Procédures sévères
Test d’une nouvelle génération de vecteurs pour la Sclérose Latérale Amyotrophique liée aux mutations SOD1 chez un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 460, modéré pour 130 et sévère pour 130. Issues d'une lignée transgénique qui développe une sclérose latérale amyotrophique, elles perdent du poids vers 90 jours puis se paralysent jusqu'à la mort vers 130 jours, une partie étant suivie jusqu'à ce point limite. Elles reçoivent une injection dans la moelle épinière et une injection dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins et des tests moteurs répétés, pour tester des vecteurs de thérapie génique visant à réduire la protéine SOD1 toxique. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie qui se traduit par la perte des motoneurones (cellules de la moelle épinière) et conduit à la paralysie puis au décès des patients dans un délai de 5 ans après le diagnostic. La maladie se présente sous forme sporadique (90% des cas) ou héréditaire (10%). 20% de la forme héréditaire sont dus à une mutation dans le gène SOD1 et sont à l'origine d'une accumulation de la protéine correspondante dans les cellules, entrainant toxicité et mort cellulaire. C’est sur cette forme de la pathologie que notre projet est focalisé. A l'heure actuelle il n’existe pas de traitements efficace chez l’Homme. L’étude sera réalisée sur une souche de souris transgéniques qui est le modèle le plus communément utilisé dans l’étude de cette maladie car les animaux développent les même symptômes que les patients. Ces animaux déclarent les premiers symptômes à 90 jours, puis leur état général se dégrade jusqu’à la mort à 130 jours environ. Ayant démontré l’efficacité d'une thérapie génique dans la SLA, nous avons maintenant pour but d’optimiser cette thérapie génique en testant l'efficacité d'une nouvelle génération de vecteurs, afin de diminuer la dose de vecteur à injecter (ce qui permettrait de réduire les effets secondaires tels qu’une réaction immunitaire, une toxicité…) tout en gardant l’efficacité du premier produit testé.
Bénéfices attendus
Ce projet mené à terme nous permettra de constater l'efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur l'augmentation de la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes, avec pour objectif à long terme, de proposer un traitement dans le cadre de thérapies géniques dans la Sclérose Latérle Amyotrophique chez l'homme. Il n’existe actuellement aucun traitement dans cette maladie
Procédures
Les souris élevées pour ce projet sont susceptibles de développer un phénotype dommageable caractérisé par une perte de poids vers 90 jours puis une atteinte musculaire conduisant à la paralysie (vers 120 jours) puis la mort de l'animal. Un prélèvement de queue sera réalisé sur ses souris vigiles afin de vérifier si elles sont ou non porteuses du gène qui nous intéresse. Une anesthésie locale sera réalisée par immersion de la queue de l'animal dans de l'éthanol refroidi. Ce geste ne nécessite que quelques secondes. 4 différentes interventions auront lieu au cours des différentes procédures dont 2 sur souris anesthésiée et 2 sur souris vigiles ; une unique injection intramoelle à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 15 minutes, une unique injection intracérébroventriculaire à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 30 minutes, des prélèvements de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sur souris vigiles, tous les 20 jours de J40 jusqu’au point limite. 1 minute suffit pour réaliser ce geste et, sur souris vigiles, tests comportementaux (pesée, test de force musculaire, neuroscore et test de coordination motrice) une fois par semaine de J50 jusqu’au point limite. Le temps total pour réaliser ces tests comportementaux n’excède pas 20 minutes par souris ; le neuroscore et la pesée sont réalisés l’un après l’autre avec une durée totale d’environ 1min, suivi par le griptest, qui nécessite moins de 5 minutes pour les 3 mesures. Pour finir, le rotarod a une durée totale inférieure à 10 minutes avec 2 mesures (de 2minutes maximum) avec 5 minutes de repos entre les 2. Concernant l'euthanasie, les animaux pour lesquels des prélèvements seront réalisés seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte qui se caractérise par une dégénérescence progressive des motoneurones. Elle provoque une paralysie progressive de l'ensemble des muscles. Les souris utilisées pour la survie présenteront donc des signes de dégénérescence comme la paralysie des pattes et/ou du bassin. Cela entrainera des difficultés pour se déplacer, s'hydrater et s'alimenter. Les différentes procédures réalisées chez l’animal (intramoelle, injection intracérébroventriculaire) sont à même d’entraîner une douleur post-opératoire. Le prélèvement caudal ainsi que les prélèvements sanguins peuvent également être une source de stress et de douleur de courte durée. Les différents tests fonctionnels réalisés chez la souris (pesée, neuroscore, test de force musculaire, test de coordination motrice et neuroscore) peuvent également entraîner un stress chez l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode justifiée pour chaque procédure afin de prélever tous les organes nécessaires à la réalisation des analyses biochimiques et histologiques prévues dans notre étude. Ces prélèvements sont réalisés post-mortem et nécessite donc l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle cellulaire n’existe pour pouvoir mener une étude pré-clinique dans la Sclérole Latérale Amyotrophique. Le modèle animal est indispensable pour optimiser et développer notre approche de thérapie génique pour cette maladie. Ce modèle, particulièrement bien caractérisé, nous permettra de quantifier l’efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé, les groupes seront constitués du nombre minimal nécessaire à une interprétation statistique viable. Si possible, les études seront réalisées sur des animaux du même sexe, afin, encore une fois, d'utilisé un nombre minimal d'animaux. Les animaux ne répondant pas aux exigences pour l’étude (porteur ou non de la maladie) seront systématiquement proposés pour d’autres études déjà validées. De plus sur chaque animal utilisé un maximum d’échantillons biologiques sera prélevé pour parer à toute nouvelle analyse à effectuer. Ce qui nous donne : 45 femelles SOD impliqué pour la procédure 2, 35 femelles B6SJL pour la procédure 3, 50 femelles SOD pour la procédure 4 et 65 mâles et 65 femelles SOD pour la procédure 5. Pour la procédure 1, il y aura également 16 mâles reproducteurs ainsi que 380 animaux non inclus en protocole mais nécessaire pour générer les souris en protocole ainsi que 64 souris supplémentaires pour garantir le bon nombre de souris au phénotype attendu, ce qui nous donne un nombre total de 720 souris.
Raffinement
Les animaux seront regroupés par groupe de 6 animaux du même sexe au maximum. Si des bagarres entre mâles sont observées, ceux-ci seront séparés immédiatement. Dans chaque cage un enrichissement sera apporté sous forme de papier craft pour la confection des nids, voir avec des abris en carton si besoin. Lors des injections, un anesthésiant adéquat sera utilisé et la qualité de l'anesthésie testée avant de procéder aux expérimentations et une analgésie adapté apporté si nécessaire. Enfin chaque animal sera suivi quotidiennement de sa naissance à sa mort et un contrôle du poids réalisé une fois par semaine avant l'apparition des symptômes de la maladie et autant de fois que nécessaire après l'apparition des symptômes afin de contrôler précisément les points limites qui, une fois atteint, entraineront automatiquement l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance excessive. De plus pour minimiser le stress des animaux, ceux-ci seront manipulés tout au long de l’expérimentation par un nombre limité de personne pour créer une habituation souris/manipulateur. De plus, les souris seront hébergées dans une salle réservée à notre équipe, ce qui limitera les venues dans la pièce et donc, le stress des animaux. Il est à noter qu’un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Quelque soit la procédure, en cas de douleur aigue, les animaux seront immédiatement euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus communément utilisés pour les projets de thérapie génique pour le traitement de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) sont des lignées murines. Dans notre projet nous utiliserons le modèle murin transgénique pour la SLA. Ce modèle reproduit les principaux symptômes de la SLA et est par conséquent adapté pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur la forme génétique de la maladie. Les animaux présentent des symptômes à partir de 90 jours (perte de poids) due à une accumulation de la protéine SOD1 entrainant une paralysie progressive à partir de 115 jours et la mort des animaux à 130 jours. Les animaux seront injectés à l’âge de 50 jours. Ce stade correspond à des animaux adultes pré-symptomatiques pour lesquels l’accumulation de la protéine toxique SOD est déjà commencée. Ce stade est idéal pour mimer un traitement puisque la pathologie est déjà présente et décelable (biochimie) mais les conséquences ne sont pas encore irréversibles.
Cartographie fonctionnelle et spatiale du tPA endogène au cerveau, en conditions normales ou ischémiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 10 tuées sans réveil. Une lignée génétiquement modifiée rend le tPA cérébral fluorescent, et une partie des souris subit un accident vasculaire cérébral provoqué au laboratoire, suivi d'une imagerie à trois, six, douze et vingt-quatre heures avant le prélèvement du cerveau. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires, une détresse et des déficits fonctionnels, l'objet étant de cartographier l'origine cellulaire de cette protéase. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours à la souris et l'absence de méthode de remplacement.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est aussi un élément clef dans le système nerveux central (SNC), mais l’élucidation des sources cellulaires de tPA est limitée par un manque d’outils de détection fiable. Cette question est pourtant majeure, pour comprendre comment le tPA favorise ou limite les fonctions et la survie neuronale. L’objectif de cette première étude est de mieux comprendre l’origine cellulaire et les fonctions du tPA dans le SNC par des approches ex vivo/in vivo en se basant sur un nouvel outil original d’étude : une souris génétiquement modifiée, qui d’une part exprime le tPA (associé à une protéine fluorescente) pour le rendre détectable, et d’autre part permet de déléter spécifiquement celui-ci dans les cellules du SNC sans altérer son expression dans les autres compartiments. Cette lignée de souris sera utilisée pour des études histologiques et fonctionnelles, en conditions physiologiques ou dans un modèle d’AVC ischémique développé au laboratoire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles pour comprendre le rôle complexe d’un acteur clef de la physiopathologie cérébrale. Cette meilleure compréhension permettra d’identifier des cibles thérapeutiques pour la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
Procédure 1 : Prélèvement sous anesthésie (sans réveil). Procédure 2 : - Chirurgie sous anesthésie ; évaluation des lésions cérébrales et des transformations hémorragiques par imagerie cérébrale : J+3h, J+6h, J+12h, J+24h. - Prélèvement sous anesthésie (sans réveil)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : une perte de poids/arrêt de la prise alimentaire et de boisson, des douleurs post-opératoires, des signes de détresse, du stress, des déficits fonctionnels.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser autant que possible le nombre minimal d’animaux adéquat, afin de correspondre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés pour les résultats de l’étude comprendront des tests non-paramétriques (Test de Kruskal-Wallis, suivi du test post-hoc de Dunn’s) ou un t-test si la distribution des échantillons suit une loi normale (Shapiro-Wilk).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Etude de l’interaction neurone-microglie et son lien avec la fonction motrice dans un modèle murin inflammatoire de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalite auto-immune leur est induite par injection pour reproduire une sclérose en plaques, provoquant troubles de la marche, faiblesse musculaire et perte de poids, avant une série de tests moteurs sur couloir filmé, grille d'agrippement et tapis roulant. Le porteur veut mesurer si un entraînement physique modéré module le dialogue entre neurones et microglie et favorise la rémyélinisation, les applications pour les patients restant formulées au conditionnel. Il indique travailler d'abord sur des modèles in vitro et ex vivo, mais conclut que le modèle murin est "ultimement nécessaire".
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, démyélinisante et dégénérative du système nerveux central et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation dans lesquelles l’organisation des fibres myélinisées est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules microgliales, cellules immunes du système nerveux central sont activées précocément lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Dans ce projet nous souhaitons étudier le lien potentiel entre les interactions microglie-neurones et l’évolution du déficit moteur dans un modèle murin de sclérose en plaques. Nous voulons de plus évaluer comment un entrainement physique d’intensité modérée durant la phase de réparation pourrait influencer les interactions microglie-neurones et ainsi moduler la rémyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des interactions neurones-microglie dans la sclérose en plaques. La mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité physique sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurone-microglie pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.
Procédures
Les animaux sont entrainés à effectuer des tests comportementaux non invasifs durant une semaine (sessions de maximum 10 min/jour par animal). Ensuite, nous immunisons les souris pour induire l’encéphalite expérimentale auto-immune, le model murin inflammatoire de sclérose en plaques. Le jour de l’induction deux types d’injections sont nécessaires, en injection sous-cutanées et par voie intrapéritonéale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Les animaux ayant déclenché la maladie seront amenés à effectuer de nouveaux les tests comportementaux non invasifs auxquels ils étaient préalablement entrainés. Durant ces tests, les animaux seront amenés à marcher dans des couloirs équipés d’une caméra ou de capteurs mesurant automatiquement les caractéristiques de la marche, agripper une grille avec les quatre pattes pour mesurer la force musculaire ou marcher sur un tapis roulant. Tous les tests ont une durée courte (maximum 10 min/session) avec des intervalles de repos de minimum 2 heures par souris et n’entrainent pas de stress émotionnel ou physique pour les animaux. Les animaux sont euthanasiés en fin d’étude par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.
Impact sur les animaux
Nous étudions un modèle murin de démyélinisation inflammatoire, l’encéphalite auto-immune expérimentale, fréquemment utilisé pour étudier la sclérose en plaques. Après immunisation, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement sur 3-5 jours suivis d’une récupération partielle ou complète. Aucun autre effet délétère n’est attendu chez les animaux en rapport avec les tests fonctionnels et l’activité physique mais une fatigue et un stress léger sont possibles. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation des souris et la douleur des injections sous-cutanées étant très courte (2 à 3 minutes), le risque de défaillance cardio-respiratoire est infime.
Devenir
Des prélévements et analyses sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de cette pathologie.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 150, après des expériences pilotes, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul de puissance après utilisation initiale de 8 à 10 animaux par condition, selon l’expérience considérée. Des tests paramétriques, des tests de corrélation et de régression linéaire seront utilisés pour l’analyse statistique des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement à température et d’hygrométrie contrôlées, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs, sous la supervision de la structure bien être animal du vétérinaire désigné. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft), cachette (maisonnette, dôme) et/ou bâtonnet à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Nous mettons en place des points-limites définis en accord avec le vétérinaire ainsi qu’un suivi quotidien par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Concernant les tests comportementaux, les animaux ont des phases d’habituation et de repos adaptés aux différents tests effectués.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. Le modèle d’encéphalite autoimmune expérimentale chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques, permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Des animaux adultes C57BL6, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’encéphalite autoimmune expérimentale seront utilisés pour cette étude. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’encéphalite autoimmune expérimentale et faire les tests comportementaux envisagés. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs bien les conditions d’initiation de la sclérose en plaques chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
étude de la modulation de l’extinction de la memoire
- Formation professionnelle
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 90 opérées puis tuées sans réveil et 30 soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet n'est pas de produire des connaissances mais de former des étudiants de master et de thèse à l'implantation de canules dans le cerveau et à un test d'extinction de la mémoire de peur liée à un contexte. Après une chirurgie d'une heure, les souris subissent plusieurs séances d'exposition puis une injection intracérébrale, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau. Le porteur affirme que ces techniques, une fois maîtrisées par les stagiaires, réduiront le nombre d'animaux utilisés dans leurs propres laboratoires.
Objectifs
Nous proposons de former de nouveaux chercheur, des étudiants en master et des étudiants en thèse, sur les méthodes modernes de mesure d’activités neuronales impliquées dans la codification de la memoire. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et de comportement leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et de comportement leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.
Procédures
Les animaux suivront une chirurgie (1 heure) qui permettra l’implantation de deux canules intracérébrales. Deux semaines plus tard, les animaux suivront un test comportemental qui permet d’évaluer la formation et la disparition de la mémoire de peur liée à un contexte spécifique. Ce test comprend : 4 jours d’habituation à la manipulation de l’expérimentateur. (Entre 3 et 5 minutes par jours). Test jour 1 : 1 fois 3 minutes. Test jour 2 : 1 fois 5 minutes. Test jour 3 : 6 fois 2 minutes (intervalle 1 heure) À la fin de la dernière exposition, les animaux recevront une injection dans la canule intracérébrale. 5minutes/hémisphère = 10minutes total. Test jour 4 : 1 fois 2 minutes. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé.
Impact sur les animaux
- Nuisances liées à la procédure chirurgicale : douleurs post opératoires, perte de poids, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration de la canule. - Nuisances liées au test comportemental : stress, douleur, agressivité vers les congénères. - Nuisances liées à la connexion des animaux au niveau de la canule : stress de la contrainte de la contention auquel l’animal doit s’habituer. - Nuisances liées aux injections intracérébrales: stress, risque mineur d’infection.
Devenir
Les animaux ayant suivi la chirurgie et le test comportemental, seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques. Les animaux ayant suivi que la procédure chirurgicale (sans réveil) seront euthanasie par dislocation cervicale.
Remplacement
Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est inévitable car aucun modèle in vitro ne permet l’étude des circuits neuronaux impliqués dans la modulation de la mémoire de la peur. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux
Réduction
L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.
Raffinement
Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil ainsi que pendant les jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Afin de palier le stress lie à la manipulation, un programme d’habituation est mis en place.
Choix des espèces
La souris est la espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système central est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.
Evaluation de molécules à visée thérapeutique dans des modèles de cystite interstitielle (chronique ou aigu) chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
8 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 410 d'entre eux et sévère pour 7 090. Une cystite interstitielle leur est induite par injection de cyclophosphamide, avant l'administration de molécules candidates, l'application répétée de filaments de force croissante sur l'abdomen pour mesurer la douleur, un placement en cage à métabolisme et, pour certains, une chirurgie d'implantation de cathéters vésicaux pouvant provoquer saignements et hémorragies. Le porteur indique que les rats ressentiront douleurs abdominales, brûlures vésicales et mictions fréquentes, et qu'il ne peut pas anticiper les effets des molécules testées, dont il ignore la nature. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la maladie et conclut que le recours aux rats est "incontournable".
Objectifs
Actuellement, le modèle expérimental de cystite interstitielle le plus utilisé au sein de la communauté scientifique internationale est le modèle cyclophosphamide (CYP) aigu ou chronique de par son induction aisée (injection i.p. de CYP) et de ses symptômes proches de la clinique humaine. Ce modèle est donc particulièrement adapté pour tester des candidats médicaments ciblant cette pathologie pour laquelle il n’existe toujours pas de traitement efficace. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans des modèles de cystite interstitielle aiguë ou chronique induits par le CYP chez le rat (évaluation nociceptive et / ou de la fonction vésicale).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de cystite interstitielle.
Procédures
Les animaux recevront une ou plusieurs administrations intrapéritonéales de cyp pour induire la pathologie. En parallèle, ils seront administrés avec des candidats médicaments (voies d’administration dépendantes de chaque protocole expérimental). De plus, les animaux subiront plusieurs fois un test comportemental qui consiste en l’application de filaments de force croissante sur l’abdomen des animaux et d’observer leur comportement. Tous ces gestes sont très rapides mais peuvent procurer un stress à l’animal du fait de la contention, de la douleur de l’aiguille. En parallèle du test de comportement, les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme pendant 24 H maximum pour évaluer leur profil mictionnel. Ils pourront également subir une chirurgie pour l’implantation de cathéters extériorisés afin de réaliser une cystométrie. Cette chirurgie assez rapide (environ 20 minutes) peut induire des douleurs post-opératoires (même avec l’utilisation d’antalgiques), des saignements voire des hémorragies… Des prélèvements sanguins durant l’expérimentation ou en terminal juste avant la mise à mort pourront être réalisés sur animal vigil ou anesthésié (geste rapide).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Nous allons induire une cystite interstitielle aux animaux, par conséquent ces derniers vont ressentir les symptômes de cette pathologie telles que des douleurs abdominales, une augmentation de la fréquence des mictions, des sensations de brûlures vésicales, une perte de poids possible.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés et des prélèvements de tissus pourront être réalisés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la cystite interstitielle. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Ce modèle est très bien établi dans notre laboratoire et nous le réalisons en routine. De par notre expérience et en accord avec la littérature, un nombre de 10 animaux par groupes expérimentaux est le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement différents et interprétables. Des t-tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes et des tests ANOVA pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes). De plus, étant donné que nous souhaitons modifier les doses de cyp dans le modèle chronique suite à une demande de l’un de nos clients, une étude pilote sera réalisée afin de redéfinir les doses efficaces et de limiter le nombre d’animaux utilisés (utilisation d’animaux d’un autre protocole possible). Dans cette procédure, des méthodes non invasives pour l’évaluation de nos paramètres expérimentaux seront utilisées (cages métaboliques, Von Frey) réduisant le stress des animaux. De plus, nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures nécessitant une anesthésie générale seront réalisées en maintenant la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Les procédures chirurgicales (implantation de cathéters) seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe avec utilisation d’analgésiques afin de limiter les douleurs post-opératoires. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement (tunnel, aspen brick à ronger) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes comme prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure… pouvant amener à des points limite. Si un animal présentait des symptômes de douleur, prostration, plaies… il sera soigné (désinfection de la plaie par exemple), isolé si nécessaire, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, et qu’un des points limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Le modèle de cystite induite par l’administration de CYP est un modèle expérimental classiquement développé chez le rat. De plus, l’exploration de la fonction vésicale chez l’animal éveillé (quel que soit la pathologie) est largement décrite chez le rat. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 semaines afin d’avoir des animaux adultes sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Etude préclinique de la récupération fonctionnelle et de la plasticité cérébrale après accident vasculaire cérébral ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 960 individus en gravité sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine ou occlusion au chlorure de fer, suivi d'examens IRM et de tests moteurs, cognitifs et émotionnels répétés sur soixante jours. Le porteur décrit un affaiblissement de la patte, des douleurs post-opératoires et une mise à mort si la perte de poids dépasse 15 % ou si le score de douleur est trop élevé. Il rappelle que les traitements neuroprotecteurs efficaces chez l'animal ont échoué chez l'humain, tout en affirmant que les méthodes sans animaux n'apportent pas le même niveau d'information.
Objectifs
A l’échelle mondiale, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est l’une des causes majeures de décès, d’invalidité et de perte socioéconomique. Face à ce fardeau, le seul traitement pharmacologique approuvé consiste en l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Néanmoins, il existe des critères d’éligibilité stricts qui excluent une grande majorité des patients. Il est donc indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. Lors d’un AVC ischémique (i.e. dû à une occlusion vasculaire), le débit sanguin cérébral (DSC) diminue drastiquement et les tissus cérébraux alentours sont altérés de manière plus ou moins définitive. Selon différents facteurs tels que la durée et l’ampleur de la diminution du DSC, l’étendue de la lésion cérébrale et sa localisation, les handicaps résiduels post-AVC peuvent être de différentes natures (moteurs, cognitifs et/ou émotionnels) et extrêmement invalidants. Plusieurs agents thérapeutiques ont été développés et ont montré un bénéfice en termes de neuroprotection chez l’animal. Cependant, la transposition des effets neuroprotecteurs des modèles animaux à l’Homme reste un échec. En effet, alors que la récupération fonctionnelle est au cœur des préoccupations humaines, les études précliniques se sont principalement concentrées sur l’évaluation du volume de lésion cérébrale pour évaluer l’efficacité d’un traitement. Par ailleurs, l’’étude comportementale après un AVC chez les modèles expérimentaux est encore peu utilisée, incomplète voire inadaptée. En effet, la majorité des études ayant travaillé sur les déficits fonctionnels n’ont examiné que les déficits à court terme et particulièrement les déficits moteurs. L’objectif de ce projet consiste donc à caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la plasticité cérébrale et les déficits fonctionnels chroniques de l’accident vasculaire cérébral ischémique, afin de mettre au point de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces troubles.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de plasticité cérébrale et de récupération fonctionnelle après un AVC ischémique. Elle permettra également de proposer des pistes pour caractériser de nouvelles stratégies thérapeutiques en combinaison ou non avec le tPA, afin d’améliorer de manière optimale la récupération des patients.
Procédures
Chaque animal fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (15 minutes). 1 - Le modèle d'ischémie par injection de thrombine sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) (50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 2 - Le modèle d'ischémie par occlusion au chlorure de fer sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par IRM (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC ; 50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 3 - La totalité des animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleurs quelques heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée lors de l’AVC) qui disparait dans la première semaine après l’AVC. Une perte de poids, des douleurs post-opératoires ou un stress pourraient être observés les jours suivants. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Les organes prélevés post mortem permettront de réaliser des analyses protéomiques et transcriptomiques.
Remplacement
Les expériences in vitro ou ex vivo ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux central. De plus, les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information pour évaluer une récupération fonctionnelle et cognitive de manière longitudinale. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale, la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale. La physiologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé grâce à nos expériences antérieures et selon les données disponibles dans la littérature. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses, le bruit et la lumière selon le cycle. La température en salle d’expérimentation sera contrôlée et adaptée au bien-être des animaux. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil sera disposée de manière à avoir une partie sur un tapis chauffant, laissant le choix à l’animal de la température dans la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront mis à mort si une perte de poids de plus de 15 % est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose (petites maisons), des carrés de cotons et des paillettes seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront mis en place jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale suite à un AVC ischémique. Les souris C57BL/6 utilisées dans cette étude seront âgées de 8 semaines car cela correspond au stade de développement jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l’étude des AVC.
Exploration des effets vasculaires de l’apolipoprotéine A-I et de composés mimant son action
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 320 individus en gravité sévère. Elles sont soumises à un régime gras, à des chirurgies pour poser des cathéters dans les vaisseaux des pattes et du cou, puis à des mesures prolongées de la fonction cardiovasculaire sur animal conscient. Le porteur décrit des douleurs, de la fièvre, des blessures possibles des vaisseaux et une gêne pour s'alimenter après les actes sur les carotides. Il affirme que la coordination in vivo de signaux nerveux, hormonaux et cardiovasculaires ne peut être remplacée, tout en prévoyant quelques études sur cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet d'étudier, le rôle de certains récepteurs ou cibles sur les vaisseaux dans le maintien de la fonction vasculaire et l'amélioration de la perfusion des tissus. Il permet en particulier d'évaluer leur contribution dans la régulation de la glycémie ce qui est d'un intérêt pour la prise en charge des sujets diabétiques. Nos résultats préliminaires obtenus sur des souris saines explorant le rôle de ces cibles au niveau du vaisseau, montrent que leur activation induit une vasodilatation. Des travaux publiés suggèrent que ces récepteurs auraient un rôle protecteur au cours des maladies métaboliques dans le sens qu'il induiraient une diminution de la formation de l'athérome au sein des parois des vaisseaux. D'autres études discutent aussi un rôle potentiel dans l'amélioration de la sensibilité périphérique à l'insuline.
Bénéfices attendus
Sur nos modèles expérimentaux, il est attendu une amélioration des paramètres vasculaires et métaboliques chez les animaux transgéniques sains ou malades avec un fond génétique dit contrôle. Cet effet sera mesuré sous l'action d'un traitement et, ce bénéfice sera mesuré par comparaison aux animaux transgéniques invalidés pour les cibles moléculaires étudiées. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (athérome, diabète, ...) chez les animaux transgéniques invalidés pour les cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 704 animaux dans le projet de recherche. Les souris seront placées sous un régime gras favorisant le développement de l’obésité et du diabète (352 souris vigiles). Leur statut diabétique sera évalué lors d’un test de tolérance au glucose. Ce dernier sera administré dans l’abdomen lors d’une injection puis la glycémie sera mesurée sur du sang prélevé à la queue à différents temps à l’aide de bandelettes et d’un lecteur de glycémie. Les souris seront par la suite soumises à des interventions chirurgicales au cours desquelles elles seront anesthésiées afin de poser un cathéter intraveineux dans un vaisseau de la patte (durée: 15 minutes, 384 souris anesthésiées). Cette chirurgie est suivie quelques jours après, d'une autre chirurgie permettant la pose, sur un vaisseau de la seconde patte arrière, d'un dispositif de mesure du débit sanguin et du rythme cardiaque (durée: 30min, 384 animaux anesthésiés). Ces deux chirurgies permettront par la suite d’étudier sur l’animal vigile, les effets de l'insuline sur le système cardiovasculaire, et, la sensibilité des tissus à son action antidiabétique (durée: 3h, 384 souris vigiles). Sur une autre série d'animaux, un cathéter sera posé dans un vaisseau du cou (carotide) de la souris anesthésiée afin de mesurer la pression artérielle sur les animaux vigiles (durée: 90min, 320 animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations peuvent induire des effets indésirables ou des nuisances sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration au niveau de l'abdomen d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances peuvent survenir à l'occasion de procédures chirurgicales comme une blessure du vaisseau lors de l'introduction du cathéter. Il est aussi possible d'induire une blessure d'un organe lors de l'injection dans l'abdomen de substances (anesthésiant, par exemple). D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier dans un tissu ou organe, au sein d'un organisme vivant, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques. Il s'agit d'études fondamentales bien en amont d'un transfert à l'homme. Il s'agit de mesurer in vivo des mécanismes biologiques en considérant la participation de mécanismes nerveux, endocriniens et les adaptations mises en jeu par le système cardiovasculaire. Pour ces explorations spécifiques coordonnant l'action de multiples signaux in vivo, l'animal ne peut pas être remplacé. Par contre, il peut-être envisagé des études in vitro sur des cellules cultivées afin d'étudier des mécanismes précis portant sur des intéractions pures mises en jeu entre cibles et composés étudiés. Ainsi, des études, in vitro, sur des lignées de cellules endothéliales commercialisées sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter pour ce champ d'exploration précis, dans la mesure du possible, l'utilisation des animaux à cette fin.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : la mesure de la tolérance au glucose, la mesure de la sensibilité périphérique à l'insuline, la vasodilatation, des prélèvements de tissus, le prélèvement de plasma pour l'étude des lipoprotéines (profils), le prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique (recherche bibliographique et examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative) est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Il est aussi prévu d'utiliser des tests statistiques comme le t de Student et l'ANOVA (logiciel Graphpad) pour estimer le nombre d'animaux nécessaires au cours de nos expérimentations. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voir supprimer la douleur et le stress, et, améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre: - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agrée. - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux manipulés avec delicatesse dans les procédures ce qui facilite les prélèvements et les mesures (par exemple: en laissant l'animal libre dans la cage et en assurant un geste délicat, naturel, lors du passage de la main sur la queue pour le prélèvement de sang lors du test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné (par exemple, une navette qui permet d'acheminer des animaux depuis l'établissement éleveur vers l'établissement principal) - des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits. - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (anesthésie/analgésie), - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques), - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet. Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Etude de l’immunométabolisme dans un modèle préclinique de cancer du pancréas.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas, des séances d'imagerie sous anesthésie et des traitements antitumoraux administrés deux à cinq fois par semaine pendant un mois, avant une mise à mort pour prélever les organes. Les bénéfices annoncés pour les patients relèvent de recherches translationnelles futures, alors que la souffrance sévère infligée est immédiate. Sur le remplacement, le porteur affirme que le recours aux animaux est "indispensable", faute d'échantillons tumoraux humains suffisants et de systèmes in vitro aboutis.
Objectifs
L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), la forme la plus courante de cancer du pancréas, est l'un des cancers humains les plus agressifs, avec une survie médiane de 6 mois après le diagnostic et un taux de survie relative à 5 ans de seulement 9%. Le PDAC se classe au quatrième rang des décès liés au cancer, et les projections pour 2030 le placent au deuxième rang après le cancer du poumon, car son incidence continue d'augmenter. Les patients sont souvent diagnostiqués tardivement en raison de l'absence de symptômes précoces, de sorte que moins de 20 % des patients ont des tumeurs localisées éligibles à une résection chirurgicale au moment du diagnostic. Malgré des avancées significatives dans la compréhension de la biologie de ce cancer, des progrès minimes ont été réalisés dans le traitement des patients atteints de PDAC avancé, dans lequel les combinaisons de thérapies cytotoxiques n'apportent que de modestes améliorations des taux de survie. Ce tableau renforce l'urgence de développer de nouvelles options thérapeutiques efficaces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux connaître le métabolisme mitochondrial dans le PDAC, en tenant compte des événements intrinsèques aux cellules tumorales, à leur microenvironnement et au dialogue immunitaire entre le muscle squelettique et la tumeur via la circulation sanguine dans l'organisme entier. Les connaissances générées par cette étude intégrative seront utilisées à l'avenir pour des recherches translationnelles visant à améliorer les stratégies thérapeutiques innovantes multimodales, comprenant des soins de soutien à la qualité de vie tels que l'activité physique adaptée.
Procédures
1) transplantation des cellules cancéreuses (1 injection unique par souris, durée quelques secondes) sous anesthésie et injection de luciférine lors de l’imagerie (1 injection à chaque expérience d’imagerie pour suivi longitudinal de la taille tumorale, 2-6 maximum par souris en fonction de la durée des protocoles, chaque injection ne dure que quelques secondes). 2) administration répétées des traitements antitumoraux 2 à 5 fois par semaine selon les thérapies, durant 1 mois au maximum ; 3) un prélèvement de sang sous anesthésie juste avant le sacrifice pour nécropsie pour prélèvement des organes d'intérêt (donc 1 seul prélèvement par souris, qui dure 30 secondes au maximum).
Impact sur les animaux
L'ensemble des animaux subira une anesthésie volatile permettant la transplantation (1 injection durant 1min/animal) de cellules tumorales. Les nuisances relatives au développement d’une tumeur pancréatique seront suivies par imagerie optique par bioluminescence (nécessitant une anesthésie volatile - hebdomadaire - 15min/souris) et à l'évaluation des signes cliniques faisant intervenir des actes de pesées du poids corporel régulières et de manipulation qui peuvent être des sources de stress (moins de 3min/animal). Enfin, l'évaluation de candidats thérapeutiques se fera via, au maximum, 3 administrations par semaine (1 injection durant 1min/animal) de composés dans des conditions connues pour ne pas engendrer de toxicité.
Devenir
Le sort de tous les animaux sera la mise à mort sous anesthésie pour prélèvement d'organes en vue d'analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. D’une part, pour cette étude mécanistique, les données expérimentales devront être en grande partie obtenues sur des échantillons de tumeurs et organes corporels, et cette démarche est limitée chez l’homme. Les gestes de prélèvement de tissu pancréatique sont très invasifs en clinique ; une seule biopsie est faite par endoscopie au diagnostic de cancer du pancréas, et seuls les moins de 20% de patients montrant une tumeur localisée dans le pancréas sont éligibles pour une résection de la tumeur par chirurgie qui n’est faite qu’une seule fois. Ainsi nous ne disposons pas d’échantillon tumoral pour plus de 80% des patients et un suivi dynamique n’est possible chez aucun. D’autre part, les critères métaboliques et fonctionnels que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules ou des systèmes alternatifs in vitro reproduisant la physiologie animale qui sont en cours de développement mais pas encore au point. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 230 individus sur 5 années conformément à la règle de réduction. Ce chiffre a été déterminé par un calcul d'effectif prenant en compte les données statistiques connues pour ce modèle.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, la transplantation des cellules cancéreuses et le suivi par imagerie seront réalisées sous anesthésie gazeuse. D'autre part, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle quotidien, par du personnel compétent, de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux. Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage) dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température ; renouvèlement d’air ; éclairage artificiel avec alternance jour/nuit) et leur milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (en alternance, tiges de papier, pelotes de lanières de papier ou abri en carton). La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine.
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’humain pour sa physiopathologie de tumeur cancéreuse. Les tumeurs pancréatiques qui se développent chez la souris montrent de nombreuses similarités avec les tumeurs humaines, faisant de la souris un très bon modèle d’étude. De plus, il est connu que plus de 80% de protéines (séquences nucléiques codantes) sont homologues entre la souris et l'homme y compris au niveau immunitaire, ce qui renforce l'utilité du modèle pour ce projet qui concerne le système immunitaire. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris allogreffees seront implantées à l’âge de 6 à 10 semaines, ce qui est un âge classique pour ce type de modèle expérimental de tumeur induite par greffe de cellules cancéreuses.
Etude des mécanismes impliqués dans l’automatisme cardiaque lors de la réponse Beta adrénergique sur des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, dont 200 individus en gravité sévère. Elles subissent une chirurgie cardiaque sous anesthésie pour provoquer une insuffisance du cœur, l'implantation sous-cutanée de capteurs, des injections de substances sur animal conscient et des épisodes de bruit de sèche-cheveux destinés à déclencher un stress. Le porteur décrit une hypertrophie du cœur et des douleurs liées aux sutures sur dix semaines, avant la mise à mort pour prélever le cœur. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun système cellulaire ne reproduit la fonction cardiaque et conclut qu'il est "indispensable" d'étudier un mammifère entier.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, les troubles du rythme sont une cause importante de mort subite. Ces troubles du rythme adviennent lors de conditions pathologiques telles que l’insuffisance cardiaque ou suite à des maladies génétiques par mutation d’une protéine impliquée dans le rythme cardiaque. La fréquence cardiaque est déterminée par un petit groupe de cellules spécialisées possédant une activité électrique spontanée permettant au cœur de se contracter automatiquement. Dans les cellules cardiaques, le calcium constitue un élément essentiel à la régulation de cette fréquence cardiaque. Lors d’un stress aigu, les catécholamines naturellement produites par l’organisme entrainent une accélération du rythme cardiaque et une augmentation du débit de sang. Si ce stress se prolonge dans le temps, le cœur peut développer une insuffisance cardiaque et donc une incapacité à se contracter correctement. L’objectif du projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les arythmies cardiaques en situation de stress sur des modèles de souris génétiquement modifiés. Nous étudierons ainsi la réponse au stress, aigue et chronique de ces souris. Les souris mâles et femelles seront étudiées distinctement dans ce projet afin de déceler des différences potentielles basées sur le sexe.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de régulation du canal au calcium RYR2 en réponse à un stress dans un contexte physiologique mais aussi dans un contexte pathologique. Ceci pourrait permettre de développer RYR2 comme une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des maladies cardiaques chez l’humain
Procédures
Afin de reproduire une insuffisance cardiaque sur ces modèles, la procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale pour une durée d'une heure et sera unique pour chaque animal. Afin d'enregistrer le rythme cardiaque, les modèles sont sujets à une implantation sous cutanée de capteurs sous anesthésie générale pour une durée d'une heure et sera unique pour chaque animal. Après implantation de ces capteurs et repos de l'animal, on évaluera la réponse au stress lors de l'enregistrement du rythme cardiaque par des injections intrapéritonéales de substances pharmacologiques ( 3 protocoles différents donc 3 injections différentes) sur animal conscient et par des épisodes de nuisances sonores de courte durée ( Bruit de sèche-cheveux).
Impact sur les animaux
Afin de reproduire une insuffisance cardiaque sur ces modèles, la procédure chirurgicale peut entrainer des effets indésirables tels que de la douleur dues aux sutures ainsi que des nuisances proches de ceux observés chez l'humain tel qu'une hypertrophie cardiaque compensatrice et une modification des fonctions contractiles du cœur. La durée de cette nuisance est de 10 semaines (8 semaines afin de développer la maladie, 1 semaine de repos après implantation de capteurs de télémétrie et 1 semaine de protocole expérimental). Afin d'enregistrer le rythme cardiaque, les modèles sont sujets à une implantation sous cutanée de capteurs pouvant entrainer une douleur dues aux sutures ainsi qu'un inconfort de l'animal. La durée de cette nuisance est de 2 semaines (1 semaine de repos après implantation et 1 semaine de protocole expérimental). Les protocoles expérimentaux pendant l'enregistrement du rythme cardiaque peuvent induire un stress chez l'animal (Stress pharmacologique par injection intrapéritonéale unique, stress émotionnelle par nuisance sonore de courte durée).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de collecter le cœur. Cela nous permettra d’étudier l’expression et l’activité de notre mutation d’intérêt. Ces études permettront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans notre domaine d’étude.
Remplacement
Au vu du niveau de complexité et de la spécialisation de ces cellules cardiaques, aucun système cellulaire (lignées, organoïdes, organes bio-artificiels ou organs-on-a-chip) ne permet d’analyser la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. De plus, notre étude porte sur la réponse du cœur (et ses défauts) en fonction du stress, en conditions physiologique et pathologique, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations in sillico ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés.
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables, pour chaque objectif du projet. Le nombre d’animaux total tient compte de la mortalité éventuelle due aux interventions chirurgicales. Cependant, en étalant les expérimentations dans le temps, nous serons en mesure de réduire le nombre d’animaux utilisés par rapport au nombre total maximum prévu, si la mortalité est moindre qu’attendue. De plus, au sein d'une procédure expérimentale, les mêmes lots de souris sont soumis à diverses techniques d’études afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et maximiser le recueil de données sur les mêmes animaux. Afin d’utiliser au mieux les animaux à notre disposition issus des croisements de lignées, mâles et femelles seront étudiés. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire et des études sur tissus ou cellules isolés seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (Température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants: apparence, comportement naturel, hydratation, signes cliniques et comportement provoqué. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie. Toutes les procédures impliquant une chirurgie sur l'animal seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et analgésiques.
Choix des espèces
La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un rongeur possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De plus, il a été démontré que nos protéines d’intérêt retrouvés chez l’être humain ont des fonctions similaires chez la souris. De plus cette espèce est le plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Des souris adultes âgées de 4 à 6 mois seront utilisées car les maladies cardiaques se déclarent essentiellement à l’âge adulte.
Etude des effets anti-hyperalgésiques d’un ou plusieurs composés dans un modèle d’arthrite induit avec de la carragénine chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
690 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur provoque une inflammation articulaire par injection de carragénine, censée reproduire une crise de goutte, puis applique des stimulations douloureuses thermiques et mécaniques répétées sur les pattes arrière, jusqu'à six mesures par jour. Il indique que l'inflammation peut conduire les rats à se mutiler et à développer des lésions ulcéreuses, et prévoit de les tuer parce qu'ils restent douloureux. Ce modèle sert à tester des candidats-médicaments analgésiques, et le porteur affirme que seul l'animal vigile permet d'étudier la douleur, et non la seule nociception mesurable in vitro.
Objectifs
La douleur altère gravement la qualité de vie des patients atteints de la maladie de la goutte. La douleur inflammatoire peut être due à une action directe des cytokines inflammatoires sur les neurones nociceptifs, abaissant leur seuil d'excitabilité et provoquant ainsi une hyperalgésie. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans un modèle de douleur inflammatoire et pour différent type de douleur (mécanique, thermique). Cela est couramment décrit dans la littérature. La carragénine (CAR) est actuellement utilisée comme déclencheur d'une inflammation aiguë dans différents tissus. L'arthrite induite par la carragénine chez les rongeurs a été largement utilisée comme modèle d'arthrite aiguë. La physiopathologie de l'arthrite induite par la CAR implique des cytokines inflammatoires. Elle imite la crise de goutte telle qu'elle peut se produire chez l'homme. Elle a été largement étudiée pour tester des composés anti-goutteux et des molécules anti-inflammatoires en tant que modèle animal. En revanche, de nombreux patients ne peuvent pas utiliser de médicaments anti-inflammatoires en raison de leurs comorbidités. Il existe donc un réel besoin de traitement local efficace et rapidement actif de l'inflammation et de la douleur qui sont intenses lors d'une crise de goutte.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance/ Antiinflammatoires : ulcères …). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans un modèle de douleur reconnu. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. A long terme, l’objectif est de pouvoir développer de nouvelles stratégiques thérapeutiques pour lutter contre les pathologies arthritiques.
Procédures
Les animaux peuvent développer des paralysies ou s’automutiler. Les animaux reçoivent des injections par voie intra-articulaire (site d’injection à surveiller). Ils peuvent également présenter une perte de poids, une perte de tonus, un stress. De plus selon les tests, les animaux sont soumis à la contention, isolés dans des compartiments (durée de 3minutes à maximum 2h30 selon le test) et une stimulation douloureuse thermique ou mécanique des pattes arrière est réalisée (durée de 1minute à 1.5 minutes selon le test). Les tests peuvent être réalisés sur plusieurs jours et peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans limite de 6 points de mesures. Les animaux pourront également subir des nuisances liées à l’administrations de composés (durée de quelques secondes à 3 minutes maximum). Ils pourront être réalisés une seule fois ou plusieurs fois par jour. Les administrations répétées peuvent causer des lésions superficielles. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé. Les prélèvements durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’injection de l’agent inflammatoire (carragénine) est faite au niveau d’une articulation : Ceci peut entrainer une douleur articulaire ainsi que les symptômes d’une inflammation locale : rougeur, gonflement, chaleur. Quand l’inflammation est trop importante, les animaux peuvent se mutiler ou créer des zones ulcéreuses. - Nuisances liées aux tests, les animaux sont isolés en compartiments plexiglas, et leurs pattes arrière sont stimulées à plusieurs reprises. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. - Nuisances liées à l’administration de composés clients. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires qui sont listés dans les points limites. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique.
Devenir
Le modèle d’arthrite est un modèle sévère et stable. Les animaux restent donc douloureux. De plus, le réactif injecté est un agent inflammatoire. Il n’est donc pas concevable de les replacer. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP (International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum nécessaire pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles et sur des approches statistiques.
Raffinement
Les animaux ont de l’enrichissement (briquettes en bois, tunnel en polycarbonate rouge transparent) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre d’immersion de la patte ou de mVF, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Des points limites strictes sont mis en place en association avec une grille de scoring afin de limiter la douleur des animaux. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs est critique et suivie avec attention au laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the Study of Pain) est récenteet les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. LE rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente (suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. es animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvénils/ pré-adolescents. (5-7semaines ; 190-240g le jour d’induction du modèle) Ce stade a été choisi car il est adapté au développement des modèles, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Étude pilote de la pathogénicité rénale d’anticorps humain sur un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
Une perte de 20 % du poids en 72 heures, une protéinurie supérieure à 3 g/L ou une immobilité totale de plus de 24 heures, avec un risque d'escarres, déclenchent la mise à mort des porcs de ce projet. 6 minipigs adultes de 24 à 30 mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit d'abord l'ablation d'un rein, "pour optimiser l'action des anticorps sur le rein restant", puis reçoit en 70 jours six injections d'anticorps humains destinées à provoquer une maladie rénale, avec des prises de sang et d'urine deux fois par semaine, sous anesthésie à chaque intervention. Le but est de reproduire chez le porc une atteinte rénale observée chez des patients atteints d'une maladie auto-immune des nerfs, après une première étude sur le hamster où les injections d'anticorps n'ont provoqué aucun signe clinique.
Objectifs
La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune du système nerveux. Plusieurs cibles des anticorps dirigés contre soi ont été découvertes, parmi lesquelles des protéines présentes sur les neurones. La survenue concomitante chez certains patients d’une maladie neurologique et d'une maladie auto-immune du rein, pouvant aller jusqu’à la perte totale de la fonction rénale, est connue de longue date. Ces deux maladies (neurologique et rénal) concomitantes ont souvent été décrites, mais leur lien n'a jamais été établi. L’objectif principal de cette étude pilote est de confirmer, sur un modèle porcin, l'implication des anticorps auto-immuns dans cette maladie rénale en reproduisant la maladie chez le porc. De plus, il s'agit d’analyser les dysfonctionnements aux niveaux clinique et tissulaire provoqués par ces anticorps, afin de mieux connaître cette maladie et d'améliorer ensuite le diagnostic et les traitements chez l'homme.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer le caractère pathogène des anticorps dirigés contre certaines protéines dans le développement d’une atteinte rénale. Nous espérons démontrer que l’injection des anticorps induit des modifications biochimiques (protéinurie, élévation de la créatininémie) et histologiques (dépôts dans les glomérules) chez le porc, conduisant au développement d’une maladie rénale. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives dans le dépistage de l'atteinte rénale de cette maladie et sur la prise en charge thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront impliqués dans une seule procédure qui se déroulera en plusieurs étapes sur une durée de 70 jours. Des injections d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux auront lieu 6 fois au cours des 70 jours pour induire une maladie rénale. Des prélèvements sanguins et urinaires auront également lieu deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Les injections et les prélèvements réalisés deux fois par semaine ne dureront pas plus de 10 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention afin d'éviter la douleur et diminuer leur angoisse. L'un des deux reins des animaux sera retiré en début d’expérimentation pour optimiser l’action des anticorps sur le rein restant. Cette chirurgie ne durera pas plus d'une heure et sera réalisée sous anesthésie générale avec une gestion rigoureuse de la douleur.
Impact sur les animaux
Pour les porcs ayant reçu des injections d'anticorps, des nuisances liées à l'apparition d'une maladie rénale et/ou neurologique peuvent apparaitre. Cependant, grâce à notre expérience clinique acquise auprès des patients présentant cette symptomatologie et dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs. Une perte de poids de 20 % par rapport au poids des 72h précédentes, une protéinurie glomérulaire supérieur à 3g/L, ou une détérioration de l’état général de l’animal avec immobilité totale de plus de 24h (risque d'escarres) seront des critères d’euthanasie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux ne pouront pas être réutilisés, replacés ou adoptés puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps.
Remplacement
L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection d'anticorps humains induit chez le minipig des modifications biochimiques quantifiables (protéinurie, majoration de la créatinémie et baisse de l’albuminémie) similaires à celles observées chez l’homme et conduit à une maladie rénale histologique. Les modèles in vitro ne permettent pas de prendre en compte l’atteinte de différentes structures du rein ni des autres organes. Cette étude ne peut pas se limiter à une approche cellulaire in vitro ou à d'autres alternatives. Le modèle minipig a été choisi car la validation in vitro de la capacité des anticorps humains à reconnaître la protéine ciblée sur des tissus nerveux et rénaux s'est avérée concluante sur ces animaux.
Réduction
Le modèle de minipig visant à recréer une maladie rénale avec des injections d'anticorps étant unique, il est difficile de prévoir quels seront les changements sur les différents paramètres cliniques et anatomopathologiques testés. Le nombre d’animaux a été réduit à 3 animaux par groupe, soit 6 animaux au total, pour la réalisation de cette étude pilote. C’est un test de faisabilité visant à induire cliniquement une maladie rénale avec des anticorps sur un minimum d’animaux.
Raffinement
Nous attachons une grande importance aux conditions d’hébergement et à la qualité de vie des animaux. Ainsi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Une zone de repos couverte de litière, permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement, leur sera accessible. De plus, ils auront des jouets suspendus à mordiller. Lors des phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie courte sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Pour l'opération chirurgicale, une anesthésie générale et une gestion rigoureuse de la douleur seront mises en place. Nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basés sur des paramètres mesurables non invasifs. Une perte de poids importante, une baisse de la fonction rénale, une infection ou une détérioration de l’état général de l’animal avec immobilité seront des critères d’interruption.
Choix des espèces
Nous avons préalablement recherché in vitro la présence de la protéine cible dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries : souris, rats, lapins et cochons d’Inde, mais aucun d’entre eux ne l'exprime. Seuls le hamster et le porc expriment cette protéine dans leurs reins. Une première étude pilote a déjà été réalisée sur le hamster. Celle-ci a montré une absence de signes cliniques pathologiques suite aux injections d’anticorps, probablement due à la faible concentration de cette protéine dans les reins de ces animaux, contrairement à l’Homme et au Porc. Notre choix s'est donc ensuite porté sur le modèle porcin, car il est plus représentatif de l'Homme. Nous travaillerons sur des minipigs car cela permettra d'avoir des animaux adultes (24-30 mois) afin de correspondre à l'âge des patients humains souffrant de maladies neurologiques et rénales simultanément.
Diagnostic rapide d’intoxication et évaluation de molécules thérapeutiques dirigées contre des toxines végétales
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
8 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 420 d'entre elles et sévère pour 7 060. Le porteur les intoxique avec deux toxines végétales qu'il décrit comme "faciles à produire" puis teste des molécules thérapeutiques et des tests de diagnostic, avec des injections et jusqu'à quinze prélèvements sanguins. Il indique que l'intoxication provoque perte de poids, mobilité réduite et difficultés respiratoires et peut entraîner la mort des animaux. Il inscrit le projet dans un objectif de biodéfense, visant à "doter l'Europe" de tests rapides, et affirme le modèle murin "nécessaire", les effets sur un "organisme entier" n'étant selon lui pas prévisibles in vitro.
Objectifs
Certaines toxines de plantes présentent une toxicité telle qu’il est nécessaire de développer des tests de diagnostic et des solutions thérapeutiques performantes pour contrer une intoxication accidentelle ou volontaire. A ce jour, aucune molécule thérapeutique ni traitement n’est commercialisé pour deux de ces toxines, faciles à produire. Des molécules (chimiques ou biologiques) ont cependant été développées et ne sont que partiellement caractérisées. Afin de déterminer spécifiquement leur efficacité, il est nécessaire de les évaluer dans un même modèle animal. Le modèle d’intoxication chez la souris nous permet de faire une première évaluation de l’efficacité des différentes molécules. Le projet présente deux objectifs majeurs : 1) Evaluer différentes molécules thérapeutiques contre deux toxines de plante. Ces molécules seront administrées seules ou combinées afin de déterminer la meilleure stratégie thérapeutique. 2) Améliorer les méthodes de diagnostic clinique d’une intoxication à ces toxines dans des fluides et/ou tissus biologiques (par exemple sang). Un test de diagnostic d’une intoxication à une des toxines est en cours de commercialisation. Il s’agit de préparer la prochaine génération, plus sensible et permettant une détection encore plus précoce. Il n’existe pas à l’heure actuelle de test de diagnostic pour la deuxième toxine d’étude. L’objectif est de doter l’Europe de tests de diagnostic rapides et performants afin de détecter ces toxines le plus rapidement possible pour la prise en charge des patients et administrer les contremesures médicales nécessaires.
Bénéfices attendus
A terme, l’objectif est d’améliorer la prise en charge des personnes intoxiquées en évaluant l’efficacité de différentes molécules thérapeutiques en fonction des différentes voies d’administration. La fenêtre de temps pour administrer les traitements et leur efficacité restent restreintes pour le moment. L’objectif est donc de disposer de molécules au meilleur de l’état de l’art pour élargir cette fenêtre de temps, en particulier après l’intoxication. Il est également nécessaire de disposer de tests de diagnostics rapides et performants (sensibles et spécifiques) dans différentes matrices biologiques pour mettre en évidence une action malveillante de dispersion de toxines et une contamination humaine éventuelle, afin de mettre en place une thérapie adaptée le plus rapidement possible.
Procédures
Toutes les manipulations pouvant entrainer des nuisances (prélèvements de sang, injections) seront réalisées sur des souris anesthésiées. Le prélèvement se fait en 30 à 60 secondes. Majoritairement, il y a 3 prélèvements et ils pourront aller jusqu’à 15 prélèvements selon les procédures.. Le volume prélevé sera adapté en conséquence, excepté pour les prélèvements terminaux effectués en fin de protocole, qui seront donc plus importants, mais toujours réalisés sur animaux anesthésiés. Dans le cas des injections, nous en avons 1 pour l’administration des toxines et 1 pour l’injection des anticorps, qui se font toutes les deux sur animal anesthésié en 30 à 60 secondes. Pour les protocoles courts (21 jours au maximum), ces gestes ne sont réalisés qu’une seule fois. Nous avons également, et ce pour un seul projet, des injections par voie sous cutanée 2 fois par jours dans les 10 jours de l’expérience. Pour les protocoles longs, les animaux étant réexposés, ils subissent une deuxième fois l’administration de la toxine en intra-nasale.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables dans ce modèle d’intoxication sont la perte de poids, la mobilité réduite, des difficultés respiratoires ainsi que des douleurs lors des injections et/ou prélèvements et du stress lors des pesées. A l’extrême, cela peut entrainer la mort des animaux.
Devenir
Dans l’ensemble des procédures, les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole, le but étant de prélever le sang pour effectuer des mesures plasmatiques des antigène et/ou des anticorps ainsi que différents tissus pour nous permettre de procéder à des analyses d’histopathologie au niveau des poumons, mais également caractériser l’inflammation suite à l’intoxication.
Remplacement
Des tests préliminaires in vitro sont mis en place dans le laboratoire (avec différentes lignées cellulaires : lymphocytes T humains, cellules épithéliales de reins de singe, cellules pulmonaires humaines) afin de déterminer et de sélectionner les molécules ou les combinaisons de molécules qui semblent être les plus efficaces avant de réaliser les tests in vivo. Ces tests cellulaires permettent de réaliser un grand nombre de combinaisons, et ainsi d’éviter une utilisation massive d’animaux. Cependant, nous savons d’ores et déjà que même si ces modèles sont pertinents pour une présélection/pré-évaluation, il existe encore des disparités entre les résultats obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo (nous avons ainsi pu observer qu’un anticorps apportant une très bonne neutralisation à l’échelle d’une lignée cellulaire dans le modèle in vitro avait une efficacité très modérée in vivo. Ainsi, les mécanismes d’action des anticorps peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. Il est donc nécessaire de passer par des modèles d’études plus complexes, prenant en compte la distribution de la toxine comme celle de la molécule thérapeutique, la réponse inflammatoire et immunitaire, comme c’est le cas avec des modèles murins. A ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico n’est capable de prédire à 100% la capacité protectrice des molécules thérapeutiques. Un modèle animal est donc nécessaire. Pour les tests de diagnostic, des échantillons prélevés sur des souris naïves, c’est-à-dire n’ayant reçues aucun traitement, mais auquel de la toxine aura été ajouté ont déjà été utilisés pour les mises au point des protocoles avant de faire les essais sur des échantillons d’animaux intoxiqués. Cela permet d’optimiser les échantillons utilisés et de réduire la quantité d’animaux en expérimentation.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés pour ce projet, nous avons décidé de réduire le nombre de molécules qui seront testées. Pour cela, les essais in vitro réalisés sur différents modèles cellulaires nous ont permis de sélectionner les molécules montrant le meilleur potentiel thérapeutique. De plus, nous avons décidé de limiter les voies d’injection de ces molécules pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. Aux regards de tests statistiques, le nombre d’animaux par lot a été déterminé pour nous permettre d’avoir suffisamment de données pour évaluer la sensibilité du test diagnostic ainsi que la performance des molécules thérapeutiques. Certains animaux seront prélevés deux fois (intervalle de 15 jours) afin de réduire le nombre de groupe nécessaire pour les cinétiques plus longues. Par ailleurs, pour les projets où différents temps d’administration sont envisagés, un seul sera testé pour commencer : seulement si celui-ci fonctionne, les autres pourront être testés.
Raffinement
Les animaux seront en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une maison en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront également ajoutées et changée chaque jour pour maximiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront également observés une fois par jour durant toute la durée des essais, lorsque leur état de santé est bon puis une surveillance matin et soir sera mise en place en cas de dégradation de l’état de santé d’un ou de plusieurs animaux. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel qualifié. Avec le vétérinaire de l’installation, nous avons déterminé des points limites à ne pas dépasser pour ces essais (notamment les signes cliniques suivis quotidiennement ou biquotidiennement afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, et d’éviter une souffrance trop importante. Lors des essais avec les toxines de l’aliment hydraté sera ajouté dans les cages pour éviter la déshydratation et la dénutrition à hauteur des animaux pour permettre même aux animaux les plus faibles d’accéder à l’aliment. L’ensemble des procédures sera également réalisé sur animaux anesthésiés.
Choix des espèces
De nombreuses études dans la littérature sur ce sujet ont déjà utilisé le modèle murin, assez sensible aux intoxications avec des toxines végétales. Leur système immunitaire très caractérisé et assez proche de celui de l’être humain ainsi que la facilité d’élevage et manipulation font des souris un modèle approprié pour faire ces essais. Les expériences seront réalisées sur souris à l’âge adulte, pourvues d’un système immunitaire mature.