Procédures sévères
Étude du rôle de Tigd4 en tant que régulateur de la fonction de la jonction myotendineuse à l’aide d’un modèle de souris génétiquement modifié.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
720 souris génétiquement modifiées vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à des tests de force musculaire, à deux programmes d'exercice dont une course jusqu'à épuisement d'environ une heure, puis à une mesure de la force de contraction sous anesthésie avant d'être tuées sans réveil pour biopsie. Le projet vise à comprendre le rôle du gène Tigd4 dans la jonction myotendineuse, un objectif de recherche fondamentale sur la biologie du muscle et de l'exercice. Le porteur affirme que ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro et que la souris est le "modèle le plus approprié", tout en indiquant que les animaux mutants n'ont montré jusqu'ici qu'un phénotype léger.
Objectifs
Le rôle principal des cellules musculaires squelettiques est de se contracter générant une force énorme. Si cette force n'est pas correctement amortie, les cellules musculaires se rompent et la fonction musculaire échoue. Les cellules musculaires gèrent ce problème en dissipant la force vers les tendons qui sont situés à ses deux extrémités. Elles forment une jonction spécialisée avec le tendon, appelée jonction myotendineuse (JMT). La JMT est donc le principal site de blessure lorsque nous faisons de l'exercice. Cependant, nous savons très peu de choses sur la façon dont elle est régulée et sur les gènes qui sont importants à sa fonction. Habituellement, les cellules du corps humain ont un noyau par cellule. En revanche, les cellules musculaires squelettiques possèdent des centaines de noyaux à l'intérieur d'une seule cellule. Il est important de noter qu'un sous-ensemble de ces nombreux noyaux remplit des fonctions spécialisées, par exemple celles de la JMT. Notre équipe a récemment identifié un gène non étudié, appelé Tigd4, qui est fortement exprimé uniquement dans les noyaux musculaires de cette jonction, mais pas dans les autres noyaux musculaires éloignés de la JMT. Cette découverte fait de Tigd4 un gène candidat intéressant à étudier plus précisément. Pour ce faire, un service de notre institut génère des souris génétiquement modifiées portant une mutation dans le gène Tigd4. Notre équipe étudiera le résultat de la mutation de Tigd4 dans la JMT et la fonction musculaire.
Bénéfices attendus
Notre étude établira que Tigd4 est un régulateur important de la JMT, qui est avec les cellules musculaires essentielle au bon fonctionnement des muscles. Par conséquent, ce projet aura de nombreux avantages dans les domaines de la biologie musculaire, de la biologie de l'exercice physique, et des maladies qui provoquent des défaillances au niveau de la JMT.
Procédures
1.Les 3 tests de mesure de la force musculaire sont des procédures non invasives durant lesquelles les souris ne souffrent pas. Ils ne prennent qu’1 à 2 min par souris avec 10 min entre chacun des 3 essais/test et 20 min entre 2 tests. Les souris retourneront ensuite dans leur cage d'origine. 2.Les 2 programmes d’exercices sont des procédures non invasives mais qui provoque un niveau d’inconfort musculaire important comme tout exercice physique intense. Le 1er exercice comprend 4 jours d’habituation progressive de 20 min puis le 5e jour les animaux débutent par 15 min d’échauffement et courent ensuite de plus en plus vite jusqu’à épuisement, environ 1h, pour déterminer leur Vmax (vitesse maximale). Le 2é exercice comprend 3 jours de 15 à 20 min d’habituation suivi d’un jour d’exercice de 60 min comparable à un exercice physique intense. 3.La mesure de la force de contraction musculaire est une procédure invasive qui est réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation. Avec l'anesthésie, ce test dure 1h et 30 min par souris. Après la procédure, les souris encore sous anesthésie seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les animaux mutants pourraient avoir des effets indésirables en raison d’une faible musculature attendue mais ce n’est pour l’instant pas le cas. Ces animaux ne présentent pas, depuis le démarrage du projet autorisé il y a un an, de phénotype dommageable sévère ou même modéré. S’ils ont un phénotype dommageable, celui-ci est léger. Les tests de mesure de la force musculaire sont non invasifs et ne provoquent pas de douleur. Les 2 programmes d’exercice sont des procédures non invasives comparables à une activité physique intense et qui provoquent un niveau d’inconfort musculaire important. La mesure de la force de contraction musculaire sera réalisée sous anesthésie et sous antalgiques et les animaux seront mis à mort avant leur réveil.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux après euthanasie à la fin de la procédure.
Remplacement
Les souris sont nécessaires pour ces expériences dans le but de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des cellules musculaires. Les modifications génétiques qui ne sont possibles que chez la souris nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées et donc la physiopathologie. Ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro.
Réduction
Nous prenons plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Mesure 1 : De multiples essais fonctionnels seront réalisés chez la même souris. Mesure 2 : Les animaux utilisés pour vérifier la viabilité des mutants seront utilisés pour les expériences histologiques et fonctionnelles, ce qui réduira également le nombre d'animaux utilisés. Mesure 3 : La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris minimum nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. La mesure de la force contractile in situ sera effectuée sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter puis les animaux seront sacrifiés avant leur réveil pour le prélèvement des tissus musculaires.
Choix des espèces
Pour caractériser la physiologie du muscle, nous devons réaliser des expériences in vivo chez la souris car les modifications génétiques sont mieux établies dans ce modèle. Le projet est basé sur nos récents travaux chez la souris qui ont permis de découvrir un gène fortement et spécifiquement exprimé dans la JMT. Par conséquent, la souris est le modèle le plus approprié pour ce projet. Le moment où la mutation Tigd4 montre le phénotype est une question ouverte pour le moment et nous n’avons observé aucun phénotype spontané visible depuis le début du projet autorisé il y a un an. Nous espérons pouvoir observer un phénotype lors des analyses histologiques, biologiques et moléculaires qui seront réalisées dans ce projet.
Toxicité aiguë – Méthode par classe de toxicité aiguë (OCDE 423)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 360
480 animaux non-humains, 120 souris et 360 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une administration unique d'une substance par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou endotrachéale, dans le cadre d'un test réglementaire de toxicité aiguë suivant la ligne directrice OCDE 423. Le porteur indique que les animaux montrant des signes cliniques intenses ou perdant plus de 20 % de leur poids sont mis à mort, et observe tremblements, convulsions, salivation, diarrhée, léthargie et coma. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode in vitro capable de générer ces données et présente l'étude comme obligatoire pour compléter les dossiers de mise sur le marché.
Objectifs
Des études in vivo chez le rat ou la souris sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Il s'agit d'études reglementaires suivant les recommandation des lignes directrices de l'OCDE. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités compétentes pour leur mise sur le marché.
Bénéfices attendus
Ces études réglementaires sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Elles permettent de fournir des résultats destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation de mise sur le marché à fournir aux autorités compétentes .
Procédures
Les animaux subissent une administration unique d'une substance par voie orale dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Cependant pour le besoin de certaines molécules (pour lesquelles la voie orale ne convient pas), le protocole est adapté pour une administration par voies intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou endotrachéale. Le temps d'intervention sur chaque animal est de 5 minutes. Il n'y a qu'une intervention par animal.
Impact sur les animaux
Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis des observations sont faites sur diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) sont msis à mort.
Devenir
Les animaux ont été traités par des substances. En fin de procédure ils sont donc mis à mort. En effet, ces traitements pourraient avoir une incidence sur l'effet d'autres substances testées ultérieurement.
Remplacement
Ces protocoles sont des études réglementaires qui permettent de générer des données sur un produit à étudier avant d’entreprendre des études de toxicologie (plus longues et nécessitant plus d’animaux). Elles sont obligatoires d'un point de vue réglementaire et permettent de générer des résultats pour l'établissement des dossiers de demande d’autorisation de mise sur le marché à fournir aux autorités d’enregistrement. Il n'existe pas de méthode in vitro permettant de générer de telles données.
Réduction
Les études sont faites de façon séquentielle : on observe les effets sur les animaux avant de décider d'administrer une nouvelle dose ou un autre niveau de dose (inférieur ou supérieur). Chaque étape n'utilise que 3 animaux.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés et manipulés dans le calme, à distance des autres animaux (y compris lors de la mise à mort). Les animaux sont placés en cages sur portoirs ventilés : chaque cage est composée d’un bac (en polysulfone) fixé à un couvercle (en polyéthérimide) doté d’un plénum connecté au plénum d’air d’extraction du portoir. Le bac est équipé d’un couvercle en acier inoxydable muni d’une mangeoire et de poche d'eau. Nourriture et eau sont fournies ad libitum. Les cages sont dépression par rapport à l’animalerie elle-même ventilée. La ventilation dans le portoir renouvelle l'air environ 100 fois par heure et l’air dans l’animalerie est renouvelé 20 fois par heure. Une minuterie permet d'éclairage 12 heures par jour (8 heures-20 heures). La température est de 22 ± 3 °C et l'humidité de 55 ± 15%, selon les recommendations. Les animaux sont placés dans les cages par groupes de 3 maximum. chaque cage contrient une litière composée de granulés de résineux irradiés. Les cages contiennent un enrichissement. Les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Une fois traités, les animaux sont observés fréquemment: pendant les 30 premières minutes après administration et régulièrement pendant les premières 24 heures, particulièrement au cours des 4 premières heures. il y a ensuite des observations quotidiennes pendant 14 jours. La durée totale d'observation est variable en fonction des réactions de toxicité, du moment où elles apparaissent et de la durée de la période de récupération. Elle peut donc être prolongée à 21 ou 28 jours. Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis observation des diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) fait l'objet d'une mise à mort.
Choix des espèces
L’étude est réalisée selon les recommandations de la ligne directrice de l’OCDE spécifique à ce test qui stipulent qu'elle doit être menée sur des rongeurs. RAT Par étude : 3 animaux par groupe, maximum 8 groupes = 24 animaux maximum. 3 études par an. Soit 72 animaux par an Donc 360 animaux sur les 5 années d’autorisation de projet. 8 à 12 semaines (soit 200 à 250 g environ) selon les recommandations de la ligne directrice. SOURIS Par étude : 3 animaux par groupe, maximum 8 groupes = 24 animaux maximum. 1 études par an. Soit 24 animaux par an Donc 120 animaux sur les 5 années d’autorisation de projet. 8 à 12 semaines (soit 25 à 35 g pour la souris) selon les recommandations de la ligne directrice.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement anticancéreux sur un modèle de tumeur mammaire humaine développée chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Immunodéprimées, elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, puis jusqu'à dix-huit injections d'une molécule inhibitrice sur six semaines, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins. L'objectif est de confirmer l'efficacité de ces molécules contre le cancer du sein triple négatif, avec un bénéfice pour les patientes annoncé à long terme. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation sur "organisme entier" est nécessaire.
Objectifs
Ce projet concerne l'inhibition d'une enzyme qui intervient dans le mécanisme de détoxification des cellules. Cette voie de détoxification est particulièrement utilisée par les cellules des tumeurs. L’augmentation de l’expression de cet enzyme a été reportée dans de nombreux cancers et est associée à la résistance aux traitements habituelles lors de rechutes. Le pourcentage du cancer du sein représente 33.5% de l’ensemble des nouveaux cas de cancer chez la femme. La grande diversité retrouvée dans le cancer du sein rend les traitements plus difficiles que sur d’autres formes de cancer du sein. Il constitue un problème clinique en raison de son pronostic relativement mauvais, de son comportement agressif, de sa capacité à métastaser et de l'absence de thérapies ciblées. Un nouveau traitement anticancéreux contre les cancers a été développé. Une première molécule a montré son efficacité sur la leucémie , le mélanome, le cancer du poumon ainsi que le cancer du sein. L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité des molécules sur des souris greffées avec des cellules tumorales humaines au niveau des glandes mammaires afin de reproduire un modèle de cancer du sein in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet à court terme sont de confirmer l’efficacité de nos molécules inhibitrices sur la progression d’une tumeur de cancer du sein implantée chez la souris. Les bénéfices attendus, à long terme, sur la santé humaine sont d’améliorer la prise en charge des patientes et d’améliorer le pronostic lors de rechutes. Ce traitement, permettra d’envisager une thérapie ciblée plus efficace que les thérapies conventionnelles actuellement utilisées contre le cancer du sein triple négatif.
Procédures
injection de cellules tumorales dans la glande mammaire de la souris par chirurgie courte sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) Traitement des souris des molécules inhibitrices (3 fois par semaine pendant 6 semaines maximum / 18 injections maximum / 5 secondes par injection) Contention des souris lors de la mesure des tumeurs (2 fois par semaine). Un prélèvement de sang en cours d'étude dans la veine mandibulaire de la souris (1 fois). Un prélèvement final de sang réalisé sous anesthésie (1 fois).
Impact sur les animaux
Douleur liée à la chirurgie. Développement de la tumeurs. Gène liée à la tumeur .Douleur légère liée à l'injection. Douleur liée à la prise de sang (piqure d'aiguille). Stress lors de la contention. Douleur liée à l'apparition de métastase.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements dans le but de la analyser.
Remplacement
Avant de réaliser des études sur la souris, l’efficacité des molécules a été démontrée sur les cultures cellulaire de tumeur séléctionnées pour ce projet. Il est dorénavant nécessaire de confirmer ces résultats sur une tumeur développée dans un mammifère. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement de son environnement. Par ailleurs, plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du traitement dans la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons, nous devons effectuer les études d’efficacité chez la souris.
Réduction
La prise tumorale ayant un taux de réussite de 80%, nous avons réduit le nombre d'animaux à implanter en prenant en compte ce paramètre. L’étude pilote sera réalisée avec le minimum nous permettant d’apprécier la croissance tumorale. Pour les procédure où le traitement sera administré aux souris, la comparaison entre les différents groupes sera réalisée par un test statistique. le nombre d'animaux par groupe a été déterminé car il nous permet un compromis entre une puissance statistique suffisante et l’éthique animale. Une réduction du nombre d’animaux sera possible en fonction des résultats obtenus lors des premières études : - Suppression des doses non tolérées dans les études suivantes pour chacune des souches de souris. - Suppression des témoins négatif s’ils ne démontrent pas d’activité dans les premières études.
Raffinement
Après leur réception, les souris disposeront d’une période d’acclimatation de 7 jours. Lors de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés maximum 70 jours (10 semaines) après leur réception si aucun point limite n’a été atteint. Ce délai correspond à la durée maximale possible des études (1 semaine d’acclimatation + 3 semaines de prise de greffe + 6 semaines de traitement). Lors de la chirurgie, des antidouleurs sont donnés avant l'opération. l'animal a une anesthésie générale et locales. Un antidouleur est apporté dans l'eau de boisson pendant les 3 jours qui suivent l'opération. Les animaux étant identifiés, toute anomalie observée permettra de faire un suivi individuel. Ils seront pesés le jour de la première intervention (J7) puis au moins une fois par semaine (3 fois lors des traitements). En cas de perte de poids >10%, de la nourriture humide sera ajouté dans la cage. En cas de tumeur invalidante, de l'eau gélifiée et des croquettes seront ajoutées dans la cage pour faciliter l'accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux seront répartis à raison de 5 ou 6 par cage (dépendant de la prise de la tumeur) afin de maintenir la sociabilité de l’animal. Une observation, 3 fois par semaine lors des traitements, permettra de détecter une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
La souris est l'un des seuls modèles d'animaux adaptés pour la réalisation de greffe de tumeur d'origine humaine. C'est un modèle reconnu dans la recherche contre le cancer. Les animaux seront utilisés à partir de 6 à 10 semaines jusqu’à 15-20 semaines. Ce choix est basé sur la bibliographie afin de favoriser la prise tumorale.
SIGNAL: INFECTION AU SARS-COV-2 DES NEURONES A GNRH, NEUROINFLAMMATION,VEILLISSEMENT ET CONSEQUENCES A LONG-TERME
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
348 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale, avec implantation de mini-pompes et prélèvements sanguins répétés, certaines lignées n'ayant qu'une espérance de vie de sept à douze jours après infection. Le projet étudie l'infection des neurones à GnRH et ses effets à long terme sur la reproduction et la cognition, y compris chez des femelles gestantes et leur descendance. Le porteur affirme que cette étude requiert "l'organisme entier" et juge ces souris "indispensables".
Objectifs
Depuis le début de la pandémie de COVID-19, les efforts collaboratifs des 5 équipes de recherche ont montré que le SARS-CoV-2 infecte et tue les neurones produisant l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) dans le cerveau des patients adultes atteints de COVID-19. Ce phénomène entraîne une réduction spectaculaire de l'expression de la GnRH dans l'hypothalamus chez une proportion significative de patients. Ces neurones, connus pour être les maîtres régulateurs de la fonction de reproduction, pourraient également jouer des rôles clés dans le développement des fonctions cognitives et sensorielles, du métabolisme et du vieillissement cérébral et systémique. En outre, les neurones à GnRH foetaux, qui proviennent du nez, expriment plusieurs protéines qui leur confèrent une sensibilité à l'infection par le SARS-CoV-2. Ceci suggère qu'ils pourraient être vulnérables en cas de transmission materno-foetale/néonatale, et fait planer le risque d'une double pandémie d'infertilité et de déclin cognitif prématuré. Nous émettons l'hypothèse que l'infection des neurones à GnRH et d'autres populations de cellules cérébrales par le SARS-CoV-2 module l'expression des gènes de l'hôte, perturbe le neurodéveloppement et aggrave les changements liés à l'âge par des altérations inflammatoires et épigénétiques persistantes dans les cellules survivantes. Le projet utilise des tissus humains de patients COVID-19 et de sujets non-infectés, ainsi que des modèles cellulaires, et nécessite également l’utilisation de modèles animaux transgéniques afin de déterminer si et comment l'infection et la perte des neurones à GnRH conduit à des altérations pathologiques à long terme. Nous poursuivrons trois objectifs: 1) Déterminer si et comment l'infection par le SARS-CoV-2 module de manière différentielle le paysage de l'expression génétique des neurones à GnRH et d'autres cellules cérébrales infectées pour accélérer l'inflammation hypothalamique, le dysfonctionnement cognitif ou métabolique et la sénescence cérébrale 2) Explorer si l'infection des neurones à GnRH ou la perte d'expression de la GnRH dans le cerveau adulte ou foetal/néonatal a des effets à long terme sur l'axe reproducteur dans des modèles animaux 3) Vérifier si le remplacement de la GnRH de façon physiologique ou l'inversion des voies pathologiques compensera l'expression génique à long terme et les altérations fonctionnelles induites par l'infection du cerveau par le SARS-CoV-2.
Bénéfices attendus
Le projet apportera une meilleure compréhension des répercussions à long terme, jusqu'ici sous-estimées, de la neuroinvasion par le SARS-CoV-2 en termes d'intégrité et de fonction des cellules cérébrales. Il pourrait permettre d’identifier les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les symptômes neurologiques de la COVID longue, et proposer des stratégies thérapeutiques viables et fondées sur les preuves pour inverser ou compenser ces mécanismes pathologiques. Les résultats du projet devraient contribuer à réduire le fardeau social, financier et sanitaire imposé par la COVID-19.
Procédures
LES INTERVENTIONS SERONT EFFECTUEES SUR ANIMAL ANESTHESIE ET CHAQUE INTERVENTION EST REALISEE 1 FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL: - IMPLANTATION DE MINIPOMPE SOUS-CUTANEES AU NIVEAU DE LA PARTIE SUPERIEURE DU DOS, - INFECTION DES SOURIS PAR VOIE NASALE (SOURIS ADULTES GESTANTES OU NON). SEULS LES PRELEVEMENTS SANGUINS SERONT EFFECTUES SUR ANIMAL VIGILE. LES PRELEVEMENTS UNIQUES SERONT EFFECTUES AU NIVEAU DE LA VEINE MANDIBULAIRE 1 FOIS PAR MOIS PENDANT 6 MOIS (SUR L'ANIMAL ADULTE) OU A P12, P23 ET P30 (SUR SOURIS POST-NATALES); LES PRELEVEMENTS FREQUENTS SERONT EFFECTUES DANS LA VEINE LATERALE DE LA QUEUE 1 SEULE FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL (3µL DE SANG TOUTES LES 6 MINUTES PENDANT 2H).
Impact sur les animaux
TOUTE MANIPULATION DES ANIMAUX PEUT PROVOQUER DU STRESS, DE LA FATIGUE ET DE L'INCONFORT ET DES MESURES DE RAFFINEMENT SERONT MISES EN PLACE POUR LES LIMITER AU MAXIMUM. EN PARTICULIER LES EXPERIENCES DE CHIRURGIE OU DE PRELEVEMENTS DE SANG PEUVENT PROVOQUER DES DOULEURS A COURT-TERME QUI SERONT LIMITEES PAR L'UTILISATION D'UN ANALGESIQUE (GEL DE CHLORHYDRATE DE PRAMOCAÏNE OU TRONOTHANE 1%). SEULS LES ANIMAUX INFECTES PAR LE VIRUS SARS-COV-2 DANS LA PROCEDURE 2 SUBIRONT UNE PERTE DE POIDS CONSEQUENTES ET SERONT SUIVIS DE TRES PRES; ILS SERONT SACRIFIES A 4 JOURS POST-INFECTION POUR LIMITER LA DUREE DE CET ETAT.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés pour chaque procédure sera EUTHANASIE à terme même ceux qui servent de contrôles afin de récupérer le sang et les organes.
Remplacement
Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par SARS-CoV-2 et de l’efficacité des médicaments nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. En effet, suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets potentiellement bénéfiques du donneur de NO au cours de l’infection ne peuvent être réellement évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. LE NOMBRE D’ANIMAUX EST BASE SUR UN CALCUL STATISTIQUE QUI PREND EN COMPTE LE PARAMETRE ETUDIE ET DES EXPERIENCES PILOTES. POUR CELA, LA TAILLE MINIMALE DES GROUPES EXPERIMENTAUX A UTILISER A ETE DEFINI ; PUIS LA POSSIBILITE DE COLLECTER PLUSIEURS ECHANTILLONS/TISSUS CHEZ LES MEMES ANIMAUX CHAQUE FOIS QUE POSSIBLE A ETE PRISE EN COMPTE. CETTE UTILISATION MAXIMISE LES DONNEES OBTENUES A PARTIR DE CHAQUE ANIMAL, AFIN DE LIMITER OU D'EVITER L'UTILISATION SUBSEQUENTE D'ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES, ET CE, SANS POUR AUTANT COMPROMETTRE LE BIEN-ETRE ANIMAL.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Les personnes impliquées bénéficient d’une autorisation pour travailler sur des agents pathogènes de groupe 3. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. EN PARTICULIER, LES ANIMAUX SONT MANIPULES INDIVIDUELLEMENT, ET DANS LE CALME, AFIN DE LIMITER TOUT STRESS DES ANIMAUX NON MANIPULES. LES MANIPULATIONS S'EFFECTUENT A DISTANCE DES AUTRES ANIMAUX. UNE SURVEILLANCE QUOTIDIENNE EST EFFECTUEE AFIN DE S’ASSURER DE L’ETAT DES ANIMAUX.
Choix des espèces
La souris exprimant l’ACE2 humain génétiquement modifiée représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par le SARS-CoV-2. AFIN D’ETUDIER LES CONSEQUENCES PATHOPHYSIOLOGIQUES DE LA PERTE DE CES NEURONES LORS DE LA COVID-19, NOUS UTILISERONS UN MODELE DE SOURIS TRANSGENIQUES DANS LESQUELLES L’ACE2 HUMAIN S’EXPRIMERA UNIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH. L’ETUDE DU ROLE SPECIFIQUE DU CO-RECEPTEUR A LA NEUROPILIN-1 (NRP1) SPECIFIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH REQUIERT L’UTILISATION DE SOURIS TRANSGENIQUES INFECTEES DE MANIERE GLOBALE PAR LE SARS-COV-2 ET QUI N’ONT PAS LE RECEPTEUR NRP1 DANS LES NEURONES A GNRH. CES SOURIS ONT UNE ESPERANCE DE VIE COURTE (7 A 12 JOURS POST-INFECTION) MAIS SONT INDISPENSABLES POUR DETERMINER LE ROLE DU CO-RECEPTEUR NRP1 DANS LA PERTE DE L’EXPRESSION DE LA GNRH. NOTRE TROISIEME OBJECTIF ETANT D’ETABLIR L’IMPACT DE L’INFECTION IN UTERO OU NEONATALE SUR LA MINIPUBERTE ET A LONG TERME SUR L’AXE REPRODUCTEUR, IL NECESSITE L’UTILISATION DE SOURIS FEMELLES GESTANTES INFECTEES PAR LE SARS-COV-2 ET D’ETUDIER LES EFFETS SUR LA DESCENDANCE A PLUS OU MOINS LONG-TERME.
Développement pharmaceutique d’une nouvelle thérapeutique de la maladie de Menkès (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
85 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 39 en gravité sévère. Les souriceaux mâles porteurs de la maladie de Menkès, dont l'espérance de vie ne dépasse pas trois à cinq semaines, reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept et subissent sept tests neurocomportementaux jusqu'à J38. L'objectif est de développer un transporteur synthétique de cuivre contre cette maladie génétique mortelle de l'enfant. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro n'est possible puisque l'étude porte sur la survie et le comportement de l'animal malade.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un déficit d’un transporteur cellulaire du cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et hémato-méningées. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant alors des déficits multi systémiques et un décès dans les premières années de vie. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et hémato-méningées est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille (
Bénéfices attendus
Chez les animaux malades traités avec le Transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées 2) Restaurations des fonctions cognitives principales 3) Amélioration de la survie L'objectif de ce projet est de développer un médicament capable de soigner des enfants porteurs de la mutation et qui ont une espérance de vie très réduite.
Procédures
1/ Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie. 2/ Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
Chez les animaux malades non traités avec le TSC : défauts de croissance et difficultés d'alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le TSC, une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n'a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires ainsi que des études anatomopathologiques sur reins ont été effectués et n’ont montré aucune toxicité.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (85 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est compris entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d'intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude complète prévoit la génération de 13 animaux mâles par groupe pour tenir compte du taux de mortalité élevé liée à la pathologie touchant seulement les mâles, mais s’arrêtera dès que les tests comportementaux seront réalisés sur 10 souris par groupe : donc un minimum de 70 (maximum 85) souris de laboratoire, réparties en 7 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines (sauvages) et 5 groupes de 10 souris mutantes (hémizygotes) seront utilisés jusqu’à l’âge de 2 mois. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales (2 procédures seront appliquées : la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal, l’injection du TSC en sous-cutanée répétée 5 fois par semaine avec 8 tests pour l’étude comportementale) auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal. Une démarche d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments cliniques sont évalués chez l’animal afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Choix des espèces
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire le lien avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques liées à des troubles du métabolisme des oligo-éléments. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.
Etude de molécules dans la prévention des lésions intestinales induites par un médicament immunosuppresseur
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
204 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dont 168 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur microbiote est remplacé par un microbiote humain, elles reçoivent par canule un immunosuppresseur provoquant diarrhées et lésions intestinales, avec des prélèvements de fèces répétés, au besoin par introduction d'une canule dans l'anus. L'objectif est de tester des molécules déjà autorisées comme médicaments pour prévenir cette entéropathie, avec un bénéfice annoncé à moyen terme. Le porteur affirme que seul l'animal permet de reproduire cette atteinte, impossible selon lui à modéliser in vitro.
Objectifs
Lorsqu’un organe vital est défectueux, il est possible de le remplacer par la transplantation d’organe. Cette intervention chirurgicale s’accompagne nécessairement d’une prise d’immunosuppresseur à vie pour le patient, afin de diminuer les risques de rejet de l’organe greffé par le système immunitaire. L’immunosuppresseur le plus utilisé chez les patients transplantés provoque des troubles intestinaux, définis comme entéropathie, tels que des nausées, des diarrhées voire même, dans les cas les plus graves, des ulcères hémorragiques pouvant mettre en jeu leur pronostic vital. Cet immunosuppresseur est aussi utilisé chez des patients présentant des maladies dites auto-immunes ; chez ces individus, les effets indésirables intestinaux sont aussi présents. De récentes recherches mettent en évidence le rôle du microbiote intestinal dans le développement des lésions intestinales associés à la prise d’immunosuppresseur. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes qui colonise notre tube digestif et est indispensable au bon fonctionnement de l’organisme. Les traitements immunosuppresseurs altèrent la composition du microbiote intestinal et favorisent la prolifération de certaines bactéries qui produisent des enzymes spécifiques connues pour transformer l’immunosuppresseur. Différentes études apportent des arguments solides qui incriminent l’immunosuppresseur transformé dans le développement des troubles intestinaux. Dans ce contexte, l’enzyme du microbiote intestinal impliquée dans la transformation de l’immunosuppresseur devient une cible de choix pour prévenir les lésions intestinales associées. Grâce à une étude exhaustive de la littérature et à des tests réalisés in vitro, nous avons identifié, dans une collection de produits chimiques, des molécules capables de bloquer spécifiquement l’effet de cette enzyme bactérienne. A noter que la collection de produits chimiques utilisée contient des molécules qui sont utilisées en Europe ou aux Etats-Unis comme médicaments pour différentes maladies. Notre objectif est de démontrer que ces molécules identifiées dans la collection empêchent la survenue des lésions intestinales induites par l’immunosuppresseur chez la souris. Chaque espèce ayant un microbiote particulier, nous avons choisi un modèle, décrit dans la littérature et défini comme humanisé, dans lequel le microbiote de la souris sera remplacé par celui de l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à apporter une stratégie thérapeutique pour prévenir, chez les transplantés, l’entéropathie qui est un effet indésirable des médicaments immunosuppresseurs. Lorsque l’entéropathie survient, la seule option est de diminuer la dose ou la fréquence de prise d’immunosuppresseur au risque de perdre le greffon. La stratégie thérapeutique étudiée dans le présent projet permettra d’améliorer la qualité de vie des patients transplantés et également de tous les patients traités par immunosuppresseur, comme les sujets atteints de maladies auto-immunes. De plus, l’enzyme bactérienne responsable de la transformation de l’immunosuppresseur est aussi mise en cause dans la modification de médicaments anticancéreux (irinotécan, régorafenib), d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (diclofenac, ibuprofen), de la morphine, et dans leurs effets indésirables intestinaux. Ainsi, le projet permettra aussi de proposer des solutions pour prévenir l’entéropathie médicamenteuse. Si l’étude proposée ici donne les résultats attendus, le bénéfice pour les malades pourrait être obtenu à moyen terme. En effet, notre stratégie consiste à repositionner une molécule déjà approuvée comme un médicament par les autorités sanitaires européennes ou américaines. L’approbation par les autorités sanitaires n’est donnée que si la molécule montre qu’elle ne présente pas de toxicité dans un certain nombre de modèles animaux (phase d’étude préclinique) puis chez des volontaires sains (étude clinique de phase I). Notre projet devrait permettre de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques sans passer par les études précliniques et de phase I très chronophages.
Procédures
Les interventions s’étaleront sur une période de 6 à 7 semaines. Les animaux seront manipulés 39 jours dans le cadre des expériences. Ils seront soumis à 3 préhensions pour pesée puis contention pour habituation à la canule pour administration orale, 1 préhension pour pesée puis contention pour habituation à la canule et prélèvement de fèces, 16 préhensions pour pesée puis contention pour administration orale via une canule, 9 préhensions pour pesée puis contention pour administration orale via canule et prélèvement de fèces. Le prélèvement de fèces peut être spontané lors de la contention ; si la défécation n’est pas spontanée, elle sera provoquée en introduisant délicatement, sur moins d’1 mm, 1 canule dans l’anus. Toutes ces manipulations se feront sur les animaux vigiles et s’enchaineront ; l’animal sera manipulé au maximum pendant 10 minutes lors des jours de manipulations. La dernière intervention prendra 15 minutes et consistera en la contention pour prélèvement de fèces et pour administration d’un anesthésique et antalgique sur animal vigile suivie d’un prélèvement de sang et mise à mort pendant que l’animal est anesthésié.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - un stress léger et momentané lié à la contention pour la pesée, pour le prélèvement de fèces, pour l’administration orale de traitement à l’aide d’une canule, et pour l’anesthésie, -une gêne légère et momentanée lors de la défécation provoquée, lors de l’administration orale avec une canule, et lors de l’introduction de l’aiguille pour l’anesthésie et l’antalgie éventuelle, - et dans le cas des animaux traités par l’immunosuppresseur sont une perte de poids modérée, une douleur modérée jusqu’à l’administration d’un antalgique, et potentiellement de la diarrhée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements, notamment du tube digestif, nécessaires à la mise en évidence d’un effet bénéfique des molécules testées.
Remplacement
En amont de ce projet, l’effet bloquant des molécules sur l’enzyme bactérienne responsable de la transformation de l’immunosuppresseur sera validé sur des selles humaines provenant de sujets sains. Une fois ce point vérifié, nous utiliserons l’animal qui, seul, permet de mimer l’entéropathie qui résulte d’une interaction complexe du microbiote intestinal avec le tube digestif et avec le reste de l’organisme, que l’on ne sait pas reproduire actuellement dans des modèles in vitro.
Réduction
La stratégie choisie de repositionner un médicament, si elle est concluante, elle permettra d’éviter les études de toxicité préclinique qui utilise de nombreux animaux. Dans ce projet, nous utiliserons des souris consanguines pour limiter la variabilité génétique inter-individuelle et par conséquent le nombre de souris à utiliser. Ce projet comprend 2 étapes : une étude pilote suivie de l’étude à proprement parler de l’effet des molécules d’intérêt sur l’entéropathie induite par l’immunosuppresseur. L’étude pilote permettra de mettre au point le modèle animal humanisé sur la base d’une revue exhaustive de la littérature et d’une collaboration avec une équipe experte du modèle de souris humanisé pour le microbiote. Cette étude pilote permettra de limiter le nombre d’animaux utilisé dans la seconde étape. Le nombre d’animaux nécessaire par condition expérimentale pour obtenir des résultats significatifs et robustes a été évalué à l’aide d’un test dit de puissance. Dans l’étude pilote nous prévoyons au maximum de tester 6 conditions expérimentales de 6 animaux par lot ; au plus, 36 souris seront donc utilisées. Les conditions expérimentales seront testées deux à deux en parallèle en comparaison à un lot contrôle pour évaluer les deux méthodes d’administration. Si les conditions expérimentales du premier essai sont satisfaisantes, l’étude pilote sera arrêtée avant d’avoir réalisé le deuxième essai. Dans la procédure 2, 14 conditions expérimentales seront nécessaires, de 12 animaux par lot, soit 168 souris seront utilisées. L’efficacité des molécules sera vérifiée en comparant les résultats des différentes conditions à l’aide du test statistique ANOVA suivi d’un test post hoc.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions d'hébergement contrôlés quotidiennement et en accord avec la réglementation pour respecter leur bien-être, c’est-à-dire : statut sanitaire ; température ; hygrométrie ; lumière ; et état général des animaux. L’hébergement sera réalisé dans une animalerie dont le statut sanitaire est régulièrement contrôlé et adapté à des animaux dont le microbiote est perturbé. Les animaux seront hébergés en groupe ; le groupe restera le même du début à la fin. De l’enrichissement est systématiquement présent dans les cages, la litière est changée régulièrement et la nourriture et l’eau sont en permanence disponibles. Les animaux seront acclimatés à l’environnement de l’animalerie pendant une période de 14 jours ; sur cette période, ils seront aussi habitués à l’expérimentateur et à la préhension et à la contention nécessaires pour certaines interventions. Pendant toute la durée des expériences, tout un panel de paramètres sera évalué quotidiennement pour chaque animal, des points limites gradés seront donc définis, afin de repérer au plus tôt les signes de mal-être de l’animal, qui seront pris en charge immédiatement et adapté pour chaque point limite qui atteint. L’ensemble des expériences seront réalisées par un personnel compétent.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de l’entéropathie induite par l’immunosuppresseur. Les troubles et les lésions intestinales miment fidèlement les caractéristiques cliniques des patients transplantés. De plus, l’humanisation du microbiote est bien décrite et efficace dans cette espèce. Les animaux seront reçus à l’âge de 2 mois (8 semaines), le protocole expérimental dure 54 jours dont 14 jours d’habituation des animaux à l’environnement de l’animalerie. Nous utiliserons des souris au stade jeune adulte comme décrit dans la littérature à la fois pour le modèle de microbiote humanisé et pour le modèle d’entéropathie induite par l’immunosuppresseur.
Effet des endozépines sur l’anxiété et l’homéostasie glucidique et énergétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
658 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 208 en gravité sévère. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique, des instillations intranasales une à deux fois par jour pendant quinze jours, des prélèvements sanguins répétés six fois en une heure, deux tests d'anxiété et un séjour en cage métabolique. Le porteur teste un peptide coupe-faim contre l'obésité, en vérifiant d'abord qu'il ne provoque pas d'effet anxiogène, avant un "éventuel transfert en clinique humaine". Il affirme qu'aucun modèle ne peut se substituer à l'animal pour cette étude.
Objectifs
L’obésité est un problème majeur de santé publique à forte prévalence dans les pays industrialisés. Les dernières données recueillies en France montrent en effet que 32% des adultes sont en surpoids et que 15% sont obèses. En marge des traitements diététiques et d’accompagnement de première intention et des solutions instrumentales ultimes comme la chirurgie bariatrique, l’arsenal thérapeutique actuel est d’autant plus réduit que des médicaments sont retirés du marché en raison de leurs effets secondaires marqués. Il est maintenant bien établi que certains neuropeptides jouent un rôle clé dans le contrôle de la prise de nourriture. Dans ce contexte, il a été démontré que l’administration intracérébroventriculaire d’une faible dose de l’octadécaneuropeptide ODN et intranasale d’un de ses analogues entraînent une forte diminution de la prise alimentaire, sans aucune autre manifestation comportementale, et qu’ils jouent donc un rôle clé dans la régulation centrale de l’homéostasie énergétique. Notre travail s’oriente vers la validation des effets d’une instillation intranasale unique ou répétée de peptide sur le comportement alimentaire chez la souris vigile normalement alimentées ou en régime hypercalorique, avant un éventuel transfert en clinique humaine. Au préalable, nous devons vérifier que l’administration d’une faible dose de peptide chez la souris n’entraine pas d’effet anxiogène comme attendu et rapporté dans la littérature. Aucun modèle ne peut se substituer à l’utilisation d’un animal dans cette étude. Le projet est constitué de 3 procédures et les données expérimentales seront recueillies chez les animaux vigiles à différents temps post-administration et une fois euthanasiés pour une quantification de gènes cibles.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient permettre l’obtention d’avancées significatives dans la recherche fondamentale et translationnelle du système endozépinergique. Tout d’abord, cette étude clarifiera le rôle joué par le récepteur de l’ODN dans les effets anorexigènes du peptide. Elle délimitera aussi la fenêtre thérapeutique en termes de dose à administrée pour s’affranchir d’un effet anxiogène indésirable éventuel et enfin, elle confirmera que la voie intranasale est particulièrement bien adaptée pour traiter nos animaux.
Procédures
Au cours du projet, certains animaux seront soumis à : -une chirurgie stéréotaxique qui constitue l’acte de chirurgie expérimentale majeur (30 min). -une instillation intranasale sous contention 1 fois ou 2 fois par jour pendant 15 jours (2 min/instillation). -une injection intrapéritonéale unique (2 min). -un prélèvement sanguin caudale (3 min) répété 6 fois en 1 heure. -deux tests d’anxiété de 5 et 10 min espacés d’une semaine. -un hébergement en cage métabolique de vie normale (21 jours).
Impact sur les animaux
A priori, nous n’attendons pas de manifestations indésirables majeures chez les animaux utilisés dans l’ensemble de cette étude. Nous porterons néanmoins une attention particulière (surveillance accrue) à la douleur des animaux canulés ou prélevés (sang), et aux stress des groupes contrôle positif du contingent engagé dans les tests d’anxiété et ceux qui perdront du poids. Les traitements n’induiront ni douleur, ni inflammation, ni changement du comportement autre ceux anticipés, considérés et maitrisés qui pourraient nuire au bien-être des animaux. Les effets mesurés chez les animaux sont transitoires et les traitements aigus suffisamment espacés (1 semaine) pour permettre une récupération totale des animaux et s’affranchir d’effets indésirables cumulatifs.
Devenir
Tous les animaux reçoivent un traitement pharmacologique aigu ou chronique et peuvent difficilement être réaffectés à d’autres protocoles. De plus, les expérimentions se déroulant dans une zone dédiée, les animaux ne peuvent pas retourner dans la zone d’élevage et être utilisés comme animaux reproducteurs. Pour l’ensemble de ces raisons tous les animaux sont euthanasiés rapidement après la fin des procédures.
Remplacement
Le projet scientifique vise à étendre la compréhension de la régulation de l’homéostasie énergétique pour envisager de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Dans la mesure où aucun modèle de substitution permettant de mener à bien ces différents objectifs physiologiques et pharmacologiques n’est actuellement disponible et devant la complexité des mécanismes mis en jeu et leur interconnexion, l’ensemble de l’étude sera réalisé in vivo chez la souris. De plus, de nombreux modèles de souris ont déjà été développés afin de mieux appréhender l’origine des dérèglements centraux de l’homéostasie énergétique et proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les études sont conduites sur des lots de 10 souris par condition de traitement. Le dispositif de cages métaboliques étant paramétré autour de 8 cages de vie normale, l’effectif sera à ce titre diminué d’autant. Ces effectifs nous assurent d’obtenir des données statistiquement comparables. Les deux tests d’anxiété sont réalisés sur les mêmes animaux à une semaine d’intervalle et après randomisation des animaux. De même, le test de tolérance au glucose est mené sur les mêmes animaux randomisés que ceux ayant subis le test de sensibilité à l’insuline, une semaine plus tard afin de garantir la normalisation de la glycémie basale. Un certain nombre de groupes expérimentaux ont été prévus mais ne seront inclus dans l’étude qu’en cas de besoin.
Raffinement
Les souris sont élevées et maintenues en cage standard conformément à la réglementation avec un enrichissement du milieu de vie constitué de nids en copeau de peuplier. Les expériences sont menées dans une pièce adjacente de la zone d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont surveillés pendant et après toute la durée du protocole et leur score quotidien confronté à la grille de score préalablement détaillée incluant des points limites adaptés.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré (in vivo sur animal entier) peut nous permettre de comprendre, de façon globale, la contribution du système endozépinergique dans l’homéostasie énergétique et comment il peut être instrumentalisé pour rééquilibrer les dysfonctions liées aux pathologies associées. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie (taille et coûts d’entretien réduits, bonne performances reproductives). De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques de l’altération du comportement alimentaire car elle est relativement sensible à une modification de son régime alimentaire. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et la prise de poids est minimale après cette période.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements pour le syndrome de détresse respiratoire aigüe à l’aide de modèles de sepsis chez le rongeur (souris et rats)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Rats : 3900
5 070 souris et 3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs déclenchent un sepsis par injection de toxine LPS ou par ligature du caecum, provoquant septicémie, inflammation, perte de poids, atteintes pulmonaires et choc septique, pour tester de nouveaux traitements du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Le porteur n'attend pas de nuisance liée aux traitements eux-mêmes, qu'il présente comme non toxiques. Il affirme que le rat et la souris reproduisent au mieux la maladie humaine et que les essais in vitro ne suffisent pas.
Objectifs
Le Syndrome de Détresse Respiratoire Aigüe (SDRA) est un syndrome clinique d'inflammation et d'œdème pulmonaire diffus qui provoque généralement une insuffisance respiratoire aiguë. Le SDRA peut être causé par des déclencheurs infectieux ou non infectieux qui impliquent l'activation et la dérégulation de multiples voies de lésion, d'inflammation et de coagulation qui se chevauchent et interagissent dans les poumons et dans le système. Le plus souvent, le SDRA peut se développer dans le cadre d'une pneumonie, d'une septicémie (39% des cas), d'une aspiration du contenu gastrique ou d'un traumatisme grave. Le SDRA représente 10 % de tous les patients dans les unités de soins intensifs dans le monde entier, avec un taux de mortalité élevé (30-40 %). Le SDRA se caractérise par une mauvaise oxygénation et des poumons non conformes ou "rigides", c'est pourquoi la ventilation mécanique et les thérapies de soutien sont les piliers du traitement de la maladie. Cependant, le taux de mortalité est toujours très élevé, il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques visant à découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la pathologie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du SDRA avec la mise en place de modèle animaux reproduisant ces pathologies chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la progression de la maladie et améliorer la qualité de vie des patients atteints par cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la septicémie et le SDRA. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui ralentiraient la progression de la maladie évaluée par des analyses sanguines (marqueurs inflammatoires, de toxicité, de NEToses (formation de pièges extracellulaires des neutrophiles) et de fibrose) ou par analyse histologique (recrutement des fibrocytes, fibrose, NEToses, toxicité).
Procédures
Tous les animaux des groupes 2 à 7 subiront soit une injection unique en intra-péritonéale de LPS, soit une administration unique en intra-nasale de LPS, soit une administration unique en intra-trachéale de LPS, soit une ligation du caecum par méthode chirurgicale pour induire la pathologie. L’injection intra-péritonéale se fera sur animaux vigiles tandis que pour l’administration intranasale et intratrachéale ainsi que pour la méthode chirurgicale, l’induction se fera sur animaux anesthésiés. Les animaux du groupe 1 quant à eux recevront du sérum physiologique, du PBS ou seront opérés à blanc. Les injections intra-péritonéales dureront moins d’une minute par animal. Les administrations intra-nasales et intra-trachéales dureront environ 5 minutes par animal et la méthode chirurgicale durera environ 20 minutes par animal. Les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 4 semaines après l'induction du modèle). Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra- péritonéale, sous-cutanée, par voie orale, par voie topique sur animal vigile ou par système de mini-pompe osmotique qui sera la voie préférentielle. Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés avec un mélange de kétamine /xylazine, qui sera administré par injection intra-péritonéale ou par inhalation d’isoflurane. Lors des prélèvements de sang intermédiaires par voie rétro-orbitale ou lorsque qu’un animal présentera un score total compris entre 5 et 7, toutes catégories confondues dans le tableau des points limites, les souris et les rats seront traités avec de la buprénorphine. Le prélèvement sanguin durera environ 5 minutes par animal. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une septicémie associée à une élévation des marqueurs inflammatoires, une perte de poids et des complications aux longs termes telle que des dommages dans les poumons et un choc septique. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).
Devenir
Euthanasie : le poumon sera prélevé pour analyse histologique et prélèvement de sang.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, le recrutement des neutrophiles et la fibrose implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie du sepsis et du SDRA. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation et les dommages pulmonaires pouvant mener à la fibrose, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en modèle cellulaire.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux grâce à une approche statistique, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude donc une analyse statistique appropriée sera réalisée.
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, prélèvement de sang) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque) ou par injection de kétamine/xylazine en intra-péritonéale. Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Pour les modèles d’induction par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique qui sera administré en phase pré- et post-opératoire ainsi qu’un analgésique local appliqué lors de la procédure chirurgicale. En dehors de la phase de chirurgie, l’utilisation d’antibiotiques peut être nécessaire afin de retarder le choc septique. Toutefois, en cas de douleur ou de souffrance importante, un analgésique pourra être employé. Nos études étant basées sur des modèles inflammatoires, les anti-inflammatoires ne sont pas applicables. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 5 premiers jours qui suivent l’induction puis trois fois par semaine pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est compris entre 5 et 7, l’animal recevra une injection de buprénorphine ou de meloxicam. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour ces modèles en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat Sprague Dawley (SD) est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6 et Balb/c représentent les souches de choix. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier du modèle utilisé, des objectifs et des besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés d’au moins 8 semaines au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.
Etude de la formation de la cardiomyopathie atrial associée à la réponse immuno-inflammatoire dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 70
Nourries quatre mois d'un régime enrichi en graisse, des souris sont prélevées d'une goutte de sang à la queue huit fois en deux heures, éveillées et chacune isolée dans une cage, puis examinées sous anesthésie par échocardiographie. D'autres souris et des rats subissent une chirurgie cardiaque destinée à installer une insuffisance cardiaque, et d'autres souris encore sont irradiées puis reçoivent le lendemain des cellules de moelle osseuse de souris donneuses. Au total, 1 370 souris et 70 rats, soit 1 440 rongeurs, vont être utilisés, la déclaration en comptant 1 100 en souffrance modérée et 340 en souffrance sévère. Le porteur cite comme effets possibles des difficultés à se déplacer et à s'alimenter, des douleurs après l'opération, des arrêts cardiaques et un affaiblissement après l'irradiation. Tous seront tués à la fin des actes, pour les prélèvements et les analyses.
Objectifs
La fibrillation atriale est l’arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population faisant craindre une épidémie dans les 50 prochaines années. La cardiomyopathie atriale définie une déformation du myocarde atrial, un remodelage du tissu et une désorganisation de la hiérarchie du tissu. A l’échelle fonctionnelle, les conductions électriques sont anormales et favorisent les troubles du rythme (arythmie). Récemment, il a été décrit une accumulation de tissu gras à l'épicarde de l'oreillette. Les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques de la fibrillation atriale, dans lesquels ce tissu gras épicardique semble dégénérer et libérer des facteurs qui diffusent librement dans le myocarde. Une infiltration de cellules immunes est observée, perturbant l’environnement homéostasique. Quiescent dans le cœur sain, l’épicarde atrial est réactivé en réponse à un stress, et devient une source de progéniteurs capables de se différencier en myofibroblastes et en adipocytes. Un stress de l'environnement réactive les progéniteurs et induit une transformation de ces cellules en adipocytes qui composent le tissu gras. Aujourd'hui, rien n’est connu sur les échanges et l'impact des cellules inflammatoires avec les progéniteurs. Les objectifs sont d'identifier les cellules immunitaires infiltrées et de comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Les projets portant sur la compréhension du changement de structure et de fonction de l'oreillette dans le contexte de l'obésité et de l'insuffisance cardiaque permettront de cibler le rôle de l'inflammation et ses conséquences dans le développement précoce des troubles du rythme atrial.
Procédures
Procédure souris obèses : les souris seront mises sous régime enrichie en graisse pendant 4 mois. Elles seront soumises à une prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures pour tester l'évolution de syndromes métaboliques. Pour cela, les animaux sont vigiles, isolés les uns des autres dans 1 cage. Lors du prélèvement à la queue, chaque souris est posée tranquillement sur la grille, sans contention et le prélèvement d’une goutte de sang est effectuée en quelques secondes. Des mesures cardiaques seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Durant toute la procédure, les animaux seront anesthésiés. Procédure, insuffisance cardiaque : les souris et les rats subiront une chirurgie cardiaque, sous anesthésie avec un anesthésiant et une injection de combiné de deux analgésiques pour respecter le bien-être animal. La durée de l'intervention est de 10-15 minutes. Puis, des mesures échocardiographies sous anesthésie seront réalisées, la durée est de 5minutes par animal. Procédure irradiation : les souris receveuses, seront irradiées, la durée est de 5 minutes par animal. Le lendemain elles sont transplantées avec des cellules issues de la moelle osseuse de souris donneuses.
Impact sur les animaux
L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage mais également à une obésité, un diabète. L'insuffisance cardiaque engendre des difficultés de déplacement et d'alimentation les 1ers jours et des arrêts cardiaques. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire) mais aussi à des douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux. L’irradiation peut également induire un affaiblissement général en plus du risque infectieux accru.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.
Remplacement
Les projets ont pour but de comprendre l’influence du métabolisme et de l'immunité sur l’activité cardiaque et le remodelage atrial. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences. Des lignées de cellules seront aussi utilisées.
Réduction
La taille des effectifs est établie avec un calcul de puissance en amont et par la suite des analyses seront effectuées en plus du nombre d'animaux. Les lots d'animaux d'expérimentation sont 1370 souris + 70 rats = 1440 animaux
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux sont en cage par 5 avec du matériel d'enrichissement. Les souris rendues obèses seront surveillée quotidiennement, des tests de glycémie seront réalisés pour surveiller l'obésité et le diabète. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent, notamment sur l'aspect du pelage, le comportement et la mobilité. Dans le projet de l’insuffisance cardiaque, les animaux sont en cage par 5. Le jour de la chirurgie, ils sont anesthésiés puis rasés sur le thorax et désinfectés avec un antiseptique dermique. Une dose d'analgésique sera injectée en sous cutané chez l’animal 30 minutes avant la procédure chirurgicale et 30 minutes avant la fin de la procédure. La 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Les souris seront surveillées quotidiennement et la prise de poids sera évaluée de manière hebdomadaire. Les points limites seront évalués quotidiennement par un personnel compétent et formé. Le comportement, la mobilité, la prise de poids, l'aspect du visage, l'aspect de la cicatrice seront des critères évalués quotidiennement par un scoring. Dans le projet de l’irradiation, les souris seront surveillées quotidiennement, une attention particulière sera effectuée sur la consommation de l’eau dans lequel un antibiotique sera ajouté pour contrôler la fragilité à l’infection. Une alimentation directement dans la cage pour faciliter l’hydratation en post-irradiation avec de la nourriture molle sera employée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié pour nos études concernant la réponse systémique dans le développement des arythmies cardiaques. Il s'agit du seul modèle dans lequel ont été générées des lignées déficientes pour l’expression de gènes d'intérêt. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études concernant l'isolement de cellules progénitrices de l"épicarde. Le modèle d'insuffisance cardiaque permet d'augmentere le nombre de cellules progénitrices in situ, de les isoler et de travailler par la suite in vitro. Souris et rats adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.
Corrélats corticaux de l’activité oscillatoire du noyau subthalamique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
410 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, la plupart dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et quatre-vingt-dix opérés sans réveil. Ils subissent une chirurgie de quatre à six heures pour implanter des électrodes dans un noyau profond du cerveau, une partie recevant aussi un cathéter, afin d'étudier la recherche compulsive de cocaïne et ses marqueurs électriques. Le porteur évoque une gêne liée au bloc de ciment dentaire fixé sur la tête, une perte de poids et un isolement des animaux après l'opération. Il mentionne des tests comportementaux "connus et maîtrisés" sans les détailler, et affirme que l'étude de la consommation exige un animal vigile et libre de ses mouvements, jugeant le rat irremplaçable.
Objectifs
L’un des enjeux actuels de la recherche sur les addictions est de comprendre pourquoi seuls quelques usagers (15-20 %) développent des comportements de recherche/consommation pathologiques. Dès lors, identifier les individus les plus vulnérables représenterait une avancée critique en termes de politique de prévention et de prise en charge, mais de tels biomarqueurs prédictifs de l’addiction n’ont jusqu’alors pas été caractérisés chez l’homme. Nos résultats récents obtenus chez le rat indiquent que l’activité électrique oscillatoire du noyau subthalamique (NST) pourrait prédire la future émergence de la recherche compulsive de cocaïne. Toutefois, la position profonde de ce noyau, nécessitant d’y implanter des électrodes d’enregistrement, attenue le potentiel translationnel de ce biomarqueur. Il est donc nécessaire de trouver des corrélats corticaux qui refléteraient l’activité du NST, permettant ainsi d’effectuer des enregistrements non-invasifs. L’objectif du projet est de rechercher un équivalent de ces activités oscillatoires en surface, au niveau des cortex moteur et préfrontal chez le rat et de confirmer son caractère prédictif sur l’émergence de la recherche compulsive de drogue.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de déterminer s’il existe au niveau cortical un corrélat de l’activité pathologique du NST, qui permet d’identifier les futurs individus compulsifs. La caractérisation d’un tel marqueur en ‘surface’ aura de fortes répercussions translationnelles, puisqu’il permettrait de détecter les individus vulnérables à l’addiction, de manière non-invasives, avant l’apparition de comportements pathologiques de recherche et de consommation de drogues.
Procédures
L'ensemble des animaux de ce projet sera soumis au moins une fois à un acte chirurgical (4-6h). 90 animaux seront soumis à un seul acte chirurgical (implantation d'électrodes) dans le cadre d'une procédure sans réveil. 280 animaux subiront deux actes chrirurgicaux (cathéter puis implantation d'électrodes, 90-120minutes) dans le cadre d'une procédure avec réveil
Impact sur les animaux
* Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. L’implantation d’électrodes peut aussi engendrer une gêne initiale, due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période.
Devenir
A l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort, et leur cerveau sera prélevé pour études histologiques ou investigations électrophysiologiques
Remplacement
Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.
Réduction
Nous utilisons le calcul de puissance lors de la planification des expériences : ce calcul permet de fixer un effectif tel que l’on ait 80% chances de vérifier notre hypothèse pour un seuil de significativité́ inferieur à 5%. Ce calcul nécessite de connaitre au préalable la taille de l’effet et la variabilité́ des mesures, ce qui n’est pas toujours possible. Il convient également de prendre en compte les aléas inhérents à ce type d’étude, tels que le risque d’infection, de cathéter bouché et/ ou de mauvais placements des électrodes, qui peuvent nous amener à exclure certains individus de l’étude. Ainsi, dans l’optique de limiter le nombre d’animaux à un strict minimum ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous analyserons régulièrement les données expérimentales. Nous effectuerons des tests de puissance statistique a posteriori afin de calculer la robustesse statistique (puissance >0,8 pour un p < 0,05) de nos résultats. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale.
Raffinement
Suivant la chirurgie et pour le reste de l’expérience, les animaux seront hébergés seul, afin de limiter d’éventuelles bagarres entre congénères qui pourraient dégrader le matériel d’enregistrement préalablement implanté. Les animaux auront un accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). Nos expériences impliquent un contact quotidien avec les animaux (flush des cathéters, protocoles comportementaux…), facilitant ainsi le suivi individuel des animaux, nous permettant de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de signes de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) et/ou de perte importante de poids, l’animal aura un accès ad libitum à une nourriture enrichie et un traitement antidouleur pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est réalisée par des personnels compétents. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'homme. Des rats adultes (9-10 semaines, environ 300-350g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique, seront utilisés.
Etude des effets anti-tumoraux de perturbateurs du métabolisme cellulaire dans le cancer de la prostate
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules cancéreuses sous la peau ou dans la prostate par chirurgie, puis des injections répétées de composés jusqu'à vingt-cinq semaines, développant tumeurs et métastases qui reproduisent la maladie humaine. Le porteur reconnaît des pertes de poids et des atteintes au point d'injection pouvant aller jusqu'à la nécrose. Il affirme avoir mené des essais in vitro sur cellules humaines et conclut à la "nécessité" de la souris pour tenir compte de toutes les interactions de l'organisme.
Objectifs
Selon le dernier rapport de l'Institut National du Cancer, le cancer de la prostate (PCa) est le cancer le plus fréquent chez l'homme et la troisième cause de décès par cancer en France. Le cancer de la prostate représente plus de 50000 nouveaux cas et 8000 morts par an en France. L'ablation de la prostate (prostatectomie) ou la radiothérapie sont les traitements des tumeurs localisées. Lorsque le cancer devient métastatique, des traitements anti-hormonaux (anti-androgènes) et/ou une chimiothérapie (Docetaxel) sont prescrits. Cependant, à très court terme (1 à 2 ans) les patients développent une résistance. Ainsi, la nécessité de trouver de nouveaux traitements est cruciale. Au laboratoire, nous travaillons sur le métabolisme des cellules cancéreuses, en effet, celle-ci ont un métabolisme différent des cellules normales. Notre stratégie est donc de cibler cette particularité est ainsi identifier des approches thérapeutiques nouvelles qui vont contrecarrer les résistances aux thérapies existantes. Grâce à l'expérimentation animale nous pouvons ainsi valider dans un modèle intégré les résultats obtenus dans des cellules en culture.
Bénéfices attendus
100% des options thérapeutiques actuelles pour le cancer de la prostate métastatique conduisent à une résistance aux traitements. Il est donc important de trouver de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du métabolisme des cellules cancéreuses de prostate est une piste thérapeutique intéressante. Nous caractériserons l'action anti-tumorale et anti-métastatique de molécules qui ont un effet anti-prolifératif et diminuent l'agressivité des cellules cancéreuses in vitro. Cela apportera la preuve de concept que dans un système physiologique intégré (étude préclinique) ces molécules ont un effet anti-cancéreux.
Procédures
Nous réalisons différentes expériences qui nous permettent de tester les effets anti-tumoraux de nouveaux composés. Au total, nous réalisons 4 types d'interventions dont une procédure chirurgicale : 1) injections en sous-cutanée de cellules cancéreuses, cette intervention est réalisée une seule fois par souris et pour une procédure, elle dure 10 secondes. Cette nuisance concerne 540 souris. 2) injection intra-veineuse réalisée une seule fois par souris et pour une procédure, elle dure 10 secondes. Cette nuisance concerne 180 souris. 3) injection intra-péritonéale des agents, elle est réalisée 3 fois par semaine pour une durée allant de 6 à 25 semaines en fonction des procédures. Cette nuisance concerne 915 souris. 4) Une procédure chirurgicale ou les souris recevront une injection dans la prostate (greffe orthotopique) après une intervention chirurgicale qui dure 20 minutes. Cette nuisance concerne 185 souris. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables peuvent être la perte de poids. Les injections intrapéritonéales et dans une moindre mesure sous-cutanée pourront entraîner des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...). Il y aura également le développement de tumeurs intra-prostatique et de métastases qui reproduisent la pathologie humaine.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures et des traitements, nous étudions les tumeurs générées par xenogreffe sous-cutanée, in situ (dans la prostate) ou bien aux métastases dans différents organes, il est donc nécessaire de mettre à mort l'animal, afin de prélever ces tissus pour les analyser.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études in vitro sur des cellules cancéreuses humaines (prolifération, capacités migratoires et invasives des cellules) et nous avons montré que nos composés d'intérêt inhibent la prolifération des cellules cancéreuses ou induisent la mort. Il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de toute la complexité et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme. La formation de métastases est un processus complexe dont l'intégralité des étapes ne peut être étudiée que sur animal vivant.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, pour satisfaire à la réduction, chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Concernant les souris transgéniques, nous ne maintiendrons en élevage que les souris ayant un phénotype non dommageable et nous réaliserons des croisements uniquement pour générer le nombre d'animaux requis pour l'expérience, nous ne conserverons que les mâles qui génèrent un cancer de la prostate.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des conditions stériles permettant de maintenir l’environnement adapté à des animaux immunodéprimés. Nous assurerons un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des souris. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance et ainsi rendre en charge immédiatement tout mal être.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Sa physiologie est adaptée aux expériences que nous désirons réaliser. Dans notre projet, nous utilisons des modèles animaux déjà établis et disponibles auprès de fournisseurs agréés, il n'est donc pas utile de générer de nouveaux modèles. Enfin, nous étudions des composés qui ont déjà été utilisés chez la souris, ils ne sont pas toxiques, mais on ne connait pas leurs effets dans le cancer de la prostate. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour faire des analyses protéiques, génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Nous travaillons sur la prostate, nous utilisons donc que des souris mâles. Les procédures expérimentales proposées sont réduites dans leur durée au temps suffisant pour établir les effets anticancéreux potentiels des nouveaux composés testés. Nous n'utilisons que des souris mâles adultes à maturité sexuelle qui sécrètent les hormones mâles. La maturité sexuelle est obtenue entre 6-7 semaines chez la souris. Les animaux seront donc utilisés à partir de cet âge.
Etude de la digestibilité fécale d’aliments supplémentés ou non avec une enzyme, à différentes doses, sur poulets de chair en croissance
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
192 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et douze rendus à l'élevage. Enfermés jusqu'à huit jours en cage individuelle pour recueillir leurs fientes, ils testent la digestibilité d'aliments additionnés d'une xylanase non encore homologuée dans l'Union européenne. Le porteur reconnaît que le confinement peut provoquer stress, prostration, frustration et parfois des boiteries sur le grillage. Il indique que les animaux ayant consommé cette enzyme ou des marqueurs ne peuvent entrer dans le circuit de consommation, ce qui explique leur mise à mort et leur envoi à l'équarrissage.
Objectifs
Parmi les matières premières utilisées pour la formulation des aliments pour poulets, certaines d’entre elles, très intéressantes pour leur apport en énergie, contiennent également des fibres, dont les parois cellulaires sont indigestibles pour cette espèce animale. Les parois cellulaires végétales encapsulent le contenu cellulaire, réduisant la disponibilité des nutriments (acides aminés, phosphore, …) et augmentent également la viscosité de l’aliment, conduisant à une moindre digestion jusqu’à l’iléum. Les xylanases sont des enzymes capables de dégrader les parois cellulaires ; leur utilisation permet donc d’améliorer la digestibilité des aliments contenant des fibres. L’objectif de ce projet est l’évaluation de la digestibilité des aliments chez le poulet en croissance par l’incorporation d’une nouvelle xylanase, non enregistrée en Union Européenne, pour laquelle doivent être établies des mesures de digestibilité de l’énergie et de la protéine afin de constituer son dossier d’homologation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise sur le marché européen d’une nouvelle xylanase permettant d’améliorer la digestibilité de régimes alimentaires riches en fibres pour les poulets/volailles. Cette solution permettra de diversifier les sources de matières premières dans les aliments.
Procédures
En démarrage, de J0 (jour de l’éclosion) à J16, 4 aliments avec ou sans enzyme seront distribués. En croissance, de J16 à J23, 4 aliments avec ou sans enzyme avec marqueurs seront distribués. De J16 à J23, les poulets seront soumis à un hébergement en cages individuelles sur une durée maximale de 8 jours, permettant une collecte individuelle des fientes (d’une durée de 3 jours) nécessaire aux évaluations de digestibilité.
Impact sur les animaux
Le confinement des animaux dans des compartiments de surface réduite pendant la période en cage individuelle de 8 jours peut être à l’origine de réactions physiologiques ou comportementales au stress (morbidité, prostration, …). Les animaux peuvent ressentir un sentiment de frustration d’être logé en cage individuelle. Le logement sur grillage pourra entrainer dans de rares cas des boiteries. L’incorporation des marqueurs et de l’enzyme dans les aliments ne présente pas de nuisances pour les animaux.
Devenir
A la fin de l’essai, les 144 animaux en cage individuelle seront euthanasiés puis envoyés à l’équarrissage, car ils auront consommé des marqueurs, ce qui ne leur permet pas d’entrer dans le circuit de consommation. D’autres part, les animaux des groupes 2, 3 et 4 auront consommé une enzyme non enregistrée en Europe ce qui ne leur permet pas d’entrer dans le circuit de consommation. Les animaux surnuméraires des groupes 2, 3 et 4 élevés au sol seront euthanasiés car ils auront consommé une enzyme non enregistrée en Europe ce qui ne leur permet pas d’entrer dans le circuit de consommation. Les animaux surnuméraires du groupe 1 élevés au sol ne seront pas euthanasiés car ils n’auront pas consommé d’enzyme non enregistrée en Europe, ni de marqueurs et seront remis dans le circuit de consommation.
Remplacement
Des études préalables d’évaluation de différentes souches de xylanases ont été réalisées in vitro, afin de sélectionner la souche la plus efficace, dans ces conditions. L’enzyme a ensuite été évaluée sur poulets dans des essais de tolérance et d’efficacité. En revanche l’étape suivante d’évaluation de la digestibilité des aliments supplémentés avec cette enzyme n’a encore jamais été réalisée. L’effet d’une xylanase dans un aliment pour poulet sur sa digestibilité est la résultante d’une série de mécanismes et régulations physiologiques (digestives, métaboliques, endocrinologiques) interagissant entre elles. La complexité de ces interactions ne permet donc pas d'utiliser des modèles alternatifs comme la modélisation ou la mise en place d'études in vitro.
Réduction
Les animaux choisis seront issus du même parquet de reproducteurs, et seront tous des mâles, afin de limiter la variabilité individuelle. En effet, le sexe fait partie des variables indépendantes qui peuvent influencer la digestibilité des nutriments. La méthode de référence en Europe pour la détermination de la digestibilité de l’énergie en volaille est basée sur l’utilisation de poulets mâles. Le nombre de répétitions (de mesures de digestibilité) est estimé à 18 par groupe expérimental, avec 4 groupes au total. En effet, la mise en cage individuelle permet de récupérer 144 échantillons de fientes, soit 36 échantillons de fientes par traitement expérimental. Ils sont ensuite poolés par 2 échantillons. Le pool est nécessaire pour avoir assez de contenus sur sec pour réaliser les différentes analyses de digestibilité. Il y a donc 18 répétitions de digestibilité par traitement. Ceci correspond au nombre de répétitions nécessaires pour obtenir : - une différence significative de 1.56 point en digestibilité de la protéine, avec un coefficient de variation de 2% sur ce paramètre, en prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%, - une différence significative de 71.6 kcal en digestibilité de l’énergie (énergie métabolisable apparente), avec un coefficient de variation de 2.2% sur ce paramètre, en prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%. La distribution des données sera évaluée selon des diagrammes en boite à moustache afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, des analyses statistiques seront réalisées sur les données zootechniques et la mortalité. Le niveau de significativité est fixé à p
Raffinement
L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Des points limites stricts et définis à l’avance seront appliqués tout au long du projet. Chaque cage disposera d’une ficelle, afin que les animaux puissent la manipuler. Les poulets ont la possibilité de se voir, de s’entendre et d’émettre des vocalises.
Choix des espèces
L’espèce choisie pour la réalisation du projet est le poulet car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) étudiés dans le cadre de ce projet lui sont spécifiques. Les animaux seront utilisés du jour de l’éclosion jusqu’à 23 jours d’âge. Ils pèseront environ 42g à leur arrivée, et environ 1,4 kg à 23 jours. Le projet porte sur l'évaluation de la digestibilité chez le poulet en croissance, autrement dit chez le poulet âgé de quelques semaines.