Procédures sévères
Prélèvements et injections sur des modèles AGA dans un contexte de génotypage, caractérisation moléculaire et phénotypage in-vivo dans un élevage.
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rats : 696
80 905 animaux non-humains, 80 209 souris et 696 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant surtout un niveau de souffrance léger, avec 10 102 cas modérés et 12 sévères. Ils subissent des biopsies de la queue, des injections et des prélèvements de sang pour génotyper et caractériser des lignées génétiquement modifiées, une partie étant tuée pour prélever des tissus ou faute de porter la modification recherchée. Le porteur indique que les animaux d'intérêt sont maintenus en vie et expédiés aux chercheurs, et que d'autres sont utilisés pour former le personnel. Il présente le recours à un organisme entier comme difficilement substituable et signale que la suppression de certains gènes provoque des phénotypes sévères, jusqu'à une mort précoce.
Objectifs
Réalisation de prélèvements et injections sur les animaux génétiquement modifiés dans le but de les caractériser, les valider et de réaliser leur production afin de livrer de slots expérimentaux aux aires thérapeutiques (Immuno-Oncologie, Immuno-Inflammation, Maladies Neurologiques Rares, Unité de médecine génétique). La validation du modèle consiste à vérifier la présence de la modification génétique et la caractérisation permet d'une part de vérifier qu’elle soit fonctionnelle puis d’autre part d’en mesurer l’impact sur la santé de l’animal. Ces techniques sont réalisées par du personnel formé et qualifié et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Avantages à court terme : valider, caractériser et vérifier la présence/absence de la modification génétique avant et pendant la production et l’utilisation des animaux présentant un intérêt pour les indications cliniques des aires thérapeutiques. Les unités de recherche ont au préalable déterminé en relation avec le département de biostatistiques le nombre d’animaux à utiliser pour atteindre leurs objectifs scientifiques. Avantages à long terme : les animaux génétiquement modifiés utilisés dans ce projet permettront l’avancée dans la compréhension de la physiopathologie de certaines maladies, améliorer le diagnostic et tester des molécules pour traiter les patients. Les connaissances scientifiques obtenues feront l’objet de publications dans un délai de 2 à 5 ans et le bénéfice sur les patients est attendu par le biais des études cliniques dans un délai de 5 à 10 ans.
Procédures
- Biopsie de queue : de 2mm maximum réalisée entre 10 et 21 jours d’âge - Injection unique ou répétée (maximum sur 5 jours) intra-péritonéale ou intraveineuse - Administration de Doxycycline dans l’eau de boisson et/ou la nourriture pendant 5 semaines maximum (contrainte liée à l’inappétence du produit) - prélévement de sang sur 14 jours (suivi glycémique) via la veine submandibulaire (contrainte de courte durée). Pour avoir des naissances ou des embryons à une date/stade précis, des injections d’hormones sont réalisées (contention, injection).
Impact sur les animaux
Stress ou douleur légère de courte durée liée à la biopsie de queue .Stress ou douleur légère de courte durée liée aux injections unique ou répétées (maximum sur 5 jours) intra-péritonéale ou intraveineuse . Inconfort lié à l'inappétence du produit dans l'eau de boisson et/ou la nourriture pendant 5 semaines maximum -Stress ou douleur légère de courte durée liée au prélèvement sanguin. La suppression de la protéine A peut entrainer un phénotype dommageable dont la gravité pourra potentiellement aboutir à un phénotype sévère, tel qu’une encephalomyopathie incluant retard de croissance, léthargie, perte des fonctions motrices, ataxie à évolution progressive entrainant la mort à ~7 semaines d’âge. La suppression de la protéine B entraine un phénotype dommageable de gravité modérée se traduisant par un stress accru, une diminution de la fertilité, une mortalité avant sevrage de 10% .
Devenir
Les animaux d’intérêt sont maintenus en vie et expédiés aux chercheurs pour être intégrés dans des projets de recherche en utilisation continue. Par ailleurs, certains animaux seront euthanasiés soit pour permettre le prélèvement de tissus nécessaire à la caractérisation du modèle, soit parce qu’ils ne présentent pas la modification génétique d’intérêt, ou ayant atteint un point limite. Enfin, certains animaux seront réutilisés pour la formation du personnel manipulant des animaux.
Remplacement
La validation, la caractérisation et la production de rongeurs répondent aux besoins de certains projets scientifiques de disposer d'animaux homogènes en poids et en âge selon des critères génétiques définis et en nombre suffisant. Les modèles génétiquement modifiés permettent de reproduire le contexte physiologique d’un organisme entier, cette étape est difficilement substituable puisque seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Chaque fois que des méthodes in silico ou méthodes in vitro (cultures de cellules, organoïdes…) suffisent à couvrir les besoins des chercheurs celles-ci sont privilégiées sans recours ultérieur à l'animal.
Réduction
La caractérisation moléculaire et l’immunophénotypage visent à déterminer la viabilité du modèle selon la cible analysée. Ce phénotypage est réalisé en amont de l’élevage afin de réduire la production inutile d’animaux en cas d’obsolescence du modèle. Le nombre d’animaux produit est optimisé par les pratiques d’élevage et le relevé d’indicateurs de production propres à chaque souche. Les objectifs de production sont réévalués régulièrement (maximum tous les 6 mois) avec les utilisateurs, et ajustés chaque fois que nécessaire. Les demandes sont calculées sur la base des évaluations statistiques propres à chaque projet utilisateur, afin de limiter le nombre d’animaux produits aux stricts besoins des procédures en place dans chaque projet de recherche, selon les justifications statistiques de chaque test.
Raffinement
Les conditions d’utilisation des animaux sont conformes à toutes les législations en vigueur, encadrées par des procédures et mises en place sur la base des meilleurs standards internationaux. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, un enrichissement est placé dans les cages (cellulose de nidification, dômes en carton) et un enrichissement sonore est présent dans chaque pièce d’hébergement afin de couvrir les sons liés au travail zootechnique. L’observation des animaux est faite quotidiennement par du personnel formé et compétent. Le responsable de l’étude est informé de toute anomalie, de même que le vétérinaire désigné si des signes cliniques sont relevés. Chaque observation est consignée, permettant ainsi de suivre le bien-être de l’animal et d’ajuster au besoin les conditions environnementales. Dans le cas où la modification génétique altère le bien-être de l'animal nous mettons en place les mesures nécessaires pour y remédier (environnement, nourriture à disposition dans les cages, critères d’arrêt spécifiques) et une surveillance quotidienne des animaux par du personnel formé et compétent. Les biopsies sont réalisées à la queue et font au maximum 2mm sur des animauxde 10 à 21 jours( absence d'innervation et de ossification à cet âge) afin de limiter l'impact de ce geste. Cette intervention ne concerne que les animaux dont le schéma d’accouplement ne permet pas 100% d'animaux porteurs de la modification génétique d'interêt. Dans le cas contraire, seuls les géniteurs sont biopsiés afin de garantir le génotype de la descendance sans avoir recours à la biopsie. Une seconde biopsie est réalisée si et seulement si les résultats de génotypage ne sont pas concluants.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des modèles pharmacologiques de choix pour les études scientifiques. En effet, leur génome facilement modifiable et à 90% similaire à celui de l’homme permet d’utiliser ce modèle pour mimer les pathologies humaines afin d’en comprendre l’origine et de tester des molécules dans les phases préliminaires de recherche. De plus, sa rapidité de production et d’hébergement permettent de réaliser des modèles en un temps et un espace restreint. Les animaux commandés sont le plus souvent des adultes (jeunes ou matures), permettant de garantir la pleine expression physiologique des cibles thérapeutiques visées. Le génotypage est effectué sur des animaux âgés de 10 à 21 jours afin de sélectionner les animaux d’intérêts aux études et aux renouvellements de géniteurs. Le phénotypage est effectué généralement sur des animaux âgés de 3 à 10 semaines. Des animaux plus âgés peuvent être également phénotypés dans le cadre d’études de vieillissement. Les animaux sont expédiés généralement entre 5 et 8 semaines d’âge selon les besoins des chercheurs.
Evaluation de la douleur chez le poisson dans le but de créer une grille de score
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Autres poissons : 636
636 poissons zèbres et 636 autres poissons vont être utilisés, une partie tuée et une partie remise en élevage, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Ils sont plongés dans un bain de substances provoquant douleur ou anxiété, puis isolés pour un test comportemental d'une heure, avant de recevoir un analgésique ou d'être tués. Le porteur reconnaît que la douleur est attendue et inévitable, l'objectif étant de bâtir une grille d'évaluation de la douleur chez le poisson. Il affirme que les comportements observés ne sont ni prévisibles ni reproductibles autrement que sur l'animal vivant.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste à mettre au point une grille de score de la douleur chez le poisson. En effet, chez l’Homme ou chez les autres modèles animaux, on utilise des grilles de score basées notamment sur les expressions faciales, afin d’évaluer la douleur ; une telle grille n’existe actuellement pas chez les poissons, bien qu’ils soient de plus en plus étudiés en recherche. L’objectif de ce projet est donc de trouver d’autres critères afin de pouvoir créer une grille de score de la douleur chez le poisson, facilement utilisable par tous. Afin d’établir une grille de score qui soit représentative des différents niveaux de douleur et comportements associés, nous réaliserons ces tests sur 2 espèces de poissons modèles : le poisson zèbre (Danio rerio) et le médaka (Oryzias latipes). Dans un premier temps, nous souhaiterions comparer l’effet de la phéromone d’alarme fraiche (Schreckstoff) et de son substituant chimique sur les comportements associés au stress des poissons. Des études préliminaires nous ont permis de voir que le substituant chimique de la phéromone d'alarme ne permettrait pas d’obtenir un panel complet des comportements observés lors des situations de stress ou de douleur. Il est donc important de pouvoir terminer cette étude préliminaire afin de comparer les deux molécules et de caractériser tous les comportements à inclure dans la grille de score. En effet, le stress a un impact important sur le comportement et la physiologie des poissons et est une composante à part entière de la douleur, il est donc difficile de les différencier. C’est pourquoi le stress doit donc être pris en compte dans la création de cette grille de score de la douleur afin de discriminer les deux états. Lors de la phase 1, nous déterminerons par des tests la molécule la plus pertinente pour mesurer le stress. Puis, lors de la phase 2, nous établirons la grille de score en applicant sur les poissons les différentes combinaisons de molécules (dont celle déterminée en phase 1), connues pour induire ou réduire le stress ou la douleur, et en analysant leur comportement à travers différents tests.
Bénéfices attendus
La création d’une grille de score de la douleur est un atout pour la bonne utilisation du modèle poisson à des fins d’utilisation scientifique. Celle-ci permettra de mieux évaluer la douleur du poisson aussi bien lors des pratiques utilisées en conditions d’élevage que lors de la réalisation des projets scientifiques. Une meilleure compréhension de la douleur chez le poisson permettrait d’améliorer le raffinement des procédures.
Procédures
Les poissons serons soumis à un bain contenant un principe actif provoquant ou stoppant la douleur ou l’anxiété pendant maximum 5min. Ils seront ensuite transférés dans un aquarium de test afin de réaliser un test comportemental dont la durée maximale sera d’une heure. Lors de ce test il est isolé de ces congénères. A la suite de ce test, le poisson recevra une dose d’analgésique ou sera euthanasié.
Impact sur les animaux
Cette étude vise à évaluer les différents signes de douleurs aussi bien comportementales que physiologiques. Une douleur est donc attendue et inévitable dans ces procédures. Nous veillerons à ce que celle-ci soit la plus courte possible et les poissons seront sous surveillance constante pendant la procédure. A la fin de la procédure la douleur sera stoppée à l’aide d’analgésique ou par la mise à mort de l’animal.
Devenir
A l’issu de chaque procédure et en fonction de l’avis vétérinaire les animaux seront soit récupérés et remis en élevage, soit mis à mort.
Remplacement
Dans le cas de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives. Les comportements observés sur les animaux aquatiques sont non prévisibles ou reproductibles. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les études comportementales se font directement sur l’animal vivant. De plus elles peuvent apporter des informations fondamentales en relation avec de grandes questions biologiques.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chacune des procédures. Pour cela nous avons limité précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses . De plus des expériences précédentes nous ont permis de valider ce nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats. Le groupe contrôle de la phase 1 sera soumis à tous les tests comportementaux afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé lors de l’élevage. Si les animaux montrent des signes de mal-être lors de l’élevage, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Pour vérifier le bien-être lors de l’élevage nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, rétraction des pigments. Afin de prévenir le stress dû à l'isolement de l'animal en plus de celui du nouvel environnement, l'animal aura accès à l'espace de test. Des tests préliminaires ont montré qu'une habituation à l'isolement s'effectue au bout d'une semaine. La surveillance des animaux sera réalisée visuellement par du personnel compétent et de façon constante lors des traitements et des tests de comportements jusqu’à ce que la douleur ou le stress soit supprimé par l’application de médicaments.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses comportementales, aussi bien pour des comportements « innés » (fonctions motrices et sensorielles) que pour des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces comportements ont été observé chez plusieurs espèces de poissons. De plus la croissance rapide du poisson-zèbre et du médaka, son développement externe dans un oeuf avec tous les stades de développement directement accessibles et sa facilité de modification génétique en font des modèles de choix. Ces modèles étant de plus en plus utilisés, il est alors important de pouvoir établir une grille de score de la douleur. Les poissons seront étudiés au stade adulte, soit à partir de 6 mois qui correspond à la maturité sexuelle et jusqu’à deux ans qui correspond au maximum de ses capacités de reproduction. Ces stades de développement nous permettent d’effectuer les différents tests de comportement pour évaluer les critères de la douleur.
Effet cardioprotecteur de la clusterine dans l’ischémie/reperfusion myocardique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
189 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 165 dans des procédures de gravité sévère et 24 opérées puis tuées sans reprise de conscience. Elles subissent une chirurgie d'infarctus par ligature d'une artère coronaire, avec des douleurs post-opératoires possibles pendant plusieurs jours, puis des injections et des prélèvements de sang répétés. Le projet teste l'effet protecteur de la clusterine après un infarctus, sur des souris génétiquement modifiées et leurs congénères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'ischémie-reperfusion et que seul un système intégré in vivo reproduit la pathologie.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d'étudier l'effet protecteur de la clusterine au cours de l'infarctus. La clusterine est une molécule capable de neutraliser les signaux de danger libérés par les cellules mortes au cours de l'infarctus. Nous utiliserons pour cela un modèle de souris déficientes en clusterine et leurs congénères contrôles. Nous utiliserons un modèle d'infarctus chez la souris, nous permettant d'étudier l'effet de la clusterine sur la taille d'infarctus après 7 jours. Nous étudierons également la cinétique de libération dans le sang de la clusterine et des signaux de dangers qu'elle neutralise, les niveaux d'expression de clusterine et des marqueurs de l'inflammation dans le tissu cardiaque ainsi que le rôle protecteur de la clusterine in vitro sur des cellules isolées de coeur de souris.
Bénéfices attendus
L’infarctus du myocarde aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde.. Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge précoce de l’infarctus du myocarde, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité aigue grace à la revascularisation, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer une insuffisance cardiaque dans le long terme. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la morbi-mortalité reste élevée (50 % de mortalité à 5 ans) et les traitements ne sont pas curatifs. A ce jour, le remodelage du myocarde après un infarctus constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Cela nécessite de mieux comprendre les mécanismes qui régissent l’altération de la fonction cardiaque post-infarctus à partir de modèles expérimentaux qui reproduisent les différentes composantes de la pathologie humaine. Ceci est un gage d’une meilleure transposition vers la clinique dont le besoin de nouveaux traitements est urgent. Le but du présent projet est de démontrer que la clusterine pourrait constituer une stratégie thérapeutique prometteuse et originale pour le traitement de l'infarctus du myocarde.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'infarctus du myocarde par ligature coronaire. La durée totale de l’intervention est d'environ 60 min, dont 15 min entre l’intubation oro-trachéale et l’accès au coeur, 30 min de ligature coronaire et 15 min pour la fermeture du thorax. 3 injections iv (dans la veine caudale) de clusterine (avant la ligature coronaire, à J2 et à J3) et/ou 1 injection de molécules neutralisées par la clusterine (avant la ligature coronaire) seront réalisées. 4 prélèvements de sang seront réalisés (avant l’occlusion, à H4, H24 et J7).
Impact sur les animaux
Au cours de la procédure chirurgicale, les nuisances ou effets indésirables (qui seront surveillés) sont l’hypotension et le refroidissement corporel pouvant causer un stress modéré. Après la chirurgie thoracique (thoracotomie), d’éventuelles douleurs post-opératoires modérées pendant plusieurs jours au niveau des nerfs intercostaux pourront avoir une incidence sur le bien être des animaux. Ces douleurs pourront être réduites par injection d’analgésiques.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.
Remplacement
Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, les lesions d'ischémie-reperfusion myocardique mettent en jeu, entre autres, des systèmes hormonaux, neuro-humoraux, des adaptations des systèmes circulatoire, rénal, central si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. Ainsi, le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude car actuellement, il n’existe pas de méthode alternative ni de modélisation possible pour l’ischémie-reperfusion myocardique. De plus, les études in vivo répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux le rôle de protéines dans l'ischémie-reperfusion myocardique , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. Une analyse statistique des résultats sera ainsi réalisée. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris: prélèvement sanguin, histologie, expression génique et protéique.
Raffinement
Nous raffinerons cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l'état général). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique avant la chirurgie et d’analgésique à différents temps (avant la chirurgie, après la chirurgie et si l'animal montre des signes de douleurs). Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabannes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les souris sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle d’infarctus du myocarde chez la souris est parfaitement maitrisé au laboratoire et mime le développement de la pathologie humaine. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques nécessaires à l'évaluation de la cardioprotection. La souris est ainsi un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, une partie du projet utilisera des souris génétiquement modifiées (CLU). C'est le seul modèle animal disponible qui présente une déficience en CLU. Les souris génétiquement modifiées sont des outils précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permettent d'étudier des mécanismes cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris de 3-4 mois (jeunes adultes) pour réaliser les interventions chirurgicales de manière optimale chez des animaux matures et pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie-reperfusion liée au vieillissement.
Etablissement d’un modèle syngénique de tumeur hépatique et développement de modèles pré-clinique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
2 189 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 1 709 d'entre elles. Elles subissent des greffes de tumeurs par laparotomie sous anesthésie, des injections répétées, des prélèvements de sang et des échographies, y compris des souriceaux de quelques jours et des femelles gestantes. Le projet développe un modèle d'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, les retombées cliniques restant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne miment que partiellement la maladie et juge le recours à l'animal indispensable.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au cisplatine au cours de la chimiothérapie ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude (souris immunodéprimées), chez qui un fragment de tumeur humaine ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires sont implantés en sous cutané ou directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale.
Bénéfices attendus
Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. Dans le cas des cancers de l’adulte les options thérapeutiques sont encore très limitées et peu efficaces dans les formes avancées. Quant aux cancers pédiatriques, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, certains sont réfractaires. Les modèles précliniques que nous allons développer sont les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique car ils sont représentatifs du comportement de la tumeur. Leur utilisation dans cette étude nous permettra donc de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients pour lesquels les options sont actuellement limitées.
Procédures
Les animaux pourront être soumis, selon la procédure considérée, aux gestes suivants : injections sous-cutanées d’analgésiques (animal vigile, 6 fois maximum, 30 sec), injections sous-cutanées d’une suspension cellulaire (animal vigile, 2 fois, 30 sec), injections intrapéritonéales (animal vigile, 10 fois maximum, 15sec), laparotomie (une seule fois, animal anesthésié, 30min maximum), greffe de tissus (une seule fois, animal anesthésié, 15 à 30 min selon la méthode considérée), prélèvements de sang (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle de une semaine minimum entre chaque, 1min) ; échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 10 min). Selon les molécules antitumorales que nous choisirons de tester, le nombre d’injections intrapéritonéales pourra être augmenté pour certains animaux, et deux gestes supplémentaires pourront être réalisés si nécessaire : administration par voie orale sur animal vigile (15 sec), injections intraveineuses sur animal anesthésié (30sec). Le nombre d’administration n’a pas encore été déterminé car il dépendra des composés choisis. Tous les actes chirurgicaux sont couverts par une analgésie appropriée.
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, déshydratation, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux.
Devenir
Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.
Remplacement
Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Les effectifs des différentes procédures ont été réduits au maximum, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes (nombre minimal d’animaux par groupe déterminé grâce à un calcul de puissance). Les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Des expériences préliminaires de mise au point seront réalisées afin de diminuer le nombre d’animaux utilisé par la suite (détermination des lignées cellulaires les plus appropriées, doses optimales à utiliser, etc.). Le suivi tumoral sera réalisé grâce à une méthode non invasive, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. L’effectif total du projet sera de 2189 animaux, et des tests statistiques appropriés seront choisis pour l’interprétation des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés sous une atmosphère contrôlée et selon les paramètres réglementaires (cages sur portoirs ventilés, 5 animaux par cage maximum, hygrométrie 55% +/- 10%, température 22°C +/- 2°C, éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 6h du matin à 6h du soir, nourriture et boisson à volonté). Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batonnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’en cas de mise bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi pourra être mise en place si l'état des animaux le nécéssite. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin.
Choix des espèces
La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, son génome présente une grande homologie à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne transposition des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. Des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois seront utilisées, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les embryons seront transfectés avec le vecteur viral à 15 jours post- insémination. De jeunes animaux âgés de 2, 5 et 15 jours seront également utilisés pour mimer le développement de tumeurs hépatiques chez l’enfant (les souriceaux présentent alors un foie immature et en prolifération, ce qui maximise les chances de développer un hépatoblastome), ainsi que des animaux adultes âgés de 6 à 8 semaines (ce qui correspond à l’âge classiquement utilisé pour les procédures de greffes).
Étude de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 90 d'entre eux. Une neurotoxine est injectée dans leur cerveau pour provoquer une dégénérescence proche de la maladie de Parkinson, avant l'administration de traitements par ultrasons focalisés, avec un risque d'hémorragie et d'œdème cérébral. Ils passent des tests comportementaux et des séances d'IRM sous anesthésie, puis sont mis à mort pour analyse du cerveau. Le porteur teste des sécrétomes de cellules souches et affirme que ces analyses ne peuvent être menées in vitro ou in silico.
Objectifs
La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue dans le monde. Selon l'Association européenne de la maladie de Parkinson (European Parkinson's Disease Association), plus de 6,3 millions de personnes dans le monde sont atteintes de cette pathologie. On estime à 1,2 million le nombre de patients rien qu'en Europe, un chiffre qui devrait doubler d'ici 2030. Sur le plan clinique, la maladie de Parkinson se caractérise par des complications motrices graves, dues à la dégénérescence progressive de neurones particuliers : les neurones dopaminergiques. Les causes de cette maladie restant largement inconnues, seules des thérapies symptomatiques fondées sur des approches pharmacologiques, la neurochirurgie et la kinésithérapie sont actuellement disponibles. Bien que ces traitements atténuent certains symptômes moteurs, le développement de nouvelles thérapies pour prévenir, ralentir voire interrompre la progression de la pathologie, comme par exemple des stratégies permettant d’agir sur les neurones dopaminergiques pour moduler leur activité (stratégies neuromodulatrices) et/ou ralentir leur dégénérescence (stratégies neuroprotectrices), représente l'un des plus grands défis à surmonter pour obtenir des avancées prometteuses dans la recherche translationnelle sur la maladie de Parkinson. Dans ce projet, nous souhaitons explorer l'utilisation de cellules souches adultes, et plus spécifiquement l’utilisation des facteurs qu’elles sécrètent, comme une thérapie potentielle pour la maladie de Parkinson. En effet, plusieurs études ont montré que l'effet thérapeutique des cellules souches serait lié à leur capacité à sécréter de nombreuses molécules neuromodulatrices, définies comme leurs sécrétomes, et qui auraient un effet régénérateur sur les neurones. Afin de tester ce nouveau concept thérapeutique, nous proposons d’étudier sur un modèle de rat de la maladie de Parkinson les effets des sécrétomes, en combinaison avec d’autres pharmacothérapies neuroprotectrices prometteuses. La délivrance de ces molécules dans le cerveau sera optimisée grâce à un dispositif de perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons focalisés. L’objectif final est de développer une stratégie innovante pour le traitement de la maladie de Parkinson avec un impact direct sur la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Dans un premier temps, le principal bénéfice attendu de ce projet est une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la maladie de Parkinson, et notamment leur potentielle modulation grâce à une stratégie thérapeutique innovante fondée sur des sécrétomes de cellules souches adultes. Pour évaluer l’efficacité thérapeutique de cette stratégie, des tests de comportement et des protocoles d’imagerie cérébrale utilisant l’IRM seront utilisés pour corréler les symptômes moteurs et non-moteurs liés à la pathologie avec des modifications cérébrales structurelles, fonctionnelles et métaboliques, mais également pour étudier comment ces modifications évoluent sous l’action des molécules thérapeutiques. Dans un deuxième temps, ce projet pourra aboutir à la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la maladie de Parkinson avec une perspective d'application clinique. L'objectif sera d'explorer, en plus de nouvelles cibles thérapeutiques, si l'utilisation des sécrétomes de cellules souches, combinée à d’autres médicaments modulateurs de la pathologie et à une méthode de délivrance optimisée dans le cerveau, peut conduire à l'amélioration non seulement des symptômes moteurs, mais également des autres symptômes associés à la maladie, ce que les thérapies actuelles ne permettent pas de réaliser efficacement. L’objectif final sera alors de proposer une stratégie innovante pour le traitement de la maladie de Parkinson avec un impact direct sur la qualité de vie des patients.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Une chirurgie sous anesthésie d’injection d’une neurotoxine dans le cerveau, afin d’induire une dégénérescence progressive de certains neurones dopaminergiques comme dans le cas de la maladie de Parkinson (d’une durée d’environ 30 minutes) ; -trois sessions d’administration d’un traitement (1 session par semaine), comprenant un protocole d’ultrasons focalisés sous anesthésie pour optimiser la délivrance des molécules thérapeutiques dans la zone pathologique et l’acquisition d’une image IRM pour contrôler l’absence de lésion (d’une durée d’environ 30 minutes par session) ; -trois sessions de tests comportementaux pour caractériser les symptômes moteurs et non-moteurs induits par la maladie de Parkinson et suivre leurs modifications par la stratégie thérapeutique utilisée (3 à 5 tests par session, 5 mn à 45 mn par test); -trois sessions d’acquisitions IRM sous anesthésie pour caractériser les modifications cérébrales structurelles, fonctionnelles et métaboliques induits par la maladie de Parkinson et suivre l’évolution de ces modifications induite par la stratégie thérapeutique utilisée (1 h à 1 h 30 par session, sans excéder 2 heures).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des injections unilatérales d’une neurotoxine seront utilisées pour induire une dégénérescence progressive de certains neurones dopaminergiques comme dans le cas de la maladie de Parkinson. Comme montré dans la littérature, les animaux ayant reçu cette injection dans le striatum droit de leur cerveau commencent à montrer les premiers symptômes d’une altération de leur coordination motrice trois semaines après l’injection. Les tests comportementaux utilisés pourraient induire un stress chez l’animal. De plus, l’un des tests utilisés nécessitera une restriction alimentaire (nourriture retirée de la cage la veille au soir de l’expérience). L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie légère. Il est possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit pendant les acquisitions IRM. Afin de délivrer les molécules thérapeutiques dans le cerveau, un protocole de perméabilisation non invasive et localisée de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons focalisés sera utilisé. Les potentiels effets indésirables sont liés au fait que ce protocole est réalisé sous anesthésie légère. De plus, des risques d’hémorragie et d’œdème cérébral existent en fonction des paramètres de perméabilisation utilisés.
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, qui permettront d’étudier au niveau cellulaire les potentielles modifications du système nerveux central induites par l’induction de la maladie de Parkinson et l’administration de traitements.
Remplacement
Bien que certaines stratégies alternatives, notamment celles impliquant des cultures cellulaires de neurones, puissent être envisagées pour tester l’efficacité neuroprotectrice ou neurorégulatrice de certaines molécules, l’utilisation d’animaux dans le cadre de ce projet reste nécessaire pour évaluer la progression des processus neurodégénératifs associés à la maladie de Parkinson, ainsi que les potentiels effets thérapeutiques des molécules testées sur les différents symptômes moteurs et non-moteurs de la pathologie. Ces analyses ne peuvent être réalisées sur des modèles in vitro ou in silico, car elles nécessitent de mimer les processus physiopathologiques observés chez l’homme, notamment la complexité structurelle, fonctionnelle et métabolique des circuits neuronaux.
Réduction
Dans ce projet, différentes approches thérapeutiques sont envisagées pour agir sur les neurones dopaminergiques atteints par la maladie de Parkinson, et notamment pour moduler leur activité (stratégies neuromodulatrices) et/ou ralentir leur dégénérescence (stratégies neuroprotectrices). Les animaux seront donc répartis en 10 groupes, en fonction des stratégies thérapeutiques testées, qui vont combiner l’utilisation de molécules neuromodulatrices et neuroprotectrices. Pour chaque groupe, le nombre d'animaux a été statistiquement défini pour permettre l’obtention de résultats fiables avec le moins d’animaux possible (10 animaux par groupe). De plus, des injections unilatérales de neurotoxine seront utilisées pour induire le modèle de la maladie de Parkinson. L'utilisation d'une injection unilatérale permettra de limiter les altérations de la coordination motrice (comparativement à une injection bilatérale), mais elle présente également l'avantage de pouvoir utiliser l'un des hémisphères cérébraux comme contrôle, ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux nécessaires. Enfin, la méthodologie retenue pour étudier les différentes stratégies thérapeutiques proposées comprend des tests comportementaux et des acquisitions IRM, techniques qui permettent un suivi longitudinal de l’animal avec la collecte de mesures répétées, ce qui contribue également à réduire le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Tout au long du projet, les animaux seront hébergés par groupe (2 à 3) avec de l’enrichissement (tunnel transparent de couleur rouge, bâton à ronger, papier à déchiqueter). Chaque animal sera suivi quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs du projet, afin de détecter tout indicateur de souffrance (mise en place de points limites) et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation. L’induction du modèle de la maladie de Parkinson sera réalisée en combinant des produits anesthésiques et analgésiques afin de limiter les douleurs liées à la chirurgie. Suite à cette induction, une grille de scoring sera utilisée pour suivre la progression des symptômes moteurs et non-moteurs de la pathologie. Les tests de comportement utilisés sont fondés sur le comportement exploratoire des animaux. Afin de limiter le stress occasionné, une session d’entraînement sera réalisée pendant la semaine qui précède le début des tests, afin que les animaux s’habituent aux expérimentateurs et aux dispositifs de tests comportementaux. Les sessions IRM et de perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique pour l’administration des traitements seront réalisées sous anesthésie avec contrôle de la respiration et de la température.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée en neurosciences, qui présente l’avantage d’avoir une organisation des structures cérébrales relativement proche de celle de l’homme. Son comportement est en outre bien documenté dans la littérature. En effet, il a l’avantage de présenter des similarités avec l’homme concernant certains mécanismes physiopathologiques de la maladie de Parkinson (et notamment l'apparition des principaux déficits moteurs), ce qui en fait un bon candidat pour étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Des rats de 8-9 semaines environ seront utilisées car ce stade de développement correspond à l’âge adulte pour cette espèce, et plus spécifiquement à un cerveau totalement mature en termes d’organisation anatomique et fonctionnelle.
Efficacité croisée, à long-terme et à court terme d’un vaccin contre la fièvre de Lassa chez le macaque cynomolgus (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
24 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent un implant abdominal par chirurgie, une à deux injections d'un candidat vaccin, une injection du virus Lassa, puis jusqu'à 26 prélèvements sur 15 mois. Le porteur indique que les animaux témoins développeront les signes cliniques d'une fièvre hémorragique, fatigue, diarrhée, déshydratation et perte de poids. Sur le remplacement, il affirme qu'il est impossible de se passer d'organismes entiers pour ces études précliniques qu'il juge indispensables.
Objectifs
Le virus Lassa (LASV) a un impact significatif sur la santé et l’économie des pays d’Afrique de l’Ouest, infectant et causant la mort de plusieurs milliers de personnes chaque année. De plus, 20% des survivants présentent des séquelles à long-terme, notamment un déficit auditif. Bien qu’étant un problème de santé publique majeur dans les pays endémiques, il n’existe à ce jour aucun vaccin pour prévenir les infections à LASV et aucun traitement complètement efficace. Bien qu’un vaccin préventif soit le meilleur moyen de contrôler les épidémies à virus LASV, un vaccin protégeant rapidement les personnes à risque ou permettant de contrer le développement de la maladie chez des patients récemment exposés serait un atout majeur dans la lutte contre la fièvre de Lassa. Ce projet de recherche se concentre sur le développement de vaccins contre LASV. L’innocuité et l’efficacité ont été démontrées chez le singe cynomolgus dans 2 études précédentes. Nous savons donc que le vaccin induit une protection efficace chez des singes vaccinés un mois ou 8 jours avant l'infection par le virus LASV mais il reste à démontrer un effet de protection contre d’autres souches, selon différents shcémas de vaccination et sur une vacination à long terme. Les résultats de ces expérimentations sont importants pour le passage de ce candidat vaccin en phases cliniques. Ce projet se déroulera dans deux animaleries.
Bénéfices attendus
Bien que la fièvre de Lassa soit un problème de santé publique majeur en Afrique de l’Ouest, il n’existe à ce jour aucun traitement ou vaccin disponible. La vaccination demeure l’approche la plus pragmatique pour enrayer les épidémies à virus Lassa. Comme indiqué par l’OMS, un vaccin contre la fièvre de Lassa doit idéalement remplir plusieurs caractéritiques : être sûr pour toutes les tranches d’âge, protéger après une seule injection, induire une protection croisée contre d’autres souches de virus et induire une protection à long terme. De plus, une vaccination d’urgence en contexte épidémique pourrait avoir un bénéfice imporant sur la limitation du nombre de cas, les clusters épidémiques étant généralement restreints à de petites zones géographiques. Le but de ce projet est de démontrer que ce vaccin, en plus de protéger 1 mois et 8 jours après immunisation, peut protéger à long terme, induire une protection contre d’autres souches de virus, et protéger à court terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie d’implantation abdominale d’un dispositif permettant de mesurer la température corporelle en temps réel (environ 30 min) (animalerie 1), 1 à 2 injections intramusculaire du vaccin (animalerie 1), 1 injection sous-cutanée du virus (animalerie 2) puis jusqu’à 26 prélèvements sanguins et écouvillons nasaux et buccaux (animalerie 1 et 2) sur une période de 15 mois (environ 15 min à chaque session de prélèvements) sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les animaux de cette étude sont équipés d’implants de suivi en temps réel de la température. Pour cela une chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale et soins anti-douleur. Après au moins deux semaines après la chirurgie (temps de convalescence), les animaux recevront le vaccin et seront soumis à des prélèvements sanguins, nasaux et buccaux. L’innocuité du vaccin utilisé a déjà été démontré dans ce modèle, il n’est donc attendu aucun effet secondaire. Dans chacune des deux expérimentations suivant ces étapes, les animaux vaccinés devraient uniquement présenter une élévation transitoire de la température, des signes de stress pendant quelques jours, puis devraient présenter un état de santé normal une à 2 semaine après l’infection. Les animaux contrôles devraient développer les signes cliniques d’une infection par LASV. Sur la base de nos expériences antérieures, nous nous attendons à ce que les animaux présentent des signes de stress ainsi qu’une hausse de la température corporelle environ 3 jours après l’infection. Dans les jours qui suivent, les animaux pourront présenter des signes de fatigue, de la diarrhée, une déshydratation, une perte de poids qui seront suivis quotidiennement. La procédure inclut des prélèvements répétés, réalisés sous anesthésie selon des volumes et une fréquence conforme aux recommandations éthiques en vigueur. Cela pourrait entraîner un inconfort, une diminution de l’alimentation et une fatigue temporaire lors du réveil.
Devenir
L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=24), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et vaccinés. Par conséquent, seule la mise à mort des 24 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.
Remplacement
Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire (classiquement utilisée depuis des décennies). Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Le vaccin utilisé ici a d’abord fait l’objet de caractérisation in vitro. La réponse immune induite a été testée et une forte réponse a été observée. Dans le cas des fièvres hémorragiques virales dont font partie les fièvres hémorragiques induites par les virus tels que le virus Lassa, il est impossible de remplacer les modèles animaux afin de réaliser des études sur la physiopathogénèse et les réponses immunitaires dans leur ensemble. Ce projet vise donc à démontrer l’efficacité d’un candidat vaccin contre l’infection, ce qui nécessite obligatoirement des organismes entiers. De plus, cela s’inscrit dans des études précliniques, indispensables au développement d’un candidat vaccin.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible pour obtenir des résultats interprétables et pertinents. En effet, un effectif de trois animaux par groupe représente le minimum absolu permettant des résultats statistiquement significatifs. Au-delà de la survie, les groupes seront comparés en fonction des valeurs de score au cours de la maladie, des valeurs des paramètres biochimiques, virologiques et autres paramètres physiologiques. Les tests statistiques ne pourront pas être tous hautement significatifs, cependant, la multiplicité des paramètres évalués permet de démontrer de manière fiable les résultats obtenus. Les précédentes études basées sur des expérimentations utilisant des groupes expérimentaux de 3 animaux ont permis d’obtenir des données et résultats significatifs montrant que la présence ou absence de virémie est un critère essentiel.
Raffinement
Animalerie 1 : - Hébergement : En raison de l’hébergement dans l'animalerie 2 et d’optimisation de l’étude, les groupes seront composés en trio compatibles. Un programme d’enrichissement spécifique à l’espèce et à l’âge des animaux est mis en place sur tout le site de l’animalerie 1, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Suivi de la température corporelle : Malgré une chirurgie pour la mise en place de l’implant, le fait d’équiper les animaux avec un tel dispositif représente un raffinement à court, moyen et long terme (jusqu’à 14 mois) en tant que mesure non invasive et paramètre de surveillance dans le cadre des points limites. - Procédures : Les animaux seront anesthésiés à chaque intervention, afin de limiter le stress lié à la manipulation ainsi que la douleur aigue liée à la chirurgie d’implantation, et aux injections et prélèvements sanguins répétés (piqure d’aiguille). Les animaux seront sous couverture antalgique durant et suivant la chirurgie d’implantation. Afin de limiter l’impact des prélèvements sanguins répétés, les sites de prélèvements seront alternés. En cas d’hématome, un autre site de prélèvement sera utilisé et de la pommade sera appliquée sur l’hématome (Hémoclar). Une grille de points limite est mise en place pour détecter tout problème inattendu. Animalerie 2 : les conditions réglementaires d’hébergement sont appliquées. Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par 3 dans un milieu enrichi afin de permettre aux animaux de mettre en avant le plus possible un comportement naturel (perchoir, jeu, diversification alimentaire…). Une évaluation quotidienne (critères déjà éprouvés) sera réalisée dès l’infection, et des points limites ont été définis. Cela permettra une fin de procédure expérimentale dès l’atteinte d’un point limite. L’enregistrement permanent de la température permet une meilleure analyse de la maladie. Les animaux sont également grâce aux caméras permettant un contrôle visuel hors horaires de présence du personnel en laboratoire. En cas de doute sur l’état d’un animal, une entrée en laboratoire sera programmée pour procéder à une observation et à une possible décision.
Choix des espèces
Il n'existe pas de bon modèle rongeur pour la fièvre de Lassa, l’Arénavirus responsable de fièvre hémorragique le plus étudié à ce jour. Les cobayes et des souris génétiquement modifiées peuvent présenter une susceptibilité plus ou moins prononcée mais ces modèles ne reproduisent qu'en partie la pathogénèse et les réponses immunitaires qui ont lieu chez l'Homme. Ce projet ne nécessite pas d'exigences particulières concernant le stade de développement des animaux utilisés hormis le fait de former des groupes homogènes en âge et poids pour pouvoir analyser les résultats sans biais. Les animaux utilisés seront des juvéniles sevrés d’au moins 12 mois et de moins de 3 ans.
Etude de l’environnement inflammatoire cérébral post-radiothérapie : suivi par microdialyse sur rat porteur de glioblastome (EU porteur; EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale humaine leur est implantée, puis une sonde de microdialyse par une chirurgie classée sévère, avant des prélèvements de liquide cérébral sur animal éveillé maintenu en cage de contention individuelle, avec radiothérapie et imagerie. Le porteur teste un médicament associé à la radiothérapie sur le glioblastome et présente la microdialyse comme un moyen de réduire le nombre d'animaux en répétant les mesures sur un même individu. Il annonce une mise à mort au point limite ou au plus tard 90 jours après le début, et juge les méthodes alternatives 'clairement pas possibles'.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes et sont généralement agressives. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nouvelles molécules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique d'un médicament innovant (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine implantée chez l'animal. L’objectif du projet étant d'étudier la réponse immunitaire après traitement par ce médicament innovant en association avec la radiothérapie. Pour cela nous utiliserons une technique qui permet un dosage répété des molécules présentent dans l'environnement de la tumeur sans réaliser de biopsie du cerveau. Au cours d'une chirurgie nous plaçons une sonde dans la tumeur cérébrale de l'animal; celle-ci nous permettra de mesurer la réponse immunitaire durant plusieurs jours. Cette technique permet de réduire considérablement le nombre d'animaux comparé aux techniques traditionnellement utilisées qui necessiteraient la mise à mort de l'animal pour chaque point de mesure. Pour le suivi de l'évolution de la masse tumorale des différents traitements, nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament innovant pour le traitement du glioblastome. La technique de mesure utilisée permettra, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le tissu cérébral, d'obtenir des échantillons de façon dynamique tout en gardant l’animal en vie. Ces échantillons nous permettront un suivi au cours du temps de la réponse immunitaire après traitement du médicament innovant et de la radiothérapie.
Procédures
Implantation dans le cerveau des animaux de tumeurs cérébrales humaines, cette chirurgie dure environ 1h. Implantation d'une sonde de microdialyse : durée de la chirurgie environ 1h30 ; présence de la sonde qui ressort au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal. Prélèvement de liquide cérébral sur animal vigile hébergé en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement. Cette méthode de prélévement sera réalisée du jour 11 au jour 17 sur l'animal conscient; l'hébergement en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement induit une restriction des déplacements de l'animal. Protocole de radiothérapie et imagerie pour le suivi de l'évolution de la tumeur sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
Implantation au niveau du cerveau de cellules tumorales d'origine humaine : chirurgie classée modérée car seule l’incision de la peau du crane peut provoquer une souffrance à l’animal. Nous utiliserons un analgésique local pour limiter la souffrance des animaux. Implantation de la sonde : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la sonde (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements adaptées au mode de prélèvement avec système de contention. Radiothérapie et imagerie sur l’animal : transport de l'animal jusqu’à la plateforme d'imagerie et de radiothérapie ; afin d’éviter toute nuisance à l’animal, le transport est réalisé en cages filtrées dans un sac de transport isotherme (pour le maintien d’une température optimale, des bouillottes chauffantes sont placées sous les cages si nécessaire). Les procédures de radiothérapie ou d’imagerie sont réalisées sur l’animal anesthésié. L'imagerie est un examen non invasif , il ne produit aucune forme de douleur.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet pour analyse des tissus cérébraux. La mise à mort est réalisée dès l’apparition d’un point limite (altération des déplacements et/ou perte de poids) ou en cas d'efficacité du traiement au maximum 90 jours après le début des expérimentations.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales et les effets du traitement par radiothérapie avec ou sans médicament innovant, dépendent de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
La technique utilisée est une méthode permettant le recueil du liquide cérébral et de ses composants sans avoir à mettre à mort les animaux. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements peuvent être réitérés au cours du temps. Nous n’avons pas de réelle idée des variations attendues entre les différents groupes d'animaux, il est donc compliqué de définir un nombre d’animaux précis nécessaire pour une obtenir une solide étude statistique mais 8 animaux par groupe semble tout à fait pertinent.
Raffinement
Les deux procèdures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress de l'animal et de permettre un réveil rapide. Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la sonde (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment des prélèvements intracérébraux, en effet les animaux seront régulièrement observés pour vérifier que le comportement des animaux n’est pas altéré par le mode de prélèvement et les contraintes de contention. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en cancérologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur et de la sonde de prélèvement plus précise mais également par la nécessité d’obtenir de volumes de prélèvement suffisamment importants. De plus la taille du cerveau de rat offre une meilleur résolution pour l’imagerie. Des rats âgés de 6-8 semaines sont utilisés, à un stade où la taille et la forme du crâne correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.
Évaluation pharmacologique de différentes approches thérapeutiques dans un modèle expérimental de cancer du côlon obtenus par inoculation de cellules tumorales par voie intra-cæcale chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules tumorales sont inoculées dans le côlon par voie intra-cæcale, puis les souris reçoivent chimiothérapie, immunothérapie ou radiothérapie, avec un suivi par imagerie pouvant durer plusieurs mois. Le porteur décrit une douleur liée au développement des tumeurs et de possibles métastases, la mise à mort survenant au point limite ou après des prélèvements incompatibles avec la survie. Il présente la souris comme un 'passage obligatoire' avant l'humain et renvoie la découverte de nouveaux médicaments au 'long terme'.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer les effets anti-cancéreux de différentes approches thérapeutiques comme la chimiothérapie, l’immunothérapie et la radiothérapie (en association ou non) dans un modèle expérimental de cancer du côlon chez la souris. Les animaux peuvent être déplacés vers une autre animalerie pour certains traitements et examens. Après implantation des cellules tumorales au niveau du colon, les souris seront suivies cliniquement pendant une période variable, allant de quelques semaines à plusieurs mois, en fonction de la croissance tumorale. Selon les cas, un suivi par imagerie (IRM ou bioluminescence) de la croissance tumorale pourra être réalisé. En cours de suivi, des prélèvements de sang pourront être réalisés. En fin d’expérience, les tumeurs pourront être prélevées pour analyses. D’autres prélèvements de tissus ou de sang pourront être effectués en phase terminale.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter le cancer du côlon, une pathologie humaine touchant plus de 43 000 personnes par an en France (dont environ 23 000 hommes et 20 000 femmes). Il est responsable de plus de 17 000 décès par an. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.
Procédures
Les souris de ce projet pourront subir une l'anesthésie gazeuse, l'administration du produit et/ou des prélèvements sanguins, le transport de l’animalerie vers la plateforme d’imagerie (moins de 10 min), une contention lors de la radiothérapie ou de l’imagerie [Mesure de la bioluminescence (moins de 10 min) ou IRM (15 à 60 min)] et lors des suivis cliniques (2 à 3 fois/semaine, environ 1 min), une douleur liée au développement des tumeurs variable selon la localisation (Colon pour le site initial ou autres organes dans le cas de métastases).
Impact sur les animaux
Les souris de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress post-opératoire, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit ou de prélèvements sanguins, un stress lié au transport de l’animalerie vers la plateforme d’imagerie (moins de 10 min), un stress lié à la contention lors de la radiothérapie ou de l’imagerie (Mesure de la bioluminescence, moins de 10 min ou IRM, de 15 à 60 min) et lors des suivis cliniques (2 à 3 fois/semaine, environ 1 min), une douleur liée au développement des tumeurs variable selon la localisation (Colon pour le site initial ou autres organes dans le cas de métastases).
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Et/ou Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le développement de la tumeur ou par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer colorectal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6-12 / par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur le cancer colorectal par injection de cellules tumorales dans le caecum, notamment de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs ressemblances avec l’espèce humaine. Selon l’origine des cellules implantées, le recours à des animaux immunodéficients pourra être fait. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Rôle des cellules de Purkinje du cervelet et de l’ocytocine intracérébelleuse dans la cognition sociale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère, 964 tuées à l'issue et 492 réutilisées comme 'stimulus social'. Les 964 souris expérimentales subissent une chirurgie stéréotaxique de deux à quatre heures, des injections cérébrales répétées, un isolement de trois semaines et une restriction alimentaire ramenant leur poids à 85 %, puis une batterie de quinze tests comportementaux (interaction sociale, anxiété, coordination motrice, labyrinthe). Le porteur étudie le rôle de l'ocytocine du cervelet dans les comportements sociaux et vise des pistes pour l'autisme et la schizophrénie. Il juge l'observation d'animaux vivants nécessaire et renvoie les retombées thérapeutiques à de simples pistes potentielles.
Objectifs
Ce projet vise à cerner la contribution du cervelet et, plus particulièrement, le rôle d’une molécule, l’ocytocine (OXT) sur les comportements sociaux. Historiquement, le cervelet est associé au contrôle des mouvements, mais, depuis plusieurs années, on sait qu’il contribue aussi aux émotions, à notre orientation, aux addictions ou encore aux interactions sociales. Parallèlement, dans notre cerveau, l’ocytocine, un neuropeptide, a pour principale fonction de réguler ces liens sociaux. Elle intervient dans l’attachement aux autres, la confiance ou l’empathie. Ce rôle a été mis en évidence au sein des réseaux neuronaux liés aux émotions et aux interactions sociales, mais n’a pas été exploré au niveau du cervelet. Pourtant, il est probable que l’OXT contribue à la modulation fine de l’activité du cervelet et, ainsi, influence l’adaptation aux contextes sociaux. Celle-ci passerait par les cellules du Purkinje et leurs récepteurs à l’OXT. L’activité de ces cellules, en conditions socialement dépendantes, pourrait moduler des fonctions sensorielles et motrices ou des apprentissages, augmenter potentiellement la saillance des stimulations sensorielles pertinentes associées à ces contextes, ou encore contribuer spécifiquement aux interactions simultanées entre l’individu et son environnement. Pour tester ces hypothèses et déterminer le rôle de l’OXT dans le cervelet en contexte social, nous manipulerons d’abord l’activité des cellules de Purkinje chez la souris. La libération d’ocytocine sera bloquée ou, au contraire stimulée, dans le cervelet à l’aide de techniques d’optogénétique et chémogénétique et nous évaluerons alors le comportement social des animaux. Les compétences sociales se développant avec la maturation du cerveau, nous réaliserons ce projet chez des animaux adolescents et adultes. Nous utiliserons des mâles et des femelles car, si l’OXT a des fonctions communes aux deux sexes, elle joue aussi des rôles supplémentaires chez les femelles en provoquant la parturition et la lactation par exemple. Puis, avec des animaux dépourvus de récepteurs à l’ocytocine dans le cervelet soit toute leur vie, soit à partir de l’adolescence ou encore à l’âge adulte seulement, nous déterminerons le rôle spécifique, dans le cervelet, de ces récepteurs dans les comportements sociaux et montrerons s’il existe ou non des fenêtres développementales où la présence de ces récepteurs est indispensable.
Bénéfices attendus
L’ocytocine (OXT) est devenue une molécule de grand intérêt en neuroscience en raison de ses effets pro-sociaux. En effet, elle dispose d’un potentiel prometteur comme nouvelle cible thérapeutique pour les troubles neurodéveloppementaux dans lesquels les comportements sociaux sont perturbés ou mal adaptés (troubles du spectre autistique, schizophrénie, troubles déficitaires de l’attention…). L’OXT, outre son rôle chez les femelles dans la parturition et l’allaitement, régule la confiance, l'empathie, l'agressivité, l'excitation sexuelle, le sommeil, le stress, l'anxiété, la douleur et le système sensoriel, et ce tout au long de la vie et chez les deux sexes. Elle permet ainsi aux individus d'adapter leurs interactions sociales de manière flexible et en lien avec le contexte. Pourtant, si le rôle de l’OXT a été investigué dans les régions cérébrales impliquées dans ces interactions sociales, il ne l’est pas ou peu dans le cervelet et ce bien que plusieurs articles indiquent sa présence et celle de ses récepteurs dans le cervelet humain et de rongeur. En effet, le cervelet n’était pas considéré comme faisant partie de ces réseaux spécifiques. Or, ces quinze dernières années, on a montré que le rôle du cervelet n’est pas réduit au contrôle du mouvement : il participe aussi aux émotions, à nos capacités d’orientation dans l’environnement, aux addictions ou aux comportements sociaux. Grâce à sa vaste connectivité avec le reste du cerveau, le cervelet amorcerait ou orienterait, au niveau du cortex, le traitement des informations motrices, sensorielles, émotionnelles et cognitives dans des directions pertinentes, en particulier dans les contextes sociaux. Avec ce projet, nous serons en mesure de mieux cerner le rôle que jouerait l’ocytocine dans cette structure dans ces contextes sociaux et, potentiellement, de mettre ainsi en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles du comportement social.
Procédures
964 souris auront un tatouage à 10 j de vie pour identification et une biopsie de la queue pour génotypage (5 minutes). Elles auront aussi une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée comprise entre 2h et 4h pour injection de vecteurs viraux, de fibres optiques ou de canules guide en fonction des procédures concernées. Potentiellement, sur ces animaux, 720 souris auront ensuite des injections cérébrales répétées (souris pour chémogénétique ; 3 pour les adolescents, jusqu’à 4 pour les adultes selon la procédure et le groupe concerné). Elles sont effectuées sous anesthésie générale courte (5 minutes) Les 1456 animaux seront soumis à une batterie de tests comportementaux. Quinze tests seront utilisés au total. Chaque animal, en fonction des procédures et de son groupe, ne sera testé que dans un nombre limité de tests (3 ou 4) sur une durée totale allant de 5 à 12 semaines en fonction des tests comportementaux effectués par les animaux, sauf les animaux qui seront suivis toute leur vie et seront testés dans 15 tests comportementaux différents, sur une durée globale de 4,5 mois. Ces tests évalueront le comportement social (durée : 3 semaines d’isolement et 40 minutes de test pour l’interaction libre ; 25 minutes pour la motivation sociale ; 3 jours pour la vie en groupe chez l’adolescent) et maternel (5 tests différents de durée variable : vocalisations : 2 minutes ; redressement :1 minute ; discrimination olfactive de litière : 2 minutes (nouveaux-nés); retour au nid : 15 minutes ; construction du nid : 24h (mère)), l'état émotionnel des animaux (3 tests : anhédonie : 3 jours ; anxiété : 15 minutes ; test de conflit entre besoin en nourriture et exploration nouvel environnement : 25 h ), les fonctions sensori-motrices (2 tests : coordination motrice : 30 minutes ; démarche : 10 minutes ; ), les capacités de discrimination sensorielles (test de discrimination avec les vibrisses : 20 minutes par jour sur 3 jours) et les capacités de mémoire et d'apprentissage (apprentissage d’un labyrinthe d’une durée de 20 jours environ).
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, des effets indésirables sont prévus : l’isolement des animaux à l’âge adulte pour renforcer la motivation des animaux pour les interactions sociales, la privation/restriction alimentaire pour l’évaluation des capacités d’apprentissage et pour l’évaluation du conflit entre motivation pour la nourriture et exploration de l’environnement, et enfin une légère baisse ponctuelle de la température corporelle chez le nouveau-né lors des différents tests comportementaux.
Devenir
Les 964 souris expérimentales concernées par le projet feront l'objet d'une étude histologique post-mortem. La totalité des souris servant de stimulus social (congénères inconnus des animaux évalués, élevés en groupe pour être mis en présence ponctuellement des animaux testés et sans autre utilisation dans le projet) seront réutilisées (soit 492 souris)
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d’étudier le rôle d’une molécule (l’ocytocine) au sein de certaines régions cérébrales dans les comportements sociaux, nous devons pouvoir observer et analyser ces comportements chez des animaux sains. Nos travaux de recherche ne peuvent donc se faire que sur animaux vivants, les autres types de procédures expérimentales (simulations informatiques ou cultures cellulaires par exemple) ne permettant pas de répondre à nos questions.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux et optimiser nos résultats, les animaux serviront à plusieurs mesures chaque fois que possible. Ainsi, dans chacune des expériences proposées, les mêmes animaux feront l’objet de tests comportementaux qui seront réalisés dans deux conditions expérimentales. Pour réduire le nombre d’animaux visiteurs nécessaires pour nos tests d’interaction sociale, nous passerons plusieurs fois le même animal en tant que visiteur. Le nombre d’animaux est choisi pour tenir compte des difficultés techniques inhérentes au projet et pour minimiser la durée totale d’expérimentation pour chaque individu, tout en prenant en compte l’existence la variabilité inter-individuelle. Les différentes procédures expérimentales ont ainsi été pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Toutes les données obtenues au cours de ce projet seront analysées avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les procédures le nécessitant se font sous anesthésie générale et analgésie. Pour limiter le stress, le(s) même(s) expérimentateur(s) manipule(nt) les animaux, y compris lors des tests comportementaux. Ils sont anesthésiés après induction gazeuse. Si besoin, ils ont un traitement analgésique et sont suivis jusqu’au réveil. Puis, chaque animal est surveillé quotidiennement et le traitement analgésique prolongé si besoin. Pour éviter l’inflammation, un traitement est donné, le produit étant mélangé à la nourriture pour 3 jours maximum. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, durant toute l’étude. La douleur est contrôlée par des points limites évalués en amont et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés. Durant le projet, les animaux sont observés une fois par semaine et évalués avec une Grille de score. Le poids des animaux sera, hors périodes spécifiques avec suivi journalier, monitoré par point hebdomadaire. Points-limites : modification de poids corporel : Perte de poids > 20% par rapport au jour précédent durant la période post-opératoire (3 jours) et durant les périodes nécessitant un contrôle quotidien de la prise de nourriture, ou perte de poids totale équivalent à plus de 20 % par rapport au poids initial. Apparence physique : Poils très ébouriffés, posture anormale, yeux fermés, déshydratation. Comportement : Vocalisations non sollicitées, automutilations, animal très agité ou immobile, yeux fermés, stéréotypies. Les animaux vivent en collectivité avec environnement enrichi (copeaux, objets et matériel de nidification) jusqu’à l’évaluation de leur comportement social. Pour celui-ci et la suite des tests, un isolement préalable peut être requis pour les animaux (3 semaines chez l’adulte). Ils seront alors isolés, mais leur environnement restera enrichi. L’eau est mise à disposition ad libitum durant toute la durée des expériences. Enfin, la nourriture est accessible à volonté dans les cages de vie, sauf dans les deux semaines avant le test d’évaluation de la cognition spatiale et pendant la durée de celui-ci (20 jours maximum), et durant les 24h précédant : l’accès à la nourriture est restreint pour motiver les animaux durant l’apprentissage de la tâche et le test d'évaluation du conflit entre motivation alimentaire et exploration de l’environnement. Le poids est amené à 85% du poids de départ et monitoré chaque jour. Les nouveaux-nés restent avec leur mère jusqu’au sevrage.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités cognitives et sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Ces mammifères ont par ailleurs un fonctionnement et un développement cérébral qui peut être comparé à celui de l’homme pour les questions abordées dans ce projet (rôle du cervelet et de l’OXT et évolution de ceux-ci au cours du développement). Notre projet vise à étudier le rôle du cervelet et de l’ocytocine dans ce dernier dans les comportement sociaux à différents stades du développement : avant maturation complète du système nerveux et après. Nous utiliserons donc des animaux nouveaux-nés, des adolescents (âge inférieur à 50 jours Post-Natal (PN)) et des adultes (PN> 70 J) d'autre part. Cela se justifie par le fait que le cervelet, chez l’homme, se développe jusqu’à 2 ans après la naissance et parce que, en investiguant comme nous le faisons ici, le rôle de ce dernier dans un contexte social, nous questionnons la mise en jeu de la voie cérébello-préfrontale. Le cortex préfrontal, structure-clé de la cognition sociale, étant la partie du cerveau dont le développement est le plus tardif chez l'homme (il n'atteint son plein développement qu'au début de l'âge adulte), la mise en jeu de cette voie se traduit potentiellement par des effets différents en fonction de l'âge des animaux. Notre projet vise à étudier le rôle du cervelet et de l’ocytocine dans ce dernier dans les comportements sociaux. Nous l’évaluerons à différents stades du développement : avant maturation complète du système nerveux et après. Nous utiliserons donc des animaux nouveau-nés (moins de 8 jours), des adolescents (Post-Natal 70 J) selon les expériences. Cela se justifie par le fait que ces comportements sociaux se mettent en place très tôt (relation petit-mère notamment) et évoluent avec le temps. Ainsi, la mise en jeu de la voie indirecte cérébello-frontale, en particulier en contexte social, est susceptible de se traduire par des effets potentiellement différents en fonction de l’âge des animaux. En effet, le cortex préfrontal, structure clé de la cognition sociale, est la structure cérébrale dont le développement est le plus tardif chez l'homme : il n'atteint son plein développement qu'au début de l'âge adulte.
Evaluation des effets de la stimulation magnétique transcranienne du noyau sous-thalamique chez le modèle de primate non-humain de la maladie de Parkinson. (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quatre macaques rhésus vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour trois d'entre eux. Ils reçoivent cinq injections d'une neurotoxine (MPTP) qui provoque une akinésie sévère et une perte de la capacité à se mouvoir et à se nourrir, puis une chirurgie stéréotaxique de trois à quatre heures pour injecter des nanoparticules magnétiques dans le cerveau. Le porteur décrit des risques d'hémorragie cérébrale et de douleurs post-opératoires, un test évaluant la rigidité musculaire du bras, avant la mise à mort pour analyse histologique. Il justifie le recours au primate par sa proximité anatomique et comportementale avec l'humain et affirme la 'nécessité' de reproduire chez le singe le schéma déjà suivi pour la stimulation cérébrale profonde.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques d’une structure spécifique : la substance noire. Cette pathologie est caractérisée par des symptômes moteurs et non moteurs suite à une désorganisation du fonctionnement des circuits neuronaux. Une des structures cérébrales clés impliquées dans la physiopathologie de la MP est le noyau sous-thalamique (NST). Ce noyau a été la cible de la stimulation cérébrale profonde (SCP) chez le singe, puis chez l’Homme afin de contrecarrer les symptômes moteurs de la MP. Bien qu’elle soit efficace, la SCP reste une approche invasive, puisqu’elle est basée sur l’implantation bilatérale d’électrodes dans le NST reliées à un stimulateur implanté en sous-cutané. Ainsi, notre projet a pour but de mimer les effets bénéfiques de la SCP chez des primates non-humain (PNH) rendus parkinsoniens en utilisant une autre stratégie moins invasive, celle des nanoparticules magnétoélectriques (NME) injectées dans la structure cible : le NST. Le projet proposé a pour objectif principal l’amélioration des symptômes moteurs caractérisant la maladie de Parkinson après activation des NME chez un modèle de PNH rendu parkinsonien. Dans cette étude, l’utilisation du PNH, du fait de sa proximité anatomique au niveau cérébral avec l’Homme et de répertoire comportemental, nous permettra de transposer plus facilement les résultats à l’Homme, comme ce fut le cas pour la SCP.
Bénéfices attendus
Ce projet a une visée thérapeutique humaine. Il a pour but de créer une alternative moins invasive à la SCP appliquée chez le patient parkinsonien. Aussi, les NME fonctionnent sans connexion filaire et donc l’implantation d’un stimulateur sous-cutanée ne serait pas nécessaire. Outre, son bénéfice quant à l’amélioration des symptômes de la maladie de Parkinson, cette nouvelle technologie, pourrait, si elle s’avère efficace, être utilisé comme une alternative à la SCP dans de nombreuses autres pathologies.
Procédures
- Le modèle expérimental de la maladie de Parkinson chez le singe est obtenu par 5 injections (1 par jour, durée moins de 30 secondes) d'une neurotoxine - La chirurgie stéréotaxique est d’une durée de 3 à 4 heures (1h pour l’anesthésie l’intubation et l’installation de l'animal, 45 min pour la ventriculographie et l’injection stéréotaxique, puis 1h en fin de chirurgie pour nettoyer la plaie, recoudre, et surveillance du réveil). - L’activation des NME par l’émission d’un champ magnétique dure quelques minutes, elle est réalisée avant et après la chirurgie. - Le test comportemental consiste à évaluer la rigidité musculaire qui quantifiera l’activité des muscles flexeurs et extenseurs du bras de l’animal en réponse à un mouvement répétitif passif de l’avant-bras. Ce test durera au maximum 15 min.
Impact sur les animaux
- L’induction d’un modèle parkinsonien par injection de MPTP provoque une akinésie sévère chez les NPH (symptômes de la maladie de Parkinson). Elle a pour conséquence d’induire une bradykinésie, entrainant une diminution ou une perte de la capacité à se mouvoir et se nourrir eux-mêmes et une perte de poids. Ces effets peuvent durer entre 2 et 3 semaines. - L’administration d’anesthésique chez le singe peut induire une accélération du rythme cardiaque ou encore des problèmes respiratoires. - L’injection des NME par stéréotaxie pourrait induire une hémorragie cérébrale, des douleurs post-opératoires ainsi qu’une infection de la plaie. - L’activation des NME par l’émission d’un champ magnétique n’induit aucun effet délétère à l’animal.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure pour réaliser les analyses histologiques
Remplacement
Le choix de cette espèce s'explique par le fait que l'anatomie et le fonctionnement du cerveau, ainsi que la motricité, sont proches de ceux de l'homme. De plus, le PNH possède un répertoire comportemental complexe et proche de celui de l'homme, ce qui est indispensable pour étudier des processus cérébraux complexes tels que les différents comportements moteurs étudiés, classiquement observés chez les patients souffrant de la maladie de Parkinson. De plus, la SCP a été premièrement mise au point chez le singe avant son utilisation chez l’Homme d’où la nécessité de répéter ce schéma.
Réduction
4 animaux seront utilisés afin de réduire au maximum le nombre d’animaux dans cette étude. Ce nombre correspondant au nombre minimal d’animaux qui permet d’obtenir une analyse statistiquement valable des résultats. Aussi, le suivi dans le temps des animaux permet de collecter plusieurs données ce qui réduit le nombre total d'animaux. Nous allons réutiliser un animal venant d’une autre étude pour le groupe contrôle, et réduire à n=3 le groupe expérimental afin de respecter au maximum la règle des 3R.
Raffinement
Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc). Les deux premiers mois constitueront la phase d’habituation (manipulation par l’expérimentateur et évolution dans l’environnement de travail). Pour s'assurer au mieux du bien- être des animaux, leur état de santé sera évalué quotidiennement par le personnel compétent sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition, etc. Enfin, pour limiter le stress des animaux, des stratégies d'habituation sont mises en place pour qu'ils participent activement et volontairement aux différentes procédures. L’IRM et la chirurgie stéréotaxique seront réalisées après sédation et sur animal anesthésié. Différents paramètres vitaux sont surveillés tout au long de la chirurgie (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, saturation en oxygène, température par sonde intra-rectale). Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident avec le vétérinaire de la conduite à tenir en fonction des points limites généraux comme la perte de poids qui sera évaluée sur une période hebdomadaire et pratiquée sans contention. Selon le scorage de l’animal il recevra une surveillance accrue et les mesures nécessaires sont prises pour améliorer son bien-être. Des points limites spécifiques sont mis en place suite à l’injection de la neurotoxine : MPTP (obtention d’un modèle expérimental de la MP modéré à sévère). L’akinésie sera surveillée et l’animal sera alimenté avec un supplément nutritionnel riche en calories 2 fois/jour, pendant 7j. L'utilisation de matelas souples/changements fréquents de position seront effectués pour prévenir les escarres à titre préventif. Le traitement L-DOPA sera proposé pour soulager l’akinésie. Les dyskinésies seront aussi scorées pour adapter le traitement L-Dopa.
Choix des espèces
Dans le cadre de cette étude, l’utilisation du modèle animal et plus particulièrement le primate non-humain (espèce Macacca Mulatta) reste indispensable. C’est le modèle animal de choix pour étudier les comportements moteurs impactés par la maladie de Parkinson. De plus, le PNH, du fait de sa proximité avec l’Homme à la fois sur le plan anatomique cérébrale et comportemental, permet de facilement transposer les résultats à l’Homme. Les animaux utilisés seront âgés de plus de 4 ans, car on peut considérer que le développement du système nerveux central a atteint sa pleine maturité à cet âge. Ce paramètre est important à respecter puisqu’il nous permettra de comparer plus aisément les résultats obtenus chez ces animaux avec les caractéristiques observés chez l’homme à l’âge adulte.
Blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA : Caractérisation phénotypique de la souche KI-L178A en conditions inflammatoires
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues d'une lignée génétiquement modifiée (KI-L178A), elles subissent un modèle d'inflammation systémique ou centrale, un modèle de sclérose en plaques, puis un examen par IRM sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. Le porteur indique des pertes de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels possibles, sans détailler de test comportemental. Il affirme que ces procédures ont un caractère de 'stricte nécessité' et ne peuvent être remplacées par des méthodes sans animaux, l'étude devant selon lui porter sur des modèles in vivo.
Objectifs
Le tPA est une sérine protéase principalement connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques dont le développement cérébral, la plasticité synaptique, ainsi que dans des processus d’apprentissage et de mémoire. Grâce à ses différents domaines, le tPA interagit avec différents récepteurs tels que les récepteurs N-methyl-D-aspartate (NMDAR). Cette interaction (tPA/NMDAR) est impliquée dans certains processus physiologiques tels que la plasticité synaptique, la corticogenèse et pathologiques (AVC, sclérose en plaques/SEP, inflammation). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction du tPA avec les NMDAR. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser phénotypiquement ces souris et leurs contrôles en conditions inflammatoires (inflammation centrale, périphérique et modèles auto-immuns).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle (SEP et processus inflammatoires). Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude phénotypique de cette interaction doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes in vitro de ce projet seront réalisées en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux et pour mieux caractériser cette interaction entre le tPA et les NMDAR.
Procédures
Un premier lot d’animaux seront soumis à un modèle d’inflammation systémique, (n=160, durée de la procédure :20 secondes) ou centrale, (n=160, durée de la procédure :30 minutes). 24 heures après, chaque animal fera l'objet d’un examen par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=320, durée de la procédure :30 minutes). Un second lot d’animaux seront soumis à un modèle de sclérose en plaques (EAE-MOG ; n=100, durée de la procédure : 20 secondes).
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectue au moins 7 jours avant le début des procédures pour leur habituation et la gestion de leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour l’ensemble des procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (Mouse Grimace Scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le nombre minimum d’animaux a été défini à partir de nos données sur chaque modèle, de nos expériences précédentes et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6 à 8 semaines correspondant à un stade jeune adulte seront nécessaires. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de pathologies (AVC, sclérose en plaques/SEP) et notamment en conditions inflammatoires (inflammation centrale, périphérique et modèles auto-immuns).
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules immunitaires au cours de la stéatohépatite.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un régime alimentaire censé reproduire une maladie du foie liée à l'obésité leur inflige, selon le porteur, une forte inflammation, une fibrose, une perte de poids sévère et des difficultés à s'alimenter et se déplacer, en plus d'injections, de prises de sang et d'un gavage. L'objectif est de valider in vivo le rôle d'une protéine dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit les interactions entre foie, tissu adipeux et intestin, concluant que l'étude in vivo reste "indispensable".
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est comprendre comment ces cellules contribuent au développement des maladies du foie. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef impliquée dans la régulation des fonctions des cellules immunitaires et dans la progression des maladies chroniques du foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas cette protéine au sein de certaines cellules immunitaires et soumis à un régime alimentaire favorisant l’apparition des complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques. De manière complémentaire, nous utiliserons des souris pour lesquelles une population de cellule immunitaire d'intérêt a été éliminée à l'aide d'un composé biologique nous permettant d'apprécier son influence sur le développement de la maladie du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo le rôle de notre protéine d'intérêt dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le rôle des cellules immunitaires.. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas 7 injections au total sur 7 semaines d'expérimentation maximum. Une seule mise à jeun sera effectuée durant l'expérimentation d'une durée maximale de 4h ainsi qu'une seule administration orale de notre composé à l'aide d'une sonde gastrique.
Impact sur les animaux
Le présent projet comporte des contentions, injections intrapéritonéales et prises de sang à la queue qui sont des gestes induisant un léger inconfort ou une légère douleur chez les animaux. De plus, notre modèle alimentaire mimant la pathologie hépatique humaine conduit à une forte inflammation au niveau du foie ainsi que l'apparition d'une fibrose qui peuvent donc affecter l'état général de l'animal (perte de poids sévère, difficulté pour s'alimenter et se déplacer). Enfin, l'administration par voie orale de notre composé pour évaluer la perméabilité intestinale dans notre modèle peut aussi générer un stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires immortalisées de nos cellules immunitaires d'intérêt. Ces lignées seront incubées en présence de lipides et de dérivés bactériens car ces composés permettent de mimer les mécanismes initiateurs responsables du développement des complications hépatiques in vivo au cours de l'obésité: afflux de lipides vers le foie provenant du dysfonctionnement du tissu adipeux et afflux de dérivés bactériens provenant du dysfonctionnement de l'intestin. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe. En effet, comme retranscrit précédemment, les interactions "foie-tissu adipeux" et "foie-intestin" contribuent à la progression et au développement des complications hépatiques associées à l'obésité. De plus, comme tout organe le foie est composé d'une multitude de cellules (hépatocytes, cellules endothéliales, cholangiocytes, immunitaires...) et il est, à l'heure actuelle, impossible de reproduire toutes les interactions mutuelles entre ces différents types cellulaires in vitro.
Réduction
Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de l'expérimentation permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir suffisamment de tissu biologique d'intérêt pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Les souris seront mises sous le régime alimentaire favorisant l'apparition de la maladie du foie à partir de 20 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 30g.