Procédures sévères

548 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque rat subit sous anesthésie une section du nerf sciatique ou du tendon d'Achille suivie d'une réparation, opération qui limite la mobilité de la patte. Le porteur indique que des automutilations et des abrasions du talon sont attendues et liées au modèle. Il teste des polymères anti-adhérences post-opératoires et affirme que les modèles ex vivo ne reproduisent pas les propriétés des "organes entiers".

Objectifs

La surface des tissus internes et des organes est naturellement structurée de façon à ce que les tissus n’adhèrent pas les uns aux autres. Lors d’une chirurgie ou d’une blessure, le traumatisme généré aux tissus va induire une réaction inflammatoire qui peut causer la formation d’adhérences anormales. Ces adhérences post-opératoires sont très fréquentes et sont observées dans plusieurs types de chirurgies : abdominales (90 pour cent de patients concernés), gynécologiques (60-90 pour cent), du tendon (30-40 pour cent), cardiaques (20 pour cent). Elles ont des conséquences délétères sur la qualité de vie du patient à court et long terme : elles limitent la mobilité des tissus concernés, peuvent engendrer de la douleur, voire des paralysies et des anomalies fonctionnelles (obstructions, occlusions, infertilité…). Bien que les techniques de chirurgie aient beaucoup évolué pour rendre la procédure moins traumatisante pour les tissus, les adhérences post-opératoires concernent globalement 1 patient sur 3. Le traitement des adhérences post-opératoires est lourd puisqu’il nécessite une nouvelle intervention chirurgicale ce qui, en plus de l’impact direct sur le patient, entraine des coûts importants pour les systèmes de santé et la société en raison des hospitalisations répétées et de la prise en charge des complications. Prévenir les adhérences post-opératoires est donc un véritable enjeu de santé publique et répond à un réel besoin clinique exprimé par les chirurgiens. Notre objectif est de développer des systèmes de réparation atraumatiques, sans sutures ni agrafes, qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales sont développés pour différentes applications de la réparation des nerfs périphériques aux hernies abdominales. Les formulations d’adhésifs et d’implants développées à ce jour ont démontré une efficacité pour restaurer la fonction de certains tissus avec une bonne biocompatibilité. L’objectif de la présente étude est maintenant de déterminer si nos systèmes de réparation peuvent également être efficaces dans la prévention des adhérences post-opératoires. Nous nous focaliserons sur des modèles, de réparation du tendon et du nerf sciatique.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de démontrer dans deux modèles précliniques différents un impact positif de nos systèmes de réparation sur la survenue des adhérences post-opératoires. Nos produits pourront ainsi fournir une solution aux chirurgiens dans la prévention de ces adhérences combinée à une réparation atraumatique et efficace des tissus déjà démontrée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie unique d’une durée de 30 minutes environ de lésion/réparation du nerf sciatique ou du tendon d’Achille effectuée sous anesthésie générale et locale ainsi qu’une prise en charge de la douleur pré et postopératoire. A la fin de la période de maintien prévue, ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

Les procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire. Les modèles vont nécessiter une transection du nerf sciatique ou du tendon d’Achille ce qui va limiter la mobilité des animaux au niveau de la patte opérée. Des automutilations et des abrasions du talon sont attendues et sont liées aux modèles.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer les adhérences post-opératoires.

Remplacement

De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les systèmes les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet in vivo consiste à caractériser l’impact de nos systèmes de réparation sur la survenue d’adhérences post-opératoires ou suite à une blessure. Il s’agit d’un mécanisme complexe faisant intervenir différents systèmes biologiques et qui nécessite de travailler sur un organisme intégré et autonome.

Réduction

Au maximum, 548 rats seront intégrés dans l’étude. Nos systèmes de réparation ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les systèmes les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=10 animaux exploitables par groupe). Une étape préliminaire de formation des opérateurs au geste chirurgical est prévue dans l’étude sur un nombre limité d’animaux (n=20). Les résultats seront également analysés par un test statistique.

Raffinement

Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées, à raison de 2 rats par cage, en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiquée par du personnel qualifié. Tous les actes techniques seront réalisés avec une anesthésie et/ou une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour évaluer la récupération de l’animal. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifiées seront déposés directement dans le fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot/cage). Des graines de tournesol seront également ajoutées à l’alimentation usuelle pour diversifier l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement et pesés 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie puis 1 fois par semaine. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance par la mise en place de points limites.

Choix des espèces

L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période minimale d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une craniotomie de soixante-dix minutes pour provoquer un accident vasculaire cérébral ischémique, puis des séances d'IRM et de microscopie sous anesthésie, afin d'étudier le rôle du tPA dans l'inflammation cérébrale. Le porteur indique qu'aucun animal n'est gardé vivant, jugeant impossible pour leur bien-être de réhabiliter des souris ayant subi un AVC. Il affirme que les techniques sans animaux "ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information".

Objectifs

Cette étude vise à comprendre l'implication de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans les processus inflammatoires qui surviennent lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, et notamment sur l'infiltration des neutrophiles du compartiment vasculaire vers le tissu cérébral. Des études précédentes montrent que l'utilisation de rtPA (Actilyse) pour induire une reperfusion du tissu cérébral peut moduler en parralèle l'infiltration des neutrophiles dans le tissu cérébrale. La contribution du rtPA dans ces mécanismes inflammatoires reste à déterminer. L'objectif de notre projet est de comprendre les effets du rtPA sur l'inflammation cérébrale à la suite d'un AVC ischémique. Afin de représenter les différentes situations qui se produisent en clinique, nous étudierons les effets de la thrombolyse par rtPA sur deux modèles murins d'AVC ischémique : un modèle thromembolique où l'injection i.v. de rtPA permet la reperfusion du tissu cérébrale et un modèle thrombotique où l'injection de rtPA est inefficace sur la reperfusion. De plus nous allons étudier l'impact de la thrombolyse par le rtPA sur la réponse inflammatoire dans le contexte d'une thrombolyse précose et tardive afin de mimer les differents contextes possibles en clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances de l'impact du rtPA sur l'inflammation cérébrale et ainsi nous permettra de proposer de nouvelles pistes pour de potentielles stratégies thérapeutiques en combinaison de la thrombolyse par rtPA.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale d’une durée totale de 41 minutes par animal et par temps, et à des acquisitions par microscopie biphotonique pour une durée de 1 heure par souris à chaque temps.

Impact sur les animaux

Afin de limiter toutes douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgésique lors du protocol chirurgical. Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite de la chirurgie. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n = 5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).

Devenir

Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (144) seront mis à mort. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subit une procédure sévère telle qu’un AVC ischémique.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 120 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total :144) a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les animaux recevront une injection sous cutanée de Buprénorphine (0,1 mg/kg, 200 μL) pour prévenir toute douleur occasionnée par la procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le reveil des animaux à l'issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quantà la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est controlée et adaptée au bien être des animaux.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée dans la littérature pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale. Les souris transgéniques Catchup utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l’étude de la neuroinflammation et des AVC. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude. Pour ce projet, nous utiliserons des mâles et des femelles. Nous avons fait le choix d'introduire la variabilité liée au sexe afin d'obtenir des résultats plus représentatifs de la clinique (hommes et femmes touchés par la pathologie). En effet, il existe des différences physiologiques du fait des variations hormonales, notamment au niveau cérébral, nécessitant une adaptation dans les traitements des AVC et dans d'autres pathologies. La prise en compte du sexe comme une variable biologique et expérimentale dans les études pré-cliniques est essentielle pour augmenter les chances d'obtenir les mêmes observations lors de la translation en clinique, lorsqu'il s'agit de mettre en place un médicament, par exemple.

746 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit la section puis la réparation d'un nerf sous anesthésie et des mesures de conduction nerveuse par stimulation électrique, pour tester des colles et implants censés prévenir les névromes après amputation. Le porteur indique que la section nerveuse affecte la mobilité de la patte opérée et provoque léthargie, douleur et perte de poids. Il affirme qu'un modèle mammifère est "essentiel" et que ces études ne peuvent se faire ni ex vivo ni in vitro, faute de reproduire un "organe entier".

Objectifs

La réparation tissulaire conventionnelle par chirurgie implique l’utilisation de sutures, d’agrafes ou autres techniques utilisant des points d’ancrage qui induisent un traumatisme supplémentaire au tissu. Ces techniques peuvent engendrer une inflammation et de la fibrose à l’origine d’effets délétères sur la réparation des tissus et sur la qualité de vie du patient. Ces techniques constituent pourtant, faute d’alternatives satisfaisantes, les méthodes de référence pour la réparation chirurgicale des tissus. Notre objectif est de développer des systèmes de réparation atraumatiques sans sutures qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales ont été développés pour différentes applications dont la réparation des nerfs périphériques et ont démontré une nette efficacité lors de précédentes études. Le but de ce présent projet est d’élargir l’indication de ces systèmes de réparation à des scénarios cliniques très spécifiques comme le traitement et la prévention de névrome notamment dans le cadre d’amputations. L’amputation concerne plus d’un million de patient par an à l’échelle mondiale, qu’elle soit liée à des traumatismes ou à des maladies chroniques comme le diabète ou le cancer. Après une amputation, il est fréquent que les nerfs sectionnés soient à l’origine : 1) du phénomène de douleur du membre fantôme qui correspond à des douleurs ressenties dans la partie du corps amputée. Ce phénomène affecte 95 pour cent des patients en postopératoire immédiat avec une persistance au long cours chez la moitié d’entre eux. 2) de la formation d’un névrome (48,7 pour cent des patients). Il s’agit d’une tumeur bégnine formée par des fibres nerveuses qui se sont développées de façon anarchique. Un névrome s’accompagne de douleurs fulgurantes et peut nécessiter une nouvelle intervention chirurgicale pour le retirer. En clinique, les chirurgiens utilisent la réinnervation musculaire ciblée pour traiter les nerfs lors d’une amputation pour prévenir l’apparition de névromes. Le but de ce projet est de valider in vivo l’efficacité de nos systèmes de réparation sur les nerfs dans un modèle de réinnervation musculaire ciblée chez le rat.

Bénéfices attendus

Si la régénération nerveuse est confirmée avec nos systèmes de réparation, une solution atraumatique pourra être proposée aux chirurgiens pour éviter l’apparition de névromes post-amputation sans créer de traumatismes supplémentaires aux tissus.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie unique d’une durée de 30 minutes environ de transection puis réparation du nerf, effectuée sous anesthésie générale gazeuse et locale associée à une prise en charge de la douleur pré et postopératoire. Nous évaluerons à trois reprises (avant, pendant et après la chirurgie) la conduction nerveuse par électrophysiologie (stimulation électrique des nerfs) sous anesthésie générale pour une durée de 20 à 40 minutes. A la fin de la période de maintien prévu, ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

Les procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire. Au cours de la chirurgie, des nerfs vont être sectionnés ce qui va impacter la mobilité de l’animal au niveau de la patte opérée. Le muscle n’étant que partiellement dénervé au cours de la chirurgie, l’impact sur la mobilité sera limité.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer l’efficacité de nos systèmes de réparation sur la régénération nerveuse.

Remplacement

De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les polymères et les designs les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet doit nous permettre d’évaluer une régénération nerveuse ce qui ne peut être fait que dans un individu intégré et autonome.

Réduction

Au maximum, 746 rats seront intégrés dans l’étude. Nos dispositifs ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les implants et colles les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Au cours de l’étude les résultats intermédiaires seront analysés et pourront permettre d’écarter d’autres designs ou des temps de suivi tardifs. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=10 animaux par groupe). Les résultats seront également analysés par un test statistique.

Raffinement

Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées (2 rats/cage), en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois et aliments à volonté. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. Les gestes expérimentaux seront pratiqués par du personnel qualifié avec une anesthésie et une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée avant la chirurgie puis 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour évaluer la récupération de l’animal puis 1 fois/semaine. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifiées seront déposés directement dans le fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot par cage). Des graines de tournesol seront également ajoutées à l’alimentation usuelle pour diversifier l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance par la mise en place de points limites. Le scoring sera effectué 1 fois par semaine et servira de support au suivi quotidien des animaux tout au long de l’étude.

Choix des espèces

L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin, d’autant plus que nous travaillerons sur des nerfs. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période d’acclimatation minimale de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement ce qui est très important pour les temps de suivi tardifs de notre étude.

2062 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles subissent des blessures cutanées créées par biopsies au dos, des greffes posées à l'aide d'un punch, des injections et le port d'une attelle, pour étudier le potentiel régénératif d'une sous-population de cellules souches de la peau. Le porteur indique que ces atteintes provoquent une douleur limitée par des antidouleurs et une gêne au déplacement. Il affirme que le processus de cicatrisation "ne peut donc pas être réalisé in vitro", la peau restant impossible à reconstituer dans sa complexité.

Objectifs

Les mécanismes de régénération chez les mammifères adultes représentent un enjeu de santé publique majeur. En effet, lors d’une blessure cutanée la réponse par défaut est une réparation rapide de la barrière avec défaut de formation des annexes. La cicatrice est donc un marqueur de la réparation restaurant la seule fonction de barrière. La régénération qui se produit au cours de la vie restaure elle toutes les fonctions cutanées (sensorielles, thermorégulatrices etc…). La compréhension des mécanismes fondamentaux qui régissent la régénération par opposition aux mécanismes de réparation représente de nouvelles perspectives de thérapies régénératives dans le cadre du traitement des grands brulés et des blessures chroniques. L’épiderme constitue un modèle de choix afin d’étudier ces processus. En effet, l’épiderme se régénère tout au long de la vie grâce à la présence de cellules souches (bien caractérisées et très hétérogènes) en son sein et se répare après blessure avec formation d’un épiderme dépourvu d’annexes (c’est à dire sans follicule pileux ni glande sébacée) grâce à la participation de ces mêmes cellules souches. Ce projet concerne l’étude du potentiel régénératif d’une sous population de ces cellules souches de l’épiderme. Nous avons identifié au laboratoire une sous population cachée qui pourrait constituer un réservoir régénérateur. Pour l’étudier, nous combinerons des modèles de traçage génétique à des tests de cicatrisation et de greffes permettant d’évaluer le potentiel régénératif des cellules souches d’intérêt.

Bénéfices attendus

L’identification d’une sous population au potentiel régénératif puissant ouvrant des nouvelles perspectives thérapeutiques en médecine régénérative pour les grands brulés et les patients souffrant de blessures chroniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie afin de créer des blessures dorsales par biopsies, la durée de la chirurgie sera de 7 à 10 minutes par souris. Les souris recevront aussi des injections sous cutanées d’analgésiques ou de composants pharmacologiques au cours de l’anesthésie d'une durée de quelques secondes (2 ou 3 secondes). Les injections d’analgésiques sous cutanées seront poursuivies les 3 jours suivant la chirurgie.

Impact sur les animaux

Toutes les procédures sont de classe sévère mais réalisées sur des animaux à phénotype non dommageable. Les biopsies cutanées représentent une atteinte à l’intégrité de l’animal toutefois la cicatrisation est un mécanisme rapide donc la douleur est limitée. Les animaux recevront des antidouleurs afin de limiter la souffrance pour les 3 jours qui suivent la blessure. L’attelle ralentit le processus de cicatrisation en limitant la contraction dermique mais ne produit pas d’autres effets. Pour ce qui concerne les grandes blessures, des pansements seront positionnés et changés tous les jours pendant 5 jours. Cette période peut entrainer la gêne du déplacement et éventuellement des démangeaisons. En ce qui concerne les expériences de greffes, la nuisance attendue est comparable aux autres procédures de cicatrisation car la nuisance repose sur le punch réalisé pour implanter la chambre de greffe et qui fait lui aussi l’objet d’une injection d’analgésique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les échantillons et réaliser les analyses histologiques nécéssaires à l'analyse des résultats.

Remplacement

Le processus de cicatrisation nécessite tous les compartiments cutanés et ne peut donc pas être réalisé in vitro car il est aujourd’hui impossible de reconstituer la peau dans sa complexité hypoderme/derme/épiderme.

Réduction

Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles, ce qui permet d’utiliser la totalité́ des animaux générés. Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs d'après des calculs de statistiques prédictives. Certaines parties de cette procédure pourront être annulées en fonction des résultats obtenus. Il est donc fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inferieur à la fin du projet.

Raffinement

Les animaux seront traités avec un inducteur pharmacologique tous les deux jours afin d’éviter le dessèchement cutané car le traitement appliqué est resuspendu en éthanol absolu. De plus, après chirurgie, les animaux seront rassemblés en accordance avec leur genre. Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en œuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé́ ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluations indiquées. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnement enrichi (maisonnettes et buchettes). Lorsque les souris sont isolées nous veillerons à ce que l'enrichissement (buchettes, maisonettes, patchs de coton) soit bien présent dans la cage d'hebergement.

Choix des espèces

Nous utiliserons des modèles murins car ils sont plus simples à manipuler que d’autres modèles cutanés tels que les mini-cochons. De plus, les modèles murins génétiquement modifiées permettent de réaliser des expériences de traçage génétique qui donnent un accès unique au devenir des cellules au cours de processus intégrés et complexes dans un contexte in vivo. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines. Ainsi nous utiliserons des souris adultes mais en phase de repos pour l’activation des cellules souches du follicule pileux. De plus, dans la procédure 7 nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines mais aussi des souris à P2 (soit des souriceaux agés de 2 jours Post natal jour2=P2) afin d’utiliser leur potentiel morphogénique puissant. Nous utiliserons des mâles et des femelles au cours de ces procédures. Notre expérience dans le domaine cutané nous a permis de déterminer que le genre à cet âge-là n’influence pas la réponse et le potentiel des cellules souches épidermiques.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la tuberculose par voie nasale, reçoivent dix injections sur animal vigile, puis subissent une chirurgie suivie de deux à six heures de microscopie sous anesthésie, séance dont elles ne se réveillent pas. Le porteur indique que l'infection provoque une inflammation pulmonaire et que la chirurgie expose à l'hypothermie et à la déshydratation. Il affirme qu'un "organisme biologique complexe" doit être utilisé et que la souris est ici le "modèle de choix".

Objectifs

La tuberculose, causée par l’infection respiratoire de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, est la deuxième pathologie infectieuse la plus meurtrière après la COVID-19. L’apparition de bactéries résistantes aux traitements antibiotiques existants rend essentiel la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Une population de cellules neuronales dans les poumons au cours de l’infection par Mycobacterium tuberculosis a récemment été découverte. Des cellules similaires à celles identifiées dans les poumons ont été décrites dans les tumeurs de prostate. Dans ce contexte, il a été montré que ces cellules neuronales dans les tumeurs dérivent de cellules souches provenant du cerveau ; elles sont associées à une plus grande mortalité des patients. Ces cellules neuronales sont donc de potentielles cibles thérapeutiques dans le cadre du cancer. L'objectif de ce projet est de mieux caractériser cette population en observant son comportement dans l’environnement pulmonaire en utilisant une technique de chirurgie et de microscopie intravitale permettant d’observer les cellules directement dans le tissu. Ces informations sont essentielles pour déterminer si ces cellules sont des cibles thérapeutiques intéressantes dans le contexte de la tuberculose.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de : (i) caractériser la dynamique des cellules neuronales induites par la tuberculose dans leur environnement pulmonaire in vivo ; (ii) déterminer si ces cellules intéragissent directement avec Mycobacterium tuberculosis ou avec les cellules immunitaires ; et (iii) déterminer si cette nouvelle population de cellules neuronales est une cible thérapeutique intéressante pour traiter la tuberculose.

Procédures

Les souris recevront 10 injections sur animaux vigiles, d’une durée inférieure à 2 minutes par injection. Cela correspond à deux injections quotidiennes sur une période de 5 jours. Les souris seront également anesthésiées/analgésiées une fois pendant 1h pour être infectées par voie nasale (durée d’environ 30 secondes), et une fois pendant maximum 6 heures 30 pendant lesquelles nous réaliserons une injection (durée d’environ 30 secondes), une chirurgie pendant 30 minutes et de la microscopie pendant 2 à 6 heures.

Impact sur les animaux

Un stress modéré éventuel pourra être engendré par la préhension et la contention afin de procéder aux injections (durée de la contention et de l’injection inférieure à 2 minutes par injection). Une sensibilité locale au niveau de la zone des injections pourrait être observée. Les principaux effets indésirables causés aux animaux résideront dans l'inflammation causée par les bactéries et la pathologie résultant de l'infection (aux points les plus tardifs). De légères altérations de l’aspect (état corporel, pelage) peuvent être observés en fin d’étude ainsi que des légères altérations de la respiration et du comportement (posture et mobilité). Lors de la chirurgie, les souris présentent un faible risque d’hypothermie, de déshydratation et d'assèchement des yeux qui peuvent survenir pendant les 2 à 6 heures d'imagerie.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront mises à mort à la fin des procédures car la chirurgie est trop invasive et qu’il est impossible de les réveiller.

Remplacement

Afin de mieux comprendre l’interaction entre le système nerveux et le système immunitaire, un organisme biologique complexe doit être utilisé. Des échantillons de patients infectés et de primates non-humains ont d'abord été utilisé mais pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, le projet nécessite l’utilisation de souris vivantes.

Réduction

L'expertise dans l’utilisation de modèles animaux d’infection par Mycobacterium tuberculosis et l’expérience des années précédentes ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des tests d’injection de différents anticorps ciblant les différentes cellules immunitaires ont été prévus pour étudier leurs interactions avec les cellules neuronales pulmonaires, mais si les interactions ne sont pas observées alors certains anticorps ne seront rapidement plus utilisés. Si les observations étaient reproduites sur trois animaux, alors le nombre d’animaux par lot serait réduit.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés au minimum pendant les 5 jours précédents l’expérience. Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. - Les instillations de bactéries seront réalisées sous anesthésie générale fixe. - Les injections rétro-orbitales seront réalisées sous anesthésie locale et générale fixe. - Les souris infectées par Mycobacterium tuberculosis seront monitorées quotidiennement. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort. - Pour la chirurgie (microscopie intravitale), seront utilisés un analgésiant, un anesthésique local, un anesthésique fixe puis un anesthésique gazeux. La température corporelle et l’hydratation des animaux seront maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. Du gel sera appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement.

Choix des espèces

Pour notre projet visant à observer la dynamique d’une population de cellules neuronales dans les poumons in vivo par une technique de chirugie et de microscopie sur poumons vivants, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques et de la variabilité de résistance à la pathologie, ii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables, et iii) de protocoles de chirugie déjà mis en place et standardisés pour la microscopie du poumon. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature pour étudier la réponse immunitaire à Mycobacterium tuberculosis.

4880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont tatouées aux doigts et biopsiées à l'oreille sur animal vigile, soumises à un régime gras et sucré pendant 24 semaines, à une infection par Escherichia coli, à un isolement prolongé et à des séances d'activité physique sur roue ou tapis, pour étudier l'interaction de ces facteurs dans la maladie de Crohn. Le prélèvement de tissu intestinal impose leur mise à mort. Sur le remplacement, le porteur se borne à affirmer que "le recours à l'expérimentation animale est donc nécessaire".

Objectifs

La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin incurable ce jour. Les traitements actuels visent à limiter l’inflammation. Des recherches sont donc nécessaires afin de mieux connaitre la physiopathologie de la MC, de manière à pouvoir proposer de nouveaux traitements. Une des difficultés de cette maladie est son caractère multifactoriel faisant intervenir des facteurs génétiques, environnementaux et microbiens. La plupart des études in vivo se focalisent sur un de ces facteurs. Ici, nous nous proposons de les combiner de manière à mieux comprendre cette pathologie. Nous nous intéresserons à des facteurs très fortement suspectés de jouer un rôle clef dans la MC ; à savoir : 1- Le régime alimentaire : les études épidémiologiques ont clairement montré qu’un mode de vie « occidental » et notamment le régime alimentaire était impliqué dans l’apparition/le développement de la MC. Nous utiliserons un régime riche en gras et en sucre (HF/HS, pour « high fat/high sugar ») pour mimer ce facteur. 2- Les facteurs microbiens : de plus en plus d’études montrent que la composition de la flore intestinale des patients est perturbée. Parmi les modifications majeures, il est clairement établi que les malades présentent associés à leur muqueuse intestinale des bactéries appelées Escherichia coli. Les souris seront infectées par un E. coli de référence isolé d'un patient ou par un E. coli commensal, c’est-à-dire un E. coli non pathogène retrouvé normalement dans toutes les flores intestinales ou enfin par un E. coli de laboratoire. 3- L’autophagie : de nombreux gènes sont retrouvés mutés chez les patients souffrant de MC. Parmi eux, de nombreux gènes impliqués dans l’autophagie. L’autophagie est un processus permettant la dégradation de protéines mal repliées, d’organelles non fonctionnelles. Plus récemment il a été montré que ce processus permettait de contrôler la prolifération des E. coli isolés de patients souffrants de la MC. Nous utiliserons des animaux déficients pour l’autophagie ou des souris génétiquement non altérées (souris contrôles). Ces dernières années, l’activité physique a été montrée comme pouvant impacter fortement l’évolution des maladies chroniques. Nous évaluerons également l’impact de l’activité physique dans notre modèle. L’ensemble du projet permettra de mieux comprendre l’impact croisé des facteurs génétiques, du régime alimentaire, des facteurs microbiens ainsi que de l’activité physique dans la maladie de Crohn.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre l'interrelation entre les facteurs génétiques/bactériens/alimentaires dans la maladie de Crohn. Il permettra également de mettre en lumière l’effet bénéfique éventuel de l’activité physique dans cette pathologie (élimination des bactéries, restauration de la réponse autophagique entre autres).

Procédures

Tous les animaux seront identifiés par un tatouage sur les doigts des pattes de manière à les identifier. Cette manipulation ne prend pas plus de 20 secondes. Une biopsie d'oreille sera prélevée de manière à effectuer le génotypage. Cette manipulation ne prend pas plus de 20 secondes. Ces 2 interventions se feront sur animaux vigiles âgés de 20 jours maximum. L’activité physique spontanée (sur roue) nécessitera de placer des animaux de manière prolongée (12 semaines) dans des cages isolées. L’activité physique sur tapis nécessitera l’isolement de l’animal (60 minutes) 4 fois par semaine pendant 12 semaines. A la fin de l’exercice physique, l’animal retrouvera ses congénères. Certains animaux seront gavés. Ce sera un gavage unique effectué sur animal vigile (la contention + le gavage ne prennent pas plus d’une vingtaine de seconde). Certains animaux seront nourris avec un régime riche en gras et en sucre pendant une période de 24 semaines.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ont été identifiées : (i) le tatouage/génotypage seront effectués sur des animaux vigiles (chaque acte ne prend pas plus de 20 secondes). (ii) Le traitement HF/HS va induire une prise de poids importante chez les animaux voire un état d’obésité (cela n'affectera pas le déplacement de l'animal ni sa capacité à se nourrir et à boire). Ce régime alimentaire durera 24 semaines. (iii) Les expériences d’activité physique sur roue nécessitent d’isoler les animaux dans une cage. L’isolement peut induire un stress car les souris sont des animaux grégaires. L'activité sur roue durera 12 semaines. (iv) Les expériences d'activité sur tapis nécessitent d'isoler l'animal le temps de l'exercice (60 minutes, 4 fois par semaine). Il sera ensuite replacé avec ses congénères dans la cage d'hébergement. L’activité sur tapis durera 12 semaines. (v) Les bactéries utilisées peuvent induire une très légère inflammation intestinale. (vi) L'infection nécessitera un gavage qui ne prendra qu'une trentaine de seconde (contention + gavage).

Devenir

Nos objectifs impliquent de collecter à la fin de chauqe procédure du tissu intestinal nécessitant de fait la mise à mort des animaux.

Remplacement

Le but de ce projet est de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie de Crohn et plus précisément l'impact de plusieurs facteurs (environnementaux, microbiens, génétiques, activité physique). Le recours à l'expérimentation animale est donc nécessaire.

Réduction

D'expérience, nous savons que les résultats de colonisation du tractus digestif par les bactéries et notamment les AIEC (des bactéries Escherichia coli capables d'adhérer et d'envahir les cellules hôtes et retrouvées à haute fréquence chez les patients souffrant de la maladie de Crohn, une inflammation chronique de l'intestin) présentent une grande variabilité, nécessitant un minimum de 10 animaux par lot pour pouvoir réaliser des études statistiques. Dans le cadre de la règle des 3R, un maximum de prélèvements sera réalisé sur les animaux de sorte que pour chaque souris nous collecterons le côlon, le petit intestin et le caecum afin d’y prélever des biopsies pour effectuer des analyses biochimiques et moléculaires.

Raffinement

Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en carton. Un suivi quotidien des animaux par des expérimentateurs habitués à ce modèle sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. De plus, nous utilisons un système de score (présenté en annexe) dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.

Choix des espèces

L’écrasante majorité des études in vivo portant sur la maladie de Crohn se font sur des souris. De plus, nous désirons étudier l’impact de la génétique dans cette maladie et la souris se prête parfaitement aux manipulations génétiques (nous possédons des souris invalidées dans la voie de l’autophagie soit dans les cellules épithéliales intestinales soit dans la lignée myéloïde : technologie flox/flox).

650 rats, des nouveau-nés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une ligature de la carotide suivie d'une hypoxie leur provoque des lésions cérébrales que le porteur reconnaît irréversibles, avant l'administration de lactate, des examens d'IRM sous anesthésie et des tests de réflexes, de mémoire et de dépression avec restriction alimentaire. L'objectif déclaré est d'évaluer des stratégies de neuroprotection contre l'hypoxie-ischémie du nouveau-né humain, dont un complément alimentaire pour la femme enceinte. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne remplace le cerveau "dans son intégrité" et renvoie au long terme l'application clinique.

Objectifs

L’hypoxie-ischémie néonatale est un problème de santé publique majeur tant par son occurrence (1-6 cas pour 1000 naissances) que par sa létalité et par les troubles cognitifs et/ou infirmités motrices qu’elle engendre. Elle est caractérisée par une diminution du flux sanguin cérébral au niveau du cerveau du nouveau-né. La seule thérapie actuellement appliquée est l'hypothermie thérapeutique modérée (diminution de la température corporelle de quelques degrés pendant 3 jours maximum), mais environ la moitié des nouveau-nés n’y répondent pas favorablement. Les objectifs de ce projet sont de développer des stratégies de neuroprotection dans le contexte de l'hypoxie-ischémie néonatale, sur un modèle de ratons. Pour répondre aux objectifs, les effets neuroprotecteurs du lactate (substrat énergétique neuronal, administré par voie intrapéritonéale) et de polyphénols (administrés dans l'eau de boisson de la mère) seront évalués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont : - le développement d’un complément alimentaire, riche en polyphénols, destiné à la femme enceinte pour prévenir les dommages induits par une hypoxie-ischéime néonatale - les résultats préliminaires de l'injection de lactate chez le rongeur permettront la mise en place d’une étude préclinique chez le porc, dont la physiologie est plus proche de l'humain. A long terme, cette neuroprotection de l’administration de lactate pourra être testée en clinique.

Procédures

Pour l'induction de l'hypoxie-ischémie, les animaux subiront une chirurgie puis une hypoxie. L'hypoxie-ischémie ser suivie par une hypothermie. Les animaux subiront une procédure chirurgicale (ligature de l'artère carotide commune ; réalisée une fois d'une durée inférieure à 10 minutes). Une hypothermie modérée sera mise en place à la sortie du caisson d'hypoxie-ischémie (1 fois, durée : 2 h). Une injection intra-péritonéale sera rélisée afin d'administrer le lactate (réalisée juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivant, durée : 2 s). Les animaux effectueront des examens par résonance magnétique nucléaire de diffusion sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (durée : 30 - 45 min). Ils effectueront aussi des examens par résonance magnétique nucléiare fonctionnelle sous anesthésie administrée en intra-veineux (1 fois, à 45 jours d'âge, durée : 2 h). La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements de réflexes précoces (durée : 5 min) et de mémoire (durée 10 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (durée : test échelonné sur 3 jours ; durée du test : 10 min).

Impact sur les animaux

Lors de précédents projets, il a été noté une perte de poids chez un faible nombre de ratons, dans les 48-72 h suivant l’hypoxie-ischémie. Dans le caisson d'hypoxie-ischémie, tout comme lors de l'hypothermie, des difficultés respiratoires pourraient subvenir. L'administraton de lactate par injection intrapéritonéale pourrait engendrer une légère douleur due à l'insertion de l'aiguille. La réponse à l'hypoxie-ischémie est variable d'un individu à l'autre : dans de rares cas, des lésions cérébrales importantes pourraient subvenir. Elles représenteront un point limite. Un stress lié à l'anesthésie durant l'IRM, une perturbation du rythme cardio respiratoire entraîneront un arrêt de la séance d'imagerie. Les tests comportementaux pourraient être vecteurs de stress pour les ratons. La restriction alimentaire associée à la mesure d'un état dépressif pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 130). L'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.

Remplacement

Des modèles d’hypoxie cellulaires existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de l’hypothermie et de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par (i) le fait que la compétence dans le modèle d’hypoxie-ischémie chez le rat est maîtrisée au laboratoire (pas de mise au point nécessaire), (ii) nous disposons de nombreux contrôles antérieurs (moins de contrôles à refaire), (iii) l'imagerie par résonance magnétique de diffusion ou fonctionnelle est une technique d’investigation non invasive et permet donc une suivi dans le temps des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux, (iv) l'utilisation d'outils statistiques.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie ; une injection d'analgésique locale sera réalisée avant l’incision et avant la suture. Les pertes de poids seront surveillées et à partir d'un certain point seront considérées comme atteignant un point limite. Des difficultés respiratoires post-opératoires entraîneront l'arrêt de la procédure. Les examens d'IRM seront réalisés sous anesthésie générale. Une modification du rythme cardiaque ou du rythme respiratoire entraînera l'arrêt de l'expérimentation. L'utilisation de gel ophtalmique durant les examens d'IRM préviendra le risque de sécheresse oculaire. L'IRM permet la quantification des volumes lésionnels.Le volume des lésions sera calculé, et au delà d'un certain pourcentage l'animal sera considéré comme atteignant un point limite. Une surveillance particulièrement accrue sera mise en place pour les 5 jours post-opératoires (couleur de la peau, estomac plein, mouvements, interactions avec la mère et les autres membres de la portée). Tous les tests de comportement seront réalisés par un unique expérimentateur, et dans une salle unique dédiée, permettant une habituation des animaux aux manipulations et à l’individu lui-même. Pour le test de dépression, nécessitant une privation de nourriture ponctuelle, la prostration de l’animal représentera un point limite. Au niveau de l’hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. Lors de ces observations quotidiennes, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés.

Choix des espèces

Le rat Wistar est utilisé depuis plusieurs années dans ce modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. Nous souhaitons suivre les animaux par IRM à 4 stades de développement: - sur des ratosns âgés de 7, 9 et 30 jours, par IRM de diffusion afin d'évaluer l'effet neuroprotecteur précoce des traitements administrés en phase aigüe de la pathologie (3 h et 48 h) et à 30 jours afin d’évaluer les effets neuroprotecteurs à long terme ; l’IRM fonctionnelle permettra, chez les ratons âgés de 50 jours d’évaluer les effets de la neuroprotection sur le remodelage des circuits neuronaux et la récupération fonctionnelle.