Procédures sévères
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 56 dans des procédures classées sévères. Ces souris hémophiles reçoivent deux ponctions du genou provoquant des saignements articulaires, des injections, une IRM du genou de deux heures sous anesthésie, puis une exsanguination par la veine cave incompatible avec la survie. Le porteur ne décrit comme nuisance qu'une gêne locomotrice et écrit n'attendre aucun autre effet secondaire ou douleur, alors que la moitié des procédures sont classées sévères. Il indique mettre au point les techniques in vitro au maximum avant d'utiliser les souris, tout en conservant ce modèle qu'il juge éprouvé et fiable.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car l’exsanguination par la veine cave n’est pas compatible avec la survie de l’animal.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Comprendre le role des lymphocytes T résidents mémoires dans l’encephalomyélite autoimmune expérimentale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
3 318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 120 dans des procédures classées sévères. Une encéphalomyélite auto-immune, modèle de la sclérose en plaques, leur est induite et provoque une paralysie ascendante progressive, évaluée sur une échelle de 0 à 5 dont le dernier stade entraîne l'euthanasie, après des injections, des gavages, des prélèvements de sang et une irradiation. Le porteur écrit que le projet ne prévoit pas l'utilisation d'analgésiques ou anti-inflammatoires, au motif qu'ils risqueraient d'interférer avec les processus inflammatoires étudiés. Il affirme que le remplacement n'est pas applicable car les études in vitro ne reproduiraient pas la pathologie.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique qui affecte le système nerveux central (SNC) qui touche 2,5 millions de personnes dans le monde, environ 80 000 patients en France et représente ainsi la première cause de handicap chez les jeunes adultes. Les traitements de fond de la SEP reposent sur des molécules immunosuppressives, qui restent incomplètement efficaces sur le long terme en particulier contre les formes progressives de la maladie. Il est donc urgent de trouver de nouvelles options thérapeutiques permettant d'enrayer le caractère chronique et progressif de la SEP. Dans ce projet nous utiliserons un modèle expérimental de SEP chez la souris appélé encéphalite autoimmune expérimentale ou EAE, pour identifier les mécanismes sous-tendant la chronicité de la maladie et en particulier nous cherchons à comprendre le rôle d'un sous-type de cellules immunitaires résidant stablement dans le SNC appelé lymphocytes T résident memoires ou TRM. Notre objectif central est de definir le rôle des TRM dans la progression de l'EAE chez la souris et identifier les mécanismes moléculaires par lesquels les TRM soutiennent l'inflammation chronique et potentiellement d'identifier des stratégie thérapeutiques visant à cibler les TRM.
Bénéfices attendus
Les traitements de fond de la SEP sont incomplètement efficaces sur le long terme et sont associés à de nombreux effets secondaires. Ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelle voies thérapeutiques via la compréhension du role joué par un sous-type de lymphocytes T (LT) sur l’environnement inflammatoire cérébéral et ses conséquences sur la sévérité et le chronicité de la maladie. Il permettra aussi de mieux comprendre les voies moléculaires impliquées qui pourraient constituter de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (intraveineuse, intrapéritonéale et sous-cutanée) et à des gavages, d'une durée de quelques secondes. Les injections sous-cutanées et intraveineuses seront réalisés sur animaux anesthésiés tandis que les injections intrapéritonéales et les gavages sont réalisées sur animaux vigiles. Les animaux subiront aussi des prélèvements de sang (3 maximun d'une durée de quelques secondes) sur animaux anesthésiés. Enfin certains groupes d'animaux subiront une irradiation qui sera realisée sur animaux vigiles et d'une durée de 6min57s.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et des gavages ainsi que des prélèvements de sang. Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et de manière transitoire. L'EAE induit une paralysie ascendante progressive. La douleur est absente ou faible jusqu’au stade de paralysie du train arrière et modérée au stade de paralysie des trains arrière et avant. Les souris peuvent aussi connaître une perte de poids à ce stade avancé de l'EAE.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de cette pathologie humaine.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos experiences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Nous analyserons aussi le nombre de LT par organes et leurs niveaux d'expression de marqueurs spécifiques.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux qui évaluera leur état général (suivi du poids, prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Le modèle de l’EAE est classiquement utilisé comme le modèle murin de la SEP. La douleur est absente ou faible jusqu’au stade 3 et modérée voire sévère au stade 4 et 5. A partir du stade 3, de la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée sont placées quotidiennement dans la cage pour éviter la déshydratation. L’incidence et la sévérité de la maladie seront suivies quotidiennement. Les signes cliniques de l’EAE seront évalués sur une échelle de 0 à 5 en fonction du handicap moteur. 0 : aucun signe ; 1 : faiblesse de la queue ; 2 : faiblesse de la queue et difficulté à se remettre sur ses pattes après retournement ; 3 : paralysie du train arrière ; 4 : paralysie du train arrière et perte de tonus du train avant ; 5 : paralysie du train arrière et avant, euthanasie. Si immédiatement après ou le lendemain d’un gavage ou d’une injection ip ou iv, un animal cesse de s’alimenter et devient prostré, il sera euthanasié. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris de 7 à 8 semaines, 23-25g au début de l'expérience) offre la possibilité unique d’étudier une pathologie d’inflammation du SNC (l’EAE) mimant la pathologie humaine de la SEP, comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques publiées utilisant ce modèle d’expérimentation animal. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. La complexité des systèmes immunitaires et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences en culture cellulaire) la ‘connectique’ des populations cellulaires mises en jeu. Il n’est donc actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal. Des souris adultes seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système nerveux central et immunitaire mature. Les souris sont considérées comme adultes entre 6-8 semaines d’âge. Avant toute procédure elles auront une semaine d’acclimatation. Dans le cas de la production de souris chimères la reconstitution du système immunitaire par la moelle osseuse injectée prend 8-10 semaines, puis les souris subiront la procédure d'EAE et seront suivies jusqu’à 50-70 jours (7-10 semaines) après induction de la maladie, donc l’âge maximal d’utilisation des souris sera de : 8 (âge des souris receveuses)+1 (semaine d’acclimatation)+10 (temps necessaire à la reconstitution du système immunitaire) +10 (temps de suivi de la procédure d’EAE)=29 semaines.
Etude de la tolérance de nouveaux agents anticancéreux à visée thérapeutique dans le cancer du poumon
- Recherche appliquée
- Cancers
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Immunodéprimées, elles reçoivent des injections dans la veine de la queue ou des gavages pour tester la tolérance de neuf composés anticancéreux, puis sont mises à mort au plus tard 28 jours après le début, y compris en l'absence d'atteinte d'un point limite, pour des analyses post-mortem. Le porteur indique que ces composés peuvent provoquer perte de poids, choc immunitaire, convulsions et lésions des muqueuses de la bouche. Il présente les bénéfices comme relevant de la santé humaine à moyen terme et affirme que l'évaluation de la tolérance sur un organisme entier est nécessaire avant tout essai clinique.
Objectifs
Le cancer du poumon à petites cellules (CPPC) représente environ 15 % de l'ensemble des cancers du poumon. Malgré des taux élevés de réponse à la chimiothérapie et à la radiothérapie de première intention, les patients atteints d'une maladie à un stade avancé finissent par rechuter, et très peu de patients survivent plus de 5 ans après le diagnostic. Les options thérapeutiques pour les maladies récurrentes ou réfractaires sont limitées, et les thérapies existantes sont associés à d'importantes toxicités liées au traitement. Le présent projet vise à évaluer la tolérance et la toxicité chez la souris de plusieurs composés avec une visée thérapeutique finale dans le cancer du poumon à petites cellules. Avant de pouvoir tester ces composés pour des études d’efficacité dans des modèles murins de cancer du poumon, il nous faut nous assurer de la bonne tolérance de ces molécules sur un petit nombre de souris. La tolérance des médicaments désigne la mesure dans laquelle les effets indésirables manifestes des médicaments peuvent être tolérés par l’organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il n’y a pas aujourd’hui de stratégies thérapeutiques pour les patients atteintes de cancer du poumon à petites cellules réfractaires aux traitements. L’étude va permettre de développer en phase préclinique de nouvelles molécules qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.
Procédures
Lors du traitement, les animaux vont subir une contention de quelques minutes et une douleur de quelques secondes due à l'aiguille lors à l'injection à la seringue dans la veine caudale. Les animaux vont subir une contention pour la pesée d'une durée de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes due à l'aiguille lors à l'injection à la seringue dans la veine caudale. Les pesées génèrent un stress lors de la contention. Les effets les plus graves retrouvés dans la littérature pour cette catégorie de composés incluent une perte de poids, un choc immunitaire ou des problèmes neurologiques (convulsions) comme effets secondaires à court-terme. Les traitements pourront éventuellement également entrainer des effets à long-terme comme des lésions dans la bouche et les muqueuses (saignements). Les composés parents n’ont montré aucun signe de toxicité particulière lors de leur administration chez la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort 28 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, même en l'absence d'atteinte de point limite afin de pouvoir effectuer les évaluations post-mortem prévues.
Remplacement
Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation des différents composés créés ont été réalisées afin de sélectionner les neufs candidats les plus efficaces. Le passage chez l'animal est maintenant nécessaire pour l’évaluation de leur tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour cette raison nous devons effectuer ces études de toxicité sur la souris.
Réduction
Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude pilote. Une décision de continuer ou non l'étude sera mise en place à l’issu de l’injection de chaque dose : si une dose a provoqué des effets secondaires entrainant une dégradation de l’état des souris, les doses suivantes ne seront pas administrées et l’escalade de dose s’arrêtera. Un test statistique fiable a été utilisé pour nous permettre de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour la comparaison des poids. Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire au autant que possible le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 28 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Les animaux étant immunodéprimés, ils seront hébergés en portoirs ventilés et manipulés exclusivement sous hotte à flux laminaire, y compris pour le change. Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées. L'état des animaux est évalué avec une grille de score et des points limites précis sont décrits. Si jugé nécessaire, un traitement analgésique sera immédiatement mise en place. Ce traitement sera renouvelé autant de fois que nécessaire sur une durée de 24h au maximum.
Choix des espèces
Afin de développer ces thérapeutiques sous une forme cliniquement applicable, nous devons évaluer leur tolérabilité et leur toxicité chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées. Pour ce faire, nous souhaitons vérifier leur innocuité dans des souris non-consanguines. Ces souris sont utilisées pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments, elles possèdent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressantes pour les études de tolérabilité. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.
Evaluation des effets de différents candidats médicaments dans un modèle de résignation induite chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 900
1 800 rongeurs, 900 souris et 900 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Les animaux reçoivent les composés à tester puis sont placés dans une situation dont ils ne peuvent s'échapper jusqu'à ce qu'ils cessent de tenter de fuir, un état que le porteur assimile à la dépression humaine, avant des prélèvements terminaux de sang, d'organes et de fluides. Il décrit ce test de résignation induite comme pouvant provoquer un stress émotionnel majeur. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution in vitro ou in silico et que l'animal reste un passage obligatoire avant l'humain.
Objectifs
La dépression est une pathologie complexe qui induit chez l’Homme des symptômes à la fois psychologiques (effets sur l’humeur), comportementaux (troubles du sommeil, comportements suicidaires) et physiologiques (effet sur l’appétit, sur l’attention). La résignation est un symptôme caractéristique de la dépression. Elle entraine une diminution de la motivation, une augmentation de la passivité et une diminution de la capacité à prendre des décisions et à résoudre des problèmes. Le test de résignation induite est un modèle animal de la dépression chez l'Homme. Dans ce modèle animal de résignation induite, les animaux sont rendus résignés en les soumettant à une situation à laquelle ils ne peuvent échapper. Après une première phase pendant laquelle les animaux vont essayer de s’échapper, les animaux vont entrer dans une phase de résignation et ne vont plus présenter de comportement d’échappement. Leur comportement est alors assimilé à un état dépressif. Ce projet a pour but d'évaluer les effets antidépresseurs potentiels d'un candidat médicament chez le rongeur en évaluant s’il permet de diminuer le comportement de résignation.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter la dépression, une pathologie humaine touchant 3.8% de la population mondiale. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.
Procédures
Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (-2 min par administration) puis effectueront le test de resignation 1 à 2 fois avec une durée de 6 à 20 minutes maximum par test (soit 12 min maximum pour la souris et 40 min maximum pour le rat si 2 tests). Des prélèvements de sang sur animal vigile pourront être effectués (2 minutes par prélèvement). Et l'animal pourra être anesthésié en fin d'expérience pour les prélèvements terminaux de fluides corporels et tissus.
Impact sur les animaux
Les contentions des animaux vigiles pour administrer le produit, induire une anesthésie ou pour effectuer des prélèvements sanguins peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Le test (d'une durée de 6 à 20 minutes, répété une fois) qui induira un caractère résigné chez les animaux est une intervention pouvant conduire à un stress émotionnel majeur. Les prélèvements sanguins induisent un stress léger et une douleur légère.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s) chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule à effet antidepresseur. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 12 / par groupe (5 groupes/étude* 6 études/an). L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse. Après chaque test les animaux seront séchés et placés dans un environnement chaud.
Choix des espèces
Le rat et la souris font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale. En effet, le rat ou la souris et l'Homme partagent de nombreuses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques avec l'Homme (les êtres humains et le rat ont plus de 90% de gènes en communs). De plus, les rats et les souris sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec des cycles reproductifs et de vie courts. Par conséquent, le rat et la souris sont des espèces de rongeurs les plus couramment utilisées dans les tests comportementaux relatifs à la dépression dont, le modèle de résignation induite. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Caractérisation de la lignée Pde2a2 +/-
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 48 dans des procédures classées sévères. Cette lignée modifiée pour réduire une protéine liée à l'autisme et à la déficience intellectuelle subit des tests sociaux et cognitifs, dont certains précédés de deux heures d'isolement, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau, de la moelle épinière, des surrénales, des testicules et des ovaires, 120 animaux mourant au cours d'une perfusion intracardiaque. Le porteur qualifie les tests comportementaux de classiques et indolores et signale une anxiété possible liée au nouvel environnement et à l'isolement. Il indique avoir d'abord travaillé sur des lignées cellulaires et poursuivre directement chez la souris pour étudier les comportements.
Objectifs
Des mutations du gène PDE2A ont été découvertes chez des patients atteints d’autisme et de déficience intellectuelle, qui sont des maladies du développement du cerveau . La protéine PDE2A est très fortement présente dans le cerveau et a un rôle clé dans le développement des neurones, leur morphologie et fonctionnement. Ceci explique que des altérations de sa quantité puissent avoir un impact négatif sur le fonctionnement neuronal et induire des maladies du cerveau. La PDE2A regroupe trois protéines variantes qui se retrouvent à des emplacements distincts dans les neurones, dont la PDE2A2 que l’on retrouve spécifiquement dans la mitochondrie. Les mitochondries sont des petites unités présentes dans les cellules qui produisent de l'énergie sous forme d'ATP grâce au processus de respiration cellulaire. Des altérations de la mitochondrie sont d’ailleurs retrouvés chez les patients ayant des mutations sur le gène PDE2A ainsi que chez d'autres patients atteints de trouble du spectre de l'autisme. Nous avons récemment étudié la souris Pde2a+/- qui, comme les patients, a une quantité diminuée de tout les variants PDE2A. Nos récentes données montrent que cette souris est un bon modèle de maladie du cerveau, et qui présente des troubles socio-cognitifs similaires aux patients. Nous voulons à présent commencer l’étude de la souris Pde2a2+/- qui aura uniquement une quantité diminuée de PDE2A2, donc seulement au niveau de la mitochondrie. En effet, cela nous permettra de savoir si une atteinte unique au niveau de la mitochondrie est suffisante pour induire des troubles comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle spécifique de la PDE2A2 au cours du développement du cerveau, et le lien entre la dérégulation de l'activité de cette enzyme au niveau de la mitochondrie et les troubles du neuro-développement comme la déficience intellectuelle, l'autisme et les troubles moteurs. Finalement, l'évaluation de la pertinence de ce modèle par rapport aux patients atteints d'une mutation permettra de mettre à disposition de la communauté scientifique un potentiel nouveau modèle de maladie du neurodeveloppement.
Procédures
Différents tests sociaux et cognitifs seront réalisés ponctuellement et qui dureront, selon les tests, de 3 minutes à 2 heures. Ces tests se feront chez les souriceaux, à l'adolescence (un mois) et à l'âge adulte (dès deux mois). Certains animaux seront soumis à une perfusion intra-cardiaque, et une injection d'anesthésique et une d'antalgique seront effectuées sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une contention plusieurs fois au cours de leur vie, que ce soit pour des pesées ou pendant les différents tests. Les tests comportementaux réalisés sont classiques et indolores. De l'anxiété peut être attendue lors des différents tests liée à un nouvel environnement notamment pour les tests d'anxiété ou lors de l'isolement dans l'actimètre ou pendant le test d'interaction sociale avec 2h d'isolement auparavant.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales. Nous récupérerons différents organes (cerveau, moelle épinière, surrénales, testicules et ovaires) afin de réaliser des études moléculaires. 120 de ces animaux subiront une perfusion intra-cardiaque, sous anesthésie générale, au cours de laquelle ils décèderont afin de pouvoir réaliser une étude sur les coupes de cerveau.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude, nous avons préalablement travaillé sur des lignées cellulaires, ce qui nous a permis de confirmer le rôle de PDE2A2. Notre étude portant globalement sur des maladies du neurodéveloppement et sur le déficit intellectuel et les troubles du spectre de l'autisme, nous devons poursuivre ce projet directement chez la souris pour étudier les différents comportements associés à ces maladies afin de valider le rôle de la forme mitochondriale de PDE2A.
Réduction
Dans un objectif de réduction, nous analyserons nos résultats après chaque groupe expérimental. Si les résultats des 2 premiers groupes expérimentaux sont significatifs et identiques, nous n'utiliserons pas le 3ème groupe. De plus, les organes de tous les animaux utilisés au cours de ce projet seront récupérés pour réaliser des études moléculaires, ce qui évitera l'emploi d'animaux supplémentaires. Pour garantir une puissance statistique (t test) suffisante à cette étude tout en minimisant le nombre d’animaux à utiliser, nous prévoyons un minimum de n=10 animaux par groupe, avec 3 expériences indépendantes. Chaque expérience sera réalisée 3 fois afin de garantir la reproductibilité des résultats, et pour chaque répétition, nous avons besoin d'un minimum de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un résultat significatif.
Raffinement
Lors des procédures chirurgicales, les animaux seront au préalable anesthésiés, accompagné d'un analgésique et d'un antalgique afin de réduire la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer un phénotype "sauvage" avec des modèles transgéniques disponibles, comme les souris Pde2a+/-. De plus, le modèle murin permet d'étudier à la fois les comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensorimoteurs que l'on peut retrouver chez les patients atteints de troubles du neuro-développement. Des tests seront réalisés au 7ème, 10ème et 14ème jour après la naissance, ce qui correspond à l'enfance chez l'humain. Puis nous réaliserons d'autres tests à 1 mois, ce qui correspond à l'adolescence. Enfin, nous réaliserons des tests à l'âge adulte d'une souris (à partir de 8 semaines). Cela permettra d'évaluer l'impact de l'extinction partielle du gène Pde2a2 au cours du développement, et d'identifier les moments clefs où la protéine PDE2A2 est impliquée dans la pathologie.
Evaluation pharmacologique de composés naturels ou de synthèse pour le traitement des maladies infectieuses
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
8 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 7 300 dans des procédures classées sévères. Elles sont infectées par diverses voies, nasale, intrapéritonéale, urétrale, intradermique et intramusculaire, puis traitées avec des composés candidats, la plupart des études se terminant par un prélèvement d'organes après mise à mort. Le porteur indique que les animaux peuvent perdre du poids et présenter posture voûtée, difficultés respiratoires et prostration, une perte de plus de 20 pour cent du poids servant de point limite. Il affirme qu'il n'existe aucun modèle in vitro reproduisant les interactions entre agent pathogène et système immunitaire, et revendique un besoin de santé publique majeur.
Objectifs
Nous avons pour objectif le développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est la résistance aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le nombre croissant d’antibiorésistances et d’infections nosocomiales sont clairement identifiés comme un besoin de santé public majeur. Il est indispensable de combattre la résistance aux antimicrobiens et de préserver la capacité de prévenir et traiter les maladies infectieuses à l’aide de nouveaux médicaments sûrs et efficaces
Procédures
Voie d’administration (traitement) : - Per os : 5 secondes, Sous cutané : 5 secondes , Intrapéritonéal : 5 secondes, Intramusculaire : 5 secondes, Intraveineuse : 5 secondes Voie d’administration (infection): - Intra-nasale: 5 secondes, Intra-peritoneale : 5 secondes, Intra-urétrale: 30 secondes, Intra-peritoneale : 5 secondes, Intra-dermique: 5 secondes, Intramusculaire: 5 secondes. Le nombre d'interventions est spécifique de chaque étude et est dépendant du régime de traitement qui lui même est corrélé à la pharmacocinétique de chaque molécule en développement. Néanmoins les fréquences d'intervention (traitement uniquement) peuvent etre uid ou bid.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont une potentielle perte de poids (qui sera considérée comme un point limite si excédant 20%). D'autres effets potentiels sont une apparition de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration difficile, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus.
Devenir
Le sort prévu de tous les animaux à l'issue de chaque procédure est la mise à mort. En effet les études se finissent pour la plupart par des prélèvements d'organes qui sont réalisés après mise à mort des animaux. Les animaux survivants ne peuvent resservir à d'autres expérimentations en raison du développement de défenses immunitaires au cours de l'établissement des pathologies infectieuses.
Remplacement
L’apparition de résistance aux traitements antibiotiques de référence rend urgente la découverte de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de la résistance de certains agents pathogènes aux antibiotiques. En effet l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies telles que la septicémie, les infections pulmonaires, les infections urinaires etc… sont utilisés. De plus les mécanismes de réaction de l’hôte peuvent être mis en évidence en utilisant ces modèles sur animaux immunocompétents versus immunodéprimés. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Le nombre estimé est entre 1000 et 1600 animaux / an sur 5 ans. 12 procédures expérimentales sont prévues dans ce projet et le nombre d'étude varie en fonction de la demande client. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de souches bactériennes différentes à tester, nombre de molécules antibactériennes à tester, doses différentes de la molécule antibactérienne). Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre à l’année. . Des études in vitro sont réalisées si possible en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur des animaux. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats robustes sont effectués. Des études pilotes sont conduites afin de s'assurer de la fiabilité du modèle.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt stricts sont mis en place. Les points limites utilisés sont: Le suivi du poids (le critère d'arret est une perte de plus de 20%), L'accumulation de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration laborieuse, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Pour le confort de l'animal la prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) au préalable des gestes douleureux (injection intraveineuse, injection intra-uretrale, injection intra-musculaire,...).
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le traitement des maladies infectieuses Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie
Etude des lésions inflammatoires du cervelet après traumatisme crânien chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures classées sévères et l'autre modérées. Des souriceaux de 7 jours subissent un traumatisme crânien par lâcher de poids sous anesthésie, puis certains une chirurgie crânienne pour imagerie, avant une perfusion intracardiaque mortelle et le prélèvement du cerveau. Le porteur décrit un modèle de traumatisme crânien pédiatrique visant à comprendre l'atteinte du cervelet, et indique que les effets sur la croissance des souriceaux ne sont pas encore décrits ni connus. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro les interactions entre cellules du cerveau.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) correspond aux lésions cérébrales traumatiques et aux altérations des fonctions cérébrales qui en résultent. Les TC sont fréquents chez les enfants et sous-diagnostiqués. Le traumatisme crânien pédiatrique est pourtant un enjeu de santé publique et social majeur. En effet, il est potentiellement responsable de troubles cognitifs et comportementaux, d’échecs scolaires puis de désinsertion sociale à l’âge adulte. Alors que le cervelet est rarement touché directement (3,3% des TC), des lésions indirectes provenant de la zone lésée dans le reste du cerveau peuvent être observées, notamment chez l’enfant. Ces atteintes participent aux handicaps moteur et cognitif. En revanche, les mécanismes mis en cause dans la génération de ces lésions sont mal connus et semblent reposer sur l’inflammation qui survient dans le cerveau lors du TC. Notre hypothèse est que le TC, même isolé, peut être à l’origine de lésions du cervelet, à cause de l’inflammation. Nous utiliserons un modèle de TC modéré par lâcher de poids d'une faible hauteur chez le souriceau 7 jours, sous anesthésie générale, pour étudier les phénomènes inflammatoires potentiellement impliqués dans les lésions du cervelet dans les suites de l'impact.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de compendre de manière plus précise comment le traumatisme crânien chez l’enfant peut conduire à des troubles à long terme, et quel rôle le cervelet joue dans ce phénomène. La fonction du cervelet est de plus en plus étudiée, mais la manière dont il participe à certaines maladies neurologiques, ou neurodégénératives, n’est pas encore totalement élucidée.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien sous anesthésie générale. Après ce traumatisme, un groupe d’animaux de 10 jours de vie sera anesthésié, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post-mortem pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem. Cette perfusion sera également réalisée chez des animaux à 45 jours de vie et à 6 mois, sous anesthésie générale et avec analgésie. Deux groupes de souris, l’un à 45 jours de vie et l’autre à 6 mois subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie pour réaliser des mesures d’imagerie sur le cerveau (durée : une heure maximum). Ces animaux seront ensuite euthanasiés sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets de cette procédure de traumatisme crânien sont partiellement connus . On rapporte ainsi une mortalité́ estimée à moins de 4%, principalement due à un éventuel rejet du souriceau par la mère, ainsi que dans quelques cas par le traumatisme lui-même. La chirurgie crânienne pour l’imagerie peut entraîner dans de rares cas la mort de l’animal. Les effets sur la croissance et le développement des souriceau ne sont pas encore décrits ni connus.
Devenir
L'euthanasie des animaux après imagerie répond à une nécessité d'ordre éthique puisque celle-ci impose une chirurgie au niveau du crane de l'animal, et rend l’utilisation du cerveau impossible pour toute autre analyse. Tous les autres animaux seront euthanasiés et les cerveaux prélevés pour analyses.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication du cervelet dans l’inflammation du cerveau après traumatisme, et dans le développement de lésions plus tardives. Cela suppose des interactions complexes entre les différents types de cellules qui constituent le cerveau, à savoir les neurones (qui transmettent les informations nerveuses), les microglies (cellules immunitaires du cerveau), les astrocytes (qui contrôlent le métabolisme), et les oligodendrocytes (qui produisent une gaine de protéine autour des neurones). Il y a également une rupture de la barrière hémato-encéphalique, qui filtre habituellement le sang avant qu’il entre dans le cerveau. Cette lésion secondaire au traumatisme est à l’origine d’une communication entre le système immunitaire périphérique (c’est-à-dire les globules blancs qui circulent dans le sang) et le système immunitaire du cerveau. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions in vitro, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal présentant un cerveau fonctionnel, dont la structure est proche de celle de l'homme pour reproduire ce système.
Réduction
Le nombre d'animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d'étude. Ce nombre minimum nous permettra d'être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. L'analyse statistique de nos données peut nécessiter plus ou moins d'animaux en fonction du type d’analyse réalisé. Pour autant, les tests étant organisés en plusieurs séries, si une différence assez importante pour conclure à un effet réel est observée avant la fin de toutes les séries, les expérimentations seront interrompues.
Raffinement
Hébergement : Les animaux seront hébergés en groupe, en milieu enrichi (sopalin , maisons en plexiglas) pour minimiser leur stress. Dans les jours suivant le traumatisme crânien, on veillera quotidiennement au bien-être des animaux et on surveillera que leur retour au sein du nid se fait bien. Des arbres décisionnels cliniques seront proposés en fonction de l'âge des animaux. Avant sevrage, sur les très jeunes animaux, les soins maternels constituent la meilleure prise en charge de la souffrance chez le souriceau. Après le 15ème jour de vie, une réhydratation sera réalisée si l’animal présente des signes d’inconfort ou de douleur. A partir du sevrage, les douleurs éventuelles seront traitées à l’aide d’un analgésique. En cas d’atteinte des points limites l’animal sera euthanasié. Tous les gestes invasifs (trauma et imagerie) seront réalisés sous anesthésie générale. A la fin de l'étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre les cellules du cerveau sur un modèle de traumatisme, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition. Le modèle de traumatisme crânien utilisé est bien connu développé et étudié au sein de notre laboratoire. Notre objectif étant l'étude du rôle du cervelet dans les lésions induites par un trauma crânien, nous nous intéresserons à 3 temps de vie plus tardifs de nos animaux : 10 jours (petit enfant), 45 jours (jeune adulte) et 6 mois de vie (adulte).
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes BRGS dans le but d’étudier le développement des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes immunitaires, dont la rate et les ganglions, la déclaration en comptant 340 en souffrance modérée et 200 en souffrance sévère. Les souris immunocompétentes sont irradiées sur tout le corps, parfois à dose létale, avant une greffe de cellules souches du sang, les souris immunodéficientes BRGS reçoivent des cellules souches humaines, et toutes subissent une prise de sang toutes les quatre semaines. Après une irradiation létale, le porteur cite comme signes possibles un affaiblissement, une perte de poids, une léthargie et un dos courbé, et prévoit la mise à mort au-delà d'un score de grimace de 1,5 ou d'une perte de 20 % du poids. Le but est de repérer des gènes impliqués dans la prolifération des lymphocytes B et de tester l'insertion de gènes d'anticorps dans ces cellules. Pour limiter le nombre de souris, le porteur annonce des groupes de cinq, et prévoit de répéter une expérience quand une différence apparaît sans être significative, "afin d'obtenir une significativité".
Objectifs
Le but de ce projet est double. Tout d'abord un objectif fondamental qui sera d'évaluer le rôle de différents gènes dans le développement et la maturation des lymphocytes B. Cette partie sera réalisée grâce à des cellules souches hématopoïétiques (CSH) murines qui seront immortalisées in vitro. Ainsi, ces CSH murines pourront recevoir à façon des mutations génétiques avant d'être injectées aux souris. Ces dernières auront reçu une forte irradiation afin d'éliminer le système hématopoïétique de la souris. Les CSH ayant la capacité de reconstituer tous les composants du système hématopoïétique, nous pourrons alors suivre dans les souris l'effet des mutations sur le comportement des lymphocytes B. L'objectif étant de repérer les gènes impliqués dans l'hyperprolifération des lymphocytes B, afin de mieux comprendre les mécanismes ayant lieu dans les lymphomes. Ensuite un objectif plus translationnel avec l'évaluation de l'efficacité de l'insertion de gènes d'immunoglobuline dans les lymphocytes B. Les lymphocytes B sont capables de produire des anticorps (appelés aussi immunoglobulines) qui seront spécifiques d'un pathogène ou d'un antigène tumoral donné. Nous voulons donc modifier génétiquement les lymphocytes B ou les CSH humaines afin d'obtenir des lymphocytes B (après reconstitution hématopoïétique dans des souris dans les cas des CSH) qui produiront un anticorps spécifique donné. Pour cela, un gène codant pour une immunoglobuline définie sera inséré soit directement dans des CSH humaines soit dans des lymphocytes B purifiés à partir de souris reconstituées à partir de CSH humaines. Les cellules seront alors reinjectées dans des souris et la production de l'immunoglobuline sera alors monitorée. Les souris utilisées dans ce projet sur les CSH ou lymphocytes B humain sont des souris immunodéficientes (BRGS) qui ne peuvent pas détruire les cellules humaines injectées. Une fois que les CSH sont injectées dans ces souris, elles reconstituent un nouveau système immunitaire humain dans la souris.
Bénéfices attendus
Concernant le projet CSH souris, de nombreux résultats seront attendus sur le rôle de différents gènes dans la survenue de syndromes lymphoprolifératifs (prolifération excessive des lymphocytes) et ainsi une évolution dans la compréhension des leucémies et lymphomes. Pour le projet CSH humain, nous testons la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B une immunoglobuline (anticorps) thérapeutique.
Procédures
Notre modèle de greffe de CSH murines dans des souris immunocompétentes implique une irradiation (parfois à dose léthale) préalable à l'injection des cellules afin d'obtenir une hypoplasie complète. La greffe des cellules se fera ensuite par injection intraveineuse dans la veine caudale. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 4 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution au cours du temps. Enfin des immunisations pourront être appliquées sur les animaux en post-greffe si la reconstitution a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection de cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire afin de repérer tout signe indiquant un inconfort ou une douleur. Des nuisances plus importantes viendront de l'irradiation corps entier léthale. Le développement d'une immunodépression complète induite par l'irradiation léthale peut engendrer un affaiblissement notable de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter une potentielle absence de reprise de l'hématopoïèse (qui devrait être obtenues suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques murines) avec l'apparition de signes de l'immunodépression (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution hématopoïètique et sur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Ces dernières sont en effet capables de se différencier en de nombreux précurseurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ces précurseurs vont ensuite continuer de se différencier soit dans la moelle osseuse soit dans d’autre organes du système immunitaire et ainsi reconstituer un système immunitaire entier et compétent. Il est actuellement possible de différencier des CSH in vitro mais uniquement vers une voie donnée, ce qui permet d’obtenir qu’un type de cellules immunitaires. Aucun modèle ne permet une différenciation complète des CSH. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes ou de souris immunocompétentes irradiées léthalement reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes des CSH, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations après CRISPR-Cas9). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Lorsque deux groupes de souris seront comparés, un test de Student (two-tailed) sera utilisé alors qu'un test One-Way ANOVA sera utilisé pour comparer plusieurs groupes ensemble. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux (posture et comportement) par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon les mêmes critères généraux cités précédemment en plus de critères spécifiques: suivi du poids et mesure du score grimace permettant d’évaluer l’état de santé des animaux. Le « score de grimace » (MGS) (Langford et al. 2010, Nature Methods) correspond a une échelle permettant d’évaluer la douleur chez l’animal, en particulier chez la souris. Cinq paramètres sont évalués et un score allant de 0 (normal) à 2 (modification sévère) est attribué pour chaque paramètre : ouverture des yeux, gonflement du museau, gonflement des joues, position des oreilles, position des moustaches. Si le MGS excède 1.5, les animaux seront alors euthanasiés. Également si la perte de poids excède 20% du poids de référence alors les animaux seront alors euthanasiés. Si des effets secondaires ou signes d'inconfort non soulagés par l’administration de buprénorphine (buprénorphine 0.1 mg/kg en sc, aiguille 30G) ainsi que des changements perceptibles (aspect, comportement, poids, isolement dans la cage, déplacements limités) sont observés, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris BRGS (BALB/c_RAG2-/- IL2GammaC-/-_SIRPA.NOD) choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK, ce qui permet donc d'éviter le rejet de la xénogreffe de cellules humaines. Ces souris permettent la croissance de nombreuse lignées lymphoïdes humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé́ de prise de xénogreffes. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de l’expression d’un phénotype dommageable car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Le maintien de ces souris en hébergement protégé de type A2 permettra de prévenir tout risque d’infection. Les utilisateurs se muniront d'une combinaison recouvrant tout le corps ainsi que d'un masque chirurgical et d'une 2eme pair de gant. Enfin, les souris seront manipulées sous hotte à flux laminaire. L’expérimentation sera commencée chez des animaux de 5 semaines à 3 mois. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 6 mois.
Évaluation de l’efficacité de candidats vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, basés sur le vaccin vivant contre la rougeole
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 930 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou intracérébrales de candidats vaccins ou de virus d'épreuve, dont la grippe et la rage qui peuvent provoquer une pneumonie et une perte de poids jusqu'à 25 %, voire la mort. Le projet évalue chez la souris des vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, dérivés du vaccin contre la rougeole. Le porteur indique qu'aucun animal ne peut être réutilisé ou sorti de l'animalerie confinée, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit l'interaction hôte-pathogène.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser l’évaluation préclinique chez la souris de candidats vaccins élaborés dans notre laboratoire. Ces candidats vaccins sont dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole, qui est l’un des vaccins humains les plus sûrs et efficaces. Pour bénéficier des grands avantages de ce vaccin, nous développons des nouveaux vaccins recombinants ou chimériques construits à partir du génome de la souche Schwarz du virus vaccinal de la rougeole (MV) qui est modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigènes des agents pathogènes ciblés. Ces antigènes sont exprimés à partir d’unités additionnelles de transcription (stratégie vaccin recombinant) ou à la place d’antigènes du vaccin contre la rougeole (stratégie vaccin chimère). Ces stratégies ont déjà fait l’objet de nombreuses publications scientifiques par notre équipe et par d’autres. Plusieurs programmes sont poursuivis en parallèle dans le laboratoire. Dans ce projet, nous développons des vaccins recombinants ou chimériques MV-COVID, MV-grippe et MV-rage. Pour chacun des agents pathogènes ciblées, une série de plusieurs candidats vaccins sont construits, produits et caractérisés en faisant varier le choix et la forme des antigènes vaccinaux, la conception du/des transgènes et leur insertion dans le génome de la souche Schwarz avant l’étude in vivo. Les candidats vaccins sont évalués pour leurs capacités immunogènes et protectrice chez des souris de laboratoire ou des souris génétiquement modifiées qui présentent une meilleure susceptibilité aux faibles doses à l’infection par les souches atténuées du virus de la rougeole. En fonction des résultats obtenus chez la souris, des séries successives de candidats vaccins sont produites afin d’aboutir à la sélection d’un ou deux candidats par pathogène ciblé. Cette sélection réduite fera l’objet d’une validation préclinique complémentaire chez le primate non humain puis d’études cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins prophylactiques efficaces et améliorés contre plusieurs pathologies infectieuses graves.
Procédures
Une identification par marquage à l’oreille (quelques secondes) en début d’expérimentation. Une à trois administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) ou instillation intranasale (60 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Alternativement, une à deux administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) puis une seule injection intracérébrale (20 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Une à trois prises de sang (10 secondes), avec des intervalles de 1 mois.
Impact sur les animaux
Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du vecteur Ad5-hACE2 suivie de celle du SARS-CoV-2. A l’opposé, l’inoculation de virus grippaux H1N1/H3N2 adaptés à la souris, du virus H1N1 pandémique (2009) ou du virus de la rage (souche CVS) peuvent provoquer une maladie symptomatique, entraînant potentiellement la souffrance. Les virus grippaux induisent une pneumonie virale primaire de symptômes modérés à sévères selon la souche et la dose d’épreuve utilisée, dont les manifestations cliniques vont d’une gêne respiratoire / mobilité réduite / perte de poids transitoire à la mort. La perte de poids peut être importante, jusqu’à 25% du poids d’une souris mâle adulte, tout en restant transitoire et en l’absence de toute autre manifestation clinique chez des souris vaccinées. Le virus de la rage est fortement neurotrope et induit une encéphalite létale après inoculation intracérébrale à la souris, dont les premières manifestations cliniques peuvent être la perte de poids, l’ataxie, un comportement agité et rotatoire, un manque de coordination des pattes et la paralysie. L’inoculation intramusculaire périphérique (membre inférieur) peut provoquer une neuropathie et/ou une paralysie progressive à mesure que le virus progresse vers le système nerveux central (SNC), puis une encéphalite ultimement létale. Pour éviter que les animaux souffrent, des points limites seront établis préalablement à la réalisation des expériences et les animaux seront mis à mort immédiatement après avoir atteint ces points.
Devenir
Une grande partie des animaux seront mis à mort afin d’être prélevés de multiples organes nécessaires pour l’évaluation de l’efficacité des candidats vaccins. Tous les autres animaux survivants seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils auront été immunisés par des vaccins vivants recombinants ou infectés par des virus d’épreuve pathogènes pour l’homme dans une animalerie confinée (A3) : il n’est donc pas possible de les réutiliser dans d’autres projets ou de les transférer en dehors de l’animalerie.
Remplacement
Ce programme préclinique est au centre de l’activité de notre équipe. Il est primordial car il produit les premières preuves de concept de l’immunogénicité et de l’efficacité des candidats vaccins qui déterminent les phases ultérieures du développement, susceptibles de produire des nouveaux vaccins humains. Aucun système in vitro ne permet à ce jour d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à l’induction d’une réponse immunitaire par les candidats vaccins vivants puis à la protection contre l’infection pulmonaire par les coronavirus ou les virus grippaux ou contre l’infection du système nerveux central par le virus rabique. En particulier, l'évaluation de l'impact vaccinal sur le contrôle de la charge virale et l’appréciation de l’histopathologie des organes cibles ne peuvent se réaliser que dans des modèles in vivo pertinents qu’il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer par des essais in vitro. Par ailleurs, avant d’entreprendre des études cliniques de phase 1 permettant de cerner l’éventuelle toxicité d’un produit vaccinal administré à l’homme ou de phase 2 permettant d’évaluer son efficacité, c’est une obligation des agences règlementaires de procéder à des études précliniques chez l’animal. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme.
Réduction
Sur la base de discussion avec un biostatisticien, et des tests statistiques appropriés, nous avons planifié d’inclure le nombre minimal d’individus par groupe expérimental qui permette une analyse statistique pertinente et concluante. Pour calculer la taille des groupes de souris injectées par les candidats vaccins, nous avons utilisé les moyennes et écart-types géométriques d’expériences antérieures obtenues dans un projet précédent. Les tests considérés sont un test de comparaison de deux moyennes indépendantes pour comparer 2 groupes et un test Anova à un facteur suivis de tests multi-comparaisons pour comparer plusieurs groupes. Grâce à ces données, un logiciel statistique a déterminé la taille optimale des groupes pour un risque alpha de 5% et une puissance de 80-90% : le nombre d’animaux sera ainsi réduit à 6 pour les études d’immunogénicité et 7 pour les études de protection. Par ailleurs, nous utiliserons un modèle d’épreuve par le SARS-CoV-2 déjà mis au point qui ne nécessitera pas de mise au point supplémentaire pour le choix des doses.
Raffinement
Les opérations de vaccination, d’infection, de prélèvement de sang, ainsi que la mise à mort et le prélèvement d’organes seront réalisés par des expérimentateurs formés. La cage des animaux comportera, comme élément d’enrichissement, du coton dentaire, pour que les animaux puissent construire un nid et, dans le cas des animaux infectés, du Diet Gel pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation. La température dans la cage d’animaux infectés sera améliorée au début des symptômes cliniques. Une évaluation clinique sera mise en place à raison de 2 fois par semaine dans le cas des animaux immunisés avec les vaccins rougeole recombinants et une évaluation quotidienne dans le cas des animaux infectés. Si les animaux deviennent cliniquement malades, leur souffrance sera abrégée par leur mise à mort. Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du SARS-CoV-2 jusqu’au 4ème jour après l’épreuve où les animaux seront mis à mort pour le prélèvement des organes. Pour les procédures d’épreuve de classe sévère (virus grippaux, virus de la rage), nous prendrons soin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux : tout en respectant les conditions qui permettent au projet de recherche d’atteindre ses objectifs, nous définirons à l’avance des points limites spécifiques de chaque agent infectieux et les animaux seront mis à mort dès que les points limites seront atteints.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte efficacement que les primates. Un modèle rongeur pertinent a donc été développé. Les souris déficientes pour le gène du récepteur d’un médiateur de l’inflammation, les interférons de type I (IFNAR) sont susceptibles à l’infection par les souches vaccinales du virus de la rougeole. Elles peuvent également exprimer le récepteur humain de ce virus, améliorant encore leur susceptibilité aux faibles doses. Nous pensons que certains candidats vaccins basés sur le vaccin contre la rougeole seront capables de se multiplier chez la souris non génétiquement modifiée . Dans ce cas, nous aurons principalement recours à plusieurs lignées de souris de laboratoires qui sont des modèles reconnus pour le SARS-CoV-2, les virus grippaux et le virus rabique. Des souris de 5-7 semaines d’âge seront commandées. Après une semaine de stabulation, les souris seront immunisées pour l’étude de l’immunogénicité des vecteurs vaccinaux ou immunisées et infectées pour l’évaluation de l’efficacité vaccinale. Il est admis qu’à partir de l’âge de 6 à 7 semaines, le système immunitaire de ces petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant leur vie d’adulte.
Identification des réseaux neuronaux impliqués dans la douleur cornéenne grâce à l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
260 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. On leur induit une douleur cornéenne chronique, soit par excision des glandes lacrymales sous anesthésie, soit par dépôt répété de chlorure de benzalkonium, avant imagerie fonctionnelle du cerveau et prélèvement. Le projet vise à identifier les réseaux neuronaux de la douleur cornéenne, que le porteur décrit lui-même comme provenant du "générateur de douleur le plus puissant" de l'organisme. Il affirme que cette douleur chronique ne peut être modélisée qu'au niveau de l'animal entier.
Objectifs
La cornée est le tissu le plus innervé de l’organisme et le générateur de douleur le plus puissant. La sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes. Elle engendre des douleurs, picotements, sensation de brûlure oculaire et sensibilité à la lumière (photophobie) avec des atteintes cornéennes. C’est une douleur chronique qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients (anxiété, dépression) et qui en fait l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Les douleurs oculaires sub-aigües et chroniques sont les plus difficiles à traiter notamment car les circuits neuronaux impliqués sont encore très mal identifiés en raison des difficultés techniques en recherche préclinique où l’étude des réseaux neuronaux chez le petit animal reste complexe. Ce projet a pour but de mettre en évidence et mieux comprendre les réseaux de neurones et leurs dysfonctionnements en lien avec une douleur cornéenne chronique et sub-aigüe. A cette fin, nous enregistrerons les activités cérébrales suite à des stimulations cornéennes, dans des modèles murins d’une douleur oculaire sub-aigüe ou d’une douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
La prise est charge de la douleur oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces notamment dans le cadre de douleurs sub-aigües ou chroniques. Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation des circuits neuronaux de la douleur cornéenne et de permettre d’améliorer notre compréhension de ses mécanismes d’initiation et de maintien, encore largement inconnus, afin de faire le lien entre manifestations cliniques et mécanismes neurologiques fin de développer des traitements réellement efficaces.
Procédures
Les animaux subiront soit une chirurgie pour le modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes soit le dépôt d’une goutte de chlorure de benzalkonium pour le modèle de douleur oculaire inflammatoire. Ils seront ensuite passés en imagerie fonctionnelle ultrasonore puis les cerveaux seront prélevés. Deux modèles animaux seront utilisés dans ce projet : 1) Modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes Les animaux développant une sécheresse oculaire sont des modèles d’une maladie humaine. Elle sera induite chez l’animal par excision des glandes lacrymales. Il s’agit d’une douleur cornéenne difficile à soigner. Les animaux sham subiront la chirurgie sans excision et donc ne développeront pas la maladie. Les animaux « naïfs » ne subiront aucune chirurgie. La chirurgie se fait sous anesthésie générale avec une analgésie appliquée en pré-, per- et post-opératoire. La chirurgie ne se fait que sur un des deux yeux. Elle dure 15 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Les animaux seront suivis régulièrement après la chirurgie pour vérifier leur état général (poids) et l’état de la plaie. 2) Modèle de douleur oculaire inflammatoire par instillation du chlorure de benzalkonium Les animaux contrôles de ce modèle recevront une goutte deux fois par jour de tampon phosphate salin (solution neutre) dans l’œil droit durant 7 jours. Les animaux modèles recevront une goutte de chlorure de benzalkonium deux fois par jour dans l’œil droit durant 7 jours. Le dépôt de la goutte se fait sur un animal vigile en contention manuelle et le temps pour réaliser le dépôt et la contention de l’animal est de 20 secondes. Ces animaux modèles développeront une douleur oculaire. - IMAGERIE fUS : L’ensemble des animaux auront une session d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui durera 2h par animal et qui se fera sous anesthésie générale. L’ensemble des tests réalisés durant l’imagerie seront donc fait sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie.
Impact sur les animaux
- Dans le modèle de sécheresse oculaire, Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. La chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post-opératoire qui disparaitra en quelques jours. La douleur post-opératoire sera prise en charge par un traitement adapté. - L’instillation topique bi-quotidienne du chlorure de Benzalkonium durant 7 jours correspondent classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. C’est un conservateur. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritations : sensation de corps étranger, de picotement ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. - Imagerie fUS : l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal : température, fréquences cardiaques et respiratoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable. Notre projet de recherche porte sur les l’étude de réseaux neuronaux complexes présents dans un cerveau entier. Bien que ces questions soient posées pour aider à une meilleure compréhension des pathologies humaines et l’amélioration de leur traitement, une première étape nécessite l’utilisation de rongeurs.
Réduction
Nous utiliserons 260 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22+/-2 degrésCelsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour et 12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites (grille de suivi). Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin de mettre à mort l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié (chirurgie ou imagerie fonctionnelle ultrasonore fUS) présente une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement l’euthanasie de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique.
Choix des espèces
Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Ce projet de recherche portant sur la douleur oculaire nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines dont les circuits neuronaux sont établis. Les animaux arriverons donc à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 7 jours. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis.
Traitement de souris gestantes avec un activateur d’une voie de regulation de la production d’energie cellulaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
120 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Les femelles gestantes reçoivent une injection quotidienne pendant 28 jours, puis sont tuées à mi-gestation, leurs embryons et souriceaux étant tués pour étudier des malformations de la face et de l'intestin. Le projet, de recherche fondamentale, teste si un activateur d'une voie énergétique cellulaire limite ces malformations dans une lignée génétiquement modifiée. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de remplacer un modèle de gestation par un modèle in vitro et ne prévoit ni analgésie ni anesthésie.
Objectifs
Il existe dans la cellule des processus de régulation de la production d'energie. Nous avons montré que l'inactivation de l'une de ces voies dans les cellules à l'origine de la formation des os de la face et du système nerveux de l'intestin aboutissait à la naissance de souriceaux présentants de graves malformations de la face et de motrcité digestive. Dans notre modèle génétiquement modifié dans lequel une voie de production d'ernergie est inactivée, nous allons donner un traitement aux mères gestantes pour compenser cette voie et voir si nous parvenons à limiter les malformations à la naissance..
Bénéfices attendus
Les malformations associées aux defauts de développement que nous étudions sont à l'origine de maladies congénitales chez l'enfant qui se traduisent comme dans notre modèle par des malformations de la face et du système nerveux de l'intestin. Ce groupe de maladies s'appelle des neurocristopathies. Parmi les plus connues il y a le syndrome de Hirschsprung et celui de Waardenburg. D'autres malformations sont aussi concernées comme celles qui surviennent suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse ou la prise de médicaments dit tératogènes, c'est à dire qui peuvent induire des malformations du foetus lorsqu'ils sont pris en période de grossesse. Ce sont des maladies orphelines, pour lesquelles presque aucun traitement n'est disponible à ce jour. Les bénéfices attendus sont notamment une amélioration de nos connaissances sur le rôle des processus cellulaires de production d'ernergie et du métabolisme en général dans l'apparation de ces syndromes.
Procédures
Les femelles gestantes recevront une injection rapide (2 secondes) pendant 28 jours sur l'ensemble de la procedure.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables attendus sont liés à la manipulation et à l'injection quotidienne des femelles gestantes. Le produit est injecté à des souris dans de nombreux articles de la littérature sans qu'il soit mention d'effet indésirable de la molécule à la dose envisagée.
Devenir
Les femelles seront euthanasiées après la campagne de production d'embryon à E15.5, les sourceaux et les embryons seront euthanasiés pour étudier les malformations de leur tête et de leur inestin.
Remplacement
Il est impossible de remplacer un modèle de gestation par un modèle in vitro à notre connaissance. Les études in vivo sur le comportement des cellules en l'absence de notre gène régulateur d'intérêt et en présence du traitement, nous permettent de poser une hypothèse forte quant au résultat attendu :"Le traitement améliore nettemment les malformations de nos animaux malades "
Réduction
Nous organisons nos croisements d'animaux afin de maximiser les chances (1/4) d'obtenir des souriceaux au génotype d'interêt dans nos portées afin de limiter le nombre de femelles gestantes necessaires. En outre l'ordre des expérimentations est choisi pour minimiser le nombre de femelle ( les souriceaux sont produits avant la cohorte d'embryon)
Raffinement
Les femelles seront hébergées en groupe avec de l'enrichissement. Aucune analgésie ou anesthésie n'est necessaire et donc prévu pour ce projet. cependant, les gestations sont surveillées Bien que au regard de la litterature scientifique disponible et de notre expertise, nous n'attendons aucun problème spécifique sur le déroulement de la gestation, l'opérateur pourra interrompre la mise bas en cas de souffrance anormale pour une mise bas.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont de developpement de l'embryon est très proche de celui de l'Homme, En outre, nous avons déjà beaucoup de donnée dans nos modèles animaux. Les femelles et les mâles seront adultes et en age de ce reproduire.
Analyse des effets de monocytes modifiés sur la croissance de tumeurs chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 496 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales et de monocytes génétiquement modifiés, des séances d'imagerie sous anesthésie deux fois par semaine et développent des tumeurs sous-cutanées mesurées régulièrement. Le porteur indique qu'une partie des protocoles provoque une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et perte de poils, et que tous les animaux sont tués pour analyse des organes. Il revendique des résultats in vitro "très encourageants" en coculture 3D mais conclut au "besoin" de passer par la souris, et renvoie les retombées cliniques au conditionnel.
Objectifs
Le développement constant des immunothérapies contribue fortement à l’amélioration et au progrès liés au traitement des cancers. Nous développons des approches cherchant à mobiliser les cellules myéloïdes (la lignée des cellules myéloïdes est produite dans la moelle osseuse et donne naissance à plusieurs types de cellules sanguines dont les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques) pour stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale et ainsi contrôler le développement de la tumeur. Nous souhaitons modifier génétiquement les monocytes pour augmenter leur capacité à stimuler la réponse immunitaire et évaluer leur efficacité antitumorale dans des modèles de souris portant des tumeurs. Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous avons pour but 1) d’optimiser ce type de traitement en cherchant à déterminer quel est le devenir des monocytes modifiés in vivo (localisation, survie, état), 2) déterminer leur mode d’action contre les tumeurs et 3) leur capacité à modifier le microenvironnement tumoral qui est par nature inhibiteur du système immunitaire. Par la mise en place de différents modèles d’injection des cellules tumorales et des CAR monocytes, nous étudierons à la fois la capacité des CAR monocytes à contrôler directement la croissance tumorale en favorisant l’interaction entre les deux types de cellules mais aussi le recrutement des CAR monocytes au sein de la tumeur et leur action sur la progression tumorale en injectant les CAR monocytes de manière systémique. Nous pourrons distinguer donc si les CAR myéloides sont capables de passer d’un compartiment/organe à la tumeur via le système sanguin. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous voulons avant tout acquérir des connaissances importantes qui pourront ensuite être utilisées en clinique pour le traitement du cancer. Les possibilités de traitement d'une tumeur solide sont jusqu'à présent plutôt limitées et parfois moins efficaces. L'approche thérapeutique avec les CAR monocytes et autres monocytes génétiquement modifiés promet d'être plus efficace tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires et surtout de permettre le traitement de cancers qui étaient jusqu'à présent difficiles ou impossibles à traiter. En effet, nos approches pourraient permettre de réduire certaines toxicités liées à l’utilisation d’autres approches de l’immunothérapie comme des cellules CAR T (lymphocytes T modifiés génétiquement), telles que l’apparition d’une suractivation du système immunitaire appelée orage cytokinique. L'avantage des CAR monocytes est avant tout qu'ils seront recrutés plus facilement au sein de la tumeur et qu'ils peuvent ainsi interagir directement avec les cellules tumorales mais aussi avec les cellules immunitaires alentour. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer « du système immunitaire. Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.
Procédures
Pour évaluer la capacité des CAR myeloides à contrôler la croissance tumorale et en se basant sur des recherches publiées (Klichinsky et al, 2020), nous injecterons les cellules tumorales et les CAR monocytes directement dans l’abdomen des souris (voie intrapéritonéale) permettant de suivre via un système d’imagerie le contrôle de la croissance tumorale. Les cellules tumorales injectées exprimant la luciferase, de la luciferin sera injectée par voie intra-péritonéale (1,5mg par souris de 20g). Les souris seront anesthésiées avec de l’Isofluorane (entre 2,5 et 3%) puis imagées via IVIS. L’anesthésie aura une durée de 10 minutes. Les souris seront imagées 2 fois par semaine. Pour évaluer la localisation, la persistance et le recrutement des cellules utilisées comme traitement, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale, intraperitoneale ou intraveineuse. (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec). Pour évaluer l’effet du traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis les animaux seront traités 1 fois avec des CAR myeloides injectées par voie intraveineuse. Pour évaluer le traitement dans d’autres modèles de tumeurs, les cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inf à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale ou intraveineuse. Dans certaines expériences, nous utiliserons une chirurgie courte (20min) sous anesthésie (1h) pour implanter de manière orthotopique des cellules tumorales pancréatiques afin de mettre en place un modèle plus fidèle afin de valider notre thérapie cellulaire. Nous administrerons le traitement cellulaire par voie intraveineuse (durée du geste inf à 10 sec). Pour comprendre comment fonctionne notre traitement, les animaux seront injectés 1 fois avec les cellules tumorales par voie sous cutanée. Le traitement sera injectée 1 fois par voie intratumorale ou intraveineuse et les cellules effectrices 1 fois par voie intraveineuse (durée de chaque geste inf à 10 sec).
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires transplantées attaquent le corps du receveur, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Comme nous avons déjà réalisé ce type d’expérience dans notre laboratoire, nous pouvons bien nous préparer et nous connaissons les signes pour éviter la douleur et la souffrance. Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules par voie intraveineuse ou sous cutanée seront celles liées à l’injection.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo
Remplacement
Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet avec des monocytes modifiés ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroides qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet car il est important de considérer l'interaction des monocytes CAR avec les cellules tumorales dans un organisme entier et d’évaluer les éventuelles toxicités.
Réduction
En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les tumeurs sous-cutanées seront mesurées minimum 2 fois par semaine afin de s’assurer qu’elles ne dépassent pas la taille maximale entrainant le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. L'intervention chirurgicale est réalisée dans des conditions aussi stériles que possible et par un personnel spécialement formé à cet effet. Un traitement anti-douleur standardisé et un contrôle régulier des animaux après l'intervention sont effectués. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score définie pour le projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques ou des compléments alimentaires.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 6 semaines afin que les souris aient atteint la maturité sexuelle, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.