Procédures sévères

272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ischémie cérébrale provoquée, une injection dans le cerveau, la pose d'un cathéter, des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés à la queue, une hyperglycémie étant induite par injections de streptozotocine, pour étudier le rôle de certaines cellules dans les hémorragies cérébrales après un AVC. Le porteur mentionne un déficit moteur ou cognitif possible et un test comportemental dont il ne précise pas la nature. Les retombées pour les patients sont renvoyées à un horizon lointain, et le porteur affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information.

Objectifs

Les transformations hémorragiques (HT) sont des complications fréquentes chez les patients victimes d'un accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Elles se produisent lorsque le sang traverse la barrière hémato encéphalique (BHE) lésée et pénètre dans le cerveau après un AVC. Une hyperglycémie est présente chez environ 28 à 40 % des patients souffrant d'un AVC. Le plus souvent, cette hyperglycémie est la cause d'un diabète pré-existant chez le patient. Or, l'hyperglycémie augmente le risque de HT ce qui est associé à une aggravation de l'issue de l'AVC et une augmentation de la mortalité. En effet, l'hyperglycémie potentialise l'inflammation, et entraîne une augmentation de la perméabilité de la BHE et donc une augmentation des HT. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment périvasculaire rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Au sein de cet espace, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Les PVM participent à la BHE. De par leur localisation, ces cellules sont à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau. Cependant, le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié et d'autant plus dans des conditions avec comorbidité. Ce projet vise donc à caractériser le rôle des PVM dans la physiopathologie des HT en présence d'un facteur de comorbidité qu'est l'hyperglycémie. Notre hypothèse, basée sur les études précédentes et sur la localisation privilégiée des PVM à l’interface entre le compartiment vasculaire et le parenchyme cérébral, est que les PVM pourraient jouer un rôle déterminant dans les HT et pourraient être affectés par l'hyperglycémie. Pour ceci, nous disposons au sein du laboratoire d'une technique permettant de dépléter spécifiquement les PVM dans les espaces périvasculaires ce qui permet ainsi d'étudier leurs rôles.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension de l'implication des macrophages périvasculaires dans les transformations hémorragiques, et notamment dans un contexte de comorbidité, permettra une meilleure compréhension de ce phénomène et à terme, une meilleure prises en charge des patients victimes d'un AVC.

Procédures

#Procédure 1 et 2 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale focale et pose d'un cathéter veineux (40min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et à J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16, J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17 , J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min). #Procédure 3 et 4 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle de transformation hémorragiques (35min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (11 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16 , J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17, J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min).

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont du stress lié à la contention (test fonctionnel, prélèvements sanguins), l'induction et le maintient de l'anesthésie (imagerie IRM, procédures chirurgicales). Des douleurs eventuelles liées à la chirugie (pose de cathéter, injection intracérébroventriculaire, ischémie thromboembolique), un déficit moteur ou cognitif (ischémie thromboembolique). De plus le modèle d'hyperglycémie via injection multiple de streptozotocine peut entrainer de la glucosurie, de la polyurie, de la polydipsie.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tissus pour réaliser des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est, avec le rat, l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA (activateur tissulaire du plasminogène) au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés, la littérature et un test de puissance statistique. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure chirurgicale. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Une habituation aux gestes et dispositifs de contention sera réalisée au préalable afin de réduire le stress des animaux lors de ces manipulations. Le réveil des animaux post-chirurgie se fera au calme, dans une enceinte chauffée ventillée individuelle avant leur retour dans la cage. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale et placées dans une armoire chauffée ventilée. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture sera mis en place. Du fait des effets indésirables induit par l'hyperglycémie, une attention particulière sera portée sur l'hydratation (turgescence cutanée) et l'hygiène de la cage des animaux avec des changements de biberons et de cages plus fréquement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’humain. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’humain et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des PVM dans les HT dans le cadre d'une hyperglycémie. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit une section complète de la moelle épinière, chez le nouveau-né comme chez l'adulte, pour induire une spasticité, puis des injections que le porteur pratique sans analgésie au motif que l'animal "ne ressent plus rien" sous la lésion. Il décrit chez les adultes des troubles urinaires persistants imposant une vidange manuelle de la vessie, un risque d'infection et de mutilation, et chez les nouveau-nés un risque de cannibalisme maternel envers les petits blessés. Le porteur affirme que le modèle murin lésé reste "indispensable" faute d'exploration fonctionnelle directe possible chez l'humain.

Objectifs

L'objectif principal de cette étude est de trouver un traitement efficace pour réduire la spasticité. La spasticité est un trouble moteur qui survient tardivement après une lésion de la moelle épinière. Elle se manifeste par une forte résistance musculaire à l’étirement, en raison d'une hyperexcitabilité du réseau de neurones qui connecte le muscle. Elle s’accompagne souvent de spasmes (mouvements involontaires) et d’une hypersensibilité à des stimuli sensoriels normalement bénins. Ce que l'on constate au niveau cellulaire, c'est une excitabilité anormalement élevée des neurones moteurs (MNs). Toutefois, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cela ne sont pas élucidés. Des travaux récents ont montré l'implication d'une famille de protéines présente à la surface des MNs, dans ce phénomène. Leur présence est fortement diminuée après la lésion de la moelle épinière, conduisant à une plus grande excitabilité du neurone et contribuant à l'apparition de la spasticité. En tentant de générer de nouvelles protéines à la surface du neurone grâce à l'outil génétique et en faisant une étude approfondie des mécanismes mis en jeu d'un point de vue fonctionnel et structurel, ce projet a pour but de diminuer la spasticité du réseau neuronal contrôlant la locomotion.

Bénéfices attendus

La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables du déséquilibre entre excitation/inhibition au sein du réseau moteur sous-lésionnel. En ciblant spécifiquement ces protéines par l'outil génétique sur le modèle murin, ces études approfondies fourniront des données solides pouvant être transposées à la recherche clinique. En effet, ce travail proposera des outils thérapeutiques innovants pour répondre précisément aux besoins des patients souffrant de spasticité, car à l'heure actuelle le choix médicamenteux est très restreint avec beaucoup d'effets secondaires indésirables, et avec une efficacité éphémère. Ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté biomédicale travaillant sur la spasticité.

Procédures

Une lésion de la moelle épinière sera réalisée sous anesthésie générale sur l'ensemble des animaux de ce projet (durée intervention 5-8min sur nouveau-né, 30min chez animal adulte) suivie d'une seule injection d'un composé potentiellement thérapeutique dans la patte postérieure gauche et droite de chaque animal (durée de l'intervention 5min). Le mode d'injection intrathécale juste au-dessus de la surface de la moelle épinière est envisagé en alternative de l'injection en intramusculaire chez l'animal adulte (durée de l'intervention 10min sous anesthésie générale). Une implantation d'électrodes sera faite sur les souris adultes sous anesthésie gazeuse (durée de l'intervention 30min). Une fois lésés, les animaux ne ressentent plus la douleur dans leur arrière train donc toute injection dans la cavité du péritoine (durée intervention 1min) se fera sans analgésie préalable aussi bien chez la souris nouveau née que chez la souris adulte. Chez les jeunes souris cette injection sera faite soit une fois par jour sur une période de 7 jours, à partir du sixième jour après la naissance (noté P6), soit 2 jours consécutifs à P6/P7, à P13/P14 et à P20/P21. Ches les souris adultes les injections se feront juste avant les expérimentations. Des enregistrements électromyographiques (EMG) des muscles de la patte postérieure avec l'animal en contention sans analgésie préalable (car l'animal ne ressent plus rien en dessous de la lésion) et des vidéos de l'animal pour observer son comportement seront faits.

Impact sur les animaux

Afin d'induire une hyperexcitabilité de la moelle épinière et des symptômes de spasticité, nous procédons à une lésion complète de la moelle épinière chez les souris, tant néonatale qu'adulte. Suite à cette intervention les symptômes de la spasticité se manifestent quelques jours seulement après la lésion chez les jeunes souris. En revanche, chez les souris adultes, ces symptômes apparaissent après plusieurs semaines. Bien que les souris opérées pendant leur période néonatale retrouvent spontanément une récupération satisfaisante de la vessie, celles opérées à l'âge adulte montrent des troubles de la vessie plus persistants, nécessitant une vidange manuelle jusqu’à la restauration complète de la fonction urinaire (généralement trois semaines après la lésion). Une autre conséquence de la chirurgie peut être l’émergence de la douleur. Suite à l’intervention, une perte de poids (10%) peut être observée. Chez les souris adultes des risques d'infections urinaires sont à prévoir ainsi qu'un risque de mutilation. L'isolement des animaux adultes opérés qui est nécessaire le temps de la cicatrisation du site d'incision, peut induire du stress. Les manipulations et les changements de lieux, des animaux pour les enregistrements electromyographiques et vidéos peuvent également engendrer du stress.

Devenir

Les animaux participant à la procédure 1 (21 souris) seront euthanasiés à la fin de celle-ci, car ils ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expériences. Quant aux animaux participant aux procédures 2, 3 et 4 (658 souris), ils seront également euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour une étude approfondie de l'activité et la fonctionnalité des cellules nerveuses mais aussi pour les protéines présentes à leur surface.

Remplacement

Notre projet vise à comprendre et à lutter contre la pathologie du système moteur suite à une lésion de la moelle épinière. Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux sollicités. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle, en effet, le modèle de spasticité chez la souris possède les principales caractéristiques de la spasticité chez l'homme. Comme la compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, le modèle murin, reste pour le moment, indispensable. Nous supposons ainsi que l'identification d'un acteur principal dans cette pathologie chez la souris, aurait un potentiel thérapeutique significatif pour l'homme.

Réduction

Ce projet nécessitera un total de 679 animaux lésés. Il s'agit d'une continuation directe des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de minimiser davantage ce nombre, les médicaments testés seront administrés en série aux mêmes groupes expérimentaux lors des différentes procédures. À l'exception de la procédure 1, où les animaux seront euthanasiés à la fin, les tissus seront prélevés à la fin des autres procédures pour être utilisés, ce qui permettra de limiter encore le nombre d'animaux. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. L'expérimentateur ne sera pas informé du groupe expérimental afin d'éviter tout biais possible.

Raffinement

Souris nouveau-nées - Les animaux anesthésiés, reçoivent une injection d'analgésique. Une fois opérées, les souris sont maintenues en fratrie et ramenées à la mère. Pour minimiser les épisodes de cannibalisme de la mère envers les nouveau-nés blessés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements anxieux. De plus, nous utilisons des friandises autorisées comme récompense pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...).Que ce soit pour la chirurgie ou les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur et les zootechniciens, en observant des points limites. Souris adultes - Chez les individus adultes,une injectiond'analgésique sera administrée deux fois dans les 24 heures suivant la lésion de la moelle épinière ou l'implantation des électrodes d'enregistrement. Deux fois par jour, leur vessie sera vidée manuellement jusqu'à la récupération de la fonction urinaire. Leur température et leur hydratation seront également vérifiées, et tout signe clinique de douleur sera surveillé. Une semaine après la lésion, les animaux seront logés par deux par cage, avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès illimité à la nourriture et à l'eau. De la même manière, l'hébergement sera enrichi à l'aide de rondin de bois et tunnel et de matériel de nidification. Du gel nourrissant sera proposé aux animaux âgés de plus de 15 jours à chaque sortie de leur zone d'hébergement pour les séries d'expérimentation.

Choix des espèces

Le modèle de souris est utilisé dans notre étude car c'est un modèle de spasticité reconnu. Nous supposons que l'identification des mécanismes moléculaires engendrant cette pathologie pourrait avoir un potentiel thérapeutique significatif pour d'autres mammifères, y compris l'homme. La compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, ainsi une grande partie de cette recherche a déjà été menée sur des lignées cellulaires et par modélisation. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle. Le modèle de spaticité chez la souris juvénile est choisi en première intention car l'apparition de la spasticité est plus rapide (5 à 6 jours) que chez l'adulte (4 semaines). Ce modèle est également compatible avec les investigations fonctionnelle qui font appel à la technique d'électrophysiologie, ce qui n'est pas le cas du modèle de spasticité adulte. Enfin la gestion des animaux opérés est plus simple car c'est essentiellement la mère qui s'en charge. Juste une surveillance accrue des animaux pour déceler une souffrance, ou un comportement anormal relative à la chirurgie est faite par l'expérimentateur et le zootechnicien. Nous avons choisi cette lignée de souris pour les raisons suivantes : (1) les mères de cette souche ont un bon instinct maternel et prennent généralement bien soin des nouveau-nés, y compris ceux qui sont blessés ; (2) les portées sont plus nombreuses que chez les autres souches de souris, avec une moyenne de 12-14 nouveau-nés par portée ; (3) les nouveau-nés sont plus gros à la naissance (poids moyen = 1,6 - 1,8 g), ce qui augmente le taux de survie après une lésion de la moelle épinière. Une partie des animaux sera utilisée à un stade développemental précoce correspondant à la première, deuxième et troisième semaine postnatale. Un autre groupe d’animaux sera étudié à l’âge adulte (procédure 4), afin de valider l'efficacité de cette thérapie génique sur un système mature, mais également pour se rapprocher le plus possible des essais cliniques chez l'homme.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Une inflammation cérébrale leur est induite par injection intracérébrale d'une protéine bactérienne, et un accident vasculaire cérébral par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne, suivis de la pose d'un cathéter et d'une imagerie moléculaire, avant mise à mort pour immunohistochimie. Le porteur indique que l'AVC peut entraîner un affaiblissement transitoire de la patte avant et que la pose du cathéter provoque une douleur modérée. Il affirme que la biodistribution des particules d'imagerie doit être étudiée dans un organisme complet et que l'expérience ne peut être totalement remplacée par des études in vitro.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique d’origine vasculaire. Il s’agit d’un déficit aigu soudain qui survient à la suite de l’occlusion ou de la rupture d’un vaisseau cérébral. Notre étude sera basée sur l’expression de molécules d’adhésions qui sont impliquées dans la migration des cellules immunitaires au sein du parenchyme cérébral. Il a été montré dans la littérature que l’inflammation post-AVC jouait un rôle dans la physiopathologie de la maladie, c’est pourquoi il nous apparait pertinent de caractériser l’expression de ces molécules d’adhésion.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'implication des molécules d'intérêts lors d'une inflammation

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Nous allons injecter une protéine bactérienne inactive dans une région du cerveau spécifique afin d’induire une inflammation du cerveau (durée : inférieure à 30min). Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) Induction du modèle d'AVC par une injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne (durée : 1h30) Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) Imagerie moléculaire avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. De plus, l’injection de LPS en intra-striatale peut induire des effets indésirables sur les animaux. Le LPS est un PAMP, motif moléculaire associé à un agent pathogène, qui active la voie NF-κB par l'intermédiaire du TLR4 et induit l'expression de cytokines pro-inflammatoires telles que TNFα, IL-6 et IL-1β. Enfin, l'injection intraveineuse de traceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée. Des analgésiques sont prévus afin de limiter et minimiser autant que possible la gêne occasionnée. Concernant les souris ayant eu un AVC, il est possible de voir apparaitre un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l’AVC.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses en immunohistochimie

Remplacement

Avant toute étude in vivo nos particules ont été testées in vitro afin de vérifier leur bon fonctionnement et spécificité. Cela nous permet de réduire le nombre d’animaux en ne leur injectant pas de particules inefficaces. Les expériences in vivo ne peuvent être totalement remplacée par des études in vitro car nous avons besoin de mettre en évidence l’affinité de nos particules pour les molécules d’adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires dans un organisme complet. En effet ; l’étude de leur bio-distribution in vivo est un point essentiel à notre projet de recherche. Après les expérience d’imagerie, les animaux sont perfusé afin de récupérer les tissus. Des études de microscopie sont réalisées par la suite sur ces tissus afin de confirmer nos observations réalisées in vivo. Cela nous permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cage standards répondant aux normes européennes actuelles (directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur la grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des molécules d’adhésion cérébrale. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

10 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit quatre interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la création de pertes osseuses de la mâchoire et une greffe de six heures, le porteur comparant la douleur attendue à celle de l'ablation des dents de sagesse chez l'humain et signalant l'impossibilité de s'alimenter pendant 48 heures après chaque opération. Les mâchoires et les plaies sont prélevées après mise à mort pour évaluation histologique. Le porteur revendique l'intérêt de la technique pour réparer les "gueules cassées" et les "accidents de la face", et affirme qu'après des tests in vitro il devient "incontournable" de passer au modèle animal.

Objectifs

Il s’agit de pouvoir réparer les lésions des os de la face et du crâne en implantant des cellules souches là où la matière manque. Pour cela, notre équipe utilise les cellules mésenchymateuses issues de la pulpe dentaire, qui ne présentent pratiquement aucun risque de rejet. En effet, les cellules de la pulpe issues des dents et celles de la plupart des os de la face et du crâne ont une origine embryologique commune, ce qui explique l’intérêt de la pulpe dentaire pour réparer les os crânio-faciaux. A terme, les applications thérapeutiques pourront concerner aussi bien les os que les cartilages ou la dentition, et ainsi bénéficier à des maladies chroniques ou rares (rachitismes génétiques, maladies des os de verre) induisant de grandes pertes osseuses… Cette technique à fort potentiel peut également inspirer des thérapies pour réparer les « gueules cassées », militaires blessés de guerre ou en OPEX, civils accidentés de la route ou des sports à risques…

Bénéfices attendus

Cette nouvelle technique de greffe et particulièrement l’utilisation de cellules dérivées de la muqueuse orale apporte une avancé considérable en chirurgie maxillo-faciale reconstructrice. La perte importante de substance osseuse très fréquente dans les différents « accidents de la face » reste un obstacle majeur lors de ces chirurgies réparatrices. Les cellules issues de la muqueuse buccale ainsi préparées et amplifiées en laboratoire permettent de disposer d’une grande quantité de « biomatériaux » greffable comme substitue osseux. Elles ont le pouvoir de se différencier en ostéoblastes et n’induisent aucun rejet par le système immunitaire. Les premiers tests effectués ont montré une parfaite reconstruction à 2 mois de la greffe. Aujourd’hui il est important de connaitre l’évolution du greffon à long terme.

Procédures

Les animaux subiront 4 interventions chirurgicales sous anesthésie générale: -Prélèvement de tissus cutanés et gingivaux. Création de défaut osseux sur la mâchoire. (4h par animal) -Greffe osseuse au niveau des défauts induits (6h par animal) -Prélèvement des plaies cutanées et gingivales en cicatrisation. (2h par animal)

Impact sur les animaux

Suite au prélèvements du tissu gingival et des plaies palatines les animaux sentiront irritation du palais et une salivation excessive. L’ablation des dents, la réalisation des défauts osseux puis celle des greffes provoqueront une inflammation et une douleur similaire à l’ablation des dents de sagesse chez un humain. Pendant 48h après chaque intervention l’alimentation sous forme de granulés sec ne sera plus possible.

Devenir

La fin de la procédure nécessitera la mis à mort de l'animal car les machoires et les plaies seront prélevées pour une evaluation histologique et protéomique.

Remplacement

De nombreux tests préliminaires in-vitro sur explant ont permis de maitriser les différents paramètres de la greffe, à savoir le support à utiliser le type cellulaire et la stratégie d’analyse des résultats. Au terme de ces tests il devient incontournable de passer sur un modèle animal afin d'évaluer l'efficacité de la greffe dans un milieu complet ou interagissent les cellules greffées et le système immunitaire du receveur. Le mini-porc Aachner présente une mâchoire adulte aux environs de 18 mois et malgré quelques différences morphologiques les caractéristiques sont très proches de l'homme de par son alimentation omnivore. Le mini-pig permet une étude à long terme sans prise de poids qui rendrait la manipulation délicate.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum afin d’offrir des résultats statistiquement fiables. L’évaluation des cicatrisations cutanées gingivales et osseuses sont réalisé sur le même individu afin de diminuer d’autant le nombre d’animaux utilisés. A la fin des procédures, les animaux mis à mort seront prélevés pour l’évaluation de nos tests et les cadavres seront mis à disposition des étudiants vétérinaire pour des cours d’anatomie et d’autopsie. Plusieurs des organes comme les poumons, les reins, le cœur et la moelle osseuse seront donnés au laboratoire de recherches pour des études ex-vivo.

Raffinement

Afin d’éviter tout stress et tout inconfort des animaux, l’ensemble des procédures sera effectués sur des animaux totalement acclimatés. Un hébergement en groupes sociaux de 2 à 4 animaux, dans un milieu enrichi de jouets dédier. Une routine de soins avec un entrainement à la manipulation ce qui permettra une induction directement dans l’espace de vie sans aucune appréhension. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale avec intubation et analgésie morphinique. Les analgésies poste opératoire seront assurées par des patch de fentanyl à diffusion constante ce qui évite tout manque d’antidouleur dans l’organisme et assure une analgésie efficace et constante. Une couverture antibiotique post opératoire évitera tout risques infectieux. Après chaque procédure les animaux auront une nourriture adaptée sous forme de pâté liquide facilitant la mastication. En plus des nombreuses visites des soigneurs en post opératoire la surveillance est renforcé par un système vidéo continu. Les points limites ont aussi bien été établis en amont de l’étude. Les animaux atteignant un des points limites seront prises en charge par le stomatologue qui procédera aux soins adaptés puis les animaux seront vu par notre vétérinaire référent avant d’être envoyé vers un refuge adapté.

Choix des espèces

De nombreux tests préliminaires in-vitro sur explant ont permis de maitriser les différents paramètres de la greffe, à savoir le support à utiliser le type cellulaire et la stratégie d’analyse des résultats. Au terme de ces tests il devient incontournable de passer sur un modèle animal afin d'evaluer l'efficacité de la greffe dans un milieux complet ou inter-agissent les cellules gréffée et le systême immunitaire du receveur. Le mini-porc Aachner présente une machoire adulte au environs de 18 mois et malgrè des différences morphologiques des caractéristique très proches de l'homme de par son alimentation omnivore. les animaux seront agés de 15 à 20 mois qui correspond à l'age adulte et permet d'avoir des animaux avec une dentition définitive.

174 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. 114 reproduisent une sclérose latérale amyotrophique évoluant vers la paralysie et sont tuées aux stades symptomatique ou terminal, et 60 subissent une lésion chirurgicale du nerf sciatique suivie d'électromyographie sous anesthésie. Le porteur indique que le modèle de SLA est à "phénotype dommageable" et que la lésion du nerf provoque douleur et perte de mobilité, tout en pariant que la mutation étudiée n'aggravera pas ces atteintes. Il affirme qu'un modèle in vivo mammifère est "crucial" pour étudier les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Les formes génétiques de SLA sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Cependant, la plupart des mutations dans les gènes impliqués dans la SLA induisent plutôt un gain-de-fonction-toxique inconnu - difficile à étudier. Recemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA. Les mutations dans ce gène induisent une perte de la protéine, un phénomène plus facilement étudiable. Ce gène est impliquée dans la dégradation des protéines et la réponse immunitaire. Comme il a déjà été montré que les cellules immunitaires étaient impliquées dans la SLA, nous étudions plus spécifiquement le rôle de ce gène dans les cellules immunitaires du cerveau. Nous cherchons à savoir si des cellules immunitaires déficientes en ce gène produisent une réponse altérées à un stress des neurones, et si elles améliore ou au contraire altèrent les problèmes moteurs associés au stress.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intêret, un gène dont la mutation peut causer la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), dans les cellules immunitaires du cerveau. Si nous montrons que la perte de ce gène dans ces cellules est toxique, cela contribuerait à expliquer pourquoi des mutations dans ce gène peut causer la SLA. Si nous montrons au contraire que ces cellules immunitaires sans ce gène sont bénéfiques pour les neurones, cela pourrait en faire une cible thérapeutique pour ralentir le cours de la maladie chez tous les patients atteints de SLA.

Procédures

** • 114 souris d'une première lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront uniquement un suivi par pesée et test de la mesure de la force musculaire (2 minutes par souris) une fois par semaine. • La totalité de ces 114 souris seront euthanasiés au stade symptomatique (à 5 mois) ou terminale (à 6 mois) pour prélèvement des organes. Deux méthodes d’euthanasie distinctes seront utilisées, nécessaire pour l’analyse des differents types d'échantillons. • 60 souris d'une deuxième lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront une chirurgie sous anesthésie pour léser le nerf sciatique, à 4 mois (jeune), ou à 12 mois (agées). Elles recevront une analgésie 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant la chirurgie et les sutures seront désinfectées (5 min par souris). Tous les jours, on évaluera la paralysie de la patte par mesure de l’écartement entre les doigts de la patte (2 min par souris). En plus, au niveau fonctionnelle, la qualité de la réinnervation musculaire est evalué toutes les 3 semaines entre 6 et 18 semaines après lésion du nerf, par l'électromyographie, sous anesthésie (8 min par souris). Une analgésie sera faîte 30 min avant le début de l'électromyographie afin de prévenir toute gène dû aux piqures d'électrodes à leur réveil. • La totalité de ces 60 souris seront euthanasiés 1 semaine ou 5 mois après lésion du nerf, pour prélèvement des organes d'intéret.

Impact sur les animaux

** Modèle de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) : Le modèle souris transgénique de SLA est un modèle à phénotype dommageable. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt améliorer le phénotype. Lésion du nerf sciatique chez la souris: Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours. Il y aura aussi une diminution (transitoirement) de leur mobilité. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt augmenter la vitesse de la régénérescence. Mesure de la réinnervation musculaire par l'électromyographie: L'application de l'électromyographie peut éprouver de la douleur au réveil des souris.

Devenir

** Tous les animaux dans les procédures sont utilisées à la fin de la procedures pour des analyses (histologique ou durée de la maladie) - et donc euthanasiées.

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocol, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion de notre gène d'intêret, pour tester si elles répondent différemment que les cellules microgliales contrôles - à un stimulus inflammatoire. Nos résultats étant prometteurs, nous avons donc décidé de passer à des expériences plus complexes, in vivo. Comme notre question concerne les intéractions entre les motoneurones et les cellules immunitaires, un modèle in vivo est crucial. Des intérations aussi complexes seraient difficiles à modéliser en culture.

Réduction

Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour l'étude de l'effet sur les souris modèles de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), le modele de la maladie humaine avec phenotype dommageable, nous avons besoin de 20 souris par génotype. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique dans les souris SLA - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la SLA. Pour l'analyse des organes à deux differentes stades de la maladie, on a besoin 6 souris par génotype (nombre minimal de souris nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). Le nombre d'animaux utilisés pour cette premiere partie est de 114. Pour l'étude de la lésion du nerf sciatique, nous utilisons une lignée transgénique avec modification de notre gène d'interet, mais sans phenotype dommageable. Nous aurons besoin de 5 souris/génotype pour s’assurer une analyse finale robuste (nombre minimal nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). L'analyse doit être fait à 2 stades différentes: pendant la régénérescence, et après régénérescence complète, pour déterminer les effets sur la vitesse et l'éfficacité. Et à 2 âges differentes, jeune et agé, pour déterminer l'effet du vieillissement sur la capacite regenerative du nerf. Pour la suivie de la régénérescence complète du nerf, 2 méthodes complémentaires sont nécessaires: la première mesure le niveau de la régénérescence du nerf (chaque jour), la deuxième mesure le niveau de la ré-innervation musculaire (à 2 stades pendant régénérescence). Le nombre d'animaux utilisés pour cette deuxième partie est de 60. Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 174.

Raffinement

** Pour la stimulation environnementale (enrichissement), nous utilisons toujours des petites maisons en carton et des fibres en carton permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage) et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Pour les souris modèles de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), les souris montrant des signes de paralysie sont surveillées quotidiennement par un expérimentateur. Un mélange de poudre de nourriture et d'eau est proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une deshydratation et une dénutrition. Un soin particulier est apporté aux yeux des souris partiellement paralysées qui peuvent être salis. Proche du stade terminal, les souris sont surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours. Pour la lésion du nerf sciatique, nous allons léser un seul nerf sciatique pour éviter que la souris ne soit trop paralysée durant la première semaine après la chirurgie. Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours mais qui sera bien pris en charge, pré- et post- opératoire par des analgésiques. Durant la première semaine après la chirurgie, nous ajoutons de la nourriture en poudre avec de l’eau directement dans la cage, car le membre opéré est partiellement paralysé. Les femelles sont hébergées entre 2 et 4 par cage, entre femelles ayant subi la chirurgie au même moment. Pour la mesure de la réinnervation musculaire par l'électromyographie, ce test peut éprouver potentiellement de la douleur au réveil des souris, mais qui sera pris en charge, pré-opératoire par des analgésiques. Pour les deux procédures, des points limites sont définis : les souris doivent impérativement être euthanasiées si elles les atteignent.

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère (pour l'étude, souris SLA), mais aussi dans un système nerveux périphérique à la jonction entre motoneurone et muscule de membres éloignés (pour l'etude, lésion du nerf sciatique). Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Nous avons une grande expérience avec les souris, et les deux modèles (SLA et lésion du nerf sciatique) sont mieux établis chez la souris que chez le rat; c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Dans un premier temps: l'étude de l'effet sur le phénotype des souris SLA et étude histologique du stade terminale. Les souris SLA atteignent le stade terminal vers 6 mois. Pour l'étude histologique du stade symptomatique avant le stade terminal, les souris sont utilisées at 5 mois (quand la perte de pois atteigne 10 pourcents). Dans un deuxieme temps: l'étude du nerf sciatique dans les souris avec modification du gène d'intêret : la chirurgie est faite au stade adulte/jeune à 4 mois, et au stade adulte/agée à 12 mois - suivi de 1 mois (pour étudier la régénérescence complète/efficacité) ou 1 semaine (pour étudier la vitesse de la régénérescence).

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine dans une artère cérébrale, avec pose d'un cathéter et IRM sous anesthésie, avant prélèvement du cerveau pour séquençage. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un affaiblissement transitoire d'une patte antérieure correspondant à la zone lésée. Il affirme que les techniques sans animaux ne fourniraient pas le même niveau d'information et revendique une première mondiale de séquençage sur ce modèle.

Objectifs

Nous proposons ici de caractériser les acteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans les différents sites d’inflammation survenant dans un modèle d'accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) pertinent et original développé dans notre laboratoire. Pour cela, nous allons nous tourner vers une approche non biaisée basée sur l’utilisation du séquençage de cellules uniques. Le transcriptome obtenu va nous fournir de nouvelles informations sur la diffusion spatiale et temporelle de la réponse inflammatoire survenant à la suite d'un AVCi. Les résultats de cette étude pourraient mener au développement d'outils de diagnostic et de traitements efficaces dans la prise en charge des patients touchés par un AVCi.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous prévoyons d’être la première équipe de recherche à séquencer les différents sites d’inflammations dans un modèle pertinent d’AVCi. Le séquençage de cellules uniques est une technique innovante permettant de générer un atlas de l’expression des gènes pour chaque cellule d’un échantillon. Ainsi, cette technique nouvelle permet d’étudier les changements transcriptomiques survenant dans une pathologie avec un niveau de résolution inégalé. Ce projet pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant le développement de nouveaux médicaments pour traiter les AVCs.

Procédures

Un modèle d'ischémie cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne sera réalisé grâce à une chirurgie. De plus, la pause d'un cathéter veineux et l'IRM de l'inflammation seront réalisés. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale et avec une couverture analgésique adaptée. Les interventions chirurgicales ainsi que les examen IRM ne dépasseront pas une heure de durée et seront réalisés une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparait dans la première semaine après l'AVC. De plus, l'injection intraveineuse de traceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie et de séquencage.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action de traitements des AVC. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. La technique de séquençage de cellules uniques présente un intérêt dans le séquençage de tissus fraichement prélevés sur des modèles in vivo. En effet, cette technique permet l'étude de l'expression des gènes de chaque cellule d'un tissu, permettant ainsi d'apprécier la diversité des types cellulaires cérébraux, diversité que l'on ne peut pas atteindre avec des techniques de cultures in vitro ou des approches in silico.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilise est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilises.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant a ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur la grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pre et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la réponse inflammatoire survenant lors des AVC ischémiques. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines, correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chacun est opéré sous anesthésie pour l'implantation d'un cathéter abdominal, puis subit des dialyses péritonéales répétées jusqu'à cinq fois par jour sur animal vigile, avec prises de sang. Le porteur indique des douleurs liées au cathéter, des inflammations, des pertes de poids et des risques d'infection bactérienne, et précise que l'observation des organes abdominaux en fin d'étude interdit de garder les animaux en vie. Ces essais servent à constituer des dossiers précliniques pour la mise sur le marché de produits de dialyse, le porteur jugeant le recours à un animal de gabarit suffisant "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à développer un modèle de dialyse péritonéale chez l'animal en vue d'étudier l'efficacité des produits à tester, répondant ainsi aux besoins scientifiques et cliniques actuels. Ces études entreront dans la constitution de dossiers précliniques, étape nécessaire à l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché et à l'utilisation clinique de ces produits chez l'humain. La tolérance locale (effet d'un produit étranger sur les tissus vivants avec lesquels il est mis en contact) pourra également être évaluée. La dialyse péritonéale est une technique qui permet de participer à l'évaluation des toxines produites par l'organisme et présentes dans le sang pour compenser une fonction rénale défaillante. Pour cela, un liquide appelé dialysat est injecté dans la cavité abdominale via un catheter. Il se trouve en contact avec le péritoine, membrane semi-perméable qui tapisse cette cavité. Les petites et moyennes molécules déchets de l'organisme présentes dans le sang pourront alors passer à travers cette membrane pour se concentrer progressivement dans le dialysat. Le dialysat ainsi chargé des déchets sera enfin retiré de la cavité abdominale par le catheter. Ces étapes seront répétées jusqu'à plusieurs fois par jour ou la nuit, selon la sévérité de l'insuffisance rénale du patient. De part sa simplicité de mise en place et de réalisation, la dialyse péritonéale représente une alternative intéressante à l'hémodialyse, qui nécessite un important appareillage, des déplacements en centre de dialyse, etc. La dialyse péritonéale peut être gérée à domicile par le patient luimême de façon autonome ou assistée. Les dialysats doivent donc être évalués pour prouver leur efficacité et sécurité. Du fait du contact étroit entre le dialysat et les organes obdominaux (digestifs, reproducteurs...), il est essentiel de prouver leur absence de toxicité avant leur mise sur le marché, d'autant plus qu'ils seront utilisés chez des patients fragiles atteints d'insuffisance rénale avancée. Afin d'étudier l'efficacité et la sécurité des dialysats, le recours à des modèles animaux de taille suffisante (ex : lapin) sont nécessaires. Ces modèles animaux permettent d'évaluer l'efficacité de la filtration du dialysat par le péritoine, en comparant les quantités de dialysat injectées et récupérées par exemple. La sécurité peut également être évaluée dans ces modèles par analyses des tissus qui ont été au contact avec le dialysat.

Bénéfices attendus

Grace à l'élaboration d'un modèle animal fiable et reproductible, les données de sécurité et de performance obtenues au cours des études permettront de répondre aux exigences réglementaires et de qualité attendues des prouits de santé pour dialyse péritonéale mis sur le marché. Un tel modèle animal pourra permettre par exemple de sélectionner parmi un panel de produits en développement celui présentant le plus de bénéfices, en comparant leurs données de performance et de sécurité. De tels essais sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre d'animaux utilisés, en poussant seulement le développement des produits les plus intéressants et en écartant rapidement des recherches les produits ne présentant pas des qualités de sécurité ou de performance suffisamment satisfaisantes. Une fois le produit le plus intéressant sélectionné, ce modèle animal permet aussi de comparer ce produit en développement à d'autres déjà commercialisés, pour s'assurer qu'il représente un bénéfice au moins égal ou supérieur.

Procédures

L’ensemble des animaux sera opéré sous anesthésie générale et traitement analgésique pour placer le cathéter péritonéal au niveau de la cavité abdominale de façon stérile. L'intervention est estimée à environ 30 minutes par lapin. Les dialyses péritonéales consisteront en l’injection du dialysat via le cathéter, à une période de stase, puis au drainage du dialysat via le cathéter. En général, la durée de stase va de quelques minutes à plusieurs heures afin d’être représentatif d’une dialyse réalisée chez l’homme (exemple : 60 minutes de stase chez le lapin correspondent à 2h chez l’homme). Les dyalises peuvent être répétées plusieurs fois par jour (en fonction de leur durée) et au maximum 5 fois par jour. Les dialyses n’étant pas douloureuses, elles seront réalisées sur animaux vigiles. Enfin, des prises de sang pourront être réalisées sur les animaux (vigiles ou sous anesthésie) en cours d’étude.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables connus pouvant survenir chez l’animal sont : une douleur liée à l’implantation du catheter, l'inflammation de la zone opérée (abdomen), la perte de poids ou d’appétit en lien avec l'anesthésie ou la chirurgie, les infections bactériennes, le stress induit par les manipulations répétées des animaux les jours de dialyses.

Devenir

Afin de s’assurer de la sécurité des produits de dialyse péritonéale, une observation de la cavité abdominale et des organes abdominaux est nécessaire. Ceci permet d’évaluer la performance et la tolérance locale de ces produits, ce qui est l’objectif des études réalisées sur ce modèle animal. Des prélèvements de tout ou partie de certains organes peuvent éventuellement être nécessaires, en particulier en cas d’anomalie constatée, pour évaluer les effets tissulaires à l’échelle microscopique. L’ensemble de ces facteurs explique l’impossibilité en fin d’étude de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

Les échanges moléculaires s'effectuant à travers la membrane péritonéale sont complexes. Des modèles informatiques ou in vitro permettent d'apporter certaines connaissances sur ce point. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de fournir l'ensemble des réponses nécessaires à l'évaluation de la performance et de la sécurité des produits de dialyse péritonéale en vue de leur utilisation chez l'humain. Pour l'heure, les interactions complexes s'établissant entre le produit infecté et la membrane péritonéale ne peuvent être recrées ex vivo.

Réduction

Grâce à l’apport des méthodes n’ayant pas recours à l’utilisation d’animaux vivants (modèles informatiques ou in vitro tels que des courbes d’osmolarité…), il est possible de déterminer en amont les meilleures concentrations de produit de dialyse péritonéale à injecter chez l’animal. Ainsi, dans la phase in vivo du développement de ces produits de santé, il est possible de tester uniquement les concentrations approuvées par les techniques ex vivo, ce qui réduit drastiquement le nombre d’animaux devant être utilisés. Par ailleurs, le donneur d’ordre demandant la réalisation de ces tests s’engage à ne pas faire renouveler à l’identique un essai déjà mené précédemment. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit évalué avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d’utiliser un même groupe « contrôle » pour plusieurs groupes « test » recevant des produits à tester différents. Enfin, nous avons déjà mentionné la possibilité de réaliser des études pour sélectionner parmi un panel de produits celui qui présente le plus d’intérêt à être développé, réduisant ainsi le nombre de tests réalisés sur des produits ayant un intérêt moindre. Par ailleurs, si l’effet attendu d’un produit est trop incertain, il est possible de réaliser une étude dite « pilote » sur quelques animaux seulement. Les résultats de cette première étude à petite échelle servent à confirmer ou infirmer les interrogations concernant ce produit. Une étude à plus large échelle, incluant le nombre d’animaux nécessaire sur le plan normatif ou statistique, ne sera alors réalisée qu’une fois les doutes levés.

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie d’implantation du catheter, une période d’habituation aux actes spécifiques (massage abdominal, contention…) peut aussi être réalisée pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcés en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). Les animaux sont suivis de façon quotidienne, 7 jours sur 7. En phase post-opératoire, ces suivis sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements, désinfection des sites chirurgicaux à chaque réfection de pansement…). En cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, l’équipe vétérinaire assure l’examen clinique et le suivi de l’animal, afin de mettre en place une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. - le risque d’infection : un traitement antibiotique peut permettre de contrôler ce risque. - la perte de poids ou d’appétit en lien avec l’anesthésie ou la chirurgie : Un suivi quotidien du transit et de l’alimentation est systématiquement mis en place à la suite des chirurgies chez le lapin, et ce jusqu'à la reprise d'un comportement alimentaire normal. En cas d’apparition de symptômes de ce type, des mesures seront mises en place : distribution d’aliments plus appétants (légumes frais, friandises…), mise à disposition d’un aliment de convalescence, voire distribution à la pipette pour aider à relancer la prise alimentaire spontanée.

Choix des espèces

La réalisation de la chirurgie et l'utilisation des produits de dialyse péritonéale nécessitent que la cavité abdominale soit d'une taille suffisante. Ceci permet une mesure précise des volumes administrés et récupérés, autorisant un calcul fiable de l'efficacité de filtration. Le choix d'un animal de gabarit assez important est également éncessaire pour permettre la réasliation de prises de sang d'un volume suffisant à l'évaluation de l'efficacité de la dialyse, tout en respectant les volumes maximums pouvant être prélevés sans avoir d'impact délétère sur les animaux. Pour cela, le lapin est un modèle reconnu pour la réalisation de ce type de tests, du fait de son gabarit adapté et des similitudes constatées entre la structure de leur péritoine et celle du péritoine humain. L’utilisation d’animaux adultes d’un poids minimum de 2,5 kg lors de la chirurgie est recommandée, afin de limiter les risques liés à l’anesthésie et de permettre la mise en oeuvre des techniques chirurgicales et post-opératoires adéquates.