Procédures sévères

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine, des passages à l'IRM, pour certaines une injection de lymphocytes T, puis des tests comportementaux censés évaluer la fatigue et la dépression sans que les tests précis soient nommés, pour étudier le rôle des lymphocytes T après un AVC. Le porteur décrit surtout un affaiblissement transitoire d'une patte et un stress lié au bruit de l'IRM, peu de détails accompagnant une gravité pourtant qualifiée de sévère. Il affirme que les techniques de remplacement "ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information" et présente la souris comme l'espèce "la plus étudiée" pour ce sujet.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) est l'une des principales causes d'invalidité et de décès dans le monde. L’AVC ischémique (AI) représente environ 85% des AVC, il est majoritairement causé par une thrombose ou une embolie entrainant une diminution de l’afflux sanguin vers le cerveau. Peu après l'apparition de l'AI, des phénomènes d’hypoxie et inflammatoires entrainent une dégénérescence neuronale responsable de déficits à long terme. La majorité des études précliniques sur l’AI se sont concentrées sur des temps précoces et sur la mesure du volume de la lésion, définitif 24 à 48 heures après le début de l'AVC, comme critère d'évaluation principal. Cependant, l'AI peut être considéré comme une maladie chronique. En effet, les patients peuvent souffrir de séquelles des mois, voire des années après la phase aigüe. Ainsi, au moins 1/3 des survivants développent une dépression et une fatigue en post-AVC. L'origine de ces symptômes n'est pas claire et peut être difficile à traiter, ce qui en fait une priorité de la recherche sur l'AVC. Malgré cela, nos connaissances sur les phases subaiguës et chroniques de l'AI sont très limitées à ce jour. Il a été suggéré que la mise en place de la dépression et de la fatigue post-AVC pourrait être liée à la dérégulation de la réponse immunitaire. Des données récentes indiquent que les populations lymphocytaires T jouent un rôle dans la réparation et la régénération du tissu cérébral dans les semaines et les mois qui suivent l'AI. Ils peuvent également interagir avec la microglie et moduler la neurogénèse et l'angiogenèse post-AVC. Dans ce projet, nous nous intéresserons à la cinétique de la réponse T en post AVC, aux interactions des lymphocytes T avec la microglie ainsi que leur implication dans la survenue de séquelles à long terme. L'identification de mécanismes d'action des lymphocytes T en post-AVC pourrait permettre d'identifier de nouvelles stratégies d'immunomodulation permettant de lutter contre les séquelles à long terme.

Bénéfices attendus

L'identification de mécanismes d'action des lymphocytes T en post-AVC pourrait permettre d'identifier de nouvelles stratégies d'immunomodulation permettant de lutter contre les séquelles à long terme.

Procédures

Une partie des animaux feront l'objet d’une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de MPIO (Microparticules d'oxyde de fer) 24h avant l'induction de l'AVC (n=32, durée de la procédure : 15 minutes). Le modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine sera réalisé sur tous les animaux (n= 370, durée de la procédure : 1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=370, durée de la procédure : 15 minutes). Une partie des animaux (n=10) sera suivi en imagerie IRM à 48h, 7j, 15j, 30J post-AVC pour évaluer les lésions de la substance blanche (n=10, durée de la procédure : 20min). Une partie des animaux recevra une injection de lymphocytes T régulateurs en post-AVC (n=180, durée de la procédure : 15min) et les séquelles comportementales seront évaluées par des tests comportementaux évaluant la fatigue et la dépression (n=160, durée de la procédure : 2h). La totalité des animaux (n=370) sera mis à mort selon les préconisations réglementaires, des échantillons biologiques seront prélevés post-mortem pour analyse ultérieure.

Impact sur les animaux

Chirurgie : Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Imagerie : Certains animaux peuvent montrer des signes de stress lié à la nuisance sonore produite par l’IRM, une perte de masse corporelle après les anesthésies. Comportement : Certains animaux peuvent ressentir un stress durant la période d’habituation à la salle de comportement.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveaux pour analyses ultérieures.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans l'étude de la réponse immunitaire en post-AVC au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites adaptés fixés au préalable permettant de décider selon un arbre décisionnel les critères d'arrêt des souffrances. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires et en immunologie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Le sysème immunitaire L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des lymphocytes T et de la microglie dans les AVC ischémiques.

4 cochons vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Ils portent en continu un sac à dos de récepteurs, sont isolés pendant l'étude, subissent une chirurgie d'implantation de capteurs de glucose dans le péritoine et sous la peau, puis des injections de glucose et des prises de sang répétées sous anesthésie, pour évaluer un dispositif destiné aux personnes diabétiques. Le porteur indique que les animaux seront tués en fin de procédure pour leur éviter une douleur chronique liée à la chirurgie. Il justifie le recours au cochon par sa taille et son anatomie proches de celles de l'humain, et affirme qu'il n'est "pas possible" de reproduire artificiellement l'implantation.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans la prise en charge innovante du diabète de type 1, visant une restauration d'un taux normal de glucose dans le sang (glycémie) par une administration d’insuline adaptée au cours du temps. Des systèmes de mesure du glucose en continu (CGM) existent déjà mais évaluent la concentration de glucose dans le liquide interstitiel et non le taux de glucose dans le sang, entraînant un décalage temporel dans l’ajustement de la dose d’insuline à délivrer. Notre projet vise l’élaboration d’un système d’insulinothérapie automatisée implanté dans la cavité abdominale (péritoine) pour le traitement du diabète. La partie du projet concernée par ce travail expérimental est d’étudier la faisabilité de l’implantation du capteur de CGM dans le péritoine, et de vérifier l’exactitude de la mesure du glucose par ce capteur intrapéritonéal, par rapport au glucose mesuré dans le sang d’une part et par rapport au glucose mesuré sous la peau de l’abdomen d’autre part. La mesure du glucose intrapéritonéal présente un intérêt plus important que la mesure du glucose interstitiel sous-cutané. En effet, la vitesse de variation du glucose intra-péritonéal est plus rapide que la variation du glucose sous-cutané lorsque que le taux de glucose sanguin varie. Il est aussi établi que l’insuline délivrée dans le péritoine est plus vite absorbée et que son action est plus rapide que la perfusion sous-cutanée. Ainsi, la combinaison d’une détection plus rapide des variations glycémiques et d’une adaptation plus rapide de l’action de l’insuline ferait du système un dispositif actif plus physiologique que les pompes actuelles.

Bénéfices attendus

La démonstration de la faisabilité de l’implantation d’un capteur de glucose intra-péritonéal, et de sa capacité à mesurer avec exactitude et de façon plus rapide et durable les variations glycémiques, permettrait d’envisager la mise à disposition aux personnes atteintes de diabète d’un dispositif implantable de capture des mouvements glycémiques, idéal pour asservir la délivrance d’insuline de façon proche de la physiologie, et réduire ainsi les écarts hyper- et hypoglycémiques.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, l'étude durera 9 jours au cours desquels les animaux seront opérés pour implanter les capteurs de mesure du glucose (2h maximum d'intervention), puis ils seront anesthésiés 2 jours et 9 jours après l'opération pour réaliser des mesures dans le sang (1 heure d'intervention à chaque fois). Ainsi, à J2 et à J9, 3 injections intraveineuses de 2, 4 et 8 ml d’une solution de glucose à 50 mg/ml seront réalisées à 20 minutes d’écart, puis des prises de sang seront réalisées toutes les 2 minutes sur 3 fois 20 minutes. Tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale associée à des anti-douleurs.

Impact sur les animaux

Au cours de cette procédure expérimentale, deux types de nuisances pour l'animal sont identifiés. D'une part les animaux seront équipés en continue d'un sac à dos contenant des récepteurs de signal, mais qui laisseront néanmoins les animaux non contraints et libres de leurs mouvements. Ce sac à dos pourrait être considéré comme un jouet par les autres animaux, et entraîner des dommages aux dispositifs. C'est pourquoi l'isolement des animaux sur la durée de l'étude sera obligatoire. Les autres nuisances seront liées à la chirurgie destinée à l’implantation des capteurs aux niveaux intra-péritonéal et sous-cutané. La prise en charge de la douleur sera maîtrisée par l’injection d'un morphinique au cours de l'intervention, puis l’administration post-opératoire d'anti-douleurs. Au cours des phases de surveillance, et au delà des soins apportés pour une bonne cicatrisation suite à l'opération, la surveillance des animaux sera très rigoureuse, notamment par l'évaluation quotidienne du comportement de l'animal à l’aide une grille de score. Les jours où seront réalisées des mesures, les animaux seront anesthésiés pour éviter tout stress supplémentaire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de leur éviter toute douleur chronique pouvant résulter de la chirurgie effectuée.

Remplacement

Il n’est pas possible de reproduire artificiellement les conditions d’implantation dans le péritoine d’un capteur de mesure du glucose. Le développement d’un tel dispositif nécessite de recueillir des données in vivo. Par sa taille et son anatomie, l’implantation chez le porc permettra de reproduire des conditions voisines d’une implantation chez l’Homme. Les exigences requises pour la réalisation du protocole en font un modèle expérimental pertinent pour cette étude.

Réduction

Pour réduire le nombre de porcs utilisés pour l’expérimentation, deux capteurs seront implantés dans le péritoine (un dans chaque flanc) et deux en sous-cutané dans la paroi abdominale, chez chacun des deux animaux. On pourra ainsi tester 4 capteurs implantés au total. Cela permettra de tester la reproductibilité des résultats avec un nombre réduit d’animaux. Les données de mesure du glucose dans le péritoine, le tissu sous-cutané et le sang seront comparées à la suite de chaque injection intraveineuse de glucose. On disposera ainsi de 240 points de mesure comparables pour 4 capteurs permettant une analyse statistique pertinente. A noter que quatre animaux ont été prévus pour pallier un éventuel problème pendant le déroulement de la procédure mais le nombre d’animaux pourra être réduit si les mesures sont reproductibles sur 2-3 animaux.

Raffinement

Afin d'habituer les animaux à porter en continu un sac à dos, ils seront équipés dès leur réception 2 semaines avant la chirurgie. Leur comportement sera surveillé afin d'évaluer la bonne habituation à ce stimulus non douloureux (diminution des signes de stress). Comme l'isolement sera nécessaire pour éviter que le harnais ne soit endommagé par les congénères, ils seront hébergés dans des box attenants et ouverts sur la hauteur afin de permettre la communication entre eux (sons et odeurs). Les autres étapes de la procédure expérimentale seront réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie, elle sera associée à la gestion de la douleur pendant et après l'opération. De même la mise à mort sera réalisée en fin de procédure alors que les animaux sont anesthésiés. Pendant la phase post-opératoire immédiate, une grille d'évaluation sera utilisée pour s'assurer du bon réveil de l'animal. Pendant la période de surveillance, une grille de score sera utilisée pour évaluer l'état clinique des animaux, portant sur des critères d'absence d'infection en lien direct avec le modèle, sur des points généraux de comportement et des signes d'inconfort ou de douleur. Cette grille aidera à la prise de décision en cas d'atteinte des points limites. Ainsi en cas d’infection aux sites d’implantation ou de signes de souffrance persistante malgré les mesures antalgiques et anti-inflammatoires d’un animal soumis à l’expérimentation, celle-ci sera abandonnée (animal sorti d’étude).

Choix des espèces

Par sa taille et son anatomie, l’implantation chez le porc permettra de reproduire des conditions voisines d’une implantation chez l’Homme. Les exigences requises pour la réalisation du protocole en font un modèle expérimental pertinent pour cette étude. Les animaux sont choisis entre 30 et 35 kg, ce qui facilite également les aspects techniques en utilisant du matériel identique à celui utilisé en médecine humaine.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection, provoquant une paralysie partielle, une perte de poids et des troubles du comportement, avec mise à mort dès un score clinique élevé maintenu deux jours. Le projet cherche à valider une protéine sanguine comme biomarqueur de suivi de la sclérose en plaques. Le porteur revendique un modèle "crucial et indispensable" tout en décrivant les modèles in vitro et la cohorte humaine qu'il utilise en parallèle.

Objectifs

L'objectif global de notre étude est de déterminer si la protéine TWEAK du sang peut être utilisée comme indicateur par les médecins pour le suivi des patients atteints de sclérose en plaques (SEP). À cette fin, nous devons d'abord déterminer quelle est la fourchette normale des valeurs de TWEAK dans le sang et quels sont les facteurs qui influencent son dosage (par exemple, les variations de la protéine au cours de la journée, la production d'anticorps contre TWEAK, etc.). Dans un deuxième temps, nous regarderons s’il y a une relation entre la quantité de cette protéine dans le sang et l'inflammation qui se produit dans le cerveau, et si/comment TWEAK pénètre dans le cerveau à partir du sang. Enfin, nous étudierons les avantages potentiels de la production d'anticorps dirigés contre TWEAK par certains patients et déterminerons s’ils les protègent de certains effets de la maladie. De plus, les symptômes gastro-intestinaux sont fréquents dans la SEP. Un de nos objectifs est aussi de déterminer si pendant la SEP chez la souris, des troubles des fonctions du tube digestif apparaissent en lien avec le système nerveux et TWEAK.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe pas d'outils non invasifs et fiables pour le suivi des patients atteints de SEP. Nous proposons cet outil de biomarqueur sanguin pour le suivi neuroinflammatoire de ces patients. L'utilisation du modèle murin d'EAE est cruciale et indispensable en ce sens. Actuellement, nous ne sommes pas en mesure de suivre les patients de manière rigoureuse et quantitative. Nous nous fions aux IRM utilisant un rehaussement à base de gadolinium pour indiquer la charge de la maladie. Cependant, nous ne sommes pas conscients des problèmes à long terme des agents de contraste utilisés durant l'IRM, et elles restent inaccessibles et coûteuses pour la plupart des patients, notamment ceux qui vivent loin des hôpitaux ou centres d’IRM. Enfin, en plus des IRM, les neurologues dépendent des symptômes cliniques du patient pour évaluer et réévaluer le succès des thérapies de modification de la maladie. Ces symptômes restent qualitatifs et des études ont montré qu'ils n'ont aucune corrélation avec ce qui se passe au niveau du SNC. Par conséquent, l'avantage de notre étude est de mettre au point un outil capable de mesurer la neuroinflammation et la progression de la maladie de manière quantitative, non invasive, peu coûteuse et accessible. De plus, l’étude exploratoire concernant les effets gastro-intestinaux de TWEAK pendant l'EAE nous permettra de comprendre les effets de cette cytokine sur un symptôme très courant chez les patients SEP et impactent la qualité de vie. Cette étude pourra fournir des informations precieuses pour comprendre les interactions entre l'axe cerveau-intestin médié par l'interaction du système immunitaire avec les deux qui sont sous-jacents à ces symptomes. En fin, toutes nos études peuvent aider à identifier de nouvelles cibles therapeutiques pour la neuroinflammation et les symptomes gastro-intestinaux chez les patients atteints de SEP, tout en contribuant à une meilleure comprehension des interactions entre ces differents systems durant la santé et la maladie.

Procédures

Parmi les 240 animaux, 150 seront induits en EAE. Ces animaux subiront deux injections pour induire l'EAE. Parmi ces 150, 30 recevront une injection de TWEAK murin recombinant une fois, et nous prevoyons de prélever du sang sur 30 autres animaux à trois reprises sur une période de 24h sous anesthésie gazeuse. Ces deux protocoles, seront réalisés par un manipulateur expérimenté.

Impact sur les animaux

Nos animaux modéliseront la SEP et on observera donc une diminution de la mobilité. Le modèle EAE est bien établi et constitue le modèle de SEP le plus utilisé avec plus de 15 000 publications depuis sa découverte . Le pic de sévérité de l'EAE se manifeste entre 21 et 23 jours après l'induction de la maladie, où on peut observer une paralysie partielle, ainsi qu’une diminution du poids corporel et de la consommation de nourriture et à des troubles du comportement. Ces effets indésirables peuvent persister tout au long de la période de la maladie. Une récupération partielle peut être observée à partir de 20 jours environ.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 21 à 23 jours après l'induction à l'EAE. Cependant, si les souris atteintes d'EAE présentent des manifestations cliniques graves, mesurées par un score clinique égal ou supérieur à 4 pendant deux jours consécutifs, elles seront mises à mort avant cette periode pour éviter une souffrance plus longue.

Remplacement

Notre équipe est engagée dans la réduction de l'utilisation des modèles animaux autant que possible, tout en garantissant que nos travaux de recherche soient pertinents et fiables. Nous avons déjà mis en place des modèles in vitro pour réduire au maximum le nombre d’animaux qui serviront au progres scientifiques dans notre projet, mais dans le cadre de notre étude, le modèle murin d'EAE est le mieux adapté à notre objectif. Notre exploration combine des modèles in vitro, des modèles de souris et des travaux cliniques. Nous allons donc réduire notre dépendance à l'égard de l'extrapolation de données provenant d'animaux en utilisant des lignées cellulaires qui imitent l'organisme humain au niveau cellulaire. Par exemple, nous n'utiliserons pas le modèle murin pour déterminer comment, au niveau transcriptomique et moléculaire, TWEAK module l'inflammation. Nous utiliserons plutôt des lignées cellulaires immortalisées humaines d'intérêt, telles que des lignées cellulaires permettant d’établir un modèle de barrière hémato-encéphalique, de macrophages, etc. Pourtant il est à l’heure actuelle impossible de retracer l'origine et le devenir de la molécule TWEAK dans un système in vitro suffisamment abouti pour reproduire la complexité des interactions moléculaires, cellulaires, et multisystemiques dans l’organisme. En d'autres termes, il n'existe pas de cadre complet utilisant par exemple des organoïdes qui imiteraient le métabolisme d'une cytokine in vitro pour examiner sa cinétique à partir du cerveau, du foie, des reins, des poumons et d'autres organes pertinents. De plus, nos études d'IRM seront directement effectuées sur notre cohorte humaine, allégeant ainsi la charge d'utilisation de souris supplémentaires. Nous allons également directement incuber les cellules humaines avec les sérums de patients SEP au lieu d’injecter des souris avec

Réduction

Nous prenons au sérieux notre engagement à minimiser l'utilisation d'animaux et à respecter les principes des 3R dans nos recherches. Nous nous limitons donc réellement aux expériences et protocoles indispensables, évitant les répétitions inutiles et utilisant des méthodes alternatives lorsqu'elles sont disponibles. Comme on peut le constater dans la section 4.2, le nombre d'animaux que nous prévoyons d'utiliser est adéquat et rigoureux : il n'implique pas un trop grand nombre d'animaux (et donc un gaspillage), tout en conservant sa force statistique. Nous avons déterminé le nombre minimal et nécessaire d’animaux à n = 240 (90 témoins et 150 EAE). Il est important de noter que nous utilisons les mêmes animaux pour réaliser diverses expériences plutôt que d'en utiliser davantage. Nous pensons que le partage des animaux et du matériel biologique est nécessaire pour réduire le nombre d'animaux requis. Ainsi, lorsque cela est possible, nous prélèverons tous les organes dont nous avons besoin sur les mêmes animaux que ceux utilisés pour d'autres protocoles. Il convient de noter que nous n'utiliserons que des femelles, car l'inoculation de l'EAE chez elles a un taux de réussite plus élevé que chez leurs homologues masculins, ce qui contribue une fois de plus à réduire le nombre d'animaux. De plus, nous utilisons des tissus cérébraux de souris EAE conservés d’études précédentes pour effectuer les mises au point techniques préliminaires.

Raffinement

Nous sommes conscients que des souris en bonne santé sont essentielles pour mener une science de qualité, et nous nous engageons à prendre en compte le bien-être de nos animaux dans toutes les étapes de notre recherche. Nos protocoles d'induction de l'EAE se font par immunisation avec un peptide et l'administration d'une toxine (en sous-cutanée). Nous effectuerons des visites quotidiennes aux souris et les pèserons quotidiennement pour nous assurer qu'elles sont correctement nourries et nous surveillerons leur comportement et leur état général en nous basant sur la grille d’évaluation des symptômes cliniques de l'EAE dont le score va de 0 à 5. (0 : Aucune modification, 1 : queue molle, 2 : queue molle et faiblesse des pattes arrière, 3 : queue molle et souvent paralysie complète des pattes arrière, 4 : queue molle, paralysie complète de la patte arrière et partielle de la patte avant, 5 : la souris se roule spontanément dans la cage et la mise à mort et recommandée). Ainsi dès le score 2, nous surveillerons la prise hydrique et alimentaire et nous mettrons en place une analgésie, qui sera ajustée en fonction du score. Si les animaux n’arrivent pas atteindre la nourriture et l’eau du fait des troubles moteurs, nous mettrons la nourriture et l’eau à même le plancher de la cage. L’euthanasie est envisagée à partir d'un score 4 observé deux jours consécutifs. Le microenvironnement des souris sera enrichi de dômes en plexiglas ou en carton. Les souris auront accès à de la nourriture et de l'eau fraîches en permanence. Les conditions de logement pour les souris seront optimisées ; les cages seront aménagées pour permettre aux souris d'exercer leur comportement naturel et leur offrir des environnements enrichissants. Les stimuli de l'environnement extérieur seront réduits au minimum pour éviter de stresser les souris, et on maintiendra le nombre d’animaux par cage à 5.

Choix des espèces

Le modèle EAE a permis la publication de plus de 15000 articles et a servi de point de départ au développement de différentes thérapies pour la SEP. Il existe plusieurs modèles expérimentaux de la SEP mais qui ne reproduisent pas tous les symptômes physiques ou les mécanismes physiopathologiquees de la SEP. Le modèle EAE MOG est pertinent pour étudier la SEP sur son versant inflammatoire. Les souris EAE ont des voies immunitaires et de signalisation similaires à celles des humains et sont plus facilement manipulables que d'autres animaux tels que les primates. Puisque nous nous intéressons à l'évolution clinique et l’aspect inflammatoire de la maladie, le modèle murin EAE est le plus pertient. Des souris âgées de huit à douze semaines seront utilisées pour l'induction de l'EAE. Ce stade de development est couramment utilisé dans de nombreuses études. À ce stade, les souris sont considérées comme étant à l'âge adulte et leur système immunitaire est développé, les rendant plus susceptibles à l'EAE. De plus, c'est à ce moment-là que la prévalence de l'EAE est maximale (i.e., plus prévisible), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilises. À mesure que les souris vieillissent, leur réponse immunitaire peut varier, ce qui rend l'induction de la maladie plus variable. D’autre part, il est préférable d'éviter d'utiliser des souris plus jeunes car leur système immunitaire n'est pas encore complètement développé, et elles ont également une myéline plus immature. Ces facteurs peuvent entraîner une variation importante dans la susceptibilité de l'animal à développer la maladie.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On implante à chacune une fenêtre vitrée, et 450 subissent une section de la moelle épinière qui paralyse leurs pattes arrière, avant une rééducation et une stimulation électrique dont le porteur veut optimiser les réglages. Il signale une paralysie postérieure, des difficultés à vider la vessie qui imposent des massages abdominaux deux fois par jour, et une douleur résiduelle malgré les antalgiques. Les retombées annoncées pour les patients paralysés sont formulées comme un espoir, appuyé sur l'actualité d'une équipe suisse.

Objectifs

Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement et d'optimiser les paramètres de stimulation en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Compte tenu de la diversité des paramètres électriques ajustables (fréquence de stimulation, durée et intensité des impulsions, nombre de répétitions quotidienne/hebdomadaire, positionnement des électrodes relativement à la lésion...), une approche rationnelle doit être mise en oeuvre sur modèle murin. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de mettre en place et valider le premier modèle souris permettant de tester l’effet de la stimulation électrique transcutanée sur la récupération fonctionnelle après traumatisme de moelle épinière. Il permettra également d’évaluer l’effet anti-spastique de cette stimulation en vue d’application à d’autres pathologies comme la sclérose en plaques, les AVC, les hémorragies, la sclérose amyotrophique… Il permettra notamment de mieux comprendre les effets thérapeutiques en fonction de la fréquence de stimulation utilisée notamment en évaluant le potentiel immunomodulateur de ces différents protocoles et leur impact neurotrophique. Il est ainsi attendu qu’une optimisation rationnelle des traitements proposés aux patients puisse être mise en place sur la base de biomarqueurs circulants choisis pour caractériser à la fois la gravité du traumatisme et sa réponse aux traitements électriques. En clarifiant les actions directes et indirectes des impulsions électriques sur le système nerveux central, ce projet permettra également de clarifier les conditions dans lesquelles l’implantation d’électrodes est requis pour obtenir l’effet thérapeutique souhaité. La prise en charge des patients humains pourrait devenir à la fois moins invasive et plus efficace.

Procédures

Sur cinq ans, 750 animaux seront implantés avec fenêtre vitrée. 450 de ces souris seront soumises à une transection de moelle épinière thoracique . La paralysie transitoire des membres postérieurs sera prise en charge dans le cadre d’un protocole de rééducation et d’électrothérapie dont nous souhaitons optimiser les paramètres. Tous les animaux recevront des anti-inflammatoires en post-trauma comme en clinique humaine. 87% de ces animaux traumatisés recevront un traitement complémentaire : soit une rééducation fonctionnelle, soit une stimulation électrique transcutanée, soit la combinaison des deux traitements. La durée des expériences sera limitée à 62 jours post-trauma, sauf pour les animaux a forte récupération dont la stabilité sera évaluée sur 360 jours. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les animaux seront soumis à des sessions d’imagerie intravitale ni douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 1 fois par semaine à raison de 50µl par prélèvement (sans dépasser un volume maximum de 7,5% de la volémie de l'animal de façon hébdomadaire). 20% des animaux seront soumis à une antibiothérapie préalable au traumatisme pour étudier l'impact du microbiote sur les phénomènes étudiés. La majorité des animaux sortiront du projet dans les 62 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. Les animaux ayant le mieux récupérer seront éventuellement gardé pendant 360 jours pour évaluation trimestrielle de la stabilité de leurs performances.

Impact sur les animaux

Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : diahrée post-prise antibiotiques, gêne locomotrice avec paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, stress et/ou douleur résiduelle modérée malgré la prise d’antalgique et anti-inflammatoires.

Devenir

Tous les animaux (750) seront sacrifiés soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. La majorité d'entre eux sera sacrifiée avant le jour 62. Les meilleurs récupérateurs seront conservés pendant un an pour évaluer de façon trimestrielle la stabilité de leurs facultés sensorimotrices.

Remplacement

Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. A ce jour il n’existe pas de méthodes de remplacement, mais l’actualité récente de la recherche en Suisse démontre l’intérêt de la recherche animale pour aider les patients tétraplégiques à retrouver une certaine utilisation de leurs membres. Notre modèle murin permettra de clarifier les mécanismes d’action du traitement par SET en réduisant au maximum les facteurs de variabilité (conditions traumatiques, gravité des lésions, diversité des genres, âges et conditions de vie des patients). Il permettra également de réaliser une optimisation rationnelle du traitement clinique à partir d’indicateurs difficiles d’accès chez le patient (évolution dynamique du phénotype de cellules inflammatoires).Un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo

Réduction

Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test de Mann Whitney dédié aux petits échantillons. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J62. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 750 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.

Raffinement

Reception et adaptation de 7 jours. Après anesthésie gazeuse légére et injection d'antidouleurs, l'anesthésie est approfondie par injection intrapéritonéale d'anesthésique avant d'être positionnés sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant , et de l'anesthésique local appliqué avant toute incision. Après l'opération, une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton) et un accès non limité à la nourriture et l’eau. Le cycle jour/nuit, la température et l'humidité sont contrôlés. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.

Choix des espèces

Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs et dont le phénotype est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et de son comportement en font un modèle pré clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront des animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaires. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux.

348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau, puis un hébergement individuel, des séjours en cage à métabolisme, un jeûne de 24 heures et un régime gras et sucré, pour étudier une protéine des cellules gliales dans l'obésité. Le porteur indique que la chirurgie échoue chez 55 % des souris, dont la région visée n'est pas atteinte, et que l'isolement et le jeûne causent inconfort et anxiété. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet cette étude "sur un animal in toto" et renvoie au long terme les pistes contre l'obésité.

Objectifs

L’obésité et les troubles métaboliques associés constituent un enjeu de santé publique majeur et une préoccupation planétaire. L’obésité est une maladie chronique de la nutrition qui trouve son origine, en partie, dans des dysfonctionnements de plusieurs structures nerveuses. Ces structures cérébrales intègrent les informations liées à nos réserves adipeuses et à l’alimentation. Elles participent au contrôle de l’appétit pour maintenir un poids corporel stable. Malgré une recherche intense dans le domaine, les mécanismes régulant notre appétit restent mal compris et les stratégies pour lutter efficacement et durablement contre l’obésité sont limitées. Ce projet vise à mieux comprendre comment une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régule la prise alimentaire et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Il étudie le rôle dans la régulation de l’appétit et du poids corporel de cellules non-neuronales appelées cellules gliales. Plus spécifiquement, il étudie un acteur cellulaire, la connexine 43 qui contribue à la communication des . La moitié des animaux auront l’expression de la connexine 43 réduite dans la région cérébrale d’intérêt, permettant de tester sa contribution : 1) dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel sous un régime alimentaire standard ; 2) dans le maintien du métabolisme énergétique, le contrôle de la prise alimentaire et hydrique, ainsi que la régulation des dépenses énergétiques ; 3) dans les réponses comportementales, hormonales, et cellulaires à une réalimentation après mise à jeun. Par ailleurs, une partie de ce projet testera la contribution de la connexine 43 dans un contexte de régime enrichi en graisses et en sucres. Nous testerons alors la propension des animaux à prendre du poids et développer un diabète de type 2 lorsqu’ils sont nourris avec ce régime hypercalorique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales d’une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régulent la prise alimentaire, le métabolisme et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la communication des cellules gliales dans la propension des animaux à développer une obésité et un pré-diabète lors d’un régime enrichi en graisses et en sucre. Nous étudierons les contrôles fins de la prise alimentaire, évaluerons la prise hydrique, les dépenses énergétiques, la réponse au jeûne ou encore de l’activité locomotrice des animaux. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités, en particulier le diabète de type 2.

Procédures

Pour les procédures impliquant des animaux nourris avec un régime standard, la durée totale du projet est de 5 ou 11 semaines . Pour les procédures impliquant des animaux alimentés avec un régime enrichi en graisses et sucres, la durée totale du projet est de 14 semaines. Toutes les souris ont une intervention chirurgicale de 45 minutes pour l’injection intracérébrale d’un composé qui cible la connexine 43. Les animaux sont ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, soit 4 semaines pour 24 animaux et 10 semaines pour les autres animaux. Après récupération chirurgicale, le poids et prise alimentaire des animaux sont mesurés 2 fois par semaine pendant 10se. Entre la 6 et 7e semaine qui suivent la chirurgie, les souris sont utilisées dans différents test(s) métabolique(s) : - Certains animaux sont hébergés pendant 3 jours dans des cages métaboliques qui mesurent la prise alimentaire en continu et les dépenses énergétiques. Le premier jour permet à l’animal de s’habituer à son environnement. Les enregistrements sont réalisés au cours des 48h suivantes. Ces animaux sont également utilisés dans un protocole de 25h qui mesure la réalimentation consécutive à un jeûne. La moitié des souris est mise à jeun pendant 24h et les autres pendant 21h puis réalimentées pendant 3h. - Pour d’autres animaux, un test de tolérance au glucose (4h), classiquement utilisé pour diagnostiquer un diabète, est utilisé. Une solution de glucose est administrée par voie orale, puis des prélèvements sanguins sont réalisés pour suivre l’évolution de la glycémie (7 prélèvements au cours des 4h). Après le test et selon les résultats obtenus, les animaux seront soumis à un test qui vérifie l’absence d’anxiété, ainsi qu’à un test de préférence alimentaire (plusieurs régimes pour rongeurs proposés pendant 8j). - Certains animaux sont utilisés dans un test de tolérance à l’insuline. Une injection d’insuline est réalisée, puis des prélèvements sanguins sont réalisés de la même façon que pour le test de glucose (7 prélèvements, 4h). -Enfin, des animaux seront utilisés dans deux tests de privation en glucose (par l’administration d’un composé pharmacologique ; durée 4h). Au cours de ce test, des suivis de mesures de la glycémie (7 prélèvements en 4h) seront réalisés, ou des mesures de la prise alimentaire (pendant 4h).

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. Le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale implique une période de récupération post-opératoire qui est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement. Un inconfort et de l'anxiété peuvent résulter de cet isolement. L’hébergement de 3 jours dans les cages métaboliques est une source d’inconfort, dû à l’environnement hermétique qui limite les contacts olfactifs avec les congénères. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal qui entraîne une perte de poids corporel importante chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. Le suivi du statut glycémique et le diagnostic d’un diabète requièrent des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue. Par ailleurs, la modification du statut glycémique cause un inconfort dû à la contention de l’animal et aux administrations des composés modifiant le statut glycémique. Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent d’être mis à mort pour des analyses post-mortem.

Devenir

Les animaux éventuellement sortis de l’étude prématurément en raison d’une souffrance non-traitable seront mis à mort. Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent d’être mis à mort pour des analyses post-mortem. Ces analyses comprennent des étude in situ, des analyses biochimiques de marqueurs métaboliques. Elles permettent également de vérifier l’efficacité de la chirurgie dans la région d’intérêt et de caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales. Les animaux sortis des procédure pour une prise de poids insuffisante sous régiùe obésogène seront sacrifiés et les tissus prélevés afin d’abonder un tissuthèque interne à l’équipe permettant de réaliser des analyses biochimiques tests et/ou des essais immunohistochimiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe pas de méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la balance énergétique. En effet il s’agit ici d’étudier le rôle d’une sous population de cellules gliales présente dans une région spécifique du cerveau et de comprendre leur interactions avec les neurones régulant la balance énergétique. Il est capital que ces cellules soient dans l’environnement complexe qui est le leur in vivo et que ne peut pas être reproduit in vitro. De plus l’objectif est ici de voir si la perturbation de la communication gliale modifie le comportement alimentaire, la prise de poids, la régulation glycémique, les dépenses énergétiques… Ces paramètres ne peuvent être abordés que sur un animal in toto et pas in vitro.

Réduction

Le nombre maximal de souris nécessaire à ce projet est de 348. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Le nombre de lots nécessaires dépend du nombre de variables testées, avec dans chaque procédure des animaux contrôle. 1) La moitié des animaux reçoit un composé inerte vis-à-vis de la connexine 43 et les autres animaux reçoivent un composé qui réduit la connexine 43 dans notre région cérébrale d’intérêt. Cela constitue la variable « condition d’expression de la connexine 43 ». Pour 2 procédures, la condition d’expression de la connexine 43 est la seule variable et nécessite 2 lots d’animaux. 2) Une partie des animaux est soumise à une modification du métabolisme (jeûne ou régime enrichi en graisses et en sucres). Le statut nutritionnel constitue une seconde variable et les procédures concernées nécessitent 4 lots d’animaux (avec la condition d’expression de la connexine 43). Pour l’ensemble des procédures, 20 lots sont nécessaires. L’effectif nécessaire par lot dépend des paramètres étudiés. Il prend en compte : 1) La variabilité individuelle des paramètres étudiés permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre a été déterminé à l’aide d’études bibliographiques ou au cours de précédents projets. Une procédure nécessite 6 animaux inclus dans les analyses finales, et les autres procédures 8 animaux par lot. 2) L’inclusion ou non des animaux dans les groupes statistiques finales. Dans ce présent projet, deux critères d’exclusion sont relevés : a) l’échec des chirurgies. L’intégralité de la région d’intérêt doit être touchée, cela représente 55% des animaux et b) l’échec, pour induire une obésité chez la souris qui peut aller jusqu’à 30 %. Ainsi, pour l’étude de paramètres nécessitant 8 animaux, nous devons utiliser au maximum 8 souris inclues dans les analyses statistiques et prévoir 8 souris exclues des analyses (et 6 souris résistantes au régime enrichi en graisses), soit au maximum 22 animaux par lot de souris soumises à un régime enrichi. Pour les animaux exposés à un régime standard, 16 animaux par lot maximum sont nécessaires. En prenant en compte les critères d’inclusion et d’exclusion, nous nous assurons que les animaux utilisés seront suffisants pour obtenir des résultats scientifiquement valables qui pourront être utilisés par la communauté scientifique.

Raffinement

Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entrainé. L'état clinique des animaux est suivi quotidiennement et un état anormal fait l’objet d’une quantification par une grille de score, permettant une prise en charge adaptée . Les actes pouvant générer de la douleur sont réalisés sous analgésie et/ou anesthésie. La chirurgie est réalisée sous analgésie pré-opératoire et post-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale. Après la chirurgie, un suivi renforcé est mis en place. Durant les 3 jours qui suivent la chirurgie, les animaux sont placés dans une salle de l'animalerie dédiée pour une surveillance accrue. Pendant cette période, une alimentation adaptée limitant la déshydratation et la perte de poids est disposée en fond de cage et une analgésie est systématiquement administrée. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de glycémie sont réalisés après application d'une crème anesthésiante. La mise à mort est réalisée sous anesthésie générale profonde et sous analgésie quand elle est susceptible de générer de la douleur. Pour étudier le métabolisme des animaux nous avons recours à un système de calorimétrie indirecte s’inscrit dans une démarche de raffinement puisqu’il permet, en une seule étude et par des méthodes non-invasives, la mesure de plusieurs paramètres métaboliques. Les mesures sont effectuées simultanement sur un même animal pour faciliter les études de corrélation entre les différents paramètres mesurés. Avant les tests nécessitant une mise à jeun, les animaux seront habitués au retrait de la mangeoire pour réduire l'angoisse causée par l'absence de nourriture. Les animaux sont habitués à la manipulation et à la contention avant les différents tests métaboliques pour réduire l'angoisse animale et éviter des fluctuations de la glycémie dues au stress de la manipulation et de la contention. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie jusqu'à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes sont disposées afin de permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères. Par ailleurs, un enrichissemen plus varié est mis en place. Deux enrichissements au choix (en plus des nids composés de lanière de papier) seront placés dans la cage et modifiés toutes les deux semaines.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Pour les procédures n’incluant pas l’étude des effets du régime enrichi en graisses, des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. L’anatomie des différentes régions du cerveau est bien connue à cet âge et ce qui nous permet plus aisément de cibler la structure cérébrale. Pour les procédures étudiant l’effet d’un régime enrichi en graisses et en sucre, des souris à partir de 5 semaines seront utilisées. Il est important de débuter les régimes enrichis en graisses et en sucres peu après le sevrage pour en maximiser les effets sur la croissance pondérale.

150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte des composés directement dans le cerveau sous anesthésie, puis on en place une partie jusqu'à cinq jours en cage à métabolisme, sur sol grillagé et isolés, pour mesurer le devenir de candidats médicaments dans l'organisme. Le porteur qualifie lui-même de sévères la douleur chirurgicale et le stress de la cage à métabolisme, et prévoit une mise à mort au-delà de 15 % de perte de poids. Il présente ces études comme "requises par les instances réglementaires" avant tout passage chez l'humain, en visant des cancers du cerveau comme le glioblastome pédiatrique.

Objectifs

En phase préclinique, le développement d’un médicament évalue différents paramètres dans le but de démontrer son efficacité ainsi que sa bonne tolérance et élimination par l’organisme. Parmi les données à apporter lors de la constitution d’un dossier en vue d’une demande de mise sur le marché, une évaluation de la pharmacocinétique comprenant les étapes d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’excrétion, du composé actif est nécessaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, par voie intracorticale (dans le cerveau). Cette approche est en particulier justifiée dans le cas de l’évaluation d’approches thérapeutiques ciblant spécifiquement le cerveau, pour des pathologies – notamment en oncologie (par exemple glioblastomes pédiatriques) – pour lesquelles le besoin médical est critique. Certains paramètres d’absorption, de distribution, de métabolisme et d’élimination des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, avant l’évaluation plus exhaustive in vivo chez le rat. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La procédure de ce projet permettra d’étudier la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration par voie intracorticale de la molécule froide ou radioactive, des animaux contrôles seront traités par administration intraveineuse avec le même composé. Selon les objectifs d’étude, pour l’évaluation des excrétions (fèces et urine), une partie des animaux seront placés en cage à métabolisme en hébergement individuel pour d’une durée maximale de 120h (5 jours). Des prélèvements divers (notamment sanguins), pourront être effectués in vivo dans le respect des recommandations vétérinaires afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Les urines et fèces seront récupérés grâce aux dispositifs de la cage à métabolisme, sans intervention sur l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer chez le rat la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une administration chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 28 jours. Lors du développement d’un médicament, cette évaluation est requise par les instances règlementaires avant passage en phase clinique. Ainsi, le comportement de la molécule dans l’organisme, son métabolisme, sa distribution dans les tissus et son excrétion pourront être anticipés avant de réaliser les études chez l’homme. La voie d’administration des composées (intracorticale = dans le cerveau) adresse le cas de pathologies difficiles à traiter et pour lesquelles le besoin médical actuel est critique, notamment en oncologie (par exemple glioblastomes pédiatriques). Le bénéfice attendu du développement de nouvelles molécules thérapeutiques est donc particulièrement important.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie intracorticale, sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie.Les administrations intraveineuse (IV) dans la veine caudal (veine de la queue) seront réalisée si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane (cas de produit radiomarqué). Les traitements pre et post opératoire les administrations sous cutanée (SC) et intrapéritonéale (IP) seront réalisées sur animaux vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile. Le nombre et la fréquence des administrations sera déterminé en fonction de l’objectif de chaque étude. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à un maximum de 5 jours en cage à métabolisme ou 28j en cage standard. Des prélèvements de sang, d’organes, d’urine et de fèces pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages à métabolisme, au maximum 120h (5 jours). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des organes et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.

Impact sur les animaux

La chirurgie et la voie d’administration des composés génèreront une douleur opératoire et post opératoire de niveau sévère, justifiant la mise en place d’une analgésie, une perte de poids transitoire sera attendue sur un maximum de 7 jours. De plus, la chirurgie pourra induire d’autres effets indésirables de type neurologique, considérant le site de dépôt du produit. Deux à 3 jours avant le démarrage de l’étude, les animaux seront répartis en groupes homogènes (poids des animaux) et donc potentiellement mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et prélèvements entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Lorsque cela sera nécessaire, le placement en cage à métabolisme génèrera un stress sévère après administration intracorticale. Dans ces conditions d’hébergement dérogatoire (et justifiées scientifiquement pour le suivi individuel des excrétions), les animaux seront placés sur un sol grillagé, ce qui pourrait gêner leur locomotion. Ils seront hébergés individuellement, mais resteront en contact visuel avec leurs congénères. Aucune toxicité du produit n’est attendue dans les conditions prévues de dose de produit utilisées.

Devenir

Après la procédure , les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées à l’aide de tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes, etc.) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité, de leur propriété pharmacocinétique favorables et de leur absence de toxicité. Ces données sont insuffisantes pour avoir une bonne prédiction de la pharmacocinétique in vivo des molécules et d’autant plus pour permettre l’extrapolation de l’animal à l’homme. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules candidat devra donc être étudiée en premier lieu chez le rat.

Réduction

Ces études pré-règlementaires constituent une des dernières étapes des phases de développement préclinique, stade auquel les molécules évaluées auront déjà été sélectionnées en tant que candidat médicament parmi de nombreuses autres molécules. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 15 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires, sera utilisé afin de constituer plus facilement des groupes homogènes au moment de l’initiation de l’étude. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette procédure, il sera toujours proposé d’utiliser des prélèvements séquentiels d’un même animal.

Raffinement

Les animaux seront randomisés minimum 2 jours avant la chirurgie. Pour le groupe d’animaux devant être mis en cage de métabolisme une phase progressive d’habituation sera mise en place (sur 3 jours). Un enrichissement de l’environnement est utilisé dans toutes les cages et dans les cages à métabolisme l’enrichissement sera adapté. La procédure chirurgicale permettant le traitement intracortical (dans le cerveau) sera réalisée par des techniciens maitrisant les gestes chirurgicaux spécifiques. L’absence de conséquence neurologique a été démontrée dans des études préalables. La réalisation de la procédure sera suivie par la SBEA et toutes propositions seront étudiées. La procédure sera réalisée sous anesthésie générale combinant une anesthésie fixe et une anesthésie gazeuse avec une analgésie opiacée et un anti-inflammatoire non stéroïdiens. Une anesthésie locale sera également administrée en sous-cutané avant la chirurgie. L’analgésie sera renouvelée 4h et 6-8h après la chirurgie puis 2 fois le lendemain et le surlendemain de la chirurgie (couverture 72h). L’anti-inflammatoires non stéroïdiens ou un corticoïde sera renouvelé pendant 2 jours. Un soutien thermique (tapis chauffant ou armoire chauffante) sera mis en place durant toute l’anesthésie et la phase réveil. Les administrations IV et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress. Les expérimentateurs sont formés pour évaluer l’état de souffrance et les points limites. Une grille de scoring est mise en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites sont listés dans la procédure. Les scores cliniques les plus élevés et l’accumulation de scores intermédiaires constitueront un point limite. Après chaque manipulation lorsque cela est possible l’animal recevra une récompense (contact positif). • Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et pesés quotidiennement pendant les 7 jours suivant la chirurgie.Si perte du poids >10% : pesées quotidiennement et ajout de capsules d’eau gélifiées Poids entre 10 et 15% : réhydratation avec du Ringer Lactate (1mL) 1 fois par jour. Si perte de poids > 15% ou >10% pendant plus de 3 jours constituera un point limite. Le maintien des animaux en cage à métabolisme sera évalué quotidiennement par le vétérinaire ou la SBEA

Choix des espèces

La réglementation demande de réaliser les études précliniques sur plusieurs espèces différentes, or pour la réalisation de cette procédure chirurgicale, le rat en raison de sa taille, est l’espèce la plus adaptée. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour mieux supporter les effets de la chirurgie et les effets secondaires des composés à tester

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur déclenche une myocardite auto-immune par injection d'extraits de muscle cardiaque de porc, ce qui provoque une insuffisance cardiaque grave pouvant aller jusqu'à la mort, avant des traitements quotidiens et des séances d'IRM avec un nouvel agent de contraste. Le porteur indique que ce modèle a été retenu parce que le rat serait "l'espèce la plus utilisée" pour cette maladie. Les retombées annoncées, un diagnostic plus précoce de l'inflammation cardiaque chez l'humain, restent attendues.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester chez l'animal la capacité d'une nouvelle technologie d'imagerie par résonance magnétique (IRM) à diagnostiquer de manière précoce l'inflammation cardiaque. Nous allons tester un nouvel agent de contraste, une substance qui augmente artificiellement le contraste de l'IRM, qui a la particularité de cibler des molécules exprimées spécifiquement lors de l'inflammation. Ainsi, une étude menée au sein de notre laboratoire a d'ailleurs démontré dans un modèle d'inflammation générale chez la souris que cet agent de contraste était capable de cibler l'inflammation au niveau du coeur. Nous souhaitons donc tester l'efficacité de cet agent de contraste de pouvoir imager l'inflammation cardiaque dans un modèle plus précis d'atteinte cardiaque tel qu'un modèle de myocardite auto-immune chez le rat. Cela permettrait d'améliorer le diagnostic et la prise en charge des myocardites chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation cardiaque chez l'animal. De plus, nous savons que dans des modèles de myocardite auto-immunes, les molécules spécifiques de l'inflammation sont sur-exprimées au niveau du coeur. Il est donc attendu que cette nouvelle technique d'imagerie IRM dans un modèle de myocardite auto-immune chez le rat puisse permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation cardiaque par rapport aux animaux contrôles.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Mise en place d'un modèle de myocardite auto-immune par immunisation avec une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Traitement anti-inflammatoire quotidien en intrapéritonéal avec contention o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie IRM avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min)

Impact sur les animaux

Le modèle de myocardite auti-immune par immunisation peut induire des effets indésirables sur les animaux. Les rats seront immunisés avec une solution contenant des extraits de muscles cardiaques de porc. Ce modèle induit une insuffisance cardiaque grave et dans certains cas au décès.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (coeur), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés avec l'agent de contraste en imagerie par résonance magnétique permettant de confirmer leur à donner un signal IRM. Des tests in vivo chez la souris ont été réalisés pour tester l'efficacité à détecter l'inflammation cardiaque et des résultats positifs ont été observés avec une prise de contraste en IRM au niveau du myocarde confirmée par l'étude histologique des tissus.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé le même agent de contraste. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons.

Raffinement

Les animaux auront le temps d'acclimation et un enrichissement de leur milieu. Une attention particulière sera accordée à l'évolution de la masse corporelle afin de vérifier que les animaux s'alimentent correctement. La douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir les différents temps d'études par une analgésie. Différents point limites ont été définis afin de ne pas poursuivre l'étude si les animaux présentent des signes de souffrance ou de douleur.

Choix des espèces

Le rat est l'espèce animale la plus utilisée dans ce modèle de myocardite expérimentale auto-immune et parmis les espèces animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine du rat sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires.