Procédures sévères
Etablissement d’un modèle de défaillance hépatique aigue induit par un stress oxydatif et une inflammation. Evaluation de propriétés de composés actifs dans ce modèle expérimental.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1380
2 760 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 2 400 étant classés en gravité sévère. Après un jeûne nocturne, ils reçoivent trois injections en trois jours, de pyrazole imitant une alcoolisation massive et de lipopolysaccharide, pour provoquer une défaillance hépatique aiguë, puis sont tués pour prélever foie, cerveau et reins. Le porteur indique attendre baisse d'activité, baisse de température et signes de douleur après les injections. Il présente le modèle comme un outil d'évaluation rapide de composés pour un "programme de développement pharmaceutique" et justifie le choix des espèces en une seule phrase.
Objectifs
La cirrhose est une maladie irréversible du foie caractérisée par un état inflammatoire continue de l’organe qui use les cellules, perturbe le fonctionnement des cellules et entraine leur destruction. La défaillance hépatique aigue ou acute-on-chronic liver failure (ACLF) est un syndrome fulminant qui évolue rapidement vers une défaillance de multiples organes et qui survient de manière aiguë, généralement en raison d'événements précipitants de différentes natures, tels qu’un épisode infectieux, une affection virale ou une prise excessive d’alcool ou de médicaments. Lors de phase aigüe d’aggravation, il se produit un emballement de la réaction immunitaire et inflammatoire déterminante pour la survie des patients cirrhotiques dont le foie fragilisé n’est pas armé pour lutter contre cette agression. L’alcool est principalement métabolisé dans le foie, il produit un stress oxydant pour les cellules et les tissus par une forte production de composé toxiques oxydants et une diminution des moyens de défense naturelle antioxydante. L’alcool et certain produit toxique et aussi des médicaments sont pris en charge dans le foie par les mêmes mécanismes de détoxification. Le pyrazole fait partie de ces produits qui sont métabolisés par les mêmes voies que l’alcool, et son utilisation permet de développer des modèles expérimentaux animaux qui miment le phénomène de « binge drinking ou alcoolisation massive rapide » qui est un facteur déclenchant de la défaillance hépatique aigue. En associant chez un animal sain, l’utilisation du pyrazole à l’origine d’un stress oxydatif à celle d’un agent pro-inflammatoire similaire à celui qui est naturellement présent sur les bactéries et qui infecte les patients, nous reproduisons in vivo 2 conditions importantes dans le mécanisme de survenue de la défaillance hépatique. Nous développerons ce modèle chez les rongeurs dans l’optique de disposer d’un modèle d’évaluation rapide des propriétés de composés destinés à poursuivre un programme de développement pharmaceutique dans cette indication de décompensation cirrhotique.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes de défaillance hépatique aigue, notamment chez le patient cirrhotique, il est nécessaire que la prise en charge intervienne le plus précocement pour sauvegarder au maximum la fonction hépatique, ce qui peut se révéler être vital lors d’une récidive. Le stress oxydant est un des mécanismes qui entraine la mort cellulaire, il est donc essentiel de le limiter de manière à préserver le capital hépatocytaire qui subsiste après une défaillance hépatique. L’identification de composés et la mise en place de solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples donc sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
Au cours des procédures décrites dans ce dossier nous procèderons à différents geste ou acte sur les animaux qui peuvent avoir une action négative sur leur comportement, leur confort ou stress, il s’agit de mise à jeun, injections, et prélèvements La mise à jeun « over-night » c’est-à-dire au cours d’une nuit complète, qui est la période d’alimentation normale du rongeur. La privation de nourriture est source de stress. Les stimulations des processus pro-oxydatifs et inflammatoires sont réalisés par une injection intrapéritonéale, ces injections au nombre de 3sont faites au cours de 3 jours successifs : 2 fois le pyrazole et une fois le LPS ou TNFa. Elles durent chacune environ 15 secondes. Ceci concerne les procédures 1 et 2. Au cours des procédures d’évaluation des activités de composés, nous réaliserons en plus une administration dudit composé par une injection par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, cette administration sera unique et durera également une quinzaine de secondes. Ceci sera appliqué au cours des procédures 3 et 4 Un prélèvement sanguin intermédiaire pourra être réalisé sur les rats au cours des procédures 2 et 4 , il sera pratiqué sur des rats anesthésiés à l’isoflurane par une ponction à la veine sub-linguale, l’action est unique et dure 15 à 20 seconde. Les prélèvement sanguin terminaux se feront également sous anesthésie générale et précéderont la mise à mort.
Impact sur les animaux
Lors des procédures décrites dans ce projet, les animaux subiront des injections en intra-péritonéales ou intra-veineuses, à la suite desquelles, on s'attend à constater une diminution de l'activité, une diminution de la prise alimentaire, une diminution de la température corporelle ainsi que des signes de douleurs ou d'inconfort tels que fourrures ébourriffées, larmoiements.
Devenir
L'évaluation histologique, biochimique et transcriptomique des organes tels que le foie, le cerveau et le rein ainsi qu'une évaluation des taux plasmatiques de marqueurs inflammatoires et hépatiques nécessitent la mise à mort des animaux.
Remplacement
Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global».
Réduction
La méthode est majoritairement basée sur l’expérience déjà réalisée et publiée. Dans certaines conditions, à partir de données expérimentales disponibles, la variance des paramètres peut être connue. A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Le test de Welsh permet de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité. Sans cette condition, les effectifs calculés par la méthode de Welsch sont généralement démesurés.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé avec des personnes habilitées, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques afin de raffiner au maximum les procédures. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires, une grille de scoring permettant de quantifier la douleur perçue par l'animal sera établie et des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Compte tenu du fait que la pathologie implique un emballement du système immunitaire et une défaillance multi -organes, il nous est impossible de remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro.
Choix des espèces
Les espèces souris et rats sont décrites dans la littérature comme des espèces en capacité de répondre biologiquement au stimulus par le pyrazole.
Modèle animal de mouvements anormaux après privation en oxygène chez le rat – projet pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Privés d'oxygène sous anesthésie pour reproduire le syndrome de Lance-Adams, ils subissent ensuite des stimulations sonores quotidiennes pendant quatre semaines et des injections de molécules anti-myocloniques, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur reconnaît que la privation d'oxygène peut tuer certains animaux et provoquer des secousses gênant leur déplacement et leur alimentation, tout en rappelant que ces secousses ne sont pas jugées douloureuses chez l'humain. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne peut étudier la mort des neurones et présente ce projet pilote comme un préalable à des travaux ultérieurs.
Objectifs
Chez l’homme, l’arrêt brutal de l'oxygénation du cerveau (ou anoxie cérébrale) peut être liée à des causes variées comme un arrêt cardiaque ou une crise d’asthme très sévère. Chez les survivants, ce manque d’oxygène peut entraîner des problèmes neurologiques chroniques comme le syndrome de Lance-Adams (LAS). Le LAS est caractérisé par des secousses musculaires involontaires (qu’on appelle myoclonies) très importantes et qui ne sont pas qualifiées comme douloureuses par les patients. Elles apparaissent spontanément ou en réaction aux sons notamment. Elles rendent impossible la réalisation de nombreux gestes de la vie quotidienne : marcher, s’alimenter, se laver ou aller aux toilettes. Les patients reçoivent souvent de nombreux médicaments qui exposent à des effets secondaires parfois graves et aux risques d’interactions entre médicaments. Malheureusement, l'efficacité de ces médicaments est souvent insuffisante pour traiter les secousses musculaires du LAS. Les mécanismes à l'origine du LAS restent peu connus. A ce jour, le principal modèle animal de secousses musculaires induites par un manque d’oxygène (donc équivalent du LAS chez l’humain) existe chez le rat. Compte-tenu des limites de cet ancien modèle, l'objectif de notre projet pilote est donc de mettre au point un nouveau modèle animal de secousses musculaires après un manque d'oxygène reproduisant les caractéristiques du LAS chez l’Homme. Avec une procédure expérimentale plus simple, moins invasive et plus représentative du mécanisme du LAS chez l’humain, nous souhaitons identifier les divers paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un modèle fiable et reproductible tout en limitant la mortalité et la douleur chez l’animal, indispensable pour vérifier nos hypothèses concernant les mécanismes à l'origine du LAS.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints du syndrome de Lance-Adams (LAS) est aujourd’hui limitée avec des traitements globalement peu voire pas efficaces. L’amélioration de la prise en charge des patients passe avant tout par une meilleure compréhension des mécanismes aboutissant aux secousses involontaires (appelées myoclonies) du LAS. Cela repose donc notamment par l’exploitation des modèles animaux qui reproduisent cette pathologie. Comme évoqué précédemment, le principal modèle déjà publié de LAS a des points faibles. Nous souhaitons donc développer ce nouveau modèle de LAS chez le rongeur pour ensuite l’explorer finement afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes pathologiques du LAS. Les études animales déjà réalisées avec le modèle existant donnent des résultats assez hétérogènes. Chez l’homme, les études cliniques semblent indiquer que les secousses des patients avec un LAS pourraient provenir de l'écorce du cerveau appelée cortex. Dans notre groupe de patients atteints de LAS, les premiers résultats sont très en faveur d’une atteinte du cortex pouvant être à l'origine des secousses. Par ailleurs, certains neurones spécifiques du cortex sont très consommateurs d'oxygène. Le manque d'oxygène pourrait donc en priorité affecter le fonctionnement de ces neurones-là. Nous faisons donc l’hypothèse que les secousses musculaires du LAS sont, au moins en partie, dues à un souffrance de cette population de neurones au sein du cortex responsable des mouvements. A court terme, cette étude pilote permettra d’établir les différents paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un nouveau modèle animal de LAS. A long terme, le bénéfice de la mise en place de ce nouveau modèle sera d’approfondir, dans un projet ultérieur, les connaissances déjà acquises sur le LAS, en particulier par des méthodes électrophysiologiques et immunohistochimiques afin de tester notre hypothèse.
Procédures
Le protocole des stimulations auditives sera réalisé chez tous les animaux, pendant 45 secondes, une fois par jour tous les jours pendant la semaine précédant la procédure de privation en oxygène, puis une fois par jour tous les jours pendant les 4 semaines suivant la procédure de privation en oxygène. Ces stimulations auditives se feront chez des animaux vigiles. Le protocole de privation en oxygène sera réalisé à une seule reprise sur tous les animaux, entre 0et 10 minutes. Cette procédure se déroulera alors que les animaux seront anesthésiés et après injection de médicaments anti-douleur. Au cours de la procédure d’évaluation de la survenue des secousses pendant les semaines suivant le manque d’oxygène, des injections de molécules anti-épileptiques et anti-myocloniques (durée d’injection et temps de maintien : 1 minute) seront réalisées une fois pour chaque animal par voie intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Ce projet pilote va permettre d’évaluer les effets indésirables possibles de ce protocole expérimental. Le risque anesthésique est à prendre en considération. La mort des animaux au cours de la procédure de privation en oxygène est une possibilité expérimentale. Les secousses musculaires engendrées dans un délai de quelques jours après l’anoxie pourront entrainer des difficultés de déplacement pour les animaux ainsi que des difficultés d’alimentation. Il nous semble également important de rappeler que, chez l’humain, les myoclonies (secousses musculaires) ne sont pas considérées comme étant douloureuses.
Devenir
Les mêmes animaux sont impliqués dans les manipulations de privation en oxygène et d’évaluation des secousses musculaires. A l’issue de ces manipulations, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, l’euthanasie étant requise pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que des procédures alternatives existent, ni les processus aboutissant à la mort des neurones ni les processus favorisant l'apparition de crises d'épilepsie ou de secousses musculaires involontaires (myoclonies) ne peuvent être légitimement bien étudiés chez l’homme ou dans d’autres modèles non animaux. De plus, il n’est pas légitime de provoquer une crise d’épilepsie ou des myoclonies chez un patient pour des études scientifiques. Enfin, lors des expériences sur les animaux, l’environnement est mieux contrôlé et la qualité des données est nettement supérieure.
Réduction
Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cette objectif que nous conduisons cette étude pilote afin d’établir les paramètres du protocole permettant de réduire au maximum la mortalité du protocole donc le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum (100) pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable. Une fois le modèle établi grâce à cette étude, nous calculerons plus précisément les différents indicateurs statistiques permettant d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une période d’une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage, bruit et espace ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, d’alimentation et soins si nécessaire, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). Une période d’une semaine d’habituation à la manipulation humaine est respectée avant la réalisation de nos procédures. Avant le début de chaque expérience, une période d’acclimatation de 30 minutes sera observée au cours de laquelle les animaux, laissés dans leur cage, ne seront pas manipulés. Cela leur permettra de s’habituer à leur nouvel environnement et éviter toute forme de stress. Les animaux bénéficieront alors de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de tunnels. Pendant la procédure d’anoxie, les paramètres physiologiques (fréquence cardiaque et saturation en oxygène) seront surveillés constamment. Tout au long de la procédure expérimentale, des points limites adaptés ont été définis afin de limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce choisie pour ce projet. Les méthodes d’investigations électrophysiologiques et immunohistochimiques (qui seront utilisées dans un deuxième temps au cours d’un projet ultérieur) sont maîtrisées au laboratoire et ont déjà permis la publication d’études sur d’autres modèles d’anoxie et d'épilepsie réalisées sur des rats adultes. Par ailleurs, les études déjà publiées sur les modèles animaux de syndrome de Lance-Adams (LAS) précédemment citées ont été faites chez le rat. Nous allons utiliser des rats adultes entre 5 et 10 semaines de vie. Le LAS chez l’humain est en effet décrit uniquement chez des adultes. Par ailleurs, les études électrophysiologiques d’anoxie cérébrale et d’épilepsie réalisées dans l’équipe dans d’autres projets ont été faites chez des rats adultes. Ces mêmes techniques seront utilisées dans un deuxième temps sur un projet ultérieur.
Validation d’un dispositif de mesure de la prise alimentaire et de la motivation chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Elles sont entraînées à un distributeur automatique de nourriture puis, pour certaines, reçoivent une injection de lipopolysaccharide déclenchant une inflammation ou subissent un régime hypercalorique de six à sept semaines, avec des périodes d'isolement en cage. Le porteur décrit ces atteintes comme modérées et transitoires, alors que le projet est déclaré en gravité sévère. Il présente l'étude, menée avec une entreprise privée, comme devant à terme améliorer le bien-être des animaux non-humains dans ses recherches futures.
Objectifs
Les dérégulations de la prise alimentaire sous-tendent certaines conditions médicales comme l’obésité ou les troubles du comportement alimentaire (anorexie, boulimie, binge eating, addiction alimentaire). Dans ce contexte, nous nous intéressons en particulier aux modulations de la prise alimentaire par l’axe microbiote-intestin-cerveau dans des modèles murins. Outre la mesure de la prise alimentaire totale, la compréhension des troubles du comportement alimentaire nécessite d’explorer également des processus psycho-neurobiologiques comme la motivation. Ces processus peuvent être analysés chez le rongeur à travers la réalisation de tâches opérantes. Ainsi, dans une volonté d’affiner et d’automatiser les outils permettant l’étude du comportement alimentaire dans ces modèles, nous souhaitons tester un système embarqué permettant i) une mesure automatique de la prise alimentaire et ii) de tester le comportement opérant des animaux dans leurs cages d’hébergement. Ce système permet à la fois de mesurer la prise alimentaire au sein des cages d’hébergement avec une haute résolution temporelle et de mesurer la motivation alimentaire par le biais du comportement opérant. Ainsi les objectifs de ce projet sont : 1- Tester la fiabilité et la sensibilité du dispositif pour la mesure de la prise alimentaire 2- Mesurer des désordres motivationnels dans une tâche de comportement opérant dans deux modèles animaux. Cette étude sera réalisée sur des souris consanguines immunocompétentes. Afin d’examiner un potentiel effet dépendant du sexe, nous réaliserons cette étude sur des individus mâles et femelles. Cette étude correspond à la première phase d’un projet en collaboration avec une entreprise privée. Le but de ce projet est de faire évoluer le système notamment pour permettre une utilisation autorisant l’hébergement des animaux en groupe. Ainsi, les résultats issus de ce projet sont nécessaires afin de passer à la phase suivante qui permettra d’améliorer le dispositif et d’avoir un impact positif sur le bien-être des animaux lors de nos études futures.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet permettront de passer à une phase d’évolution du dispositif dans son design pour permettre notamment une utilisation autorisant l’hébergement en groupe. Scientifiquement, les analyses post-mortem envisagées (histologie, biologie moléculaire) contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux sous-jacents et à établir de futurs protocoles expérimentaux. Ce projet contribuera également à alimenter la collaboration avec une entreprise dans le développement du médicament et permettra éventuellement de tester des molécules en développement pour des indications de troubles du comportement alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à des entraînements à utiliser un dispositif embarqué qui leur permettre de s'alimenter d'une part (durée : env. 2 semaines). D'autre part une partie des souris seront entraînées à utiliser ce dispositif pour réaliser des tâches opérantes (durée : env. 1 semaine). Certaines souris recevront une administration unique de lipopolysaccharides ou seront exposées 6-7 semaines à un régime riche en lipides pour induire des désordres motivationnels.
Impact sur les animaux
Les procédures contiennent des périodes d’hébergement en individuel. L’hébergement en individuel peut engendrer un stress chez la souris. L’hébergement en individuel dans ce projet a été limité au maximum et durera au maximum 2 semaines. Un surenrichissement des cages sera proposé. Dans une des procédures, certains animaux seront injectés avec du LPS. Cet agent induit une réaction inflammatoire systémique pouvant être objectivée à travers des signes cliniques. Les modalités d’administration choisies altèrent modérément l’état clinique de l’animal et conduisent à une résolution de la réponse moléculaire pro-inflammatoire en moins de 9h. Dans une des procédures, certains animaux seront exposés à un régime hypercalorique. La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment hypercalorique riche en lipides (HFD) conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des mofifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition à ce régime dans notre projet (6-7 semaines) perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
Cette étude vise à tester un distributeur alimentaire pour souris dans le but de faire évoluer le système notamment pour permettre une utilisation autorisant l’hébergement des animaux en groupe. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de vérifier la fiabilité et la sensibilité du dispositif pour la mesure de la prise alimentaire et de mesurer des désordres motivationnels dans deux modèles animaux. Plus précisément, des tests statistiques permettant une analyse de l’effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou l’effet sexe des animaux lors de mesures répétées seront employés ; des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données seront utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés soit en groupe, soit en individuel. Les cages d’hébergement contiendront un objet leur permettant de se mettre à l’abri, des carrés de cotons ou des sticks de papier pour réaliser leur nid. Pour les animaux hébergés en individuel, un surenrichissement par rapport aux individus hébergés en groupe sera prévu. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. Le bon fonctionnement et chargement des dispositifs distributeur d'aliments sera vérifié régulièrement voire quotidiennement (lors de l’apport d’aliment uniquement par le dispositif). Le design de la procédure comportementale a été conçu pour assurer la validité des données obtenues tout en limitant la durée de l’hébergement individuel au minimum.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). De plus, le dispositif testé a été conçu pour la souris. Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Evaluation de l’efficacité de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’attaque thromboembolique chez le rat (acronyme : MATERAVC-2023)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
308 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque rat subit une chirurgie du cou de 40 minutes pour injecter des caillots dans une artère et déclencher un accident vasculaire cérébral, puis un traitement à tester et des tests comportementaux de J1 à J21 mesurant les déficits moteurs, avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le modèle reproduit paralysie et déficits sensorimoteurs, et écrit vouloir "reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable". Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne modélise l'ischémie-reperfusion cérébrale, et résume les bénéfices en une seule phrase sur de possibles nouveaux traitements.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la 2ème cause de mortalité dans le monde. Environ 80% des AVC sont induits par une interruption de la circulation sanguine dans le cerveau. A l’heure actuelle, le rt-PA est le seul médicament préconisé dans cette pathologie. Toutefois, ce traitement possède de nombreuses limites : efficacité limitée et risque de complication avec aggravation des symptömes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.
Bénéfices attendus
Cette étude pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre l'AVC.
Procédures
L'ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter des caillots dans une artère pour induire l'accident vasculaire cérébral. Cet acte chirurgical durera 40 minutes sous anesthésie générale. Deux heures plus tard, sur animaux vigiles, un traitement sera administré. Avant et après chirurgie, un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s'étalant de J1 à J21 post-AVC, seront réalisés pour une durée totale de 30 minutes maximum, afin de mesurer les déficits moteurs et sensoriels liés à l'accident vasculaire cérébral et la récupération au cours du temps des animaux. Enfin, à la fin du projet, un ensemble d'organes sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.
Impact sur les animaux
L’hébergement en cage individuelle des animaux induits, nécessaire durant les 72h suivant la chirurgie, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture ou le cathéter nécessaire au traitement, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. Le modèle par définition reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entrainer des pertes d’équilibre, une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion et une atteinte des fonctions motrices. L’AVC est un évènement grave chez un patient et sa survie est engagée. Le modèle d’étude chez l’animal présente, lors de l’induction et durant les 48 premières heures suivant l’induction, des signes cliniques d’inconfort manifestes (paralysie). Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé et une mise à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Pour évaluer les effets de notre composé, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort 3 ou 21 jours après l’induction de l’AVC, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale), afin de récupérer le cerveau et les organes pour des analyses histologiques.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire l’efficacité d’un traitement dans le cadre d’une intervention visant par exemple à limiter la taille des lésions cérébrales au cours d’un AVC thromboembolique chez l’Homme. Le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux au cours de l’ischémie-reperfusion du tissu cérébral chez l’Homme ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Sur la base de notre expérience de ce modèle, le nombre de rats utilisé pour chaque étude est réduit au minimum et révisé à la baisse au fur et à mesure de nos expériences tout en garantissant une interprétation statistique et scientifique des résultats. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront 3 par cage avec du papier kraft et une brique d'Aspen comme enrichissement, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale du site d’incision) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, limitant le risque pour l’animal de rompre ses points. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle dans une pièce dédiée chauffée à 28°C jusqu’à leur réveil. Pour pallier aux problèmes liés aux signes cliniques du modèle (perte d’équilibre, faiblesse musculaire, atteinte des fonctions motrices), les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Ce gel riche en glucides et en électrolytes améliore la prise en charge des rats pendant les phases post-opératoires, et demeure davantage accessible (placé sur le sol de la cage, contrairement aux granulés situés en hauteur). Une litière à forte granulométrie sera également utilisée pour éviter les risques d’étouffement en phase post-opératoire. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et durant les 48h suivantes. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. La remise en cage par 3 ne sera réalisée que lorsque la récupération des animaux sera suffisante (reprise de poids après la perte attendue liée à l’induction du modèle). Les animaux d’une même cage recevront le même traitement afin de limiter le risque de dominance d’un animal avec traitement sur un animal sans traitement par exemple. Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.
Choix des espèces
Les mécanismes et les conséquences physiologiques de l’ischémie-reperfusion cérébrale sont similaires chez le Rat et chez l’Homme. Le Rat est donc une espèce pertinente pour modéliser les AVC thromboemboliques chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des rats mâles Wistar Han de 300-350g à l’arrivée au laboratoire. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Etude de l’interaction des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique avec les lymphocytes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 150 étant classées en gravité sévère. Une pathologie neuro-inflammatoire est induite par injection intra-péritonéale et 100 souris chimères subissent une irradiation, pour étudier le passage des lymphocytes dans le système nerveux central. Le porteur indique que les souris malades présentent perte de poids et troubles moteurs, et mentionne des tests comportementaux sans préciser lesquels. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne fournit de résultats exploitables et décrit son modèle comme "unique".
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'étudier les interactions entre les lymphocytes et les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique afin de cerner les mécanismes et particularités permettant un passage des lymphocytes dans le système nerveux central et le rôle de ce passage en condition physiologiques et pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de mieux comprendre les interactions entre système immunitaire et système nerveux central, en condition physiologique afin de comprendre les conséquences de ces interactions en terme de susceptibilité aux infections, aux maladies auto-immunes mais aussi dans le cadre du vieillissement et des pathologies neurodégénratives. En conditions pathologiques, les modèles développés, in vitro et in vivo permettent de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Procédures
Une pathologie neurologique inflammatoire sera induite par injection intra péritonéale unique chez certains animaux, pathologie qui pourra être surveillée pour étude entre 2 jours et 90 jours. Certains animaux seront des modèles de souris chimères et subiront une irradiation (100 souris) unique de 6 minutes et 36 secondes.
Impact sur les animaux
Une pathologie neurologique est attendue lors de l'étude de la condition pathologique. Dans ce cas les souris présentent des signes cliniques (perte de poids, troubles moteurs) et immunologiques qui seront alors surveillés.
Devenir
Au total l'ensemble des animaux sera mis à mort afin de pouvoir quantifier et étudier l'infiltrat lymphocytaire dans le système nerveux central.
Remplacement
L’étude de l’implication des cellules endothéliales dans la migration des lymphocytes dans le système nerveux central via la reconnaissance de l’antigène, nécessite des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées telles que l’activation et la différenciation lymphocytaire in vivo, la migration cellulaire, l’entrée et l’activation dans le tissu cible. Il n’existe pas actuellement des méthodes alternatives à ces études in vivo pour l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents des pathologies humaines. Notre modèle d’étude unique permet d’obtenir des informations nouvelles et importantes concernant les affections neuro-inflammatoires.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé d'après les conditions minimales nécessaires à une puissance statistique permettant d'établir des conclusions statistiques recevables. Les animaux de ces procédures étant utilisés pour des expérimentations in vivo ou in vitro pour générer des cultures primaires, le nombre peu difficilement être réduit. Cependant, la nouvelle version de ce protocole intègre une révision à la baisse des effectifs estimés en raison des premiers résultats d'étude sur les lymphocytes CD4 ayant mis en lumière des difficultés techniques non résolvables à l'heure actuelle. L'ensemble des organes étudiés sont prelevés chez les souris (système nerveux central mais aussi rate, ganglions, et tube digestif) afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux inclus dans les procédures en condition pathologiques ou dans la procédure chimère auront une surveillance accrue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance anormale induisant son exclusion de la procédure et sa mise à mort. Les points limites à surveiller identifiés sont : Activité extrême (grattage ou léchage anormal) - Posture (courbée ou prostrée) - Aspect (perte de poids, déshydratation, poil hérissé, taches) - Absence de toilettage et diminution de l’appétit - Respiration anormale (rythme et mouvement) - Stéréotypies et hyperactivité (démangeaisons, léchage) - Présence d’anomalie (blessure, inflammation). Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie après une anesthésie gazeuse par isoflurane. Les animaux seront au maximum 5 par cage et auront un enrigissement permettant une stimulation de leurs comportements naturels et l'amélioration de leur bien être selon les recommandations en cours dans l'établissement utilisateur. Lors du suivi par test comportemental, les animaux auront une période d'entrainement progressive de 3 jours avant de débuter les tests comportementaux mesurés.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines (maladies infectieuses, maladies inflammatoires) comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques. Notre modèle, floxé, a été développé dans cette espèce et aucune autre espèce d’animaux possédant ce transgène n’est disponible. De plus, l’utilisation de la souris permet une compatibilité cellulaire avec les autres modèles murins développés. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Adultes entre 6 et 16 semaines d’âge car nous avons besoin d'animaux adultes qui ont un développement des systèmes immunitaire et nerveux central complet pour nos expériences. Seule la procédure 1 pour l'induction du modèle est réalisée plus tôt.
Caractérisation du métabolisme glucidique chez des souris atteintes de glycogénose de type III.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses par transgénèse d'une glycogénose de type III, elles subissent des biopsies de la queue, des jeûnes répétés de 6 à 12 heures, des injections intra-abdominales puis des incisions de la queue pour mesurer leur glycémie, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort pour prélever foie, reins et intestins. Le porteur indique que le jeûne peut provoquer des hypoglycémies avec prostration et refroidissement, et que 10 à 30 % de ces souris développent des tumeurs du foie entre 15 et 18 mois. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la régulation du sucre entre organes impose de travailler sur l'organisme "en entier" et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Le glycogène est la forme de stockage de sucre apporté par l’alimentation. Il est principalement accumulé dans le foie et dans les muscles. Sa dégradation par le foie permet de libérer du sucre dans le sang pour maintenir la glycémie (concentration de sucre dans le sang) autour de 1g/L, et cela dès la fin d’un repas. Une baisse de la glycémie en dessous de 0,7 g/L est appelée hypoglycémie. La glycogénose de type III est une maladie génétique rare due à l’absence de l’enzyme qui permet la dégradation du glycogène en molécule simple de sucre. Cette maladie se caractérise, dès le plus jeune âge, par des hypoglycémies, lors de jeûnes courts, et l’accumulation de glycogène dans le foie. Il est connu que ces patients peuvent maintenir leur glycémie en induisant la production de sucre par l’organisme par une autre voie métabolique à partir de substrats comme les acides aminés (produits de dégradation des protéines). Ainsi, pour éviter les hypoglycémies qui peuvent être fatales, les patients doivent manger régulièrement, en privilégiant les sucres lents (maïzena cru) et des aliments riches en protéines. Ce projet a pour objectif de caractériser les conséquences exactes de l’absence de la dégradation du glycogène sur le métabolisme du foie et la régulation de la glycémie, en déterminant le rôle des deux autres tissus capables de produire du sucre, les reins et l’intestin. Pour cela, nous disposons d’un modèle de souris transgéniques qui développent les mêmes symptômes que les patients atteints de glycogénose de type III. Nous proposons d’étudier la régulation de la glycémie à partir de différents substrats qui sont connus pour être préférentiellement utilisés par le foie ou par les reins/l’intestin. Ceci nous permettra d’identifier la contribution de ces 3 organes dans le maintien de la glycémie chez les patients atteints de glycogénose de type III. Nous étudierons aussi le métabolisme hépatique, rénal et intestinal après un jeûne limité à 12h, temps nécessaire pour l’utilisation des stocks de glycogène du foie chez les souris saines. Ce projet devrait permettre de mieux définir les mécanismes moléculaires permettant aux souris atteintes de glycogénose de type III de maintenir leur glycémie et d’évaluer le rôle des reins et de l’intestin en l’absence de dégradation des stocks de glycogène par le foie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet devrait permettre de mieux caractériser l’adaptation du métabolisme chez des souris atteintes de glycogénose de type III pour maintenir une glycémie physiologique, évitant le décès des souris par hypoglycémie lors de jeûne court. Notre hypothèse est que les reins et l’intestin pourraient compenser la perte de la production de sucre par le foie. Ainsi, ce projet devrait mettre en exergue la contribution des reins et de l’intestin dans le maintien de la glycémie. Cette étude permettra aussi de comprendre les mécanismes moléculaires induits chez les patients traités par des régimes enrichis en protéines. Ces régimes sont connus pour apporter des acides aminés, après dégradation des protéines, qui sont utilisés comme substrats pour produire du sucre, principalement par les reins et l’intestin, alors que le foie ne peut pas produire de sucre à partir de ces acides aminés.
Procédures
Les souris subissent une biopsie de l’extrémité de la queue qui est un geste qui dure quelques secondes. Les souris seront soumises à 2 périodes de jeûne de 6 h, et à une période de jeûne de 12h. Pour déterminer l’effet des 2 produits administrés aux souris, la solution sera injectée progressivement, en environ 30 sec-1 min, dans l’abdomen des souris. Leur glycémie sera ensuite mesurée sur une période de 2 heures, après l’incision de l’extrémité de leur queue. L’incision est un geste très rapide qui dure 1 ou 2 secondes, et qui sera réalisé juste avant l’injection des produits à tester. Une prise de sang sera réalisée en moins de 1 minute, avant la mise à mort des souris. Au total, l’expérimentation s’étalera sur 3 semaines.
Impact sur les animaux
- Les souris atteintes de glycogénose de type III sont susceptibles de développer des hypoglycémies au cours du jeûne de 12h qui peuvent entrainer un mal-être général, caractérisé par un ralentissement de leur déplacement, même sous stimulation du zootechnicien, une prostration, et éventuellement un refroidissement de l’animal. - De plus, ces souris (entre 10 et 30%) peuvent développer des tumeurs hépatiques entre 15 et 18 mois. - L’entaille de l’extrémité de la queue des souris entraine une légère douleur. - L’injection de produits chimiques peut entrainer une légère inflammation du péritoine. - La prise de sang réalisée peut entrainer une légère douleur due à la piqure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissu par une méthode éthiquement autorisée. Le foie, les reins et les intestins seront prélevés pour des analyses moléculaires.
Remplacement
La production de sucre par l’organisme implique 3 organes, le foie, les reins et l’intestin qui agissent de façon coordonnée pour maintenir les taux de sucre dans le sang à des valeurs comprises entre 0,7 et 1,1 g/l en dehors des repas. Le maintien de l’homéostasie glucidique implique une régulation inter-organe, via l’action de diverses hormones et de signalisations nerveuses. Notre étude nécessite donc de travailler sur l’organisme en entier pour conserver ce dialogue complexe entre organe.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, du modèle animal, et du métabolisme, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider les approches expérimentales utilisées. Afin de pouvoir faire une analyse statistique avec une puissance de 80% et p
Raffinement
-Pour habituer les animaux aux manipulations et aux zootechniciens, les animaux seront pesés de façon hebdomadaire permettant aussi de suivre leur poids. A noter que l’ensemble du personnel a suivi une formation aux techniques de contention des souris moins stressantes que sans soulever l’animal par la queue. -Afin d’éviter les éventuelles hypoglycémies et l’épuisement des souris qui pourrait être dû à leur faiblesse musculaire, les souris ont accès à la nourriture directement dans la cage et des embouts des biberons longs. - La connaissance des modèles animaux atteints de glycogénose a permis de définir des points limites, en identifiant les manifestations physiologiques liées aux hypoglycémies chez la souris. Un suivi de glycémie sera réalisé si un animal reste prostré dans une cage, et/ou ne répond pas ou peu aux stimulations du zootechnicien. En cas d’hypoglycémie sévère (glucose inférieur à 30-40 mg/dL), la souris sera systématiquement injectée avec une solution de glucose et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. -À la suite de la prise de sang en veine submandibulaire, l’arrêt du saignement sera rapidement maitrisé par un point compressif de la veine. -Pour prévenir la douleur due au prélèvement de sang, de la crème anesthésiante sera appliquée localement sur l’extrémité de la queue des souris ou la zone de piqure, 30 min avant l’incision. - Une perte de poids de plus de 15%, associée à une dégradation de l’état général de l’animal (poils hérissés, yeux fermés...) sera un point limite pouvant survenir lors d’une atteinte hépatique ou du développement d’une tumeur du foie -Enfin, l’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, morsures...). En cas de petites plaies, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles qui apaise et cicatrise sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie observée chez les patients. Par ailleurs, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Le génotypage des souris par l’analyse d’ADN purifié à partir d’une biopsie de queue sera réalisée à l’âge de 15 jours, afin de sélectionner les souris avant leur sevrage. Les protocoles seront ensuite réalisés chez des souris adultes âgées d’environ 12 mois qui correspond à un stade précédant le développement de tumeurs du foie chez les souris atteintes de glycogénose de type III. Cette étude s’intègre dans un projet global d’étude des mécanismes de la tumorigenèse du foie en relation avec les perturbations du métabolisme.
Mise en place de modèles de glioblastomes implantés en stéréotaxie chez le rat immunocompétent Fischer puis opérés (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
88 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance modérée à sévère. Une tumeur cérébrale leur est greffée par stéréotaxie, laissée se développer une vingtaine de jours, puis retirée par une chirurgie que le porteur classe en gravité sévère, avec des anesthésies répétées pour l'imagerie. Il reconnaît que le développement de la tumeur peut provoquer une atteinte de la motricité et de la coordination et une perte de poids, trente-six rats étant mis à mort pour atteinte d'un point limite. Il veut mettre au point un modèle de glioblastome opéré chez le rat immunocompétent et juge le remplacement par des méthodes alternatives "clairement pas possible".
Objectifs
Le glioblastome (=tumeur intracérébrale) est la forme la plus agressive des tumeurs du cerveau avec des récidives systématiques malgré des traitements lourds. Le traitement actuel consiste en une chirurgie pour enlever la tumeur accompagnée d’un traitement par chimiothérapie et radiothérapie. Notre laboratoire affiche une bonne expertise dans l'utilisation de modèles tumoraux d'origines humaines développés sur rongeurs immunodéficients. Cependant, ces animaux apportent une réponse incomplète à nos recherches menées sur les tumeurs cérébrales de par l'absence de la prise en charge de l’immunité. Pour cela, nous souhaitons développer des modèles issus de tumeurs de rongeurs portées par des rongeurs immunocompétents, dont la réponse immunitaire joue un rôle primordial dans le développement de la tumeur ou dans la réponse antitumorale. Notre choix s'est porté sur 2 types de glioblastomes (2 différents) de rat qui sont caractérisés par une forte capacité d'invasion et d'infiltration dans le tissu cérébral sain mais aussi par des capacités de radiorésistance et de chimiorésistance : cet échappement aux stratégies thérapeutiques standards en fait de bons candidats permettant l'extrapolation en cancérologie humaine. L’objectif à terme de ce projet de mise au point de modèle opéré (chirurgie pour enlever la tumeur) permettra de repositionner nos travaux futurs dans un contexte clinique de prise en charge thérapeutique (dont le traitement de référence inclut entre autre la chirurgie pour enlever de la masse tumorale principale). Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet préliminaire permettra de mettre en place un modèle de tumeurs cérébrales enlevées par chirurgie sur rats immunocompétents au sein du laboratoire, l'intégration de la composante immunitaire étant primordiale dans la continuité de nos travaux. En outre, ce projet de mise au point d'un modèle expérimental avec notamment l'intégration de la chirurgie pour enlever la tumeur servira dans des études pour lesquelles une stratégie thérapeutique sera menée en utilisant la cavité laissée suite à la chirurgie. A plus long terme, le bénéfice attendu est de proposer une stratégie thérapeutique pour améliorer la prise en charge du glioblastome humain.
Procédures
-Procédure 1 et 2 : greffe intracérébrale de tumeurs cérébrales réalisée une fois au début de l'étude à J0 (durée 45min) Puis développement de la tumeur du cerveau jusqu’à 21 jours. - Procédure 2 : Chirurgie pour enlever la tumeur : réalisée une fois au milieu de l'étude (durée 45 min). - Anesthésie isoflurane réitérée 4 fois (procédure 1) et 5 fois (procédure 2) pour l’imagerie durant 15 minutes. L’imagerie sera réalisé dans l’établissement utilisateur 2/2, toutes les autres procédures seront réalisées dans l’établissement utilisateur 1/2.
Impact sur les animaux
La première nuisance, modérée, est liée à l'implantation même de la tumeur dont le développement conduit chez les rats à une possible atteinte neurologique (atteinte de la motricité et de la coordination) associée à des pertes de poids. Notre recherche bibliographique a mis en avant une survie des animaux comprise entre J21 et J24 . La seconde nuisance est liée à la chirurgie pour enlever la tumeur (classée sévère). Enfin, le transport depuis l'animalerie (établissement utilisateur 1/2) jusqu'au site d'imagerie IRM (établissement utilisateur 2/2) et l’anesthésie à l’isoflurane hebdomadaires des animaux représentent une nuisance légère .
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. 44 pour prélèvement du cerveau et analyse histologique et 36 pour atteinte d'un point limite (suivi de la croissance tumorale par imagerie).
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène impliquant différents types de cellules. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
S’agissant d’une étude prospective, aucune analyse statistique ne sera réalisée. Afin de limiter le nombre d’animaux, les expérimentations seront menées étape par étape par pallier, tout d'abord en se concentrant sur une tumeur nécessitant 44 rats maximum (36 + 8 surnuméraires). Dans un premier temps, 8 rats seront utilisés pour réaliser le suivi de croissance. Ce nombre a été évalué comme minimum pour caractériser la croissance tumorale par imagerie et analyses histologiques. Dans un second temps, la tumeur sera enlevée par chirurgie sur 10 rats à condition que les résultats sur la 1ère série de 8 rats correspondent à nos attentes (prise de tumeur visible à l’imagerie et analyse histologique correspondant). Si cette série de chirurgie pour enlever la tumeur est satisfaisante, nous complèterons les effectifs avec respectivement 8 animaux pour le suivi de la croissance tumorale et 10 animaux pour la chirurgie pour enlever la tumeur. Les 2 séries ne seront répétées (avec la même stratégie) pour les 2ème type de tumeurs, que si les résultats obtenus avec la 1ère tumeur ne donnent pas les résultats escomptés en termes de croissance et de chirurgie pour enlever la tumeur (2° tumeur : 44 rats maximum (36 + 8 surnuméraires).
Raffinement
Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de papier craft et de buchettes en bois à ronger et bénéficieront d'un cycle jour/nuit inversé dans leur salle d'hébergement. Ils seront hébergés par 2 ou 3 dans des cages de 900 cm2 et les expérimentations ne débuteront qu'après une semaine d'acclimatation suite à la réception des animaux. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur et après son retrait chirurgical (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement et de la motricité, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Des points limites précoces sont définis (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement) afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Le transport des animaux vigiles entre l’animalerie et le site d’imagerie sera réalisé en maintenant une température optimale par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages.
Choix des espèces
Dans les études menées pour traiter le cancer, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur dont le volume deviendra suffisamment important pour permettre l’imagerie. Par soucis de cohérence avec les données et protocoles de la littérature, les rats utilisés seront des âgés de 6 semaines à la réception. Au moment de l'implementation de la tumeur, ces rats seront pubères (envron 7 semaines pour un poids de 200 à 250g).
Développement d’une stratégie thérapeutique ciblée pour traiter la thrombose artérielle et l’AVC ischémique, EU 2/2.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
740 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 380 dans des procédures de souffrance sévère et 240 opérées sans réveil. Un accident vasculaire cérébral ou une thrombose leur est provoqué, suivi d'IRM répétées, le porteur décrivant au réveil une activité réduite, des troubles de la motricité et des mouvements de rotation. Il reconnaît le risque de saignement pouvant conduire à mettre l'animal à mort pour limiter la douleur. Il teste des anticorps censés cibler le thrombus et affirme qu'il est "impossible" de remplacer la souris par des modèles in vitro pour ces pathologies.
Objectifs
Le projet se fera dans deux établissements utilisateurs. L’hémostase regroupe les processus biologiques assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion vasculaire, vont former un agrégat, appelé clou plaquettaire, qui limite le saignement. Un processus similaire intervient lors de la thrombose artérielle qui se développe dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à l’érosion ou la rupture de cette plaque, les plaquettes forment un thrombus pouvant entrainer des pathologies graves comme l’AVC ischémique suite à l’obstruction d’une artère cérébrale. Il existe aujourd’hui en clinique 3 classes d’agents antiplaquettaires pour traiter efficacement la thrombose artérielle, mais leur principal effet indésirable est qu’ils induisent des saignements. Concernant les AVC ischémiques, le traitement de référence est basé sur une approche pharmacologique activant la destruction du thrombus (fibrinolyse), combiné ou non à une approche chirurgicale permettant de retirer de manière mécanique le thrombus. Cependant, à cause du risque hémorragique, ces deux approches doivent être réalisée respectivement dans les 4h30 ou 6h après l’apparition des premiers symptômes, ce qui limite fortement le nombre de patients pouvant être traités, puisque que passé ces délais, ils ne peuvent plus recevoir les traitements. Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique ciblée qui permettrait de limiter le risque hémorragique lié à ce type de traitement. Cette approche est basée sur le développement d’anticorps anti-fibrine couplés : i) à l’hirudine, connue pour inhiber les plaquettes et la synthèse de fibrine venant consolider l’agrégat ; ou ii) à l’activateur de fibrinolyse, le rtPA, permettant la destruction du thrombus. L’utilisation d’un anticorps anti-fibrine permet ici de cibler l’action de de ces molécules spécifiquement au lieu de la thrombose, la fibrine étant produite uniquement dans le thrombus. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de ces anticorps sur la thrombose artérielle et l’AVC ischémique, ainsi que leur risque hémorragique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur 2 aspects : • La thrombose artérielle : on pourrait mettre en évidence une réduction de la thrombose dans les modèles expérimentaux et ce potentiellement en réduisant les risques de saignement, que l’on sait importants avec les traitements actuellement disponibles. • L’AVC ischémique : on pourrait mettre en évidence une réduction de la taille des lésions post-AVC couplée à une potentielle réduction des saignements par rapport au traitement rtPA du fait du ciblage spécifique du thrombus. Cette réduction des saignements pourrait également conduire à une augmentation de la fenêtre thérapeutique des traitements de l’AVC : à ce jour, la rtPA ne peut être administrée que 4.5 heures après l’AVC. L’identification de tels résultats pourraient déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle ou un AVC ischémique ainsi qu’à une réduction des séquelles à long terme de ces pathologies. .
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale (animal vigile), sous-cutané, intra-veineux et intranasal (animal anesthésié). Certains modèles nécessitent des procédures chirurgicales, celles-ci seront de maximum 60 min. Des IRM de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Une autre est le risque de saignement au site chirurgical. Si le saignement observé est trop important la souris sera sacrifiée afin de limiter toute douleur ou inconfort. Pour les modèles d’AVC, on s’attend au moment du réveil à un impact sur le comportement (activité réduite), sur l’apparence physique (apparence des poils, paupières), sur la nutrition et sur la motricité (rotation). Pour le modèle de saignements pulmonaires, au moment du réveil on s’attend à un impact sur le comportement (baisse d’activité) et la respiration (accélération).
Devenir
Modèles de thrombose Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure. Temps de saignement Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure. Modèle d’inflammation pulmonaire induite par LPS Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements au niveau des poumons après leur mort. tMCAO Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements de leur cerveau après leur mort. Modèles d’AVC Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements de leur cerveau après leur mort.
Remplacement
Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique ciblée basée sur le développement d’anticorps anti-fibrine couplés : i) à l’hirudine, connue pour inhiber les plaquettes et la synthèse de fibrine venant consolider l’agrégat ; ou ii) à l’activateur de fibrinolyse, permettant la destruction du thrombus. L’utilisation d’un anticorps anti-fibrine permet ici de cibler l’action de de ces molécules spécifiquement au lieu de la thrombose et de l’AVC, la fibrine étant produite uniquement dans le thrombus. Les deux pathologies étudiées étant des processus particulièrement complexes faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par une habituation au gel nutritif 2 jours avant l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’injection d’un analgésique pendant et après chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal facilement disponible et les modèles d’études in vivo y sont largement répandus et maitrisés. La souris est un modèle couramment utilisé pour évaluer la formation de thrombus. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Etude in vivo de la virulence de Pseudomonas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas par voie urétrale, nasale, abdominale, plantaire ou intraveineuse, puis reçoivent des inhibiteurs testés pour réduire la virulence, avec des prélèvements répétés de sang et d'urine. Le porteur reconnaît que ces infections peuvent provoquer une inflammation urinaire ou pulmonaire et un affaiblissement général qualifiés de sévères. Il vise de nouvelles cibles contre les infections nosocomiales et juge le recours à l'animal "irremplaçable" pour suivre la dissémination bactérienne entre organes.
Objectifs
Les bactéries du genre Pseudomonas y compris Pseudomonas aeruginosa, sont présentes dans le monde entier dans le sol et l’eau. Elles préfèrent les endroits humides, tels que les éviers, les toilettes, les piscines insuffisamment traitées par le chlore, les spas et les solutions antiseptiques périmées ou inactivées. Ce sont des pathogènes opportunistes qui touchent principalement les personnes présentant un système immunitaire affaibli. En effet elles représentent à elles seules plus de 8% des infections nosocomiales en France. Ces bactéries peuvent infecter le sang, la peau, les os, les oreilles, les yeux, les voies urinaires, les valves cardiaques et les poumons, ainsi que les plaies (telles que les brûlures, les blessures ou les plaies d’origine chirurgicale). L’utilisation de matériel médical tel que les cathéters qui sont insérés dans la vessie ou les veines, les tubes respiratoires et les systèmes de ventilation mécanique, augmente le risque d’infections à Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie représente un problème de santé publique majeur avec plus de 550 000 morts globalement chaque année et une résistance accrue aux antibiotiques. En 2017, l'Organisation mondiale de la santé OMS a classé Pseudomonas parmi les trois premiers micro-organismes « critiques » qui constituent une menace en raison de leur capacité à devenir de plus en plus résistants à tous les antibiotiques disponibles. La découverte de nouvelles molécules antibactériennes devient donc une nécessité face à un futur manque d'antibiotiques efficaces. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la virulence de cette bactérie pour développer de nouvelles stratégie d’anti virulence contre ce pathogène bactérien. Le but de notre étude est d’étudier et de cibler les facteurs de virulences de Pseudomonas au cours d’infection chez la souris.
Bénéfices attendus
L’étude des facteurs de virulence de Pseudomonas va permettre de mieux comprendre les mécanisme mis en place par la bactérie pour infecter l’hôte. Cela permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui viserait à diminuer la virulence de ce pathogène et donc de diminuer les symptômes associés à des infections nosocomiales qui représentent 750 000 infections par an en France et qui sont en lien direct de 4 000 décès par an.
Procédures
Les souris vont recevoir une inoculation de bactéries par différentes voies suivant la procédure : trans urétral (2 injections à 1h ou 6h d'intervalle suivant le modèle) ; intra nasale (une injection) ; intra péritonéale (une injection) ; voie coussinet plantaire (une injection) ; intraveineuse (une injection). Dans chacunes des procédures nous allons tester des inhibiteurs de facteurs de virulence qui seront eux injectés via différentes voies suivant l'inhibiteur sélectionné : i) traitement par eau de boisson comme cela peut être réalisé avec les antibiotiques, traitement de 48 à 72h, ii) par injection IP sur 3 jours à 24h d’intervalle, iii) par gavage comme il est souvent utilisé pour les antibiotiques également, 3 gavages à 24h d’intervalle ou iv) par injection trans-urétrale (pour la procédure 1) 3 injections à 24h d'intervalle. Pour chaque lot de souris un prélèvement de sang à la queue sera effectué pour récupérer 20 µl qui permettrons de faire une énumération sanguine De plus un prélèvement d’urine quotidien (hors weekend) par contention de la souris et application d’une bandelette de buvard au niveau de l’urètre sera réalisé pour suivre la colonisation vésicale au cours du temps dans le modèles d'infection urinaire.
Impact sur les animaux
Certaines de ces procédures expérimentales pourront entrainer une souffrance chez l’animal avec des effets locaux (inflammation de l’appareil urinaire ou pulmonaire) ou encore systémiques (affaiblissement de l’état général par exemple). Ces nuissances seront qualifiées comme sévères.
Devenir
A la fin de toutes les procédures tous les animaux seront euthanasiés car nous avons besoin de récupérer différents tissus et liquide biologique pour réaliser une analyse ex vivo.
Remplacement
L'utilisation de méthode alternative in vitro a été préalablement réalisée pour démontrer l'impact des différentes souches mutées ou non ou des inhibiteurs sur la cellule eucaryote en culture. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes. De plus les objectifs sont i) de découvrir le(s) rôle(s) des différents facteurs de virulences sur la colonisation de Pseudomonas, ii) d’identifier des inhibiteurs de Pseudomonas qui permettront de diminuer sa virulence iii) de mesurer les effets des facteurs environnementaux sur leur expression in vivo. En effet suivant l’organe cible de Pseudomonas, l’environnement sera forcément très différent (exemple vessie vs poumons). Or on sait que les interactions entre la bactérie et son environnement vont être très importants et non négligeables dans notre étude, et cette interaction complexe ne peut être modélisée in vitro.
Réduction
Certains des modèles décrits précédemment sont déjà mis en place dans l’équipe, c’est le cas par exemple du modèle d’instillation dans la vessie, ou encore l’infection en coussinet plantaire. Les autres modèles vont devoir être mis en place au laboratoire, mais nous nous appuyons uniquement sur des modèles déjà établis dans la littérature. De plus nous utiliserons des inhibiteurs déjà testés in vitro et décrit dans la littérature ou utilisés chez l’homme dans d’autres contextes. Enfin les gestes à réaliser pour les modèles qui ne sont pas encore implantés au laboratoires sont déjà acquis par le personnel de l’équipe dans le cadre d’autres projets. Une attention particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. De plus une étude longitudinale sera réalisée à L’IVIS (In Vivo Imaging System) qui est un système d’imagerie tomographique sur animal vigile. Il permet de visualiser des marqueurs fluorescents ou bioluminescents, dans notre cas des bactéries, dans les différents organes de la souris (vessie, poumons, rate …) sur des animaux vivants endormis à l’isoflurane. Une bonne corrélation entre le signal de bioluminescence et le nombre de bactéries retrouvées dans les organes par analyse microbiologique a été établie dans des expériences précédentes. Cet outil nous permettra de suivre le niveau d’infection des souris de manière longitudinale sans les euthanasier, nous permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et plus fréquemment pendant les phases aigues. Des points limites adaptés seront mise en oeuvre afin d'évitre toute souffrance inutile de l'animal.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude des facteurs de virulence de Pseudomonas dans des conditions in vivo. De plus la littérature sur les différents modèles proposés avec Pseudomonas est largement décrite. Souris de 5 à 9 semaines suivant le modèle expérimental. Dans la littérature, les souris utilisées pour les différents modèles décrits sont classiquement âgées entre 6 à 9 semaines. Nous prenons une marge d’une semaine pour respecter la période d’acclimatation.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
Issues de couples reproducteurs commerciaux, les souris de ce projet appartiennent à une lignée transgénique de la maladie d'Alzheimer décrite par le porteur comme à "phénotype dommageable", dont les défauts neuropathologiques apparaissent dès six semaines. 1 327 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 929 en souffrance modérée et 398 en souffrance sévère. Les souris traitées reçoivent une seule injection de vecteur viral, soit dans la veine derrière l'œil sous cinq minutes d'anesthésie, soit dans le cerveau par une ouverture du crâne sous 90 à 120 minutes d'anesthésie, puis passent un test d'alternance spontanée et un test d'apprentissage et de mémoire non nommé, avant un prélèvement de liquide céphalo-rachidien et de sang sous anesthésie, sans réveil. Sur le remplacement, le porteur affirme que le recours aux souris est "essentiel" et précise que les animaux non-humains utilisés sont "nés et élevés en captivité dans des élevages agrées".
Objectifs
Aucun traitement n'étant aujourd'hui en mesure de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, nous avons pour objectif de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Comment ? En nous tournant vers la thérapie génique, qui consiste à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau dans le but de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans la maladie d'Alzheimer (MA) dans un modèle murin de la maladie. Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié (AAV Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) permettant de délivrer l’ADN au cœur même des cellules. Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux AAV modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Les objectifs de l’étude sont : 1) Démontrer la fonctionnalité de l’AAV et donc de confirmer l’efficacité thérapeutique de l’administration intracérébrale. 2) Comparer l’efficacité thérapeutique de deux AAV par administration intracérébrale ou intraveineuse. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec phénotype dommageable seront utilisés. Ils seront issus de couples reproducteurs commerciaux. Les animaux seront injectées une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90-120 minutes sous anesthésie gazeuse avec injection d'analgésique en pré-opératoire, application d'analgésique sur le site incisé et injection d'analgésique en post-opératoire). Des études comportementales (consistant à évaluer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris) seront réalisées afin d’évaluer les effets des vecteurs injectés sur les déficits cognitifs. Le test mesurant l’alternance spontanée sera réalisé en une session d'une journée. Le test mesurant l’apprentissage et la mémoire comprend des sessions d'entrainement de 4 à 8 jours, puis un test effectué en une journée, juste après la session d'entrainement. Le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien et sanguin sera réalisé (45 minutes) sous anesthésie après injection d’un anti-douleur. Ces prélèvements sont réalisés juste avant l’euthanasie des animaux (sans réveil après les actes).
Impact sur les animaux
Parmis les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1)Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adeéno-associés) pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées soient déjà évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.7) un stress lié à la manipulation de des animaux lors des tests comportements
Devenir
l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des actes prévues que ce soit pour l’élevage (sans prélèvement) de la lignée ou à l’issue des procédures (avec prélèvement pour analyse).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (1327) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. La taille des effectifs a donc été établie grâce à un calcul de puissance. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests de comportement et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (comportementaux, biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des demandes/exigences expérimentales.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’analgésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection. Une surveillance particulière de l’œil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. Le geste de l’injection intraveineuse est maitrisé par l’applicateur. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux jeunes adultes (souris : 4-8 semaines) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques ou intraveineuses de manière précoce (4-8 semaines) afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement sur la neuropathologie et le comportement).
Impact de la « cellule d’origine » sur le phénotype de la tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Chaque souris, immunodéficiente et pré-pubère, subit deux chirurgies pour l'"humanisation" d'une glande mammaire puis la greffe de cellules tumorales humaines, et développe ensuite une tumeur du sein. Le porteur reconnaît le développement d'une pathologie potentiellement grave et cherche à comprendre comment la "cellule d'origine" façonne le type de tumeur. Il valide des étapes préalables in vitro mais juge le modèle in vivo "indispensable" pour reproduire l'environnement tumoral.
Objectifs
Au cours des dix dernières années, les progrès des technologies de séquençage et de la biologie computationnelle ont conduit à une nouvelle ère de médecine de précision en oncologie. Les tests génomiques permettent d'adapter la prise en charge clinique à chaque patient cancéreux en fonction des altérations génomiques des cellules cancéreuses. L'état actuel de l'oncologie de "précision" repose sur l'administration de médicaments ciblés capables de contrôler les voies mutées. Malgré les grands espoirs que suscite cette approche, seule une fraction des cancers répond aux interventions "ciblées". Le succès décevant de la médecine génomique dans le domaine du cancer est dû à une relative inefficacité à détecter des altérations exploitables ainsi qu’à un manque de compréhension fonctionnelle de la dépendance des voies moléculaires d'une masse tumorale donnée. Il est donc crucial de définir le schéma cellulaire et moléculaire de causalité conduisant à la progression tumorale et à la résistance thérapeutique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment l'initiation du cancer du sein peut conduire à différents sous-types de tumeurs mammaires avec une réponse spécifique aux thérapies. Plus précisément, nous voulons examiner comment la cellule de l’épithélium mammaire soumise à la première agression oncogénique - la "cellule d'origine" - peut avoir un impact sur la tumeur résultante en termes de paysage moléculaire et de réponse au traitement. Dans ce but, nous voulons mettre en place un modèle expérimental dans lequel nous pouvons suivre l'effet d'un oncogène sélectionné dans différentes cellules à l'origine de la hiérarchie de différenciation de l'épithélium mammaire et ensuite étudier la tumeur résultante.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment une agression oncogénique donnée dans des cellules différentes de l’épithélium mammaire (les cellules d’origines) donne naissance à des tumeurs dont les caractéristiques phénotypiques et l’agressivité varient. Ceci permettra par la suite de mieux comprendre les mécanismes de l’initiation tumorale et de prédire l’évolution d’une tumeur et sa réponse aux traitements.
Procédures
L’ensemble des animaux subira deux procédures chirurgicales (sous anesthésie+analgésie) : l’humanisation de la paire de glandes mammaires numéro 4 qui durera environ 20 minutes et l’implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire humanisée qui durera approximativement 15 minutes. L’induction in vivo sera réalisée par l’injection ip de doxycycline qui durera quelques secondes pour chaque souris.
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie potentiellement grave. Les gestes chirurgicaux et l'anesthésie associée ainsi que l’injection de doxycycline constitueront une nuisance sur les animaux. Les manipulations et les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
A l'issue de la procédure, les souris seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées, dissociées afin d’analyser l’immunophénotype et les caractéristiques moléculaires des cellules tumorales.
Remplacement
En amont de l’étape in vivo, l’expression des oncogènes et leur impact seront validés in vitro avant d’envisager leur transplantation. Cependant, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro et c’est pourquoi le modèle expérimental in vivo reste actuellement indispensable.
Réduction
Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant l’obtention de résultats statistiquement robustes. Pour cela, nous nous appuierons sur la méthodologie de calcul disponible sur le site http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/ qui permet d’estimer statistiquement la fréquence de cellules à l’origine de l’apparition de tumeurs.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de des lanières de papier compacté utiles à la nidification et d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris pré-pubères de 3 à 4 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, avant le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande. Il est donc nécessaire de faire la résection de la glande mammaire et l’injection de fibroblastes humains avant la formation des canaux mammaires afin d’« humaniser » la glande mammaire murine. Deux à quatre semaines après l’« humanisation » des glandes mammaires, les souris pourront alors être greffées avec des cellules épithéliales mammaires humaines transformées par des oncogènes classiques des cancers du sein chez la femme.
Induction de la satiété par électrostimulation des voies nerveuses sympathiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 523 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère (1 506 individus). Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec pose de fibre optique et injection intracérébrale de virus, l'implantation d'électrodes spinales ou abdominales, un régime gras et sucré destiné à les rendre obèses, puis des séances répétées d'électrostimulation sur cinq semaines. Le porteur reconnaît que ces impulsions peuvent déclencher des comportements d'automutilation, auquel cas la stimulation est arrêtée. Il vise un dispositif médical contre l'obésité et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut aborder la question, la souris restant selon lui un prérequis réglementaire au développement préclinique.
Objectifs
Ce projet vise à développer une méthode médicale pour traiter l'obésité en utilisant une technique d'électrostimulation du système nerveux. Contrairement aux traitements médicamenteux actuels, qui ont montré une faible efficacité dans la perte de poids, les interventions chirurgicales comme le bypass gastrique sont actuellement les options les plus efficaces pour traiter l'obésité. Cependant, ces interventions chirurgicales sont irréversibles et peuvent présenter des risques à long terme ainsi que des effets indésirables. Des études récentes ont suggéré que les effets bénéfiques du bypass gastrique sont liés au système nerveux sympathique. En conséquence, la stimulation électrique de ce système pourrait représenter une alternative moins invasive à la chirurgie pour traiter l'obésité. Plusieurs données scientifiques soutiennent cette approche, notamment la démonstration de l'inhibition des signaux nerveux spécifiques responsables de l'augmentation de la prise alimentaire. Le développement d'un dispositif médical utilisant l'électrostimulation du système nerveux pour réguler la prise alimentaire et le métabolisme pourrait être une solution prometteuse pour lutter contre l'obésité. Dans ce projet, l'objectif est d'étudier l'effet de l'électrostimulation du système nerveux sur la régulation de la prise alimentaire. Pour cela, des souris génétiquement modifiées sont utilisées comme modèle animal, permettant de surveiller en temps réel l'activité des neurones responsables de la satiété chez l'animal éveillé.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de réduire efficacement le poids chez les personnes obèses ou en surpoids. Cependant, cette surcharge pondérale peut entraîner plusieurs problèmes de santé tels qu'une élévation de la tension artérielle, un excès de triglycérides et un excès de sucre dans le sang, pouvant à long terme conduire au diabète de type 2 et/ou à des maladies cardiovasculaires (infarctus) et/ou hépatiques (cirrhose). Par conséquent, le développement de traitements plus efficaces est nécessaire pour lutter contre l'obésité. Les expériences menées dans le cadre de ce projet nous permettront d'évaluer, dans un modèle préclinique, les effets de l'électrostimulation des nerfs périphériques ou de la moelle épinière sur la perte de poids chez des animaux rendus obèses.
Procédures
Dans une première série d'expériences, les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 30 minutes au cours de laquelle nous poserons une fibre optique et réaliserons une injection intracérébrale de virus à l'aide d'un cadre stéréotaxique. Les souris seront soit sacrifiées 3 semaines après la chirurgie par surdosage d’anesthésique pour le prélèvement des cerveaux après perfusion intracardiaque, soit suivies pour un enregistrement en fibre optique pendant 3 sessions d'une heure après un jeûne de 5 heures sur 10 jours, avec isolement en cages individuelles pendant la durée de l'enregistrement. Aucun prélèvement n'est prévu pour cette procédure. Dans d'autres expériences, les animaux subiront deux procédures chirurgicales de moins d'une heure chacune. La première consistera à poser une fibre optique et à injecter par voie intracérébrale un virus, le tout après avoir immobilisé la tête de l'animal sur un cadre stéréotaxique. La seconde consistera à implanter des électrodes de stimulation au niveau spinal ou abdominal. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures, puis seront soumis à une électrostimulation après avoir été isolés en cages individuelles. Cette électrostimulation sera effectuée selon différents protocoles pendant une durée maximale de 5 semaines, avec un total de 30 sessions de stimulation de 10 minutes par semaine, réparties sur 3 jours hebdomadaires. Aucun prélèvement n'est prévu pour cette procédure. Enfin, concernant certains animaux, ils seront nourris avec un régime enrichi en graisses et en sucres pendant 9 semaines. Ensuite, ces animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 45 minutes, comprenant l'implantation d'électrodes de stimulation au niveau spinal ou abdominal. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront placés dans des cages métaboliques pour habituation pendant une semaine puis seront électrostimulés pendant 10 minutes avant chaque repas (fournis toutes les 2 heures) en suivant différents schémas temporels. Cette électrostimulation sera poursuivie pendant 3 semaines avant la mise à mort. Aucun prélèvement n'est prévu.
Impact sur les animaux
Toutes les expériences présentées dans cette demande comportent une phase chirurgicale incluant les éléments suivants : • Injection sous-cutanée d'analgésique préopératoire ; • Perte de poids et douleur durant les 2 à 3 premiers jours chez les animaux après l'intervention chirurgicale ; • Surveillance et manipulation des animaux durant les 4 jours de récupération post-chirurgicale (pesée, palpation) ; • Risques chirurgicaux inhérents à toute opération chirurgicale, tels que les risques d'infection ou de rupture des fils de suture ; • Mobilité entravée par la connexion aux générateurs externes pendant la période d'enregistrement et d'électrostimulation. Par ailleurs, les impulsions électriques peuvent causer un inconfort temporaire chez l'animal, ce qui nécessitera une évaluation et une limitation de la durée au maximum. De plus, certaines expériences impliquent un changement de régime alimentaire pouvant entraîner une prise de poids anormale chez cette souche murine et éventuellement des problèmes de malocclusion. Enfin, bien que les animaux soient en général hébergés avec leurs congénères, des périodes d'isolement (hébergement individuel) seront nécessaires : • pendant les enregistrements par fibre optique (maximum 5 heures par jour, tous les deux jours, pendant une durée maximale de 5 semaines) et • lors du suivi métabolique dans des cages dédiées (3 semaines en tout).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort dès la fin des expériences pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode in vitro ou in silico scientifiquement validée pouvant servir d'alternative à l'expérimentation animale pour aborder les questions soulevées par ce projet. En effet, l'étude de l'obésité ne peut être adéquatement réalisée in vitro en raison de sa nature complexe. Elle requiert une approche in vivo, prenant en compte l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. Ainsi, l'utilisation d'une espèce le plus proche possible de l'espèce humaine s'avère nécessaire, car la physiologie digestive est caractéristique de chaque groupe phylogénétique. Par exemple, l'utilisation d'animaux modèles de type insectes ou nématodes n'est pas réaliste pour de telles études. En revenanche, la souris posséde un système digestif proche de celui de l'homme même s'il présente des spécificités dont nous devrons tenir compte. Par ailleurs, l'usage d'un modèle expérimental in vivo murin s'avère essentiel en tant que prérequis pour la phase de développement préclinique, selon les autorités régulant la mise sur le marché de dispositifs médicaux.
Réduction
Le nombre de souris a été minimisé tout en restant suffisant pour obtenir des résultats exploitables. Compte tenu de l'expérience pratique des chercheurs, nous estimons qu'un maximum de 17 souris sera nécessaire pour élaborer les différentes étapes du modèle pour la mise au point de la phase chriurgicale. Les chercheurs ont déjà utilisé des points de repère anatomiques et pratiqué des gestes chirurgicaux sur des cadavres de souris, mais l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire avant de passer à la phase d'optimisation des paramètres de stimulation. Quant à la deuxième phase, étant donné que le nombre de paramètres d'électrostimulation possibles est pratiquement infini et afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, nous utiliserons des modèles de régression linéaire. Nous estimons qu'au maximum, 582 souris seront nécessaires pour cette procédure. Ce nombre total de souris est une estimation maximale, car nous effectuerons les expérimentations sur des lots de 10 animaux et des évaluations seront effectuées toutes les 20 souris. Ainsi, si 10 paramètres d’électrostimulation satisfaisants sont identifiés (permettant de réduire l'activité des neurones de la satiété) avant la fin de la procédure, nous mettrons fin aux expérimentations. En ce qui concerne les effets de l'électrostimulation sur la prise de poids, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique reconnue. Étant donné que notre stratégie expérimentale repose sur la comparaison du poids des animaux électrostimulés par rapport à ceux qui ne le sont pas, nous aurons besoin au maximum de 924 animaux, sachant que nous testerons différents schémas d'administration de l'électrostimulation pour les 10 types de stimulation sélectionnés lors de la phase préliminaire. Ce nombre total de souris est également une estimation maximale, car nous arrêterons les expérimentations dès qu’une combinaison de stimulation/schéma d’administration permet de diminuer significativement le poids des animaux.
Raffinement
• Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). • Une période d’acclimatation d'au moins 7 jours aura lieu, au cours de laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera effectué. Il convient de noter que pour la phase mesurant l'impact de l'électrostimulation spinale sur le prise de poids, les animaux recevront un régime alimentaire enrichi en graisse et en sucre et seront observés au moins 3 fois par semaine par les expérimentateurs afin de surveiller leur état de santé général. • Les chirurgies seront réalisées par du personnel compétent, et les animaux seront placés sous anesthésie et analgésie pour prévenir toute souffrance. Les animaux seront observés deux fois par jour pendant les quatre jours suivant l'opération. Les soins post-opératoires incluront notamment l'administration d'analgésiques pendant 3 jours, ainsi que l'administration d'un traitement anti-inflammatoire stéroïdien dans l'eau de boisson, qui sera maintenu pendant les 2 jours suivants. • Les effets potentiellement douloureux de l'électrostimulation seront évalués tout au long de la procédure, afin de mettre fin à l'électrostimulation dès que des signes de douleur apparaissent. Plus particulièrement, des comportements tels que des sauts de l'animal, une course de la souris ou des comportements d'automutilation entraîneront l'arrêt immédiat de l'électrostimulation en cours, y compris les intensités supérieures. • Les effets sur la prise de poids seront évalués sur un nombre d'animaux strictement nécessaire pour évaluer les effets à long terme de l'électrostimulation. • Enfin, des critères limites ont été définis pour anticiper toute détérioration de l'état de santé général des animaux, qu'ils soient sous anesthésie ou conscients. Si nécessaire, des protocoles de soins appropriés seront appliqués. En cas de détérioration de la santé de l'animal, la mise à mort sera effectuée immédiatement sur décision du responsable de l'étude.
Choix des espèces
L'espèce murine sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux dans la prise alimentaire sur ce modèle. De plus, c'est la seule espèce pour laquelle un large panel d'animaux modifiés génétiquement existent, permettant ainis de mesurer l'activité neuronale par photométrie. Nous utiliserons des animaux adultes, car l'objectif est de développer un dispositif médical pour les sujets adultes (âgés de ≥ 8 semaines).