Procédures sévères

34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.

Bénéfices attendus

L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).

Procédures

Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.

Remplacement

L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.

Raffinement

Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.

Choix des espèces

Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).

350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules tumorales sont implantées dans la joue, suivies d'un protocole d'irradiation qui peut provoquer dépilations, croûtes et ulcérations locales pendant sept à dix jours. Le porteur décrit un "projet pionnier" à "fort impact sociétal" et affirme qu'il est "indispensable" de développer des modèles animaux, les mécanismes inflammatoires ne pouvant selon lui être étudiés que dans un organisme entier. Le passage en essais cliniques au bénéfice des patients reste annoncé pour la fin du projet, au conditionnel.

Objectifs

Le carcinome épidermoïde de la cavité buccale (CCSO) est un sous-ensemble important de cancers de la tête et du cou, qui sont le 6e cancer les plus répandus dans le monde. De plus, la radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme certaines tumeurs de tête et cou, la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale chez des rongeurs. Nous investiguerons aussi la participation de certains mécanismes radiobiologiques. L’efficacité de la technique d’irradiation portera sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs, de la tête et du cou, irradiées. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier a des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif ou pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactants pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les tumeurs de tête et cou. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer d'autres techniques de RT et peut-être de changer certains des paradigmes de la RT conventionnelle. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

La première procédure est une étape de go/no go visant à caractériser l’impact de la croissance tumorale de 2 lignées cellulaires au niveau de la joue de souris. Pour cela, des cellules tumorales seront implantées dans l’épithélium oral de la joue d’animaux anesthésiés (durée anesthésie : 20 minutes) et un suivi par imagerie scanner, durant laquelle les animaux seront sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie : 20 minutes), sera effectué chaque semaine pendant 3 mois pour suivre l’évolution de la croissance tumorale. Dans la seconde procédure visant à réaliser une première évaluation in vivo de l’augmentation possible de l’index thérapeutique de notre technique d’irradiation pour le traitement de tumeur tête et cou, des cellules tumorales seront implantées dans l’épithélium oral de la joue aux animaux anesthésiés (durée anesthésie : 20 minutes). Vingt et un à vingt-huit jours après l’implantation des cellules, les animaux seront irradiés sous anesthésie générale (durée anesthésie : 30 minutes). Trois prélèvements sanguins seront réalisés. Selon les résultats de la procédure 1, les animaux seront également imagés par scanner régulièrement pour suivre la croissance tumorale. Enfin, la troisième procédure permettra l’étude et la caractérisation de l’infiltration immunitaire induite par notre technique d’irradiation. Pour cela, des cellules tumorales seront implantées dans l’épithélium oral de la joue aux animaux anesthésiés (durée anesthésie : 20 minutes). Vingt et un à vingt-huit jours après l’implantation des cellules, les animaux seront irradiés sous anesthésie générale (durée anesthésie : 30 minutes). Deux prélèvements sanguins seront réalisés et les animaux seront mis à mort 7 jours après irradiation pour réaliser les analyses post-mortem de l’infiltrat immunitaire.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales conduira au développement d’une tumeur au niveau de la joue des animaux qui sera contrôlée régulièrement. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire pouvant durer quelques jours . Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérationsau niveau de la joue, à l’endroit de l’irradiation pendant 7 à 10 jours.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. De même, les mécanismes inflammatoires et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été calculé à l'aide d'outils statistiques pour que les résultats puissent être significatifs.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des souris sera mise en place avant toute expérimentation : les souris seront manipulées quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement utilisées en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 8-10 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

3 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les mères suivent un régime hypergras et chaque souriceau subit jusqu'à quatorze interventions, dont neuf injections d'une molécule inflammatoire dès le lendemain de la naissance, une ouverture du crâne sous anesthésie pour l'imagerie et des prélèvements sanguins répétés à la queue. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et prévoit l'euthanasie pour prélever cerveau, foie et pancréas. Il affirme qu'il est impossible de reproduire hors de l'organisme les connexions étudiées, les bénéfices pour l'humain étant renvoyés à un éventuel traitement de l'obésité.

Objectifs

La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut s’étendre au cerveau et y entraîner des lésions. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras des mères pendant la lactation. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.

Bénéfices attendus

Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.

Procédures

Les mères seront soumises jusqu’au sevrage des petits (21 jours) à un régime hypergras ou à un régime contrôle (croquettes plus ou moins riches en graisse). Chaque souriceau sera soumis à 14 interventions au plus. 1/ Ils recevront 2 injections intrapéritonéales (dans le ventre, au niveau de l’abdomen, dans la cavité où se trouvent les organes digestifs, l’injection est faite un peu au-dessus de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Il y aura donc au total 9 injections, de quelques secondes chacune. 2/ A 4 semaines, sous anesthésie générale, une ouverture de l’os du crâne sera réalisée sur un lot d’animaux pour des mesures d’imagerie, pendant lesquelles du glucose sera administré. Cette mesure dure de 1h à 1h30 en totalité. 3/ Pour savoir si les animaux développent un diabète, un autre lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Chaque prélèvement dure quelques secondes. Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose (une seule dose de chaque). L’efficacité d’un anti-diabétique sera testée sur un lot de souris spécifique (1 injection par jour pendant 3 jrs à partir de 4 semaines). Deux heures après la 3ème injection, un test d’insuline sera réalisé comme décrit précédemment. Le lendemain, un prélèvement de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sera réalisée sous anesthésie, avant euthanasie par dislocation cervicale. 4/ D’autres animaux seront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement dans des cages individuelles appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une habituation à l’isolement en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant. Au total les animaux resteront isolés pendant 2 semaines : 1 semaine d’habituation puis 1 semaine en cage métabolique. 5/ A 6 semaines, un autre lot d’animaux subira le test de « l’arêne » où les souris se déplaceront librement pendant 10 min sous une caméra pour évaluer leur comportement. 6/ A 4 et 6 semaines, une perfusion intracardiaque de liquide sera réalisée sur certains animaux, sous anesthésie générale et avec analgésie, pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem.

Impact sur les animaux

- L’injection intrapéritonéale peut créer une infection locale dans la zone d’injection - Chez les animaux inflammatoires, on peut observer un retard de croissance (taille et poids inférieurs à la normale) et des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...) et moteurs. - Un «graissage» du pelage peut être observé chez les animaux sous régime hypergras, car les miettes de croquettes qui tombent dans la cage lors de la prise alimentaire des animaux entraînent un dépôt lipidique dans la cage. - Une accélération du rythme de la respiration peut survenir chez les animaux à tous les stades. - La chirurgie crânienne peut entraîner dans de rare cas la mort de l’animal. Cela n’a pas d’impact sur le nombre d’animaux utilisé. - La récupération d’une goutte de sang à 10 reprises en 2h après administration d’insuline ou de glucose à 4 semaines peut engendrer un peu de stress chez les animaux, et parfois une hémorragie si la coagulation naturelle ne se fait pas normalement. - L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.

Remplacement

Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.

Raffinement

Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Une surveillance quotidienne règlementaire est respectée dans l’établissement. Une surveillance spécifique des animaux du projet est par ailleurs appliquée : - Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. - A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. - Après sevrage, les animaux sont surveillés toutes les semaines au moment du change des cages et les vendredis après-midi (avec prise de poids) avant le weekend. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique. Une anesthésie générale sera réalisée lors des mesure d’imagerie, et pour le prélèvement sanguin des souris ayant reçu le traitement anti-diabétique. Avant la perfusion intracardiaque de liquide, une analgésie et une anesthésie seront réalisées.

Choix des espèces

Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.

36 cochons miniatures vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont soumis à une irradiation totale du corps sous anesthésie, à onze prises de sang jugulaire, à des prélèvements de moelle osseuse et à l'injection de cellules souches d'origine humaine, sous immunosuppresseurs administrés pendant plusieurs semaines. Le porteur situe ce projet dans la mise au point d'un traitement du syndrome aigu d'irradiation pour les militaires en opération ou les victimes d'accident nucléaire, et prévoit la mise à mort à J90 pour localiser les cellules greffées. Il affirme que le passage à la clinique "nécessite" des animaux de grande taille et que la physiopathologie du miniporc est proche de celle de l'humain.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de proposer un nouveau traitement du syndrome aigu d’irradiation (SAI), pour le militaire en opération ou la population victime lors d’une urgence radiologique, d’un accident nucléaire ou un acte de malveillance. Il est basé sur une technologie permettant de produire des cellules souches hématopoïétiques (CSH) obtenue à partir de cellules souches reprogrammées issues de cellules humaines. Ces cellules d’origine humaine sont nommées hiPSC et ont commencé à révolutionner les pratiques médicales. Le traitement en urgence de population nécessite de disposer de produits cellulaires pouvant être congelés, décongelés et injectés rapidement et permettant de traiter un groupe important d’individu. Ces banques de cellules souches dites « médicament » permettront de produire des cellules souches de différents types pour traiter les victimes. Des hiPSC issues de donneurs « universels » sont déjà disponibles. Le projet a pour ambition de démontrer que cette stratégie d’utilisation des hiPSC est la réponse thérapeutique au traitement en masse du syndrome aigu d’irradiation. Ce projet est en synergie avec les nouvelles stratégies internationales en termes de santé et de médecine régénérative, à savoir la constitution de banques d’hiPSC de grade clinique (à savoir excellente viabilité et absence d’anomalie chromosomique) et la dérivation de produits cellulaires de qualité. L’objectif est la validation après la destruction des cellules de la moelle osseuse par l’irradiation de la reprise de l’hématopoïèse chez le cochon par une injection de cellules souches humaines hématopoïétiques issues d’hiPSC. Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant iPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique.

Bénéfices attendus

La preuve de concept de la possibilité de générer un tissu sanguin fonctionnel (l’ensemble des cellules du sang) à long terme à partir d’un tout nouveau type cellulaire appelé « hiPSC » a été établie chez le petit animal. Cette nouvelle technologie permet de produire les cellules à l’origine de la production du sang. Le traitement en urgence de populations nécessite de disposer de produits congelables afin de traiter un groupe d’individus. Des banques de cellules souches obtenues à partir d’hiPSC de grade clinique permettront de produire des cellules souches de différents types pour traiter les victimes. Des hiPSC issues de donneurs « universels » sont déjà disponibles et transposable à une échelle industrielle. L’objectif de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reconstitution hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique. Pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo, plus particulièrement des animaux de grande taille et dont la physio-pathologie du SAI est proche de l’homme. La validation de la reprise d’hématopoïèse humaine xénogénique chez le cochon par une greffe de cellules souches hématopoïétique issues hiPSC et également de la sous population de cellules triée à partir de ces hiPSC (la sous population à capacité de reconstituer l’hématopoïèse) permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant iPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique. Le bénéfice de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reconstitution hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique chez l’homme.

Procédures

Une prise de sang sera effectuée à J-4 et J0 avant l’irradiation et à J3, 7, 10, 35 ,38, 45, 52, 59 et 90 sous anesthésie générale pour un prélèvement à la veine jugulaire de 5ml (temps de prélévement entre 5 et 10 min). A J45 et J90, au cours de cette même anesthésie et associée à une anesthésie locale, sont également prélevés 5 mL de moelle osseuse dans l'humérus (2 min). Les procédures d’irradiation sont réalisées en une seule fois pour une durée de 5 min sous masque et isoflurane après une anesthésie générale. Les injections de cellules sont effectuées en une seule fois sous anesthésie à la veine de l’oreille par un système de perfusion et sous monitoring cardiaque et respiratoire, la durée de l’injection étant de 10 min. Pour éviter tout rejet des cellules humaines les animaux sont traités par des immunosuppresseurs (une première molécule 1 fois par jour de J-3 à J30 soit 34 administrations orales, une deuxième molécule de J-3 à J60 soit 64 administrations par voie orale, une 3ième moécule de J-3 à J60 soit 64 administrations par voie orale, toutes en prise spontanée dans la nourriture), et une injection unique intra-musculaire d'une 4ième molécule. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique par voie intramusculaire à chaque intervention sur l'animal soit maximum 11injections intra-musculaires.

Impact sur les animaux

Selon la littérature, ce syndrome est caractérisé par une diminution du nombre de globules blancs dans les 48h premières heures suivie d’une remontée puis de nouveau une chute des neutrophiles de 10 à 22 jours et d’une diminution des plaquettes (avec le taux le plus bas atteint entre 9-17 jours, sur une durée de 2 semaines et récupération à 3-4 semaines et complète à 2 mois post-irradiation). Une chute des globules rouges est notée à J14. La récupération à des valeurs proches de la normalité des cellules du sang se situe à 6 semaines. Aucune perte de poids n’est attendue suite à l’irradiation à faible dose. La survenu transitoire de quelques pétéchies entre J10 et J14 post-irradiation est observée chez quelques animaux. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique du Shotapen à 0,1ml/kg (association de streptomycine et de pénicilline d’une durée d'action de 3 à 5 jours) par voie intramusculaire à chaque intervention sur l'animal si espacée de 72 heures minimum (à l'occasion de prises de sang notamment).

Devenir

Tous les porcs sont mis à mort à la fin du protocole à J90 post-irradiation pour des prélèvements tissulaires post-mortem de poumon, foie, rate, thymus, amygdale, os, intestin afin de localiser la présence des cellules humains greffées.

Remplacement

Le passage à la clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules souches reprogrammées et issues de cellules humaines adultes différenciées (hiPSC) en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’injection de cellules en concentration compatible avec leur production.

Réduction

Pour obtenir des valeurs statistiques, les groupes des miniporcs irradiés et traités par les cellules souches sont classiquement constitués de 8 individus pour pallier les variabilités inter-individus des animaux et également du greffon injecté et pour éviter ainsi d’avoir à renouveler plusieurs fois l’expérimentation. Le nombre d’animaux choisi pour ce protocole est nécessaire et suffisant pour exploiter d’un point de vue statistique les résultats obtenus.

Raffinement

Dans le contexte du bien-être animal, les cages d’hébergement seront enrichies en objets (balles) favorisant le bien-être de l’animal. Les animaux disposent d’espace d’hébergement adapté pour 5 cochons de 5 à 10 kg. De plus, le raffinement est renforcé par le fait que ces animaux seront anesthésiés pour toutes interventions (irradiation, prélèvements sanguins) et mise à mort selon la réglementation en vigueur. Des points limites sont définis et seront appliqués pour mettre fin dans les délais les plus brefs à toute anomalie ou à toute douleur, toute souffrance, toute angoisse ou tous dommages durables constatés qui pourraient être évités tout au long des procédures expérimentales. Les animaux seront acclimatés pendant 2 semaines. Le transport des animaux au site d’irradiation sera effectué par le véhicule climatisé dédié à ce transport. Pour la procédure d’irradiation les animaux sont anesthésiés et surveillés pendant la durée de l’irradiation, ainsi que pendant la phase de réveil. Une surveillance quotidienne pendant toute la durée de l’expérimentation sera effectuée par les techniciens animaliers compétents et basée sur la prise alimentaire, la présence des troubles digestifs (diarrhée transitoire), de la posture et du comportement (animal prostré) : - Pesée des animaux au début de l’étude, puis toutes les semaines pendant la durée de l’expérimentation - Les signes de douleur/stress sont définis comme une réduction de la consommation alimentaire et/ou troubles digestifs et déshydratation, modification des signes locomoteurs (prostration, ne pas remuer la queue, manque de curiosité normale, changement dans le schéma de vocalisation normal au toucher). Une grille de score sera établie pour chaque animal. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et une mise à mort compassionnelle sera éffectuée selon les méthodes approuvées en limitant le plus possible la douleur, la souffrance et l'angoisse des cochons, par une personne compétente de l'établissement hébergeur.

Choix des espèces

Le passage à l’étape clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules hiPSC en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc de 8 semaines qui est un porc de taille et de poids réduite permettant l’administration de cellules en concentration compatible avec leur production limitée à l’heure actuelle. Les porcs seront des femelles afin d’éviter des conflits et donc risques de blessure, qui sont plus fréquents chez les mâles. Le risque de blessure doit être absolument évité chez ces animaux qui auront un système immunitaire et de coagulation affaibli après irradiation et par conséquent un risque de mortalité augmenté.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une irradiation totale du corps avant l'injection de cellules souches, avec des prélèvements sanguins toutes les deux semaines, puis pour certaines des immunisations répétées. Le porteur décrit un affaiblissement possible après l'irradiation, perte de poids, léthargie, diarrhées et suppurations oculaires liées aux injections rétro-orbitaires. Il affirme que les événements moléculaires du développement des lymphocytes B sont impossibles à reproduire in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable", l'euthanasie servant à prélever les organes de l'immunité.

Objectifs

Les lymphocytes B sont des cellules de l’immunité adaptative sécrétrices d’anticorps dirigés contre les agents étrangers au soi. Pour produire des anticorps, le lymphocyte B doit se différencier en une cellule sécrétrice d’anticorps, aussi appelée plasmocyte. Notre laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur les évènements moléculaires qui concourent à cette différenciation. Cette dernière induit dans la cellule d’importantes modifications qui sont sous le contrôle d’un grand nombre de facteurs clés agissant pour certains sur le stress cellulaire et sur des évènements qui pourraient conduire à un cancer. Nous avons très récemment montré que des enzymes ayant les capacités de phosphorylation des protéines et jouent un rôle primordial dans ce processus de différenciation en plasmocytes. Dérégulées, ces enzymes contribuent à la survenue et au maintien de cancers issus des lymphocytes B (lymphomes) et plasmocytes (myélome). Nous souhaitons confirmer in vivo chez la souris le rôle des ces enzymes dans ce processus de différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Ce projet comporte trois volets: 1) Le premier consiste à la mise en place technique d’une transplantation de cellules de la moelle osseuse en vue d’une production nouvelle de cellules sanguines chez la souris immunocompétentes ; 2) Dans un deuxième temps nous transplanterons des cellules de moelle issues de souris modifiées génétiquement et aptes à développer des cancers; 3) Enfin, nous transplanterons des cellules préalablement modifiées avec perte des capacités à produire les enzymes d'intérêt. Les animaux ainsi modifiés permettront l’étude précise des évènements moléculaires qui participent à la différenciation en cellule normale ou tumorale, selon le cas.

Bénéfices attendus

Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension du rôle des kinases PIM dans la biologie du lymphocyte B normal ainsi que dans le développement des tumeurs induites au cours de cette différenciation, les lymphomes et le myélome.

Procédures

Notre modèle de greffe dans des souris immunocompétentes implique au préalable une irradiation totale des souris avant l'injection des cellules. Les cellules seront injectées dans le sang après une anesthésie gazeuse des animaux. L'injection sera de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes. Des prélèvements sanguins itératifs (1 fois toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés pour tous les animaux. Le prélèvement sanguin ne nécessite aucune anesthésie et n'excèdera pas 1 minute. Enfin des immunisations seront appliquées sur certains animaux (aucune anesthésie requise) dès 3 mois post-greffe pour les animaux dont la reconstitution sanguine a été jugée optimale. L’immunisation sera soit unique ou itérative (2 ou 3 injections espacées de 1 semaines à 1 mois selon les modèles), avec des injections de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes.

Impact sur les animaux

L'irradiation des animaux peut engendrer un affaiblissement notable de leur vitalité, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées quotidiennement durant la phase post-irradiation (au moins 1 semaine) pour détecter une potentielle absence de prise de greffe et apparition de signes d’affaiblissement immunitaire (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Afin de lutter contre la perte de poids (en lien avec des diarrhées induite par l'irradiation), un apport gélose pourra être utiliser pour faciliter l'absorption des aliments et la réhydratation des souris. Enfin, le développement de suppurations des yeux peut aussi apparaitre suite aux injections rétro-orbitales. Une vigilance particulière au cours du suivi quotidien des animaux en post-greffe sera donc porté sur cet effet possible.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution de toutes les cellules du sang et sur développement de la réponse immunitaire et des tumeurs.

Remplacement

Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'importance des kinases PIM chez l’Homme dans la différenciation normale du lymphocyte B en plasmocytes et leur implication dans le développement des cancers. Les évènements moléculaires impliqués dans le développement des cellules du système immunitaire, et tout particulièrement des lymphocytes B sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro. Le recours à des animaux est donc indispensable pour cette étude.

Réduction

Afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (organes de l'immunité, moelle osseuse et sang) afin de réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes chez la souris, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal. Enfin, la taille des groupes de souris est choisie de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Le nombre de 10 souris par lot est choisi assez élevé pour pallier le fait que ces expérimentations ont une reproductibilité assez faible. En effet, l'irradiation totale et la greffe subséquente de cellules sont des procédures avec une forte variabilité, et un risque non négligeable de perte d'animaux en période post-irradiation.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel.

Choix des espèces

Les souris sont de bons modèles d'étude notamment pour caractériser des mécanismes physiologiques ainsi que comprendre les processus de cancérogénèse étant donné leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin est aussi le plus utilisé actuellement pour le développement tumoral et étudier la tumeur dans son microenvironnement. Enfin, de nombreux outils sont maintenant disponibles pour l’étude des structures anatomiques, cellules et gènes dans cette espèce (anticorps, séquence de référence) dans les modèles murins, facilitant alors l'analyse des données. Pour notre projet, les cellules de la moelle osseuse des souris donneuses seront greffées dans des souris receveuse de même fond génétique afin d’éviter le rejet de greffe. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 4 semaines d’âge et jusqu’à 3 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection de monoiodoacétate dans l'articulation leur provoque une arthrose douloureuse et durable, avec boiterie et difficultés d'appui, avant l'essai de nouveaux anti-inflammatoires par la même voie. Le porteur reconnaît que le modèle, non résorbable, interdit toute réutilisation des animaux. Sur le remplacement, il affirme que la culture cellulaire ne rend pas compte de la composante inflammatoire et conclut que le passage par la souris est "inévitable", alors que les retombées pour les patients arthrosiques restent renvoyées au conditionnel et au long terme.

Objectifs

L’arthrose est une pathologie qui touche principalement les personnes âgées et dont la prévalence est en constante augmentation. Pour autant, à l’exception de la mise en place de prothèse, il n’existe aucun traitement de fond efficace. En effet, actuellement, aucune thérapeutique anti-arthrosique capable de réparer ou prévenir la dégradation du cartilage n’est disponible. Les traitements préconisés sont essentiellement symptomatiques et visent à soulager les douleurs et la gêne fonctionnelle. Parmi eux, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) constituent la première ligne de traitement pour la prise en charge de l’arthrose. Cependant, ils ne sont pas dénués d’effets secondaires (toxicités digestives et cardiaques), ce qui limite leur utilisation chronique par voie orale chez les personnes âgées ou souffrant de comorbidités. Lorsque la prise en charge de la douleur n’est plus maitrisée, la prothèse est envisagée. Malheureusement certains patients sont non éligibles à cette technique chirurgicale et l’arsenal thérapeutique pour les « soulager » demeure insuffisant, malgré la visco-supplémentation ou les infiltrations de corticoïdes dont l’efficacité est temporaire (environ 3 mois) et qui de plus conduiraient à long terme à un effet délétère sur le cartilage. C’est sur la base de ce constat que repose notre projet soutenu par la Société Française de Rhumatologie (SFR). Nous proposons en effet d’améliorer l’efficacité des AINS tout en diminuant les effets indésirables de la voie orale en choisissant une administration d’AINS par voie intra-articulaire. Pour autant, les AINS étant rapidement éliminés de l’espace articulaire suite au renouvellement constant du liquide synovial, nous souhaitons augmenter le temps de résidence de l’AINS au niveau articulaire en fonctionnalisant les molécules par une structure de type ammonium quaternaire présentant une forte affinité pour les charges négatives des protéoglycanes du cartilage.

Bénéfices attendus

Les données recueillies à la suite de ce projet nous permettront d’évaluer l’intérêt de nouveaux anti-inflammatoires non stéroidiens pour des administrations i.a. en termes d’optimisation de l’effet antalgique, de diminution de l’inflammation et d’impact sur la dégénérescence articulaire. Si la preuve de concept est validée, cette stratégie pourrait permettre à plus long terme d’améliorer la prise en charge symptomatique des 10 % de patients arthrosiques pour lesquels l’indication de prothèse n’est pas retenue ou contre-indiquée, et pour lesquels la prise en charge de la douleur reste encore sans réelle solution.

Procédures

Tous les animaux subiront dans un premier temps une injection en intra-articulaire de MIA ou de NaCl sous anesthésie (intervention de 1 à 2 minutes). Les traitements seront réalisés par injection en intraarticulaire sous anesthésie (intervention de 1 à 2 minutes) Les examens d'imagerie seront réalisés sous anesthésie. La durée de l'anesthésie dépendra de l'examenet variera entre 10 minutes et 1h30.

Impact sur les animaux

Le modèle MIA est un modèle qui induit une douleur arthrosique qui se met en place progressivement. L’injection de MIA en intra-articulaire entraine une augmentation de la sensibilité nerveuse. Les effets indésirables sont donc de la douleur ainsi que des problèmes de locomotion (boiterie, difficultés d’appuis, …). Une légère perte de poids peut être observée les premiers jours post induction. Concernant, les injections intra-articulaires des traitements, les effets sont comparables à l’administration de sérum physiologique en intra-articulaire et ne génèrent ni douleur, ni effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux devront être euthanasiés en fin d'expérimentation pour différentes analyses réalisées sur les pattes. De plus, ce modèle générant une arthrose douloureuse non résorbable, les animaux ne peuvent pas être réutilisés.

Remplacement

La culture cellulaire ne représente pas la complexité du vivant et notamment sa composante inflammatoire. Les études sur cellules nous permettent de réaliser une première sélection des molécules mais doivent être complétées par des études chez l’animal, d’autant plus lorsqu’il s’agit de vectorisation, comme c’est le cas ici. Le passage sur un modèle animal est donc inévitable pour juger de façon optimale notre stratégie thérapeutique.

Réduction

Pour la réalisation des études préliminaires, nous avons constitué des groupes de 10 souris ce qui correspond au nombre de souris minimal nécessaire à la réalisation des analyses de caractérisation souhaitées avec une bonne significativité. Dans le cas où lors de cette phase, l’une des molécules se révèlait nettement moins intéressante que les deux autres, elle serait abandonnée. L'étude relative à l'évaluation des molécules selon un protocole d'administration répétée comprenant deux stades de sacrifices pour des analyses histologiques, nous avons constitué des groupes de 30 souris. Ce nombre correspond au nombre minimal de souris qui nous permettra d’obtenir les données suffisantes attendues et de façon significative pour pouvoir réaliser l’ensemble des analyses et obtenir une réponse définitive sur l’efficacité du traitement sans avoir besoin de recommencer le protocole.

Raffinement

Le modèle animal MIA étant un modèle de douleur, une surveillance accrue sera mise en place notamment par le suivi du score clinique. Une attention particulière sera effectuée quant à la locomotion et un suivi du poids tous les deux jours sera réalisé. En effet, un problème de locomotion pourrait gêner les déplacements et l’accès à la nourriture située en hauteur. Dans ce cas-là des dispositions seront prises telles que la nourriture directement dans la cage.

Choix des espèces

Le modèle d’inflammation MIA que nous avons choisi dans ce projet est très couramment utilisé et caractérisé chez le rongeur (rats ou souris). Nous avons choisi ici le modèle souris. Les souris seront utilisées à 8 semaines, un stade pour lequel leur articulation est suffisamment développée pour l’injection en intra-articulaire.

198 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la gravité la plus élevée du lot. Une tumeur cérébrale de type gliome leur est implantée, puis leur cerveau est irradié à des doses de 15 à 40 Gy avant l'injection d'un anticorps d'immunothérapie. Le porteur décrit une détresse, une perte de poids et des ulcérations du cuir chevelu au site d'irradiation, et prévoit la mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Il qualifie le projet de "pionnier" à "fort impact sociétal" et affirme que la combinaison radiothérapie-immunothérapie est "indispensable" à évaluer sur l'animal entier.

Objectifs

La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeur cérébrale), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Pour ce faire, nous explorons de nouvelles approches et proposons de développer des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement afin d’améliorer encore l’indice thérapeutique. Ces techniques de radiothérapie innovantes qui utilisent du fractionnement spatial de la dose seront alors combinées avec un des traitements les plus prometteurs que sont les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire. Ainsi, l’immuno-oncologie a pour objectif d’exploiter et de renforcer les capacités de notre propre système immunitaire à reconnaître et détruire les cellules cancéreuses. Tout d'abord, il faut savoir que les lymphocytes T aident l'organisme à lutter contre les infections et d'autres maladies, y compris le cancer. Toutefois, les cellules tumorales peuvent échapper à cette attaque en exprimant à leur surface une protéine appelée PD-L1 qui inactive les lymphocytes T avant qu’ils n’attaquent. La PD-L1 agit en se liant à des récepteurs appelés PD-1 situés sur les lymphocytes T. La liaison de PD-L1 avec PD-1 conduit à l’inactivation des lymphocytes T, un mécanisme dénommé « épuisement des lymphocytes T » qui est un moyen de résistance tumorale. Cette liaison PD-L1 avec PD-1 constitue donc une cible thérapeutique intéressante pour l’immuno-oncologie. En effet, le blocage de la protéine PD-L1 peut empêcher les cellules cancéreuses d'inactiver les lymphocytes T et inverser leur épuisement. Ils retrouvent donc leur rôle dans la détection et la destruction des cellules cancéreuses. L'immuno-oncologie est certainement l'un des domaines de la recherche médicale les plus enthousiasmants, car cette approche a le potentiel de changer profondément la façon dont sont traités de nombreux types de cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus sains. Dans ce nouveau projet nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique en combinant des techniques d’irradiation innovantes avec de l’immunothérapie avec des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques pouvant ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. , le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

Dans la procédure visant à déterminer à quel moment précis PD-L1 est bloquée par l’administration de l’anticorps anti-PD-L1, les rats Fischer sous anesthésies (générale gazeuse et locale environ 45 minutes) seront tout d’abord implantés avec la tumeur au niveau du cerveau puis recevront l’anticorps anti-PD-L1 en injection intrapéritonéale à j13, j16 et j19 post implantation de la tumeur. Puis dans une seconde procédure, la combinaison de l’immunothérapie par blocage de la voie PD-1/PD-L1 au temps idéal précédemment déterminé et de la radiothérapie par mini faisceaux à j14 post implantation tumorale sera réalisée. Les rats Fischer sous anesthésies (générale gazeuse et locale environ 45 minutes) seront tout d’abord implantés avec des cellules de gliome de rat au niveau du cerveau ; puis irradiés au niveau du cerveau, sous isoflurane (environ 20 minutes d’anesthésie) avec une dose entre 15 et 40 Gy à j14 post-implantation de la tumeur et, pour finir, les animaux recevront une dose d’anticorps anti-PD-L1 en injection intrapéritonéale (durée du geste inf à 10 sec) au temps idéal déterminé lors de la première procédure.

Impact sur les animaux

Suite à l’implantation tumorale et à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours. Le blocage de la voie PD-1/PD-L1 n'a montré aucun signe de toxicité chez les souris traitées dans la littérature.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. Les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Ces mécanismes sont les clés pour une combinaison efficace avec l’immunothérapie. Dans une première étude in vivo (Bertho et al 2022), nous avons démontré que la MBRT induit un recrutement efficace des lymphocytes T et cela justifie l’évaluation de la combinaison avec des immunothérapies. De plus, l’évaluation des combinassions radio-immunothérapies requièrent l’expérimentation in vivo où l’interaction entre la réaction à la radiation et le système immunitaire peuvent être activées. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons régulièrement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être, puis nous utiliserons un enrichissement adapté avec des objets placés dans les cages d'accueil (des tunnels en carton). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale adaptée aux interventions mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème, apaisante cicatrisante sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Le système immunitaire des rats est adapté pour nos études (même types cellulaires que l’humain, même mode d’action) et déjà dévelopé au moment de l’étude. Les animaux utilisés seront des adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant y compris du système immunitaire et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

1250 cochons vont être utilisés dans des procédures classées à un niveau de souffrance sévère, puis renvoyés dans une structure d'élevage. Les procédures décrites se limitent à un hébergement individuel de vingt et un jours et à une limitation des mouvements de dix jours pour collecter les fèces, afin de mesurer la valeur énergétique d'aliments. Le porteur indique que cet isolement partiel peut provoquer un stress et une néophobie alimentaire. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ou mathématique n'est assez précis et qu'il "a besoin" d'essais sur animaux.

Objectifs

Les aliments des porcs sont constituées de matières premières qui sont combinées dans une recette permettant de satisfaire au mieux les besoins nutritionnels des animaux, tout en limitant les excédents nutritionnels préjudiciables au bien-être animal (développement de maladies métaboliques, surpoids entraînant des troubles locomoteurs, inadaptation digestive à l'origine de diarrhée). Les matières premières utilisées dans les aliments doivent donc systématiquement faire l'objet d'études de caractérisation. L'un des principaux critères permettant la combinaison des matières premières dans une recette est leur teneur en énergie. Celle-ci est déterminée sur la base de l'utilisation digestive de l'énergie, qui est mesurée par différence entre les quantités d'énergie ingérée et excrétée dans les fèces. L'objectif du projet est de déterminer l'utilisation digestive de l'énergie des aliments chez le porc.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre de disposer de connaissances concernant la valeur nutritionnelle des aliments. Celles-ci sont bénéfiques pour les animaux, l'environnement, les éleveurs et l'ensemble de la société car elles permettent une meilleure utilisation des ressources alimentaires, diminuant ainsi les risques métaboliques pour les animaux, les risques liés aux impacts environnementaux des élevages et la compétition entre les animaux et l'homme pour l'utilisation des ressources alimentaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à des conditions d'hébergement particulières (hébergement individuel pendant 21 jours et limitation des mouvements pendant 10 jours).

Impact sur les animaux

La principale nuisance est liée aux modalités d'hébergement. D'une part, les animaux sont placés en cages individuelles. D'autre part, les mouvements des animaux sont limités pendant la deuxième phase du projet pour la collecte des fèces non contaminées par de l'urine. Ces pratiques pourront induire un stress pour les animaux, qui seront partiellement isolés de leurs congénères. Les aliments qui seront utilisés pendant les études seront également variables et différents des aliments consommés préalablement par les animaux. Une néophobie alimentaire est donc possible.

Devenir

Les animaux réintègrent une structure d'élevage pour poursuivre leur croissance.

Remplacement

Nous souhaitons mesurer l'utilisation digestive des aliments chez le porc. Pour cela, nous ne disposons pas de modèles (in vitro ou mathématiques) suffisamment précis pour permettre la représentation de la complexité biologique des phénomènes digestifs et nous avons besoin d'avoir recours à des essais sur animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé comme étant le nombre d'animaux strictement nécessaire pour mesurer l'utilisation digestive de l'énergie des aliments avec une précision suffisante (nous considérons qu'un écart-type de 1% est nécessaire pour que les mesures réalisées soient bénéfiques pour la connaissances des valeurs nutritionnelles des aliments). Sur la base de nos essais antérieurs, cette précision est atteinte avec un effectif de 5 animaux par aliment. Les comparaisons entre aliments seront réalisées sur la base d'analyses de variance dans les conditions d'application des modèles statistiques linéaires généralisés.

Raffinement

Les animaux sont toujours placés à proximité de leurs congénères pendant le projet, soit en contact direct (phase d'adaptation), soit en contact visuel et auditif (phase de collecte). Toutes les cages sont équipées de dispositifs d'enrichissement qui sont renouvelés régulièrement et au gré des comportements individuels. Nous utiliserons des matériels manipulables (chaînes métalliques et balles en plastique dur) qui ne peuvent pas être rongés par les porcs, car cela aboutirait à la présence de résidus dans les fèces, pénalisant les mesures. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel expérimenté afin de détecter l'atteinte d'un point limite.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce-cible des études. Les animaux seront en croissance, d'un poids moyen de 50 kg. Ce poids correspond au poids vif moyen des animaux présents dans les élevages commerciaux et qui sont la cible des résultats du projet.

11 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit l'ablation d'une partie d'un poumon avec pose d'un renfort de suture à base d'alginate, puis un suivi par scanner sur six à neuf mois avant la mise à mort pour analyse histologique. L'ouverture de la cage thoracique peut placer l'animal en détresse respiratoire et la chirurgie entraîne des douleurs post-opératoires. Ce projet est une preuve de concept en vue du marquage CE d'un dispositif médical, que le porteur affirme ne pouvoir tester que dans un environnement réunissant "les différents organes", impossible selon lui à reproduire in vitro.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Cependant, il doit présenter des caractéristiques, parmi lesquelles : 1/ maintenir la plaie en milieu humide et chaud, 2/ être modifié selon les stades de cicatrisation, 3/ être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, 4/ absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, 5/ ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, 6/ ne pas être toxique et être hypoallergénique, 7/ protéger des chocs, 8/ être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, 9/ être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées mais très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles mais lorsqu'elles sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies par rupture de petits vaisseaux dits « capillaires » qui induisent un saignement continu et étendu, le chirurgien utilise des hémostatiques chirurgicaux résorbables comme traitement. Ces dispositifs médicaux sont des produits de synthèse ayant des temps de résorption longs. Nous souhaitons tester un produit naturel dont le temps de résorption devrait être plus court que ses concurrents. Son enrichissement (calcium, zinc et magnésium) permet des échanges ioniques avec la plaie et favorise l'activation des réactions en cascade de la coagulation. Le dispositif médical est un renfort de la suture dans l’utilisation d’un système d’agrafage de type GIA® et dont la résorption sera suivie à différents temps par imagerie scanner. L’objectif de cette procédure est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale, de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé ainsi que des zones proches à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de dispositif hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements liés au renfort de suture par agrafage en cours de chirurgie et se déroulera dans 3 établissements utilisateurs. De plus, nous disposerions d’un produit fabriqué en France, ce qui n’est pas le cas des autres dispositifs (Etats-Unis, Japon). La biocompatibilité de ce dispositif a été testée en in vitro.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de pansement) pour le renfort d’un système d’agrafage sur la résection d’un tissu (lobectomie pulmonaire partielle) mais aussi de suivre la résorption du produit et les adhérences possibles dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) en tant que renfort de suture.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour permettre l’accès au poumon tout en préservant les autres organes dans les cavités respectives dans l'EU1. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès à l’organe, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutané). L’animal n’aura qu’une seule intervention chirurgicale. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Quelques minutes au total Retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie après entrainement médical : 5 minutes. A différents temps post-opératoires, l’animal aura une imagerie dans l'EU3 pour évaluer le taux de résorption : transport anesthésie acquisition environs 2h à chaque fois. Pour l’hébergement à long terme, les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages dans l'EU2, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés régulièrement. Cet acte ne dure que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Lors de l’ouverture de la cage thoracique, il y aura une rupture du vide pleural qui se situe entre le poumon et la plèvre recouvrant la cage thoracique. Ce vide est essentiel pour permettre au poumon de se gonfler et dégonfler. Si le vide est rompu, le poumon ne peut pas se gonfler correctement lors de l’inspiration et place l’individu en détresse respiratoire. Pour éviter cette complication, l’incision sera refermée plan par plan et hermétiquement. Ensuite, à l’aide d’un cathéter et d’une seringue, l’excédent d’air sera aspiré de la cage thoracique en même temps que la remise progressive du poumon sous ventilation. La procédure sera potentiellement douloureuse pour l’animal en post-opératoire, et la procédure analgésique systématique sera adaptée à chaque animal selon le suivi de l'état clinique. Au bout de 3 semaines, les animaux déclarés aptes au transport partiront pour une autre structure qui assurera l’hébergement de longue durée. A différents temps post-opératoire, l’animal sera transféré vers un centre d’imagerie pour passer au scanner. Le transport entre les différentes structures va générer du stress dû à l’arrivée dans un nouvel environnement. De plus, les différentes contentions pour réaliser les pesées et les gestes techniques pour faire l’anesthésie de la chirurgie et de l’imagerie ainsi que la mise à mort peuvent générer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort soit parce qu’ils auront atteint un point limite ou qu’ils ont atteint le temps d’observation (J+6 mois, J+7,5 mois, J+9 mois). Une étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée donc cela nécessite le prélèvement de l’organe.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements lors de résection de tissu en cours de chirurgie. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

Nous utiliserons 11 animaux au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes. Il y a 2 animaux supplémentaires prévus pour compléter un groupe si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Étant donné que c’est une preuve de concept, nous n’avons pas besoin de plus 3 animaux par lot pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et nécessite une intervention chirurgicale pour l’arrêter, nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé et raffiné la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux mise à mort, issus de procédures antérieures.

Raffinement

Initialement l’intervention était prévue en thoracoscopie c’est-à-dire sous coelioscopie, ce qui ne nécessite que 3 incisions (une pour la caméra et 2 pour les instruments). La forme de la cage thoracique est trop étroite pour travailler avec les pinces et le système d’agrafage sans provoquer d’autres lésions sur les tissus environnants. C’est pourquoi, il a été opté pour une chirurgie ouverte avec une voie d’abord au niveau du 9ème espace intercostal, dont l’incision suivra la forme des côtes. L’animal sera injecté avec un analgésique d'action longue (anti-douleur) pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique. L’animal est placé sous masque avec un anesthésique gazeux et sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. L’extrémité du lobe pulmonaire sera saisie à l’aide d’une pince atraumatique. Les mors du système d’agrafage équipés du renfort seront placés de part et d’autre du lobe, puis le dispositif sera mis en place. Cette résection n’empêche pas le poumon de fonctionner correctement par la suite. La plaie sera protégée à l’aide d’un pansement. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous surveillance jusqu’à son réveil complet. L’animal avec les couvertures polaires sera remis dans l’enclos et recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans l’enclos des légumes frais, plus appétents, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. L’état général de l’animal et de la cicatrice seront suivis quotidiennement pendant 1 semaine, puis toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Les animaux seront hébergés collectivement mais s’il est seul, il aura un contact visuel et/ou olfactif avec d’autres congénères et bénéficiera d’un renforcement de l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter rapidement toutes complications. Ces dernières seront reportées auprès du vétérinaire de la structure qui mettra en place le traitement adapté. La surveillance sera renforcée le temps nécessaire. Pour obtenir la complète collaboration des animaux sur un hébergement à long terme, des techniques de renforcement positif seront mises en place.

Choix des espèces

Toute étude en vue du marquage CE d’un dispositif médical existant sous plusieurs formats doit être réalisée sur le format de taille maximale, correspondant ici à un dispositif de 8 cm. Il n’existe que 2 espèces animales sur lesquelles nous pouvons trouver un poumon capable d’accepter un dispositif de cette taille, le porc et le mouton. Les études initiales pour le dispositif actuellement commercialisé ayant été réalisées sur le porc, nous avons donc retenu cette espèce pour ce projet. Le modèle lapin utilisé dans le cadre d’autres projets semblables ne peut être utilisé pour ce projet car la taille du poumon ne permet pas de faire la résection nécessaire, sous peine d'handicaper gravement l'animal en post-opératoire. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Il s'agit de jeunes animaux de trois à quatre mois.