Procédures sévères

Pour accroître les connaissances fondamentales sur les premières étapes de la formation des métastases, 1 040 poissons zèbres vont être utilisés, à l'état d'embryons, de larves ou d'adultes, tous tués à l'issue. La déclaration en compte 950 en souffrance modérée et 90 en souffrance sévère. Selon les groupes, les poissons reçoivent une ou deux injections au stade embryonnaire puis jusqu'à une séance d'imagerie par jour d'une à deux heures sous anesthésie pendant quinze jours, les larves étant hébergées seules. D'autres, injectés au stade d'une cellule, sont photographiés sous anesthésie jusqu'à une fois par semaine et imagés sous anesthésie et intubation jusqu'à une fois toutes les deux semaines, de 8 à 52 semaines, et d'autres encore subissent une coupe de nageoire pour génotypage. Le porteur affirme que des points limites ont été établis "pour éviter toute souffrance animale", et décrit chez les adultes porteurs de mélanomes une nage dégradée, des abcès, des œdèmes, des difficultés à respirer ou à se nourrir, et chez les poissons à vieillissement accéléré un amaigrissement et une mort prématurée.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Finalement nous allons déterminer si ces processus se déroulent de la même manière chez des poissons jeunes et chez des poissons ayant un vieillissement accéléré.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.

Procédures

Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour. Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour. Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum, sous anésthésie. Imagerie par microscopie avec anésthésie et intubation, jusqu'à une fois toutes les deux semaines. Durée 30 minutes. De 8 à 52 semaines maximum. Groupes 4 et 5: prélèvements d'un petit morceau de nageoire sur animaux anésthésiés pour génotypage.

Impact sur les animaux

Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères. Le vieillissement accéléré conduit à un amincissement des individus et une mort prématurée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.

Réduction

Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier loresque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie.

Choix des espèces

Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.

12 490 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 10 990 en gravité sévère. Une douleur neuropathique leur est provoquée par chirurgie ou injection, puis ils subissent des stimulations mécaniques ou thermiques répétées jusqu'à six fois par jour et l'administration de composés par de multiples voies avec prélèvements sanguins, pour tester des candidats analgésiques. Le porteur décrit des atteintes possibles, paralysie, automutilation dans de rares cas, amaigrissement, anémie et perte de tonus, et indique que la plupart des modèles restent douloureux dans le temps, ce qui exclut selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'étude de la douleur chez l'animal vigile reste la "seule option" avant le passage à l'humain, l'in vitro ne portant que sur la nociception.

Objectifs

La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur neuropathique et pour différent type de douleur (mécanique, thermique). Ces modèles et tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés dans le laboratoire depuis plusieurs années. La douleur neuropathique est liée à une atteinte des nerfs. Elle a différentes origines. La première origine est un traumatisme ou une compression. Elle peut aussi être due à un agent chimique tel que l’oxaliplatine (anticancéreux), Les maladies telles que le diabète, le cancer, les infections au VIH et le zona peuvent aussi entrainer une neuropathie. Ces douleurs se traduisent majoritairement par une allodynie (douleur induite par un stimulus normalement non douloureux) ou une hyperalgésie (sensation de douleur ressentie plus intensément) induite par le toucher, la pression, le froid ou chaud. En France, c’est 7 à 10% de la population qui est atteint de douleurs chroniques. Cette hypersensibilité a un impact sur la qualité de vie (troubles du sommeil, anxiété et dépressions). Ceci engendre donc une augmentation des visites chez les professionnels de santé (médecins généralistes, psychiatres…) ainsi qu’une augmentation des prescriptions de médicaments L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs neuropathiques et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.

Bénéfices attendus

Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.

Procédures

Induction du modèle : chirurgie ou injection en intrapéritonéale afin d’induire le modèle. Ils seront ensuite testés avec un des tests suivants. Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Les 6 modèles décrits dans ce projet sont des modèles de douleur neuropathique chronique ou aigue. Les autres nuisances liées au développement de ces modèles sont des paralysies ou automutilations (dans de rares cas, nuisances sévères), une patte qui se recroqueville plus ou moins (nuisance modérée), une hyperglycémie, un amaigrissement (nuisance modérée), une perte de poids, parfois une anémie et une perte de tonus. Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal. Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité réduite mais possible (nuisance légère). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle, nuisance légère). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé (nuisance légère

Devenir

Une grande partie des modèles utilisés ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Seul le modèle d’administration aigue à l’oxaliplatine pourrait être replacé. Bien que les animaux ne présentent plus d’allodynie après une semaine nous ne connaissons pas les impacts potentiels que l’administration en systémique a pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP (International Association for the Study of Pain) , la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Ces modèles sont couramment utilisés au sein de la structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet.

Raffinement

Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre d’immersion de la patte ou de mVF, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l'assoication internationnal de l'étude de la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés dans l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents lors de l’induction de la pathologie (21 à 49 jours ; 80-280g pour des mâles). Ces stades ont été choisis car ils sont adaptés au développement des modèles, ils permettent un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ces stades de développement permettent aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.

300 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, selon le porteur "de façon éthique", dans des procédures dont la déclaration classe 150 souris en souffrance modérée et 150 en souffrance sévère. Ce sont des souris Apc, une lignée exploitée pour la fonte musculaire liée au cancer qu'elle développe, chez les mâles, entre 11 et 15 semaines. Les femelles subissent sous anesthésie une ablation des ovaires, et toutes reçoivent une pastille d'œstradiol implantée sous la peau, une prise de sang et une mesure de force musculaire qui passe par une incision de la peau, avant les prélèvements de tissus. L'équipe veut savoir si l'œstradiol protège de cette fonte, et n'en tire pour les patients que la perspective de "stratégies d'intervention" à base de modulateurs du récepteur aux œstrogènes. Pour le choix de la souris, le porteur avance que toutes les techniques du projet ont été développées chez elle, ce qui évite "toute étape de mise au point préalable".

Objectifs

Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peuvent être observées dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Nos données préliminaires obtenues dans un modèle murin de cachexie associée au cancer, la souris Apc, suggèrent l'existence d'un dimorphisme sexuel dans le développement de la cachexie, les souris âgées de 15 semaines ne faisant ni l'experience d'une perte de masse musculaire ni celle d'une perte de force musculaire. Par ailleurs, des données de la littérature indiquent que

Bénéfices attendus

En déterminant le rôle protecteur potentiel des oestrogènes face au développement de la cachexie associée au cancer, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie, et de proposer des stratégies d'intervention basés sur l'utilisation de modulateurs de l'activité du récepteur aux estrogènes.

Procédures

Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris femelles, les souris femelles seront soumises aux interventions suivantes sous anesthésie gazeuse : ovariectomie (durée totale 15 min), implantation sous-cutanée de pastilles contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min). Les prélèvements tissulaires (15 min) sont réalisés sous anesthésie chimique. Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris mâles, les souris mâles seront soumises aux interventions suivantes: implantation sous-cutanée de pastillescontenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min), prélèvements tissulaires (15 min).

Impact sur les animaux

La procédure d'ovariectomie ainsi que l'implantation de la pastille sont réalisées avec administration de brupénorphine pour limiter les suites douloureuses de l'intervention. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 6H00 après l'ovariectomie, puis toutes les 24H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Le cas échéant une ré-administration de buprénorphine pourra être effectuée. L'ovariectomie est étant elle-même à l'origine d'une légère perte de poids et de masse musculaire (de l'ordre de 2 à 5%), nous serons donc particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une courbe de suivi de masse corporelle sera effectuée en mesurant leur poids tous les 2 à 3 jours. Les mesures de forces musculaires impliquent une approche chirurgicale nécessitant une incision au niveau de la peau. Afin de limiter les souffrances des souris, une anesthésie profonde à l'isofurane sera effectuée depuis le début de l'approche chirurgicale jusqu'à l'injection d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour réaliser les prélèvements tissulaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort de façon éthique au terme de chaque procédure afin de procéder à des prélèvements tissulaires.

Remplacement

La cachexie associée au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus, le muscle bien évidement, mais aussi le système neuroendocrinien (axe gonadotrope). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.

Réduction

Nous avons avons utilisé un teste statistique en ligne afin de déterminer la taille du groupe optimale pour obtenir des résultats ayant une force statistique suffisante robuste. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront inclus qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 14 animaux par groupe nécessaire à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R.

Raffinement

Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.

Choix des espèces

Les données dans le domaine de la cachexie associé au cancer ont largement été obtenue chez la souris. Par ailleurs, l'ensemble des techniques nécessaires à la réalisation de ce projet a été développé chez la souris. En travaillant chez la souris, nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des données publiées dans le domaine et nous éviterons toute étape de mise au point préalable qu'aurait nécéssité l'utilisation d'un autre modèle animal. Par ailleurs, la cachexie associée au cancer est un processus multifactoriel systémique mettant en jeu de nombreux tissus (muscle, tissus endocriniens, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 11 semaines correspondant à un stade précachectique chez les souris mâlesApc. La fin de procédure aura lieu a l'âge de 15 semaines correspondant à une stade cachexie modérée chez les souris mâles Apc. La cachexie sé développent entre l'âge de 11 et 15 semaines, un traitement pendant cette période permettra de vérifier l'efficiacité de l'oestrogénothérapie.

Les 2 718 souris de ce projet subissent sous anesthésie une chirurgie d'environ une heure pour ouvrir dans leur crâne une fenêtre d'imagerie de 3 mm, fermée par une lamelle. Parmi elles, 1 770 reçoivent une injection unique de produit fluorescent dans le cerveau, 948 un implant permettant des injections répétées, 420 une ou deux injections rétro-orbitales, et 420 un traumatisme crânien et une implantation de cellules tumorales, avec des séances d'imagerie répétées tête immobilisée et, pour les souriceaux non sevrés, un risque de rejet cité par le porteur. Le but est de cartographier, avec une nouvelle technique de microscopie, l'espace entre les cellules du cerveau. La déclaration compte 2 298 souris en souffrance modérée et 420 en souffrance sévère. La description des procédures prévoit que toutes soient tuées après la préparation de leurs tissus, et la déclaration n'en compte aucune gardée vivante. La rubrique sur leur devenir écrit que les "souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie", soit les 948 équipées de l'implant d'injection.

Objectifs

Environ 25% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire (ECS) qui correspond à l’espace se trouvant entre les cellules et qui sert d’environnement à l’échelle microscopique pour le cerveau et forme un chemin de communication chimique entre les cellules. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'ECS sont composés d’éléments de nature différentes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes, telles que le système de sommeil/éveil ou d’un œdème cellulaire provoqué par un traumatisme cérébral. De plus, l’ECS fournit un réservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances entre les cellules. Ainsi, l’ECS n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'interactions cellule-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Afin de visualiser la structure de l'ECS à très petite échelle (nanomètre), nous utiliserons une nouvelle approche d'imagerie, à savoir la technique de Shadow imaging (SUSHI). C'est une méthode de marquage où un produit fluorescent est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’ECS avec une très haute résolution. En outre, comme le produit fluorescenr ne pénètre pas les cellules saines, toutes les cellules apparaissent en noires, ce qui permet d'imager également la structure anatomique des cellules non marquées. Cette méthode présente de grands avantages puisqu’elle n’est pas sensible à la perte de fluorescence de la molécule (la diffusion du produit fluorescent permet de maintenir un signal constant) ni à la toxicité (puisque le produit fluorescent reste en dehors des cellules). Dans ce projet, nous comptons tester plusieurs produits fluorescents qui présentent tous une gamme de longueur d’onde proche de celui de la GFP (Protéine fluorescente verte) et ne pénètrent pas les membranes cellulaires.

Bénéfices attendus

Cette technique sera utilisée pour imager l’ECS au travers d’un dispositif d'imagerie posée soit sur le cortex soit sur l’hippocampe (petite partie du cerveau qui sert pour la mémoire, le comportement et certaines émotions). Partant de là, nous nous proposons d'effectuer des séances d'imagerie répétées d’un même animal pour cartographier, sur animal vivant et avec une résolution spatiale inédite, la morphologie de l’ECS et caractériser la dynamique (quelques minutes à quelques semaines) des structures fines de l’ECS afin de voir les interactions cellule/cellule à l'échelle des circuits intégrés.

Procédures

Toutes les souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie (2718 souris). Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie de 3mm de diamètre sera fait dans le crâne de la souris et une lamelle sera posée dessus afin de protéger le cerveau de l'extérieur. 1770 souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies. L'injection prendra environ 15 minutes et sera faite qu'une seule fois sur ces souris. 948 souris auront une pose d'un dispositif implantatoire dans le cerveau permettant d'injecter plusieurs fois le produit fluorescent. Ce dispositif implantatoire sera posée pendant la chirugie pour le dispositif d'imagerie. Chaque souris de ce groupe aura un dispositif implantatoire et plusieurs injections dans le temps d'une durée de 15 minutes environ chacune. Une injection rétro-orbitales sera faite sur 420 souris. Une injection par oeil et 2 injections par animal au maximum. L’induction d’un traumatisme cranien (impact fait en une fraction de secondes) et l’induction de cellules tumorales (une dizaine de minutes) sera faite sur un total de 420 souris. Toutes les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections injection (si la souris a un dispositif d'injection ou non). Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et l'induction du traumatisme cranien et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies, injection retro-orbitale et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.

Devenir

Les souris subissant la préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires seront euthanasiées à la fin de l'expérimentation afin de prélever le cerveau entier. Les souris ayant subi une chirurgie pour l'implantation d'un dispositif d'imagerie seront utilisées pour la microscopie puis euthanasiées à la fin de l'expérimentation si elles ne sont pas utilisées pour la préparation des tissus. Les souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie.

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L’objectif de ce projet étant de caractériser l’ECS dans les conditions les plus naturelles possibles, cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles sur ordinateurs (in silico) ou sur micro-organismes, organes ou cellules en dehors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera, dans un premier temps, validé en imageant de toutes petites particules (nanoparticules) fluorescentes. Toutefois, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire l’ensemble des paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques. C’est pourquoi une seconde étape de validation dans des tranches organotypiques (tranches de partie de cerveau sur une lamelle) apparait cruciale pour optimiser les conditions d’imagerie qui seront utilisées à terme pour l’imagerie sur animal vivant (in vivo).

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode de production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'Homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'Homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'Homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 et 21 jours. Puis sur ces mêmes animaux de 2 à 6 mois, période qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une meilleure reproductibilité des résultats.

16 250 souris et cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent une injection unique d'un produit pharmaceutique, déjà commercialisé ou nouveau, par voie intraveineuse, intrapéritonéale, orale ou sous-cutanée, pour un test réglementaire dit de toxicité anormale. Le porteur affirme s'attendre à prouver l'"innocuité" du produit et écrit qu'aucune mortalité ni signe clinique n'est attendu, alors qu'il déclare 5 625 souris en gravité sévère. Sur le remplacement, il indique qu'il n'existe "pas d'équivalent in vitro" et que ce test devient obligatoire dès qu'il figure au dossier d'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

L’objectif de ce test est de détecter une éventuelle toxicité d’un produit pharmaceutique, après son administration aux animaux. Les produits administrés aux animaux sont des produits pharmaceutiques déjà sur le marché ou nouvellement produits. Nous recherchons par ce test une toxicité anormale, c’est-à-dire que nous nous attendons à prouver l’innocuité du produit. A noter que ce test est réalisé en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Le test de toxicité anormale sur rongeurs est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Administration par injection intraveineuse, sur souris uniquement : volume maximum 0,5 ml / souris, Administration par injection intrapéritonéale : volume maximum 1 ml / souris et 5 ml / cobaye, Administration par voie orale : volume maximum 1 ml / souris et 25 ml / cobaye, Administration sous-cutanée pour les cobayes : volume maximal 10 ml. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Des injections uniques sont prévues dans les deux procédures de ce projet.

Impact sur les animaux

Les tests sont réalisés sur des produits pharmaceutiques fabriqués selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Ce test est à visée libératoire – c’est un test requis pour la mise à disposition de certains médicaments aux patients. La mortalité d’un animal ou l’apparition d’un signe clinique sur celui-ci n’est donc pas attendue sur ce type de test libératoire. Les principales nuisances pour l’animal sont : Douleur et stress liés à l’administration des produits pharmaceutiques (par injection IP, IV, SC ou gavage), Stress lié à la contention, Tous signes cliniques potentiels faisant suite à la toxicité anormale, L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin de protocole ou en cas d'atteinte de points limites (sauf pour la procédure 1). La réutilisation des animaux pour un autre test de toxicité anormal n’est pas possible car cela pourrait interférer avec le résultat de ce second test.

Remplacement

Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : Il n’existe pas aujourd’hui d’équivalent in vitro au test de toxicité anormale. Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM du produit pharmaceutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal requis par les pharmacopées et les demandes réglementaires (e.g. dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché – AMM). Si l’intervalle de poids requis pour réaliser le test est faible, deux animaux supplémentaires peuvent être commandés. Ce cas peut se présenter par exemple en cas de retest selon la pharmacopée Russe ; il est demandé l’utilisation de 5 souris pesant entre 19 et 21 grammes le jour de l’injection. La marge de poids étant faible, 1 animal supplémentaire sera commandé.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée du protocole Les souris disposent d’un enrichissement de type enviro-dri, spécialement conçue pour améliorer l'activité de construction de nids afin de pouvoir se cacher. Les cobayes disposent d’un enrichissement de type tunnel afin de pouvoir se distraire et se cacher. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. Une observation quotidienne est réalisée : elle consiste à vérifier l’état clinique des animaux, leur alimentation et leur boisson. En cas de point limite observé, l’animal est euthanasié (sauf pour la procédure 1).

Choix des espèces

Espèces décrites dans les Pharmacopées pour le test de toxicité anormale. Les critères de sélection des animaux sont décrits par les Pharmacopées, ou les dossiers d’AMM : - Entre 17g et 30g au début du protocole pour les souris - Entre 200g et 400g au début du protocole pour les cobayes

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont soumises à une alcoolisation forcée à doses élevées, à un régime gras ou à une cirrhose provoquée par injections, avec des injections et gavages répétés, pour comparer trois modèles de maladie du foie et étudier le rôle de la bactérie Enterococcus faecalis. Le porteur indique que l'alcool peut provoquer une réaction forte et rapide, que la cirrhose induite entraîne une inflammation péritonéale, et que les doses de bactéries choisies évitent des symptômes sévères. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune approche in vitro ne reproduit les interactions entre intestin, foie et système immunitaire et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Les bactéries présentes dans les intestins de notre organisme jouent un rôle important dans la susceptibilité des patients atteints de maladies chroniques du foie. Les manifestations cliniques des maladies chroniques du foie sont l'hépatite, la fibrose, la cirrhose ou le cancer du foie. Ces manifestations s'accompagnent de lésions dans le foie de plus en plus graves qui empêchent cet organe vital de fonctionner correctement. Ces patients sont sensibles aux infections bactériennes en raison d'un dysfonctionnement de leur système immunitaire et de la traversée des bactéries présentes dans les intestins dans le sang pour rejoindre le foie. Chez les individus en bonne santé, Enterococcus faecalis (E. faecalis) est une bactérie présente en petite quantité dans les intestins. Elle est plus abondante dans les intestins des patients atteints de maladies chroniques du foie et c'est actuellement l’unique bactérie pour laquelle un lien entre sa surabondance intestinale et la gravité des lésions du foie liées à l’alcool a été mis en évidence. L'origine infectieuse des maladies chroniques du foie est encore mal comprise et les mécanismes sur lesquels elle repose restent à définir. Notre objectif est d’identifier les conditions qui favorisent l’infection du foie par E. faecalis et de déterminer les mécanismes qui permettent à cette bactérie d'aggraver les lésions du foie. Pour cela nous avons isoler 3 souches différentes de E. faecalis ayant des propriétés infectieuses différentes. L’objet de cette demande est de comparer trois modèles précliniques de maladies hépatiques chroniques dans lequel le rôle de ces souches de E. faecalis puisse être caractérisé. En particulier, nous analyserons comment E. faecalis aggrave les lésions du foie générées par l’alcool au cours de la maladie alcoolique du foie, celles induites par un régime riche en graisses, en glucides et en cholestérol au cours de la maladie non alcoolique du foie, et celles observées au cours de la cirrhose du foie. Ceci nous permettra d’établir le modèle pré-clinique le plus relevant pour comprendre les mécanismes d’infection de E. faecalis dans le foie. A plus long terme, ces connaissances seront utiles pour comprendre comment des bactéries présentes dans les intestins aggravent les maladies du foie et seront nécessaires pour envisager des innovations pour améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies hépatiques chroniques.

Bénéfices attendus

Ces 30 dernières années, l’allongement de l’espérance de vie et les progrès de la médecine ont été associés à une augmentation de la population vieillissante et du nombre de personnes immunodéprimées ou affaiblies, et ont conduit à l’émergence de bactéries qui profitent de la défaillance du système immunitaire pour aggraver des maladies. Parmi ces bactéries dites "pathogènes" car elles sont responsables de maladies, E. faecalis est une bactérie à double visage: inoffensive chez les personnes en bonne santé et pathogène chez les patients avec un système immunitaire affaiblie. Son implication dans les maladies du foie est récente et nous manquons d'éléments pour comprendre son rôle aggravant dans ces maladies. L’ambition du projet dans lequel s’inscrit cette demande est d’établir le modèle de maladie hépatique le plus pertinent pour analyser le rôle de E faecalis.

Procédures

Les interventions soumises aux animaux sont les suivantes : - 160 souris vigiles recevront une injection, deux fois par semaine à 3 jours d’intervalles, pendant 7 semaines. - 240 souris anesthésiées recevront 1 injection, 2 jours par semaine, à 3 ou 4 jours d’intervalle pendant 2 semaines. - 250 souris vigiles recevront 3 injections, 1 fois par jour, 3 jours consécutifs. - 250 souris vigiles seront soumises à un gavage oro-gastrique, 1 fois par jour, 4-5 jours consécutives pendant 2 semaines

Impact sur les animaux

Nous soumettrons les animaux à une alcoolisation forcée avec des doses élevées d’alcool. La quantité d’alcool dans le régime peut engendrer une réaction forte chez la souris en peu de temps. Au cours du traitement riche en graisses, en glucides et en cholestérol, les souris accumulent généralement de la graisse abdominale et présentent une accumulation de graisses dans le foie avec une augmentation modérée du ratio foie/poids corporel. Aucune complication évidente n'est enregistrée autre qu'une légère hyperglycémie. L’injection pour déclencher la cirrhose peut entraîner une irritation locale de la peau et une légère inflammation péritonéale. L’infection ne sera pas à l’origine de symptômes sévères car nous utiliserons des doses de bactéries bien tolérés par les souris. L’utilisation d’un antibiotique pendant 3 jours pourra générer un inconfort digestif qui disparaitra après l’arrêt du traitement. Les effets indésirables de l’anesthésie sont l’hypothermie et l’abolition des réflexes comme pour avaler ou cligner des yeux.

Devenir

Euthanasie pour analyses sur organes post-mortem

Remplacement

Les approches expérimentales chez la souris permettent d’intégrer la complexité des interactions entre l’organisme et la bactérie pathogène. A ce jour, aucune approche in vitro n’est disponible pour remplacer ce type de modèle et « mimer » ces interactions. Au niveau métabolique, les complications qui vont être observées au cours des maladies métaboliques du foie (accumulation de lipides, inflammation, fibrose…) mettent en jeu des interactions entre plusieurs organes en l’occurrence le microbiote intestinal, la barrière digestive dont son système immunitaire, le foie et dans certains cas, les tissus adipeux, interactions qu’il est actuellement impossible de reproduire in vitro. Si nous réalisons en amont un certain nombre d’expériences in vitro sur des hépatocytes, le principal type cellulaire du foie, le foie est composé de différents types cellulaires qu’il est également difficile de mimer in vitro. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours est donc l’animal permettant d’intégrer la complexité des interactions entre organes et au niveau cellulaire et métabolique et immunologique.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés, nous avons estimé le nombre d’individus à utiliser par groupe sur la base de nos précédents travaux et de la littérature. Dans les trois modèles testés (alcool, régime riche et cirrhose), nos critères de jugement sont liés à la quantité de bactéries présentes dans le foie et à la modulation des transaminases (des enzymes produites principalement par le foie dont l’augmentation traduit la maladie hépatique). Nous avons évalué que le nombre total d’animaux par groupe nécessaire est égale à 20 pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées en petit nombre, par 2 ou 4. Les souris bénéficieront d’un enrichissement dans chaque cage car il diminue le stress de l'animal et facilite la thermorégulation de l'animal. Tout au long des procédures, les souris seront pesées et examinées régulièrement pour détecter des signes de de détresse (changements dans la respiration, poil rêche comportement inhabituel, posture voûtée, perte de poids). La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux, si nécessaire. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Les gavages seront réalisés sur souris vigiles pour éviter les fausses routes et réalisés avec un volume réduit et des canules de gavage fines et courtes bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les gavages seront réalisés par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole pour limiter le stress des animaux. Le jour des prélèvements d’organes, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées.

Choix des espèces

Le modèle murin présente, en plus de qualités propres en terme d'expérimentation, plusieurs avantages pour l’étude des infections par des bactéries pathogènes car les pathologies sont similaires à celles que l’on peut observer chez l’homme. E. faecalis est capable de coloniser le tractus gastro-intestinal des souris, de proliférer et de disséminer via la circulation sanguine comme cela est observé chez certains patients. De plus, les mécanismes cellulaires développés dans les maladies du foie chez la souris sont proches de ceux observés chez l’Homme même si le stade n’évolue pas vers les formes les plus sévères. Dans cette étude, des souris « jeunes adultes » âgées au minimum de 8 semaines seront utilisées. Leur poids devra être supérieur ou égal à 20 g. Il permettra d’assurer une continuité avec les expériences déjà réalisées pour lesquelles les doses de bactéries que nous utilisons ne sont pas à l’origine de symptômes sévères chez ces souris.