrent en phase d'expérimentation qu'au minimum 15 jours après leurs arrivés. Les animaux sont pratiquement systématiquement manipulés sous anesthésie gazeuse. Quand des procédures d'injections ou de chirurgies sont mise en place, des analgésiques sont administrés. Les souris sont maintenues au minimum de 2 par cage pour maintenir une interaction entre individus. L’environnement d’élevage est enrichi à l’aide de nids et de carrés de cellulose pour garnir ces nids. Si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition d'inconforts (réduction de la réactivité, difficulté de locomotion, fourrure non entretenue, tendance à l'isolement) elle serait euthanasiée immédiatement. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : • nombreux protocoles bien établis pour cette espèce • possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés • modèles mimant très bien les cancers mammaires et de mélanomes humain et récapitulent toute la cascade métastatique en peu de temps et ont déjà fait l'objet de nombreuses publications dans le domaine. Ce seront des souris adultes entre 8 et 12 semaines, car les traitements envisagés s'adressent à ce type de population. Des animaux de 5 semaines seront employées pour l'analyse de l'impact des Nano-Particules sur le système immunitaire.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Aucun geste expérimental ne leur est infligé, la souffrance provenant des modifications génétiques elles-mêmes, qui produisent un retard de croissance, un nanisme et des faiblesses musculaires, certaines souris ne survivant pas au sevrage. Le projet étudie deux enzymes qui dégradent un neuromédiateur, avec pour horizon les inhibiteurs médicaux et les gaz neurotoxiques. Sur le remplacement, le porteur affirme que la fatigabilité musculaire et la communication entre organes ne peuvent être reproduites en culture cellulaire.

Objectifs

L’acétylcholine est une molécule de communication locale entre neurones (neuromédiateur) mais aussi une molécule de communication à l’extérieur du système nerveux. Nous cherchons à comprendre les fonctions de deux cholinestérases qui détruisent très efficacement l’acétylcholine. Dans les jonctions neuromusculaires, ces deux enzymes sont localisées dans des domaines différents et contrôlent la fatigabilité des souris. Nous utilisons des approches génétiques sophistiquées pour établir une nouvelle voie de signalisation contrôlée par ces enzymes dans cette synapse et montrer son importance dans la fatigabilité. Au niveau de l’animal entier, ces deux cholinestérases jouent des rôles complémentaires probablement pour maintenir les réseaux de communications par l’acétylcholine relativement indépendants. Nous utilisons des approches génétiques sophistiquées pour établir que les muscles pourraient être une source d’acétylcholine qui interfère avec des fonctions physiologiques autres que la motricité.

Bénéfices attendus

Les inhibiteurs de cholinestérases sont largement utilisés (Alzheimer, myasthénie, anesthésie, syndrome du golfe) et provoquent beaucoup d’effets indésirables. Des pesticides et des armes de destruction massive (gaz neurotoxiques sarin VX novitchok) sont aussi des inhibiteurs de cholinestérases et sont extrêmement toxiques. En comprenant les fonctions respectives des deux cholinestérases dans le contrôle du niveau d’acétylcholine dans les systèmes nerveux et en dehors des systèmes nerveux, nous devrions pouvoir 1) sélectionner de nouveaux inhibiteurs pour le traitement des maladies neuromusculaires ou pour les anesthésies; 2) proposer de nouvelles prises en charge des intoxications par des pesticides ou des gaz neurotoxiques.

Procédures

Aucune. Les animaux présentent des altérations fonctionnelles d'origines génétiques.

Impact sur les animaux

Les résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ainsi que sur les lignées transgéniques publiées ont montré que les nuisances pour les souris sont variables en fonction des génotypes mais concernent principalement un retard staturo-pondéral et des faiblesses musculaires. Nous anticipons qu’une partie des lignées aura un développement incomplet jusqu’à l’âge adulte. Ces phénotypes ont été observés avec des souris sans la protéine AChE ou souris sans les protéines AChE et BChE. Les souriceaux de ces lignées seront étudiés dans la période périnatale (P0-P1) et en fin de développement embryonnaire. Certaines souris ne survivent pas après le sevrage et seront étudiés à P13-P15. L’autre partie de lignées développées pourront développer des atteintes du fonctionnement de la communication neuromusculaire mais peuvent se développer jusqu’à l’âge adulte. Elles sont actives, se nourrissent dans la mangeoire. La respiration basale s’est adaptée et les souris vivent plus d’un an. Ces souris présentent une fatigabilité notable, une faiblesse musculaire qui ne permet pas à la souris de rester accrocher à une barre. Elles sont plus petites à partir de 7-8 jours de développement post-natal et ce nanisme persiste à l’état adulte. Les mécanismes impliqués sont probablement nombreux (thermorégulation, métabolisme, digestion, circulation).

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de procéder à des analyses histologiques

Remplacement

Objectif 1 La fatigabilité est une notion qu’il est difficile d’explorer ex-vivo car les stimulations nerveuses utilisées ex-vivo pour contracter un muscle ne reproduisent pas le profil d’activations utilisé dans la réalisation de ses mouvements. La fatigabilité n’est pas simplement liée à la force maximale développée par un muscle. Objectif 2 Le retard de croissance dans les différents mutants de souris résulte probablement d’une communication entre organes, l’ACh qui s’échappe des muscles, interfère avec des communications médiées par l’ACh entre les cellules variées dans d’autres organes. Cette communication ne peut pas être reproduite en culture cellulaire ou organoïde. La modélisation est impossible en absence de connaissance 1) du niveau de la fuite potentielle d’ACh à partir des muscles (hypothèse), 2) des cibles possibles : cardiorespiratoires, vasculaire, digestives, inflammatoires ; 3) des conséquences sur le métabolisme ; de la dynamique de l’ACh dans le milieu intérieur.

Réduction

Les études sur l’ACh sont conduites jusqu’à présent en utilisant des inhibiteurs des cholinestérases, ces approches nécessitent l’utilisation de différentes doses d’inhibiteurs et donc de nombreuses cohortes d’animaux. Les interprétations sont difficiles car les inhibiteurs peuvent avoir d’autres cibles que les enzymes visées. Nous développons ici des approches génétiques pour utiliser moins d’animaux. Pour l’objectif 1, chaque souris est son propre contrôle. Le suivi longitudinal des souris dans leur cage d’élevage limite le nombre d’animaux. Pour l’objectif 2, une approche systématique permettait de produire 48 génotypes, nous proposons de produire une moitié de ces génotypes (24), et les avons soigneusement choisis afin qu’ils soient pleinement exploités pour valider notre hypothèse.

Raffinement

Pour étudier spécifiquement les questions liées aux conséquences de l’ACh endogène, nous avons développé des approches génétiques sophistiquées, mutations ponctuelles dans une sélection de gène qui abolissent la fonction hydrolyse d’ACh et pas d’autres propriétés du gène AChE, délétion de courte séquence dans le génome pour limiter les modifications chromosomiques. Nous avons aussi sélectionné des lignées parmi toutes les combinaisons alléliques possibles, pour lesquelles le retard de croissance devrait être visible de façon précoce et touchera tous les animaux nés. Nous utilisons des conditions propices à l’élevage des souris. Les croisements sont conduits avec un mâle et une femelle en élevage continu.

Choix des espèces

La souris est un mammifère qui permet d’aborder la dynamique de l’ACh dans l’organisme, 1) L’ACh est le neuromédiateur des muscles chez la souris comme chez l’homme (une source majeure d’ACh); 2) il est possible de créer des modèles génétiques afin de modifier précisément la fonction, la production ou la localisation des enzymes de dégradation de l’ACh. Objectif 1 Souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Objectif 2 Jeunes à P0et à P13.

250 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par le staphylocoque doré, par voie sanguine ou sous la peau, pour étudier la compétition pour les métaux entre la bactérie et l'hôte, avant d'être tuées pour prélever les tissus. Le porteur indique que l'infection générale peut provoquer une perte de poids marquée, une baisse d'activité et des variations de température, et que l'infection cutanée forme une plaie purulente dès le troisième jour. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire coordonnée "ne peut être étudiée qu'au sein de l'animal".

Objectifs

Les métaux comme le fer et le manganèse sont des micronutriments cruciaux pour toutes formes de vie. L'hôte exploite ce besoin comme une arme contre l'infection, privant les organismes pathogènes comme le staphylocoque doré de ces ressources essentielles à sa survie lors d'un processus appelé "immunité nutritionnelle". Le projet vise à étudier le combat pour l’accès aux métaux entre l’hôte et le pathogène et comprendre comment S. aureus échappe à l’immunité nutritionelle. Afin d’identifier les facteurs impliqués dans l’adaptation aux changements de disponibilité en métaux, nous suivrons les réponses des deux protagonistes au cours de l’infection. Les niveaux de métaux variant selon l’organe infecté, nous utiliserons des modèles d’infection locale (infection de la peau) et systémiques (infection générale).

Bénéfices attendus

Les scientifiques du monde entier cherchent à développer de nouvelles stratégies pour lutter contre les bactéries pathogènes devenues résistantes aux antibiotiques actuels comme le staphylocoque doré. Ce dernier est une menace majeure pour la santé humaine et l'une des causes les plus courantes d'infections bactériennes. Une approche prometteuse est de perturber/empêcher l’accès du pathogène aux ressources essentielles telles que les métaux. Cependant, afin de développer et parfaire ces nouvelles approches thérapeutiques, mais aussi de limiter l’apparition de mécanismes de résistance, une compréhension détaillée des interactions complexes entre l’hôte et le pathogène pendant l'infection est essentielle. Ceci est particulièrement important au niveau des abcès car ils sont les principaux contributeurs à la pathogénicité du staphylocoque doré. En effet, il s’agit de réservoirs difficilement accesibles aux antibiotiques qui favorisent les infections chroniques chez l'Homme. Cette étude permettra donc d’établir une base solide pour le développement de nouveaux antibiotiques ciblés.

Procédures

Un groupe subira une injection intraveineuse sous anesthésie d'une durée de 5 minutes. Un autre groupe subira une injection sous la peau sous anesthésie d'une durée de 5 minutes puis 1 à 3 anesthésies d'une durée de 15 minutes pour suivre le processus infectieux.

Impact sur les animaux

Lorsque les souris sont infectées par cette bactérie, elles peuvent ressentir une certaine douleur lors de l'injection. Toutefois, cette procédure sera effectuée sous anesthésie. En raison de l'infection générale, les souris peuvent souffrir d'une perte de poids significative, d'une baisse d'activité et d'hyperthermie, voire d'hypothermie dans une phase très avancée de l'infection. Lorsque les bactéries sont injectées sous la peau, une petite lésion cutanée se forme dans les 24 premières heures en raison de la réponse immunitaire de la souris. Au bout de 3 jours, la lésion est beaucoup plus grande, et une plaie se forme. Les souris peuvent potentiellement montrer une baisse d'activité et avoir une plaie purulente à partir du 3ème jour après l'infection.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus/organes requis pour le projet.

Remplacement

L'utilisation d'un modèle animal telle que la souris est essentielle pour étudier les facteurs impliqués dans le combat entre le staphylocoque doré et l'hôte. En effet, la souris présente une réponse immunitaire bien caractérisée et proche de celle de l’Homme. Comme cette réponse implique l'action coordonnée de différents types de cellules de l’hôte, elle ne peut être étudiée qu’au sein de l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit autant que possible tout en conservant un nombre suffisant pour une analyse fiable. L'utilisation de chaque animal sera optimisée en réalisant différents types d'analyses sur un même animal. Une étude pilote sera menée pour déterminer le nombre de cellules infectées obtenues par souris, afin d'utiliser le plus petit nombre possible d'animaux.

Raffinement

Le projet a été conçu en intégrant des mesures pour réduire le stress et, si possible, la souffrance des animaux. Une période d'acclimatation de 2 semaines est observée avant le début des expériences. De plus, les animaux seront logés en petits groupes d'individus compatibles dans des conditions contrôlées. Des méthodes pour réduire certains des effets du stress (objets de cellulose pour la nidification ou la mastication) seront mises en place sans toutefois interférer avec le déroulement de l'infection. Les animaux seront préalablement habitués à être manipulés dans un tunnel transparent afin de réduire leur stress. L'inoculation bactérienne sera effectuée sous anesthésie générale. Des points limites ont été établis pour soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris femelles agées de 7 et 10 semaines, modèle utilisé communément dans la littérature. Ceci permettra de comparer nos résultats aux études déjà réalisées. Le modèle d'infection des souris par le staphylocoque doré a été largement étudié et montre des signes similaires de maladie comparés aux infections humaines. Lorsque les humains contractent une infection grave à staphylocoques, ils peuvent avoir notamment des bactéries dans le sang et une formation d’abcès dans de nombreux organes. Ainsi, comme nous étudions la réponse immunitaire de l'hôte après une infection à staphylocoques, il est utile d'utiliser un modèle qui ressemble le plus possible au système immunitaire humain.

165 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent, sous anesthésie, des séances d'imagerie, une mesure de pression par une aiguille insérée jusque dans le ventricule droit, et une stimulation cardiaque destinée à déclencher des arythmies, une partie étant en plus placée trois semaines en atmosphère appauvrie en oxygène. Le porteur indique que cette stimulation peut provoquer une fibrillation ou une tachycardie ventriculaire et le décès de certains animaux, et que l'hypoxie entraîne une baisse d'activité et une perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que l'étude chez l'animal est "essentielle" et "ne peut être remplacée", un seul patient porteur du déficit ayant été identifié.

Objectifs

Les arythmies ventriculaires, correspondant à un défaut de contraction des ventricules, est la forme d’arythmie la plus mortelle. En effet, elle représente la moitié des décès d’origine cardiaque et environ 30 % des décès totaux en France. Ces arythmies résultent principalement d’un dysfonctionnement acquis ou inné de protéines exprimées dans les cellules du cœur appelées canaux ioniques. Des arythmies provenant du ventricule droit hypertrophié/dilaté sont décrites chez les patients souffrant d’hypertension pulmonaire et notamment dans le contexte de maladies hypoxémiantes qui peuvent être liées à la pollution. A travers ce projet, nous proposons d’étudier le rôle que pourrait jouer le canal ionique TREK1 dans ces arythmies, à l’aide d’un modèle de souris dans lequel son expression a été invalidée. Sa sensibilité à l’étirement en fait une cible particulièrement attractive dans le ventricule droit étiré suite à une hypertension pulmonaire. Une meilleure connaissance du rôle physiopathologique des canaux ioniques, ici TREK1, permettra de mieux appréhender le mécanisme de déclenchement des arythmies ventriculaires et d’adopter des stratégies thérapeutiques plus efficaces dans le contexte des pathologies du ventricule droit.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction contractile, l’activité électrique cardiaque mais surtout dans le déclenchement d’arythmies au niveau du ventricule droit, région du cœur dans laquelle il est fortement exprimé. Ce projet est renforcé par une approche expérimentale multi-niveaux : -Celui de l’animal (ECG/IRM/stimulation transoesophagienne), -Celui de l’organe (cartographie optique), -Celui du tissu (histologie), -Celui de la cellule cardiaque, de la cellule musculaire lisse -Celui de la protéine/de l’ARNm Ce projet permettra une meilleure compréhension du rôle du canal TREK1 et par conséquent de mieux appréhender le(s) mécanisme(s) de déclenchement des arythmies ventriculaires qui peuvent conduire à la mort subite. Des stratégies thérapeutiques visant TREK1 pourraient alors s’avérer efficaces dans le traitement d’arythmies ventriculaires chez l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à deux types d’interventions non invasives sous anesthésie générale puis une mesure invasive avant euthanasie: • Examens d’imagerie par IRM non invasif (environ 1h30) • Enregistrement ECG non invasif (environ 15 min) • Mesure de pression intraventriculaire droite invasive (20 min) Ces trois expérimentations seront réalisées sur 80 animaux répartis en 2 conditions : • Milieu normal: 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 • Milieu appauvri en oxygène : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 (3 semaines). Un autre groupe d’animaux sera aussi soumis à une intervention invasive sous anesthésie générale, la stimulation cardiaque transoesophagienne (environ 15 min). Cette intervention sera réalisée sur 80 animaux répartis en 2 conditions : • Milieu normal : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 • Milieu appauvri en oxygène : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1. Les trois procédures seront réalisées une seule fois sur chaque animal.

Impact sur les animaux

Les anesthésies répétées lors des différentes procédures du projet peuvent induire des effets indésirables. Elles seront espacées au minimum de deux jours et une surveillance accrue aura lieu lors du réveil de l'animal (signes de désorientation, apathie). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux et liés aux différentes techniques utilisées sont principalement de classe modérée : • Imagerie à résonance magnétique, Electrocardiogramme et mesure de pression au niveau du ventricule droit: anesthésie générale pouvant entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. •Mesure de pression au niveau du ventricule droit : geste invasif avec une incision de la couche musculaire au niveau de l’abdomen en dessous du diaphragme et insertion d’une aiguille fine reliée à un capteur de pression à travers celui-ci jusque dans le ventricule droit. •L’hypertension pulmonaire n’induit pas de souffrances élevées chez l’homme mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. •Lors de l’exposition à l’hypoxie dans un caisson, un stress est généré aux souris se traduisant par une baisse d’activité et d’appétit dans les premiers jours (perte de poids de 5 à 10%) avant un retour à la normale. •L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation des ventricules pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin des procédures et le cœur sera prélevé pour réaliser la cartographie optique sur cœur isolé, les études histologiques ou les études électrophysiologiques et de biologie moléculaire sur cardiomyocytes isolés.

Remplacement

Il est connu que TREK1 est exprimé dans le cœur et impliqué dans une pathologie cardiaque, la tachycardie ventriculaire. A ce jour, un seul patient avec un déficit en TREK1 au niveau du cœur a été identifié empêchant l’étude du rôle de ce dernier dans l’activité électrique du cœur chez l’Homme. L’utilisation d’animaux sains et déficitaire en TREK1 est donc la seule façon de répondre à cette question et de reproduire la situation pathologique présente chez l’Homme. Cette étude chez l’animal est donc essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Le caractère non invasif de l’électrocardiogramme et de l’imagerie à résonance magnétique permettra de réaliser d’autres expériences telles que les mesures de pression au niveau du ventricule droit mais aussi l’étude à l’échelle du cœur entier ou de la cellule cardiaque sur les mêmes animaux. Ce projet permettra d’évaluer avec fiabilité le rôle du canal TREK1 dans l’activité du cœur ainsi que dans les arythmies du ventricule droit. Dans ce projet, 160 souris sont prévues et réparties dans les 2 conditions suivantes (2 groupes avec n=80/groupe): - Normoxie: (milieu avec un taux d’oxygène normal) 40 Wild-type: •20 stimulation transoesophagienne •20 imagerie à résonance magnétique / électrocardiogramme / pression ventricule droit 40 Knock-out: •20 stimulation transoesophagienne •20 imagerie à résonance magnétique / électrocardiogramme / pression ventricule droit -Hypoxie: (milieu appauvti en oxygène). Le nombre d’animaux est répartit comme la condition Normoxie. A ça s’ajoute 5 souris supplémentaires utilisées pour la formation d’un expérimentateur à la stimulation transoesophagienne au début de l’étude. Concernant la partie sur l’animal entier, 5 échecs par groupe sont considérés pour chaque protocole (imagerie à résonance magnétique, électrocardiogramme, stimulation transoesophagienne et pression ventricule droit) pour les motifs suivants : - Arrêt de l’examen pour le bien-être animal - Valeurs aberrantes des données collectées - Mort de l’animal. Concernant la partie sur cœur entier, les animaux sont divisés en 3 : imagerie sur cœur entier (15 animaux par groupe), mesure de l’activité électrique sur cellules cardiaques isolées (50 animaux par groupe) et biologie moléculaire/histologie (15 animaux par groupe). De manière similaire à la partie sur l’ animal entier, des échecs (3 pour l’imagerie optique et la biologie moléculaire/histologie et 5 pour la mesure de l’activité électrique sur cellules cardiaques isolées) sont considérés pour les motifs suivants : - Ischémie du cœur isolé - Mort des cellules cardiaques après isolement - Valeurs aberrantes des données collectées. Une analyse descriptive (moyenne, percentile, écart standard de la moyenne) sera effectuée ainsi que la vérification que chaque groupe suit la loi normale (test de Shapiro-Wilk). Dans le cas attendu que les données collectées ne suivent pas la loi normale (échantillon de n

Raffinement

Les mesures de RAFFINEMENT sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adapté). Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés quand nécessaire et des points limites seront déterminés afin de réduire la souffrance et/ou d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse. L’atteinte d’un point limite entraîne une ou plusieurs des actions suivantes : • Augmentation des fréquences d’observation des animaux : mise en place d’un suivi deux fois par jour (visites, signes cliniques relevés). • En cas de perte de poids, du gel diet riche en énergie ou des pellets humides seront mis à disposition. Si l’animal est hébergé en groupe, il sera isolé en cage individuelle afin de pouvoir contrôler son alimentation et son hydratation. • En cas de perte de poids continue (entre 10% et 20%), une surveillance accrue sera effectuée et les soins renforcés. En cas de perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal enregistré pour cet animal et pour une durée de 48 heures, l’animal sera mis à mort immédiatement sur décision du responsable du projet et/ou du vétérinaire désigné. • En cas de réduction de la mobilité, des pellets humides seront mis à disposition. • En cas de plaies, des soins seront administrés (désinfection avec un antiseptique, nettoyage de la plaie). • En cas de persistance du pli cutané, une réhydratation sera mise en place (injection intraperitonéale de NaCl 0.9% tiède, gel diet). L’animal sera isolé en cage individuelle afin de pouvoir contrôler sa réhydratation. Tout constat d’un mal-être est remonté au responsable du projet et au vétérinaire délégué pour des examens approfondis et traitements adaptés. Si la douleur, la souffrance et l’angoisse ne pouvaient être réduites à leur minimum, une décision d’interruption d’expérimentation sera prise.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces classiquement utilisées pour étudier les effets de la suppression d’un gène d’intérêt. Dans ce projet, il s’agit d’un modèle de souris n’exprimant plus le canal ionique TREK1 et qui a l’avantage d’avoir été déjà utilisé à des fins de recherche scientifique. L’activité électrique cardiaque variant en post-natal et jusqu’à l’adolescence, nous travaillerons sur des souris adultes de 15 semaines. Ce modèle de rongeurs va permettre de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction du cœur mais également dans le dysfonctionnement électrique et mécanique du cœur par ECG, IRM et stimulation transoesophagienne (S.T). Les résultats obtenus dans ce projet pourront être transposés chez l’Homme et ainsi permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant directement TREK1.

80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 64 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 16 un niveau modéré. Elles subissent une injection cérébrale par chirurgie stéréotaxique pour inactiver un noyau, et pour la plupart la pose d'un cathéter dans la veine porte par une seconde chirurgie, avec mesures de glycémie et prélèvements avant la mise à mort. Le projet cherche à savoir si ce noyau cérébral est "nécessaire" à l'effet coupe-faim du glucose produit par l'intestin. Le porteur indique utiliser des animaux de réforme pour la mise au point et affirme que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être remplacée par des cellules ou des organoïdes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de sucre (glucose) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. L’intestin est en effet capable de produire du glucose en dehors des repas dans une veine spécifique (veine porte), située entre l’intestin et le foie. La détection de glucose dans cette veine après un repas induit un signal nerveux qui cible le cerveau, et qui en retour, va diminuer la taille du repas suivant. Ainsi, lorsque nous imitons la production de glucose par l’intestin en perfusant du glucose directement dans la veine porte, nous observons une diminution de la prise alimentaire associée à une activation de 3 régions du cerveau, connues pour contrôler la faim. Cependant, les études réalisées jusqu’alors ne permettent pas de déterminer si l’activation de chacun de ces 3 noyaux est nécessaire ou si elle est redondante pour les effets coupe-faim de la production intestinale de glucose. Un des noyaux impliqué dans ces effets coupe faim, est un centre important d’intégration des signaux provenant du système digestif et est connu pour moduler la prise alimentaire. Dans ce projet, nos objectifs sont de déterminer si l’activation de ce noyau est nécessaire à la mise en place de l’effet coupe-faim induit par la production intestinale de glucose. Pour cela, nous étudierons, sur une durée d’un an, si l’inactivation de ce noyau cérébral spécifique (par l’injection d’un virus directement dans le cerveau) annule les effets coupe-faim de la détection de glucose dans la veine porte.

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques sur l’obésité, le contrôle glycémique et l’accumulation de graisses dans le foie ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier précisément quelles régions du cerveau sont indispensables aux effets bénéfiques de la production intestinale de glucose. Ils s’intègrent dans une étude plus globale qui cherche à comprendre comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. A plus long terme, ces mécanismes pourraient représenter une cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

A l’âge de 12 semaines, certaines souris subiront : - une injection (5 secondes) d'un composé destiné à inactiver des neurones spécifiques, suivie de deux mesures de glycémie par prélèvement de sang à la queue (3 secondes chacune) et deux mesures de poids et de prise alimentaire sur 24h, puis 15 jours après, une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris, puis 15 jours après, une injection intrapéritonéale suivie d’une chirurgie sous anesthésie générale permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte d’une durée de 20 minutes/ souris (64 souris).

Impact sur les animaux

- L’injection peut entrainer une légère douleur au niveau de l’abdomen ainsi qu’un stress. Une attention particulière sera portée lors de l’injection pour éviter au maximum toute inflammation du péritoine. - Les interventions chirurgicales sont susceptibles de provoquer de la douleur. - L’injection du virus peut entrainer une faible réponse immunitaire localisée. - La chirurgie réalisée dans le cerveau peut entrainer des problèmes neuro-musculaires. - Au cours de la chirurgie, l’anesthésie gazeuse peut entrainer des difficultés respiratoires. - La chirurgie peut entrainer une hémorragie locale. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de raffinements spécifiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes et analyses des tissus. Le cerveau, le foie et les tissus gras seront étudiés pour déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques de la détection de glucose dans la veine porte préalablement observé sur ces tissus.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose dans la veine porte a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-dabiète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.

Réduction

La totalité des animaux utilisés dans la procédure de mise au point sont des animaux de réforme, systématiquement mis à mort en dehors de ce projet. Ainsi, l’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux spécifiquement pour cette expérience. De plus, certaines interventions seront mises en œuvre sur les animaux d'un même lot de façon à ne pas recourir à des animaux supplémentaires. Le nombre de souris utilisées pour l’expérience propre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 16 souris par groupe. De plus, différents tissus (foie, reins, tissus adipeux, pancréas, …) seront prélevés afin de déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques à court terme induit par le signal glucose portal dans ces tissus. Ces tissus pourront constituer une banque de tissus commune au laboratoire pouvant être utilisés par la suite pour d’autres problématiques relatives à la production intestinale de glucose, notamment en évaluant la stéatose hépatique et le brunissement du tissu adipeux. Au total, ce projet nécessitera au maximum 80 souris mâles.

Raffinement

Les souris seront accueillies à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Les souris seront hébergées en animalerie conventionnelle avec eau et nourriture ad libitum avec enrichissement. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisées et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Après les chirurgies, un suivi intensif est régulier sera réalisé tous les jours tout au long de l’expérience pour identifier et réduire d’éventuelles souffrances selon une grille de score spécifique. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points particuliers limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.

Choix des espèces

Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.