Procédures sévères

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs percent leur tube digestif sous anesthésie pour déverser les selles dans l'abdomen et provoquer une péritonite, puis suivent la défaillance cardiaque par échographie avant de prélever le cœur. Le porteur indique que l'infection peut provoquer stress, perte de poids et baisse de mobilité, et estime que garder ces souris en vie ne serait pas éthique vu la sévérité des procédures. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier le tissu cardiaque lui-même est "indispensable" et que ni les essais en tube à essai ni la modélisation informatique ne peuvent mimer l'infection de façon fiable, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à la souris.

Objectifs

Les infections sont des maladies extrêmement fréquentes et potentiellement graves. Dans leur forme la plus sévère (sepsis), l’inflammation provoquée par l’infection touche le corps entier et peut nuire au fonctionnement des différents organes, dont le cœur. Ce mauvais fonctionnement du cœur ne répond pas toujours au traitement par antibiotique. Il n’existe pas de traitement à ce jour qui traite spécifiquement l’inflammation responsable de la dysfonction du cœur au cours d’une infection sévère. Notre premier objectif est d’étudier cette dysfonction cardiaque induite par le sepsis. Pour cela, nous utiliserons un modèle d’infection sévère chez la souris. Les souris seront opérées sous anesthésie générale (elles seront endormies) afin de créer un petit trou dans leur tube digestif qui permettra aux selles de se déverser dans l’abdomen provoquant ainsi une infection appelée péritonite. Les souris ainsi infectées recoivent des anti-douleurs, et du liquide pour maintenir leur pression arterielle. Ce modèle a déjà été utilisé par plusieurs équipes et l’inflammation qu’il engendre provoque une dysfonction cardiaque similaire à celle observée chez l’homme. Nous pourrons ensuite caractériser le fonctionnement du cœur par échographie. Notre second objectif est d’étudier les paramètres de l’inflammation responsables de la dysfonction du cœur. Pour cela, les cœurs des souris infectées comme précédemment décrit seront prélevés et analysés après le décès de la souris et nous déterminerons quelles sont les protéines de l’inflammation qui sont exprimées à l’intérieur du cœur au cours de l’infection. Enfin, notre troisième objectif est de tester des traitements ciblant les protéines de l’inflammation qui auront été trouvées dans les cœurs des souris infectées. Nous injecterons aux souris infectées ces traitements par une piqure sous la peau et comparerons à des souris infectées traitées par placébo. Les points de comparaison reposeront sur l’analyse par échographie de la fonction du cœur et sur la survie des souris à l’infection.

Bénéfices attendus

Les infections sont très fréquentes en santé humaine et potentiellement graves avec un taux de décès élevé. Le décès peut être en lien avec des organes qui ne fonctionnent plus, dont le cœur, à cause de l’inflammation qui s’est propagée dans tout le corps et ce malgré un traitement antibiotique. A ce jour, aucun traitement spécifique n’existe pour soigner ce mauvais fonctionnement du cœur dû à l’infection. Notre travail permettra de mieux décrire cette dysfonction du cœur au cours de l’infection, de comprendre à quoi elle est due précisément et d’évaluer finement l’efficacité sur cette atteinte du coeur de traitements contre l’inflammation. En cas de résultats encourageants, notre étude ouvrira la porte à des études de ces traitements chez l’Homme

Procédures

Les souris sont opérées sous anesthésie générale. Elles sont endormies grâce à un gaz anesthésiant. La durée de la chirurgie est d’une dizaine de minutes. Une injection dans le ventre (intra-péritonéale) de médicament contre la douleur est réalisée avant la chirurgie et répétée toutes les 12 heures après pour les souris encore en vie. Dans la procédure qui teste les traitements, les souris les reçoivent soit par une injection dans le ventre soit par une prise orale, selon le mode de fonctionnement du médicament.

Impact sur les animaux

Les souris pourront ressentir une douleur après la chirurgie liée à l’ouverture du ventre. Celle-ci est prévenue par des médicaments contre la douleur qui sont systématiquement donnés. L’infection peut provoquer un stress, une perte de poids, une diminution ou augmentation de la température corporelle, une diminution de la mobilité des souris ou un défaut de leur toilettage. Les traitements seront administrés par injection dans le ventre ou sous la peau ou par la bouche. Les souris pourront ressentir un stress lié à la contention et une douleur liée à la piqûre.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure. En effet, il s’agit de procédures sévères, il ne serait donc pas éthique pour le bien être animal de les garder en vie.

Remplacement

L’étude de la fonction du cœur chez l’Homme au cours des infections sévères a été déjà réalisée de manière aussi complète que possible avec des analyses non-invasives. Cependant, pour aller plus loin dans la compréhension de ce phénomène, il est indispensable d’étudier le tissu du cœur en lui-même, or cela n’est pas possible chez l’Homme. Il n’existe pas à ce jour d’expérience dans les tubes à essais ou de modélisations sur l’ordinateur qui pourraient mimer l’infection de manière fiable car celle-ci a plusieurs causes et se propage dans tous le corps mettant donc en jeu des mécanismes complexes. De plus, il n’est pas éthique de tester des médicaments directement chez l’Homme. Ces raisons rendent nécessaire le recours à des modèles animaux.

Réduction

L’ensemble des études déjà réalisées sur le sujet dans le monde sera étudié avant de débuter les expérimentations animales. Ainsi, tous les traitements déjà essayés et non-efficaces ne le seront pas à nouveau ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Nous n’étudierons que les animaux mâles car il a été montré que la mauvaise fonction du cœur au cours de l’infection était plus fréquente chez eux. Ainsi, cela permettra de ne pas inclure des femelles qui pourraient ne pas présenter de dysfonction du cœur et donc ne pas être analysées dans la suite du travail. L’étude de la fonction du cœur se fait par échographie ce qui est non-invasif pour la souris. Ainsi, les échographies peuvent être répétées chez une même souris au cours du temps sans avoir besoin de la mise à mort ce qui permet également de réduire le nombre d’animaux. L’analyse de l’expression des protéines de l’inflammation dans le cœur lui-même est une technique performante qui détecte un grand nombre de protéines en utilisant un nombre très faible d’animaux. L’analyse préalable de ces protéines guidera les traitements qui seront ensuite testés : seuls les traitements dirigés contre les protéines exprimées dans le cœur des souris au cours de l’infection seront testés. Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentation. Un suivi quotidien sera réalisé avant le début de l’expérimentation puis toutes les six heures dès que celle-ci aura commencé. La chirurgie est réalisée sur une souris anesthésiée.. La douleur post opératoire est systématiquement prévenue par l’administration d’un médicament contre la douleur avant la chirurgie et au bout de 12 heures. Les souris seront mises à mort si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie toutes les heures dès le début de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection sévère chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Les souris utilisées seront des souris mâles car le mauvais fonctionnement du cœur au cours de l’infection sévère est plus fréquent chez les souris mâles. Ces souris seront des souris adultes de 8 à 12 semaines car nous nous intéressons à l’infection sévère chez les humains adultes

8 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une réaction inflammatoire est provoquée par une injection de sensibilisation puis une injection intradermique dans la voûte plantaire, entraînant un œdème douloureux de la patte et des difficultés d'appui. Le porteur indique cinq à sept examens d'imagerie sous anesthésie pour tester des composés contre l'eczéma de contact, la dermatite atopique ou le psoriasis. Toutes les souris sont euthanasiées en fin d'étude, le porteur décrivant l'imagerie sur animal vivant comme le moyen "incontournable" d'évaluer ces composés.

Objectifs

L’objectif du projet est de reproduire, chez la souris, un modèle d’hypersensibilité retardée survenant chez l’Homme correspondant à une réaction inflammatoire locale aigue, en vue de l’évaluation de composés pour le développement de traitements dans des pathologies inflammatoires de la peau. Le modèle de réponse d’hypersensibilité retardée est utilisé de manière standard en Immunologie car il permet d’évaluer la réponse immunitaire à l’injection ou au contact d’une molécule identifiée comme corps étranger par l’organisme. Ce modèle permet ainsi d’évaluer l’impact thérapeutique de composés permettant de réduire la réaction immunitaire inflammatoire consécutive à une seconde exposition avec ce même antigène. L’approche envisagée n’est pas spécifique d’une pathologie donnée mais plus tôt des voies mécanistiques conduisant à des pathologies liées à l’exacerbation de l’immunité locale chez le patient. Ce projet permet de caractériser les modifications de la réponse immunitaire induite par les composés testés. Il permet de caractériser leur cinétique de distribution et d’élimination dans l’organisme étudié (la souris), la cinétique d’action et l’efficacité de ces mêmes composés par imagerie non invasive, en vue de la sélection de candidats médicaments pour préparer leur évaluation chez l’Homme en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. A court terme ce projet permet d’identifier le potentiel thérapeutique de molécules ciblant la réaction inflammatoire locale aigüe en vue de développements de traitements dans l’eczéma de contact (crèmes métaux polluants), la dermatite atopique, le psoriasis arthritique... L’approche par imagerie permet de suivre les paramètres de distribution, d’élimination ; le mécanisme d’action du composé sur l’inhibition du système immunitaire et d’évaluer l’efficacité du traitement contre la réaction inflammatoire produite en permettant une investigation de plusieurs paramètres simultanés de façon non invasive et longitudinale sur les mêmes animaux. L’approche permet donc ainsi de diminuer le nombre d’animaux testés par rapport à une approche conventionnelle nécessitant des prélèvements de tissus répétés pour obtenir des informations équivalentes. A plus long terme, les données générées sur ce modèle permettront d’augmenter les connaissances scientifiques sur les processus immunologiques impliqués dans diverses pathologies inflammatoires humaines et feront l’objet de publications seront partagés avec la communauté scientifique. Les données générées permettront de sélectionner des composés et supporter leur évaluation en phase clinique pour contribuer à la constitution des dossiers d’autorisations de mise sur le marché de ces nouveaux médicaments. L’approche par imagerie permettra potentiellement d’envisager l’évaluation de méthodes comparables dans le diagnostic ou le suivi de pathologies inflammatoires chroniques ou un bénéfice/risque serait plus envisageable (Arthrites, syndrome de l’intestin irritable, maladie de Crohn…).

Procédures

Chaque animal reçoit deux injections de la molécule induisant la réponse inflammatoire. (Une première injection, dite de sensibilisation, à la molécule inflammatoire (antigène) complexée à un adjuvant est pratiquée dans la zone dorsale par voie sous cutanée. Cinq jours après, une injection intradermique de l’agent inflammatoire seul est pratiquée sous anesthésie dans la voute plantaire d’une patte postérieure. Les composés évalués pour leurs activité anti-inflammatoire dans le modèle, sont administrés par voie intraveineuse, ou intrapéritonéale, ou sous cutanée ou par voie orale. Les animaux sont injectés avec les agents de contraste d’imagerie par voie intraveineuse, ou intrapéritonéale ou sous-cutanée, et sont soumis aux examens d’imagerie.Chaque administration/injection de composé est réalisée environ en 1 minute. Ils sont anesthésiés à chaque prise d’image (5 à 7 examens d’imagerie par étude espacés sur 10 jours). Chaque prise d’image dure de 1 à 10 minutes maximum en fonction de la modalité d’imagerie mise en œuvre (nucléaire ou optique), et en fonction de la nature du traceur employé. Le volume de l’inflammation de la patte injectée sera mesuré au pied à coulisse sous anesthésie tout au long de l’étude. (Compter 1 minute pour la mesure). La durée de l’anesthésie est de 5 à 15 minutes en anesthésie gazeuse pour chaque prise de vue, de façon à permettre l’installation de l’animal dans l’appareil sous le champ de la caméra, la prise de vue et la mesure de l’œdème.

Impact sur les animaux

La première injection d’induction de sensibilisation à l’antigène permet de sensibiliser le système immunitaire de la souris pour lui permettre de reconnaitre la molécule étrangère. Le complexe étant visqueux l’injection sous-cutanée s’effectue en deux points sous anesthésie gazeuse pour limiter les effets de volume et l’irritation. Cinq jours après, l’injection du même antigène que celui utilisé pour la sensibilisation (sans adjuvant) est pratiquée par voie intradermique dans la voute plantaire d’une des pattes postérieures, sous anesthésie gazeuse. L’antigène sera reconnu par le système immunitaire de la souris sensibilisée qui réagira en développant une réaction inflammatoire jusqu’à l’apparition d’un œdème au site de la seconde injection dans les 24 heures. La phase aigüe de l’inflammation est maximale à 24h, elle se traduit par un gonflement et une rougeur du pied qui diminue spontanément dans le temps. L’inflammation génère une certaine douleur qui peut conduire à des difficultés d’appuis ou de locomotion de façon transitoire. Les injections de produits testés ou d’agents d’imagerie, ainsi que et des prélèvements sanguins répétés peuvent provoquer un inconfort léger à modéré et de courte durée.

Devenir

Les souris sont euthanasiées en fin d’étude. Le sang et organes d’intérêt peuvent être prélevés pour analyses. Si les points limites sont atteints en cours d’étude, les souris sont euthanasiées pour raison éthique de façon anticipée.

Remplacement

Les études d’imagerie permettent de documenter le devenir du composé testé dans le corps d’un animal vivant et de valider les propriétés thérapeutiques des composés à l’échelle du corps entier, pour préparer le protocole d’évaluation des composés sélectionnés dans les phases cliniques en vue de l’obtention de l’autorisation de mise sur le marché d’un nouveau traitement chez l’homme. Actuellement, l’utilisation d’animaux vivants reste le moyen incontournable de montrer les relations pharmacocinétique-pharmacodynamie, le devenir (bio distribution), la tolérance et l’efficacité du candidat médicament dans un organisme complexe car, aucune méthode substitutive fiable d’évaluation in vitro ou in silico d’une molécule ne permet de répondre à toutes les interactions in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est préalablement basé sur les publications scientifiques. Ensuite, sur la base des données historiques expérimentales, un biostatisticien est consulté pour optimiser le nombre d’animaux à utiliser en fonction de l’objectif et du design de l’étude (nombre de groupes d’animaux, type de comparaisons et répétitions), du nombre et de la variabilité des paramètres mesurés, de la modalité d’imagerie mise en œuvre, et de l’importance des effets à mettre en évidence. Les méthodologies statistiques sont appliquées pour proposer une analyse des données appropriée afin de mener les études pour répondre à l’objectif fixé en réduisant au maximum les biais expérimentaux avec un minimum d’animaux. Les techniques d’imagerie permettent l’étude longitudinale des paramètres reflétant l’impact du produit testé sur la réponse inflammatoire induite pour chaque animal, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études par rapport aux études traditionnelles.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe de 4 à 5 par cage et un enrichissement spécifique est donné aux souris : un abri en carton, une litière en cellulose standardisée et douce type « Alpha dri ® » est utilisée pour faciliter la locomotion, de la nourriture et un gel hydratant sont apportés en supplément directement dans la cage dès le démarrage de l’étude. - Les anesthésies gazeuses sont employées : lors des injections sous cutanées du complexe antigène/ adjuvant (2 x 50µl en sous cutané) pour tenir compte de la viscosité importante du complexe, lors des injections intradermiques dans la voute plantaire, lors de la mesure de l’œdème inflammatoire au pied à coulisse permettant de limiter la douleur générée par la pression exercée sur le site inflammé. - Les sessions d’imagerie s’effectuent sous anesthésie gazeuse (ou fixe) pour garder l’animal immobile et sans stress le temps de la prise d’image. Les autres examens complémentaires sont réalisés juste avant ou immédiatement à la suite des prises d’images pour bénéficier de cette anesthésie. Après chaque anesthésie, Les animaux sont suivis jusqu’au réveil en armoire ventilée chauffante ou chauffé à 23°C pour optimiser les conditions de réveil. - Le recours à l’imagerie pour l’évaluation de la bio distribution des composés testés et l’évaluation de l’impact du traitement sur la réponse inflammatoire à l’aide de biomarqueurs d’imagerie constituent un raffinement en soi puisqu’il permet de générer des informations spécifiques de la réponse au traitement de façon non invasive tout au long de l’étude, de façon répétée sur les mêmes animaux, en limitant le recours à des prélèvements de tissus à intervalles réguliers nécessaires sans cela. - A ce jour, le modèle de référence est le modèle proposé. Selon les résultats obtenus, on pourra ensuite tenter de raffiner le modèle en utilisant des adjuvants moins réactifs ou une autre voie d’injection pour atténuer les effets secondaires, mais en conservant la réponse immunitaire équivalente dans son mécanisme d’action. L’apparition de trois signes cliniques notables (dos vouté, déshydratation, blessure, abcédation au point d’injection dorsale, stéréotypies, pelade…), ou d’un seul signe clinique sévère (perte de poids ≥ 20%, ou ≥ 15% 3 jours de suite, automutilation, plaie, infection, nécrose) entraine l’arrêt anticipé de tout ou partie de l’étude en accord avec le directeur d’étude et le vétérinaire responsable.

Choix des espèces

Le modèle d’hypersensibilité retardée chez la souris est documenté et décrit dans la littérature est standardisé et largement utilisé. Ce modèle fait appel à une réponse cellulaire inflammatoire cutanée dont le mécanisme est comparable à celle qui se développe chez l’Homme au contact d’agents inflammatoires. Par ailleurs, la facilité d’utilisation, la compatibilité avec les méthodes d’imagerie non invasives nucléaires et optiques, la compatibilité avec l’étude des composés sur des effectifs relevant d’un point de vue statistique, la disponibilité des modèles humanisés exprimant les cibles thérapeutiques d’intérêt, et de souris transgéniques exprimant un reporteur d’imagerie d’intérêt, et la faible variabilité de réponse attendue d’un animal à l’autre par rapport à d’autres espèces permettent de tester plus de traitements et de sélectionner ceux qui génèrent des effets plus robustes et reproductibles sont autant d’avantages qui nous ont conduit à choisir la souris comme modèle. Les souris adultes sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge.

3 600 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent la pose d'un cathéter intra-urétral pour une infection à Escherichia coli, un gavage quotidien de mycotoxines pendant 28 jours et des prélèvements sanguins par coupe de la queue. Le porteur indique que l'infection provoque un inconfort et une douleur aiguë, que le prélèvement à la queue engendre une douleur, et fixe un point limite de mise à mort à 15 % de perte de poids. Toutes les souris sont euthanasiées pour prélever les tissus, le porteur décrivant le recours à l'animal comme "irremplaçable" pour évaluer l'effet du stress et de l'alimentation sur ces infections.

Objectifs

De nombreux facteurs ont été décrits comme participant à la genèse ou à la sévérité des IVU chez l'Homme ou comme facteurs facilitateurs de la mise en place de ces maladies chroniques. Parmi ces facteurs environnementaux, des études épidémiologiques placent le stress comme l'un des facteurs majeurs impliqués dans la régulation de l'immunité et de la sévérité de ces maladies. D'autre part, de nombreux contaminants alimentaires, retrouvés régulièrement dans notre alimentation sont excrétés dans les urines et peuvent réguler la production ou l'action des toxines bactériennes. L'objectif de notre projet est d'étudier le rôles des stress : lié à notre alimentation (contaminants alimentaires) ou à notre mode de vie (stress psychologique, anxiété) et comment ils influencent la survenue ou sévérité de ces pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à mieux comprendre le processus de développement des IVUs et des effets à long terme sur la physiopathologie de cette affection en réponses à des stress. Ces travaux nous permettront d'appréhender une meilleure compréhension du rôle du stress (anxiété) et de la nourriture dans la physiopathologie de ces maladies et pourront apporter de nouvelles pistes pour développer de nouveaux traitements d'anti-virulence et atténuer leur effet dans la survenue et l'étiologie de cette pathologie.

Procédures

Prise de poids des animaux : fréquence 3 fois, durée 1 minute - Insertion d'un catheter par voie intra-urétrale : fréquence 2 fois sous anesthésie isoflurane injection de 50µL, durée 2 minutes - Prélèvement d'urine avant la fin de l'expérimentation en maintenant la souris vigile au-dessus d'un tube, Fréquence: 3 fois, durée 1 minute. Prélèvement de fecès: quotidien pendant la durée de l'expérimentation sur animal vigile (prélèvement directement à l'anus d'une crotte/animal), durée 1 minute. Prélèvement de sang à la queue: - fréquence 1 fois unique, 30µL seront prélevés à la queue. - fréquence 2 fois à J3 et J6, 30µL seront prélevés à la queue pour analyser la translocation bactérienne, durée 5 minutes. Gavage oral: fréquence 1 fois par jour pendant 28 jours 100µL, durée 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les traitements avec les contaminants alimentaires que sont les mycotoxines ne sont pas connus pour induire de la douleur. Le stress de contention n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Les infections urinaires avec des souches pathogènes de Escherichia coli (UPEC) sont connues pour induire un inconfort au niveau de l'aine et l'observation de douleur aigue. La grille d’évaluation comprendra les points suivants : - Qualité du poil (lisse/hérissé ; propre/sale) - Pertes de poids (supérieure ou pas à 15%) - Prostration : nous mettrons le rongeur sur la main de l’expérimentateur (mesure de la vivacité : curieux (redresse la tête, sens en alerte)/prostré (mise en boule, recroquevillé) ; mesure de la mobilité : mouvement exploratoire se déplaçant sur la main/ pas de mouvement) - Comportement alimentaire perturbé : présence de déchet alimentaire dans la cage, poids de l’aliment restant traduisant une perte de la prise alimentaire, prise hydrique traduisant une déshydratation - Mouvement dans la cage (sociabilité, exploration de l’environnement) - Observation des selles : normales, molles, présence de diarrhées avec ou sans sang, fréquence des diarrhées et durée (épisodique, courante, en continue) Si un point limite est atteint alors la procédure s'arrêtera et l'animal sera mis à mort et autopsié. L'insertion du catheter par voie intra-urétrale peut provoquer une gêne et une douleur pour l'animal au moment de l'infection. Celle-ci sera réduite par l'utilisation de vaseline pour faciliter l'entrée du catheter. Les animaux seront pesés avant et pendant la procédure. Si une perte de poids supérieure à 15% est observée, l'animal sera alors sorti du protocole expérimental et euthanasié. Le prélèvement de sang par coupe de la queue engendre une douleur. Pour y pallier, une analgésie locale avec du Sedorectal (médicament à usage vétérinaire) de contact pour désensibiliser le bout de la queue sera réalisée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu des expérimentations afin de prélever les tissus qui seront analysés.

Remplacement

Des études in vitro ont été préalablement conduites sur des cellules en culture permettant d'élucider comment agissent les toxines produites par les UPEC sur les cellules eucaryotes. le recours à l'animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d'évaluer les répercussions des stress psychologique et nutritionnel sur la survenue et la sévérité des IVU. une veille scientifique sera mise en oeuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l'expérimentation animale dans le domaine et afin de ne pas reproduire des études déjà menées.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=10 animaux/groupe). Afin d'obtenir des résultats relevants et statistiquement interprétables, nous prévoyons un nombre similaire d'animaux par groupe dans ce projet. Un calcul de test de puissance statistique (Erreur type I = 0.05) effectué à partir d'expérimentations précédentes conduite sur le même format (expérimentation d'infection urinaire avec plusieurs souches UPEC) a mis en évidence qu'un nombre de 10 souris par groupe est nécessaire pour mettre en évidence une modulation significative des scores cliniques. L'utilisation de l’IVIS (in vivo imaging system), un système d’imagerie tomographique sur animal vigile permettra de visualiser des marqueurs fluorescents ou bioluminescent, dans notre cas des bactéries, dans les différents organes de la souris (vessie, rein, …) sur des animaux vivants endormis à l’isoflurane. Une bonne corrélation entre le signal de bioluminescence et le nombre de bactéries retrouvées dans les organes par analyse microbiologique a été établi dans des expériences précédentes. Cet outil nous permettra de suivre le niveau d’infection des souris de manière longitudinale sans les euthanasier, nous permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives. Le bien-être de l'animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Il y aura une pesée avant le début de l'expérimentation et à des temps définis après le début de l'expérience afin de s'assurer d'une perte de poids inférieure à 15%. Nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et mettrons en place une grille d'évaluation. La grille d'évaluation comprendra les points suivants : - qualité du poil (lisse/hérissé; propre/sale) - pertes de poids (supérieure ou pas à 15%) - prostration : l'animal sera mis sur la main de l'expérimentateur (mesure de la vivacité: curieux (redresse la tête, sens en alerte) / prostré (mise en boule, recroquevillé); mesure de la mobilité: mouvement exploratoire se déplaçant sur la main / pas de mouvement) - comportement alimentaire perturbé : présence de déchet alimentaire dans la cage, poids de l'aliment restant traduisant une perte de la prise alimentaire, prise hydrique traduisant une déshydratation - mouvement dans la cage (sociabilité, exploration de l'environnement) - observation des selles : normales, molles, présence de diarrhées avec ou sans sang, fréquence des diarrhées et durée (épisodique, courante, en continue). Si un point limite est atteint alors la procédure s'arrêtera et l'animal sera mis à mort et autopsié. Les animaux seront hébergés en présence d'un enrichissement (même quantité de coton dans toutes les cages). Le prélèvement de fèces ou d'urine sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Une habituation à la contention sera réalisée avant les prélèvements.

Choix des espèces

la souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous utiliserons des souris femelles car les IVU touchent 30 fois plus de femmes que les hommes. Nous travaillerons sur des animaux jeunes adultes post-sevrage entre 4 et 7 semaines en début d'expérimentation.

250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit la section d'un nerf de la patte avec une perte de sept millimètres, réparée par un greffon, puis des injections, des tests locomoteurs hebdomadaires pendant douze semaines et une électrophysiologie terminale sous anesthésie, pour évaluer des vésicules issues de cellules souches olfactives humaines. Le porteur reconnaît que la lésion nerveuse entraîne des déficits sensorimoteurs et peut conduire à de l'automutilation, tout en affirmant que cette chirurgie n'entraîne pas de perte de poids. Il n'utilise que des mâles pour éviter la variabilité hormonale et conclut que le recours au mammifère est "absolument indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de vésicules extracellulaires issues de cellules souches de la muqueuse olfactive dans la réparation nerveuse périphérique. Il s’agira d’étudier chez le rat Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après lésion du nerf péronier (transsection) avec perte de substance de 7 mm, à réparer le nerf à l’aide d’un manchon veineux (segment de veine sous cutanée) dans lequel ont été injectées des vésicules extracellulaires fraiches ou cryopréservées. L’objectif principal étant d’améliorer la repousse des axones sensitifs et moteurs afin de conduire à une récupération sensori-motrice la plus complète possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subit des dommages nerveux périphériques (plaies, coupures, sections…) avec perte de substance nerveuse suffisante pour ne permettre la suture bout-à-bout des manchons nerveux. L'évaluation qui portera sur la récupération locomotrice et l’activité electrophysiologique (réflexe H) sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.

Bénéfices attendus

Les vésicules extracellulaires dérivées des cellules souches olfactives humaines apparaissent comme une alternative prometteuse et innovante pour réparer les nerfs périphériques. En effet, ces vésicules ont des effets similaires à ceux de leurs cellules mères et bénéficient d'opportunités uniques telles que la disponibilité immédiate, la faible immunogénicité et l’absence de différenciation anarchique. Notre étude pré-clinique vise à tester l’efficacité thérapeutique de ces vésicules sur la régénérescence nerveuses périphériques en vue de proposer une thérapie cellulaire innovante transférable à l’Homme. Dans le domaine de la réparation nerveuse périphérique, l’extrapolation des résultats des études précliniques in vitro et in vivo à l’Homme échoue dans la grande majorité des cas et moins de 10% des substances testées en essais cliniques aboutissent à la mise sur le marché d’un médicament. Notre étude représente donc une étape très importante avant un transfert vers la clinique humaine.

Procédures

1) Chirurgie initiale lésionnelle (lésion nerveuse périphérique) et réparatrice (insertion d'un machon veineux ou nerveux) (tous les groupes expérimentaux) + implantation d'une mini-pompe osmotique (uniquement pour 3 groupes expérimentaux / 10) réalisée sous anesthésie : durée 1h. 2) Injections intramusculaires de vésicules (uniquement pour 3 groupes expérimentaux / 10) réalisée sous anesthésie : 1 injection par semaine pendant 4 semaines : durée 5 min. 3) Tests comportementaux (tous les groupes expérimentaux) réalisés en condition éveillée 1 fois par semaine pendant 12 semaines : durée 20 min. 5) Electrophysiologie terminale (tous les groupes expérimentaux) réalisée sous anesthésie et sans réveil : durée 1h.

Impact sur les animaux

La lésion nerveuse périphérique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels. Les nuissances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs post-traumatiques ou liées aux injections intramusculaires, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux. Il faut également noter que les lésions nerveuses périphériques peuvent conduire à de l’autophagie. Toutefois, l’expérience montre que ce type de chirurgie n’entraîne pas de perte de poids, de problème de miction, de déshydratation ou une dénutrition post-chirurgicale.

Devenir

A l'issu du projet, tous les animaux seront euthanisés afin de prélever les nerfs et les muscles pour une étude anatomo-histologique.

Remplacement

Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en oeuvre après une section du nerf avec perte de subtance sont proches de celui de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Les études in vivo n’utilisant pas des mammifères ou celles in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise à proposer une stratégie innovante de réparation nerveuse périphérique directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération post-traumatique nerveuse périphérique.

Réduction

Afin de mener à bien notre projet, nous devons constituer 10 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g lors de la chirurgie initiale. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques paramétriques, nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 animaux, soit un total de 250 animaux. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous enrolerons, dans un premier temps, 5 animaux par groupe, soit un total de 50 animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, d’une puissance de 80% et d’un seuil de significativité de 5%, avec un test statistique approprié, les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre les groupes traités et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement, nous réviserons nos objectifs initiaux et réduirons les groupes expérimentaux afin de privilégier les modes d’administration les plus favorables. Si, malgré la réduction du nombre de groupes, aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et concluerons à l’inéfficacité du traitement thérapeutique.

Raffinement

Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique, ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne de l’état de santé des animaux et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures detinées à réduire la douleur et le stress. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés selon la procédure réservée aux animaux éveillés. Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénaires. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénaires dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire dont la température des locaux est aux environs de 22°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h. Nous nous efforçerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, et des soins et des gestes adaptés, avec notamment, pour ces derniers, une diminution de l’angoisse et du stress des animaux par manipulation avant, pendant et après tout prélèvement, intervention et test comportemental.

Choix des espèces

Les mécanismes neurobiologiques mis en oeuvre chez les mammifères après une section du nerf avec perte de subtance sont proches de celui de l’humain. C'est pour cette raison que nous avons choisi d'étudier ces mécanismes chez les rongeurs (rats). Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes. C'est pour cette raison que nous utiliserons des animaux de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ.

11 cochons vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit l'ouverture de la cage thoracique et la résection partielle d'un lobe pulmonaire pour y poser un renfort de suture à base d'alginate, puis des passages au scanner sous anesthésie jusqu'à neuf mois après l'opération avant sa mise à mort pour prélever le poumon. Le porteur indique que l'ouverture du thorax peut placer l'animal en détresse respiratoire et que la chirurgie est potentiellement douloureuse. Il présente le projet comme une preuve de concept pour un dispositif hémostatique et met en avant qu'il serait fabriqué en France, à la différence des produits concurrents.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Cependant, il doit présenter quelques caractéristiques, parmi lesquelles : 1/maintenir la plaie en milieu humide et chaud, 2/être modifié selon les stades de cicatrisation, 3/ être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, 4/absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, 5/ ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, 6/ ne pas être toxique et être hypoallergénique, 7/ protéger des chocs, 8/ être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, 9/ être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées mais très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies par rupture de petits vaisseaux dits « capillaires » qui induit un saignement continu et étendu, le chirurgien utilise des hémostatiques chirurgicaux résorbables comme traitement. Ces dispositifs médicaux sont des produits de synthèse ayant des temps de résorption longs. Nous souhaitons tester un produit naturel dont le temps de résorption devrait être plus court que ses concurrents. Son enrichissement (calcium, zinc et magnésium) permet des échanges ioniques avec la plaie et favorise l'activation des réactions en cascade de la coagulation. Le dispositif médical est un renfort de la suture dans l’utilisation d’un système d’agrafage de type GIA® et dont la résorption sera suivie à différents temps par imagerie scanner. L’objectif de cette procédure est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale, de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé ainsi que des zones proches à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de dispositif médical hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements liés au renfort de suture par agrafage en cours de chirurgie. De plus, nous disposerions d’un produit fabriqué en France, ce qui n’est pas le cas des autres dispositifs (Etats-Unis, Japon). La biocompatibilité de ce dispositif médical a été testée en in vitro.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de pansement) pour le renfort d’un système d’agrafage sur la résection d’un tissu (lobectomie pulmonaire partielle) mais aussi de suivre la résorption du produit et les adhérences possibles dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) en tant que renfort de suture.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour permettre l’accès au poumon tout en préservant les autres organes dans les cavités respectives. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès à l’organe, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutané). L’animal n’aura qu’une seule intervention chirurgicale. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Quelques minutes au total Retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie après entrainement médical: 5 minutes. A différents temps post-opératoires, l’animal aura une imagerie pour évaluer le taux de résorption: transport anesthésie acquisition environs 2h à chaque fois. Pour l’hébergement à long terme, les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés régulièrement. Cet acte ne dure que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Lors de l’ouverture de la cage thoracique, il y aura une rupture du vide pleural qui se situe entre le poumon et la plèvre recouvrant la cage thoracique. Ce vide est essentiel pour permettre au poumon de se gonfler et dégonfler. Si le vide est rompu, le poumon ne peut pas se gonfler correctement lors de l’inspiration et place l’individu en détresse respiratoire. Pour éviter cette complication, l’incision sera refermée plan par plan et hermétiquement. Ensuite, à l’aide d’un cathéter et d’une seringue, l’excédent d’air sera aspiré de la cage thoracique en même temps que la remise progressive du poumon sous ventilation. La procédure sera potentiellement douloureuse pour l’animal en post-opératoire, et la procédure analgésique systématique sera adaptée à chaque animal selon le suivi de l'état clinique. Au bout de 3 semaines, les animaux déclarés aptes au transport partiront pour une autre structure qui assurera l’hébergement de longue durée. A différents temps post-opératoire, l’animal sera transféré vers un centre d’imagerie pour passer au scanner. Le transport entre les différentes structures va générer du stress dû à l’arrivée dans un nouvel environnement. De plus, les différentes contention pour réaliser les pesées et les gestes techniques pour faire l’anesthésie de la chirurgie et de l’imagerie ainsi que la mise à mort peuvent générer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort soit parce qu’ils auront atteint un point limite ou qu’ils ont atteint le temps d’observation (J+6 mois, J+7,5 mois, J+9 mois). Une étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée donc cela nécessite le prélèvement de l’organe.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements lors de résection de tissu en cours de chirurgie. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

Nous utiliserons 11 animaux au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes. Il y a 2 animaux supplémentaires prévus pour compléter un groupe si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Étant donné que c’est une preuve de concept, nous n’avons pas besoin de plus 3 animaux par lot pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et nécessite une intervention chirurgicale pour l’arrêter, nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé et raffiné la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux mise à mort, issus de procédures antérieures.

Raffinement

Initialement l’intervention était prévue en thoracoscopie (sous coelioscopie), ce qui ne nécessite que 3 incisions restreintes(caméra & 2 instruments). La forme de la cage thoracique est trop étroite pour travailler avec les pinces et le système d’agrafage sans risquer de provoquer des lésions des tissus environnants. La chirurgie ouverte a été retenue, avec un abord le long des côtes au niveau du 9ème espace intercostal. L’animal sera injecté avec un analgésique d'action longue (anti-douleur) pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique. Après intubation, l’animal est placé sous ventilation avec un anesthésique gazeux et sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. L’extrémité du lobe pulmonaire extériorisée permettra la mise en place de part et d’autre, des mors du système d’agrafage équipés du renfort. Cette résection volontairement limitée, n’empêche pas le poumon de fonctionner correctement par la suite et n'impacte pas significativement la respiration de l'animal au réveil. La plaie sera protégée à l’aide d’un pansement. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous surveillance jusqu’à son réveil complet. L’animal avec les couvertures polaires sera remis dans l’enclos et recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans l’enclos des légumes frais, plus appétents, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en postopératoire. L’état général de l’animal et de la cicatrice seront suivis quotidiennement pendant 1 semaine, puis toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Les animaux seront hébergés collectivement mais s’il est seul, il aura un contact visuel et/ou olfactif avec d’autres congénères et bénéficiera d’un renforcement de l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter rapidement toutes complications. Ces dernières seront reportées auprès du vétérinaire de la structure qui mettra en place le traitement adapté. La surveillance sera renforcée le temps nécessaire. Pour obtenir la complète collaboration des animaux sur un hébergement à long terme, des techniques de renforcement positif seront mises en place.

Choix des espèces

Toute étude en vue du marquage CE d’un dispositif médical existant sous plusieurs formats doit être réalisée sur le format de taille maximale, correspondant ici à un dispositif de 8 cm. Il n’existe que 2 espèces animales sur lesquelles nous pouvons trouver un poumon capable d’accepter un dispositif de cette taille, le porc et le mouton. Les études initiales pour le dispositif actuellement commercialisé ayant été réalisées sur le porc, nous avons donc retenu cette espèce pour ce projet. Le modèle lapin utilisé dans le cadre d’autres projets semblables ne peut être utilisé pour ce projet car la taille du poumon ne permet pas de faire la résection nécessaire, sous peine d'handicaper gravement l'animal en post-opératoire. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Il s'agit de jeunes animaux de trois à quatre mois.

3 696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'une tumeur, l'administration de virus oncolytiques et de chimiothérapies ou d'anticorps jusqu'à cinq fois par semaine pendant trois semaines, jusqu'à huit prélèvements sanguins et autant de séances d'imagerie sous anesthésie, pour tester des combinaisons antitumorales sur cinq modèles de cancer. Le porteur indique que les injections répétées, la chirurgie et l'anesthésie peuvent provoquer douleur, perte de poids, ulcérations et parfois la mort de l'animal. Les retombées pour les patients, une meilleure prise en charge et un allongement de la survie, sont renvoyées au conditionnel et au long terme, tandis qu'il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces réponses et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Selon l'OMS pas moins de 15 millions de décès sont dus au cancer dans le monde chaque année soit presque 1 décès toutes les 2 secondes. Bien qu'il y ait eu de grands progrès dans la mise au point de médicaments contre le cancer, la recherche pour la mise au point de médicaments plus performants permettant de prolonger la durée de vie des patients atteints de cancer reste plus que jamais une urgence. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’activité anti-tumorale de nos virus oncolytiques chez la souris. Les virus oncolytiques étudiés auront été modifiés et sélectionnés pour leurs propriétés anti-tumorales vis-à-vis des tumeurs dans des tests cellulaires adaptés. Les cancers du pancréas, de la vessie, de l’ovaire et les métastases hépatiques d’origine colique font partie des cancers majeurs en France. Le but du projet est d’évaluer sur cinq modèles orthotopiques murins de cancer l’activité anti-tumorale combinée de substances anti tumorales (chimiothérapies ou anticorps) et de virus oncolytiques exprimant différents gènes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les progrès scientifiques de ces dernières années sur la compréhension de la croissance tumorale ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. La mise au point de ces nouveaux médicaments n’est possible qu’en passant par des modèles animaux adaptés. Les bénéfices portent sur la mise au point des traitements plus efficaces dans le cas de cancers chez l’homme. A court du terme, ces bénéfices porteront sur l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de cancer et à long terme sur l’allongement de la survie des patients.

Procédures

Dans ce projet les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Procédures chirurgicales sous anesthésie et analgésie pour induction d’un modèle de cancer adapté pour l’étude (durée d’environ 30 à 40 minutes), Administration du ou des candidats médicaments sur animal vigile ou anesthésié (5 fois maximum par semaine pendant 3 semaines, durée de quelques secondes) avec un mimimum de 3 heures entre chaque substance. Prélèvements de sang effectués au maximum 8 fois et espacés d'une semaine (durée 2 minutes maximum). La technique d’imagerie de fera sous anesthésie gazeuse (maximum 8 fois espacées de 3 jours minimum, durée d’environ 10 à 15 min).

Impact sur les animaux

Malgré toute l’attention portée aux évaluations in vitro, nous ne pouvons pas exclure la survenue d’effet secondaire des médicaments. Ils peuvent survenir sous la forme d’une perte de poids, des troubles gastro-intestinaux ou des troubles du comportement. Les injections répétées peuvent être une source de stress et de douleur pour l’animal. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. De plus, l’acte chirurgical peut induire une hémorragie et le recourt aux anesthésies peut poser des problèmes cardio-respiratoires et entrainer la mort de l’animal. Enfin, les micro-prélèvements de sang sont réalisés dans la veine caudale latérale, à l’extrémité de la queue, sur les animaux vigiles et non contraints. Ces prélèvements (maximum 8 espacés d'une semaine), d’une durée de 1 à 2 min, provoquent une douleur transitoire et peuvent être stressants pour quelques animaux qui sont libres de manifester leur impatience ou inconfort. De plus, même si cela n’a jamais été observé, et en dépit des précautions prises, il reste possible qu’une inflammation locale apparaisse ou qu’une nécrose des tissus et/ou une infection se développent.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude pour le prélèvement de tissus. En raison des modèles et de l’utilisation de virus oncolytiques, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

L’étude de l’activité anti-tumorale d’un virus candidat médicament nécessite l’utilisation d’un modèle intégré faisant intervenir la pharmacocinétique et la biodistribution des chimiothérapies et des virus. Il n’existe pas de modèle in vitro tenant compte des réponses vis à vis des virus oncolytiques et des chimiothérapies dans différents tissus et tumeurs solides. Le modèle immuno compétent nous permettra, par la suite, de tester l’efficacité du virus dans des modèles où le système immunitaire n’est pas altéré. Le modèle immunodéficient permet de tester l’efficacité du virus sur les tumeurs humaines.

Réduction

La réalisation de ces procédures par un technicien rompu à ces manipulations, et la standardisation du protocole garantissent une bonne reproductibilité et permet de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe est choisi selon des contraintes statistiques et des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues. L’expérience pourra être répétée afin de valider les résultats obtenus. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, cette expérience de validation se concentrera uniquement sur les virus dont la réponse est statistiquement différente du groupe contrôle. Cette deuxième expérience, avec des effectifs adaptés, sera conçue en concertation avec notre service biostatistique. Il est prévu l’utilisation de 3696 souris pour l’évaluation dans 5 modèles orthotopiques, avec 6 virus et 2 substances à activité anti-tumorale par procédure.

Raffinement

Seuls les virus oncolytiques +/- substances à activité anti-tumorale présentant le meilleur rapport efficacité/non toxicité in vitro seront étudiés in vivo. Seuls les virus ne risquant pas d’induire une souffrance chez l’animal seront testés dans ce projet. Durant l’étude in vivo, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement (coton ou papier kraft) du milieu est prévu dans chaque cage avec eau et nourriture ad libitum. Nous veillons à limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, en surveillant l’apparition d'éventuels effets secondaires occasionnés par les traitements et en appliquant le cas échéant des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux. Des points limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance. Lors de la chirurgie, les animaux seront sous anesthésies locale et générale et sous analgésie. L’analgésie sera poursuivie 24h après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. Des souris immuno compétentes et immuno déficientes seront utilisées. Animaux âgés entre 6 et 9 semaines lors de l’injection des cellules tumorales (avec un âge plus avancé il y a un risque de prise tumorale moins homogène).

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'un modèle de myopathie centronucléaire, elles présentent une faiblesse musculaire et cardiaque et subissent des tests de force et de coordination (suspension, agrippement, rotarod), des mesures de contraction musculaire sous anesthésie et des échographies cardiaques. Le porteur indique que la maladie réduit la taille et le poids des animaux dès six semaines et que le phénotype cardiaque deviendrait sévère s'ils étaient maintenus en vie. Il présente la souris comme la "seule espèce" assez proche de l'humain pour ces expériences.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires (CNM) sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints. Aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Récemment dans la littérature, il a été décrit que le gène X, présent au niveau du muscle et du coeur et codant pour une protéine X jouant un rôle clé dans la contraction musculaire, a été identifié comme étant responsable de certains cas de myopathies centronucléaires. Il a été montré également qu’une diminution de la quantité de la protéine Y améliore les signes cliniques musculaires chez la souris ayant un déficit en protéine X (X-déficiente). Cependant, l’amélioration de l’espérance de vie et des signes cliniques cardiaques restent limitée chez ces souris. L’objectif du projet consiste à valider une preuve de concept selon laquelle une augmentation de l'expression d’une autre protéine, protéine Z, pourrait restaurer les signes cliniques cardiaques de la souris Xdéficiente. Cette stratégie de thérapie où la surexpression d’une protéine peut compenser les effets négatifs liés à une mutation d’une autre protéine a déjà montré son efficacité dans la littérature. Pour vérifier notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des croisements génétiques de souris afin d'obtenir des souris déficientes en protéine X et surexprimant la protéine Z humaine. Si une amélioration des signes musculaires et cardiaques ainsi qu’une augmentation de l’espérance de vie sont observées, la mise en place d’une thérapie génique sera conduite par la suite dans le modèle de souris X-déficiente.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène X

Procédures

Concernant les tests liés au phénotype musculaire : - Test de suspension : Mesure de la force du corps. -Test d’agrippement : Mesure de la force des pattes -Test de performance Rotarod : Mesure de la coordination motrice, l'équilibre, l'endurance et la résistance à la fatigue. -Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA): Les souris seront totalement anesthésiées pour qu'il n'y ait pas de réponse à la stimulation tactile (injection intrapéritonéale, deux injections) pendant maximum 1 heure. Concernant les tests liés au phénotype cardiaque: Les animaux seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme.

Impact sur les animaux

Selon les travaux issus de la littérature, les souris X-déficientes présentent une faiblesse musculaire et cardiaque aux âges étudiés. Dans cette étude, un nouveau modèle de souris X-déficiente sera étudié et des tests seront effectués pour confirmer le même profil observé dans la littérature. Les nuisances ou effets indésirables attendus causés par le retrait de la protéine X dans le modèle de souris X-déficiente sont les suivants : - Les animaux Xdéficientes vont avoir une diminution de la motilité à 6 semaines de vie ainsi qu'une diminution de la contractilité musculaire à 13 semaines de vie à cause de la faiblesse musculaire dû à une perte de fonction de la protéine X. Au niveau cardiaque, à 6 semaines, elles vont développer une anomalie cardiaque qui va entraîner comme conséquence une diminution de la fonction cardiaque. Une diminution de la taille de la souris ainsi que du poids seront observées dès la sixième semaine. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests sont les suivants : -Pour le test de suspension et le test d'agrippement, la souris peut subir un léger stress. -Pour l’électrocardiographie, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la plateforme de l'échographie tout au long de l'expérience. -Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme, ce qui peut également entraîner un stress de courte durée -La mesure des propriétés contractiles musculaires est également réalisée sous anesthésie, pouvant provoquer une sécheresse oculaire au réveil. Concernant le perçage d'oreille des animaux à partir du 14ème jour après la naissance pour leur identification couplée au génotypage, ces animaux peuvent ressentir une douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. Le phénotype cardiaque étudié est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer les dommages liés à cette lignée, à savoir 20 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles et femelles porteuses de la mutation). Les résultats obtenus des deux cohortes (souris sauvages et souris Xdéfcientes) seront utilisés pour deux procédures, ce qui permet une réduction du nombre de souris.

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.

Choix des espèces

Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène X, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la maladie musculaire. Les symptômes de faiblesse musculaire et cardiaque liés à cette mutation apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 6 semaines et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette maladie. Les tests pour évaluer les signes musculaires et cardiaques ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l'Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.

1 500 rongeurs, 1 000 souris et 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et soixante-quinze réutilisés en formation. Ils reçoivent des agents à tester par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse afin d'établir la dose maximale tolérée, avec pesées et prélèvements sanguins quotidiens. Le porteur décrit les effets attendus de la première administration, perte de poids, posture courbée, expressions faciales de douleur, hypothermie ou diarrhée, et fixe un point limite à 20 % de perte de poids. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir la toxicité in vivo et que la tolérance doit être "vérifiée chez le rongeur".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance des animaux pour un agent thérapeutique pouvant être d’origine biologique, chimique, cellulaire, viral ou bactérien après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Ce projet permettra d’identifier la dose maximale après une ou plusieurs administrations qui n’engendre pas d’effet toxique chez les animaux (tolérance, Maximum Tolerated Dose, MTD) afin d’utiliser ces composés aux doses non toxiques pour d’autres expériences.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité d’évaluer la tolérabilité d’un traitement par un agent thérapeutique pouvant être d’origine biologique, chimique, cellulaire, viral ou bactérien après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite envisager des études d’efficacité sur des modèles expérimentaux complexes (animaux porteurs de tumeurs) permettant de démontrer des preuves concepts avant d’envisager des investigations plus poussées en clinique.

Procédures

Les animaux seront identifiés par la mise en place d’un système d’identification sous anesthésie générale (moins d’1 min, une seule fois) pouvant entrainer un stress léger. Les animaux seront randomisés pour former des groupes homogènes en poids pouvant entrainer un stress de 1-2j lié au changement de congénères (une seul fois). Les traitements peuvent être administrés aux animaux par voies : • Orale sur animaux vigiles (moins d’1 min) (max de 40 mL/kg/jour repartie en plusieurs prises / 4 prises maximum intervalle de 6h) • Sous-cutanée sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) au niveau des flanc ou du dos (jusqu’à 10 mg/kg (rat) ou 40 mL/kg (souris) réparti sur 2-3 sites avec un maximum de 3 sites par jour) • Intrapéritonéale sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) (jusqu’à 20 mL/kg (rat) ou 80 mL/kg (souris)), • Intraveineuse sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) ( jusqu’à 25 mL/kg en injection lente avec, pour des volumes supérieur à 20 mL/kg, des produits chauffé à 37°C), Les animaux seront pesés et observés (moins de 5 min, tous les jours) pour détecter d’éventuelle effets secondaires. Les prélèvements sanguins, lorsqu’ils sont requis, seront effectués sous anesthésie par les méthodes recommandées les moins traumatisantes et en prélevant le volume minimum requis. Les méthodes de prélèvements sont validées par le vétérinaire : • Jugulaire (3 prélèvements par jugulaire/jours) (moins d’1 min) • Saphène (3 prélèvements par coté sur 24h) (moins d’3 min) • Queue, soit au niveau de la veine mandibulaire (2 prélèvements / 24h), (moins d’1 min) • Via un cathéter (fémorale ou jugulaire) (moins d’1 min après la pose du cathéter, moins de 5 min) Tous les prélèvements sanguins seront faits par des personnes compétentes. La fréquence des prélèvements et les volumes collectés respecteront les recommandations du comité d’éthique. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. Pour les prélèvements, unique ou répété, individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). Les prélèvements de tissus et/ou d’organes seront réalisés sur animaux euthanasiés. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une 15 minutes avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Lors de l’injection pour la première fois d’un agent thérapeutique, les effets sur l’animal peuvent être : une perte de poids, un aspect corporel détérioré, une distension abdominale, une posture courbée, la texture de la fourrure altérée, une couleur des oreilles et des pattes plus pâles ou cyanosées, des expressions faciales de douleur, une respiration et des habitudes naturelles détériorées ; critères d’observation avancés : comportement provoqué anormal, déshydratation, diarrhée, hypothermie…

Devenir

Les animaux ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée. Tous les animaux inclus dans les groupes de traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux ayant reçu une administration unique et étant rester moins d’une semaine en procédure pourront être utiliser en formation.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir la toxicité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Les données in vitro sont souvent insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules sur les organes. La tolérabilité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur.

Réduction

Au cours des trois prochaines années, nous prévoyons l’utilisation de 500 animaux (rats et souris) par an, soit 1500 animaux sur 3 ans répartis sur 40 études. Dans la mesure du possible, afin de limiter le nombre d’animaux inclus dans une étude, le même animal pourra recevoir des administrations uniques à doses croissantes du même composé (au minimum 72h d’élimination entre deux doses) plutôt que d’avoir recours à des animaux différents pour chaque dose. Dans le cas de recherche de toxicité aigue ou à moyen terme avec différents groupes pour différentes doses, le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au moins 24 heures, avec un lancement initialement du groupe recevant la plus faible dose. Ainsi l’administration n’aura pas lieu pour les groupes suivants devant recevoir une dose supérieure dans le cas ou des effets secondaires immédiats ou à moyen terme ont été observés. En pratique, si 20% ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite (perte de poids de 20% ou plus, score de 3 sur un critère, score de 2 persistant plus de 3h sur un critère, score de 2 sur au moins 3 catégories) dans les 24h suivant l’administration, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Sur la base des expériences passées, le nombre minimum permettant d’obtenir Une réponse satisfaisante de tolérabilité se situe entre 3 à 5 animaux par groupe. L’exploration de la dose maximale tolérée se fera toujours sur un nombre entre 3 à 5 animaux par groupe. Une fois la dose déterminée le même produit pourra être utilisé dans le cadre de ce projet sur un nombre plus important d’animaux (10 au maximum) pour obtenir une puissance statistique plus grande compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité.

Raffinement

Les injections/prélèvements seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique en termes de volume, de fréquence, d’antalgie et d’anesthésie. Tous les gestes techniques seront réalisés par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. Chaque animal sera observé et pesé quotidiennement et un scoring clinique sera réalisé pour détecter d’éventuels effets secondaires des traitements. La fréquence de pesée et de l’observation des animaux pourra être augmenter suivant leur état général. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Dans le contexte de la première administration d’un traitement thérapeutique non testé in vivo, elles seront réalisées le matin, et les animaux sont observés en continue durant les 30 premières minutes qui suivent la première administration puis toutes les 2h pendant les 6 premières heures post-administration. Afin d’évaluer la toxicité aigüe immédiate ainsi que la toxicité à moyen terme suite à une administration unique ou répétée, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. Les observations des signes cliniques feront l’objet de la mise en place d’un scoring clinique individuel. Les scores cliniques les plus élevés constitueront des points limites, ainsi que l’accumulation de scores intermédiaires. Les pertes de poids supérieures ou égales à 20% constitueront un point limite. Si 20% ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 6 semaines afin que leur morphologie supporte mieux les effets secondaires des composés testés.