Procédures sévères

1140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux reçoivent une injection de molécule pro-inflammatoire dans le péritoine ou directement dans le cerveau à cinq puis trente jours de vie, avec ouverture de la boîte crânienne par craniotomie et imagerie par ultrasons sous anesthésie. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et un risque de mort par surdosage anesthésique, la mise à mort étant justifiée par les injections et la craniotomie subies. Il présente ce modèle comme applicable à terme au nouveau-né prématuré humain et affirme que ces caractéristiques du cerveau en activité sont impossibles à reproduire hors de l'organisme.

Objectifs

La neuroinflammation est une réaction inflammatoire (réaction de l'organisme aux lésions et infections) qui se produit dans le cerveau. Lorsqu’elle survient peu avant ou après la naissance, la neuroinflammation peut impacter des phases critiques du développement du système nerveux central et avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu (handicaps moteurs, troubles comportementaux, déficits cognitifs…). Cette étude vise à mieux comprendre l’impact de l’inflammation sur le développement cérébral. Nous nous intéressons ici à trois caractéristiques du cerveau : la connectivité entre différentes régions cérébrales lorsqu'elles sont activées, l’architecture vasculaire et la rigidité. La connectivité analyse l’activation simultanée de plusieurs aires cérébrales structurellement différentes. La neuroinflammation engendre des défaillances de cette connectivité fonctionnelle. L’inflammation modifie également les vaisseaux sanguins de la zone touchée, puisqu’elle se traduit par un afflux important de sang à cet endroit. L’architecture vasculaire à l’échelle des microvaisseaux fera l’objet d’une partie de cette étude. Enfin, la neuroinflammation, de par ses conséquences au niveau vasculaire notamment, pourrait modifier la rigidité du cerveau, et nous chercherons à quantifier cette modification. Les ultrasons biomédicaux, utilisés à des fins d’imagerie diagnostique, sont un moyen parfaitement adapté à l’étude de ces trois caractéristiques. L’essor considérable qu’ils ont connu au cours des dernières années a permis d’augmenter le niveau de détail des images, spatialement et temporellement, et leur sensibilité. Dans notre étude, trois techniques d’imagerie ultrasonore seront utilisées : les ultrasons fonctionnels pour étudier la connectivité fonctionnelle, l’imagerie superrésolution pour cartographier l’architecture cérébrale à l’échelle des microvaisseaux, et l’élastographie pour mesurer la rigidité du cerveau inflammé.

Bénéfices attendus

Ce projet contribue à enrichir les recherches faites sur la neuroinflammation chez le souriceau, en utilisant une méthode jusque-là peu utilisée pour étudier ce sujet : l’imagerie par ultrasons. En particulier, l’étude de l’impact possible de l’inflammation sur la rigidité du cerveau constitue la principale avancée de ce projet. A plus long terme, les données collectées serviront à la recherche sur le nouveau-né humain prématuré. La neuroinflammation est en effet une conséquence de la prématurité des enfants, dans 20 à 40% des cas. Elle est à l’origine de la plupart des lésions dans le cerveau du nourrisson, regroupées sous le terme d’encéphalopathie du prématuré. Mieux comprendre les modifications de vascularisation, de connectivité et de rigidité induites par la neuroinflammation contribuera à élargir les outils pronostiques de la prématurité, afin de pouvoir mettre en place des interventions plus précoces et ouvrir la voie à de nouveaux traitements.

Procédures

- Les animaux recevront une injection (à travers le péritoine, sans anesthésie, 1 min ; ou directement dans le cerveau, avec anesthésie, environ 30 min) d’une molécule pro-inflammatoire, à deux stades de croissance différents (5 jours et 30 jours après la naissance). - Les animaux au 30ème jour après la naissance nécessitent une opération chirurgicale d'ouverture de la boîte crânienne, au cours de laquelle ils seront placés sous anesthésie générale (environ 1h). - Toutes les mesures d’imagerie ultrasonore (imagerie fonctionnelle, élastographie, imagerie superrésolution) sont réalisées sous anesthésie générale (durée variable en fonction des mesures à effectuer : entre 15 min et 1h30). - L'imagerie superrésolution nécessite en plus l'injection de microbulles dans la circulation sanguine, réalisée sous anesthésie, à l'aide d'une seringue très fine, adaptée à la taille de l'animal (environ 2 min).

Impact sur les animaux

- L’administration intra-péritonéale (i.e., dans le péritoine) ou intra-cérébroventriculaire (i.e., directement dans le cerveau) peut créer une infection locale dans la zone d’injection. - L’injection de molécule inflammatoire engendre un retard de croissance chez les animaux concernés, qui se traduit morphologiquement par une taille et un poids inférieurs à la normale. De plus, les animaux injectés sont susceptibles de développer des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible…) et moteurs. - Une dose mal estimée d’anesthésie au cours des acquisitions en imagerie peut engendrer le réveil des animaux si trop faible, ou leur mort si overdose, ce qui justifie une étape préalable d'ajustement des doses. - La manipulation des animaux au cours des injections, ainsi que l’injection elle-même, sont sources de stress pour les animaux.

Devenir

Pour toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés. Ils auront en effet reçu des injections et/ou subi une craniotomie donc ne pourront pas être maintenus en vie.

Remplacement

Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).

Réduction

Au total, notre projet nécessitera au maximum 1140 animaux. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique.

Raffinement

- Des grilles de scoring en fonction de l’âge des animaux seront proposées pour s’assurer du bien être des animaux et déterminer les points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus des animaux. Suite à l’inflammation, on surveillera régulièrement la prise de poids et l’apparition éventuelle de troubles comportementaux (isolement, agressivité) : la molécule inflammatoire sera injectée le matin, puis les animaux seront surveillés 1h, 6h, 10h, 22h et 24h après l’injection (deux personnes se relaieront pour la surveillance). Si l’un de ces points limites est atteint, et/ou à la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés. - Les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. - Pendant les chirurgies nécessaires pour la mise en place des appareils d’imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l’animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure de chirurgie sera interrompue et l’animal euthanasié. - Au cours des acquisitions en imagerie, sous anesthésie générale, les constantes physiologiques suivantes seront mesurées en continu : fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température.

Choix des espèces

Dans le cas de l’étude de la neuroinflammation, la littérature montre que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; il pourra donc, à plus long terme, être appliqué au cas du nouveau-né humain. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la neuroinflammation sur certaines caractéristiques du cerveau, à différents stades de croissance : les animaux seront utilisés au cours du développement, à un stade encore immature du cerveau (5 jours après la naissance), et à plus long terme, lorsque le cerveau a atteint sa maturité (30 jours après la naissance).

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un préconditionnement, une greffe de cellules leucémiques par voie intraveineuse et des traitements répétés par gavage ou injections, une partie étant euthanasiée pour prélèvement et les autres gardées en vie jusqu'à un point limite terminal. Le porteur indique que l'installation de la leucémie provoque un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs, une prostration et une hypothermie. Il affirme l'absence de corrélation entre la réponse aux chimiothérapies in vitro et in vivo pour conclure au caractère "indispensable" du modèle murin, tout en ne justifiant le nombre d'animaux que par des "tests statistiques appropriés".

Objectifs

Malgré un taux élevé de rémission après un traitement conventionnel par chimiothérapie, les rechutes reflet d’un mauvais pronostic, sont fréquentes chez les patients atteints du cancer du sang le plus commum, les leucémies. La principale raison est que certaines cellules ont résisté à ce traitement et ont pu proliférer et ainsi reconstituer la maladie. Comme cela a été montré dans d'autres types de cancer, les cellules cancéreuses résistantes sont les cellules qui ont la capacité d’adapter leur métabolisme. L’autophagie, processus impliqué dans la dégradation et le recyclage de composés cellulaires endommagés est un régulateur du métabolisme. Nous émettons maintenant l’hypothèse que cette adaptation soit contrôlée par l’autophagie, un mécanisme également impliquée dans de nombreuses maladies telles que le cancer. En effet, l’autophagie favorise la croissance de nombreuses cellules cancéreuses en leur fournissant tout ce dont elles ont besoin pour se multiplier. Elle participe aussi à la résistance aux traitements. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie dans les mécanismes de résistance aux traitements anti cancéreux dans les leucémies.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le développement et la résistance des leucémies. Cette connaissance précise permettra l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et conduira au développement de médicaments ciblant directement l'autophagie ou bien ses régulateurs. De nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes pourront alors émerger dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de leucémie.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis une fois par jour pendant 3 jours à une injection dans la cavité abdominale (intrapéritonéal) de quelques secondes, d'un composé permettant de supprimer le mécanisme d'autophagie dans l'ensemble des organes de la souris. Les animaux seront tout d’abord préconditionnés avec un agent qui va éliminer les cellules de moelle osseuse afin de pouvoir par la suite injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue (caudale) sur animal vigile c’est-à-dire non endormi, puis à des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire (en mandibulaire) de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse d’environ 5 min en intra-fémoral de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement journalier de durée variable selon le type de thérapie par voie orale en gavage (pendant 7 jours consécutifs) ou bien par une injection dans la cavité abdominale en intra-péritonéal (pendant 5 jours consécutifs) ou en intra-veineuse (pendant 3 jours non consécutifs). Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il pourra y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage + injection intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Les animaux lorsqu’ils sont traités avec les différentes molécules, lors de la greffe ou lors du suivi de prise de greffe (gavage, intra-péritonéal, intra-veineux) pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress et/ou une perte de poids. Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de plusieurs semaines (variable selon le type de cellules leucémiques injectées) un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides, d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête).

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée afin de prélever la moelle osseuse, la rate et le foie (et potentiellement le tissu adipeux) afin de caractériser les cellules leucémiques résistantes aux traitements, 3 jours après la fin du traitement. Pour les autres souris, l'objectif sera de savoir si le traitement améliore leur survie. Dans ce cas les animaux post-traitements seront gardés en vie et ils ne seront euthanasiés que lorsqu'ils présenteront un point limite terminal.

Remplacement

Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans le développement leucémique et la résistance aux traitements anti-cancéreux, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant de récapituler de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses comme lorsque celles-ci sont au sein d’un organisme en entier car ce dernier peut modifier leur comportement. Par exemple, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse aux chimiothérapies in vitro et celle in vivo, rendant nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo dans des modèles murins.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites et ont permis l’établissement d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Un suivi de la présence de cellules cancéreuses dans le sang ou dans la moelle sera réalisée (toutes les une à deux semaines à partir de 4 semaines après la greffe), une pesée et une évaluation hebdomadaires du comportement et de l'aspect physique permettra de mettre en place des actions précoces et adaptées.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à comprendre pourquoi les cellules cancéreuses résistent aux traitements. Ils présentent des avantages pratiques tels que la croissance rapide, un cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales. Dans cette étude, nous utilisons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.

402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de cellules cancéreuses dans le tibia, suivie d'un suivi radiographique hebdomadaire pendant douze semaines et de traitements par voie intraveineuse ou orale. Le porteur indique un développement tumoral attendu, une douleur se manifestant par une boiterie, et une sortie de l'étude avant que le volume tumoral ne dépasse 10 % du poids de l'animal. Il affirme que l'environnement tumoral est impossible à recréer in vitro et conclut au caractère "indispensable" du modèle murin pour étudier les protéines PDL1 et MCT4.

Objectifs

Le cancer pulmonaire est une cause fréquente de mortalité chez l’homme. 40 % des patients vont présenter des métastases osseuses qui assombrissent leur pronostic. Lorsque le cancer est métastatique, il est incurable et diminue drastiquement la survie des patients. Les cellules cancéreuses sont caractérisées par l’expression différentes de nombreuses protéines impliquées dans le fonctionnement cellulaire ce qui permet aux cellules cancéreuses de se multiplier anormalement. Parmi les protéines augmentant l’agressivité du cancer, MCT4 et PD-L1 jouent un rôle important dans plusieurs cancers dont le cancer pulmonaire. En revanche, il n’y a pas de données chez les patients porteurs de métastases osseuses. MCT 4 est la principale protéine qui exporte l’acide lactique des cellules tumorales dans leur environnement. Dans l’os, ce lactate soutient le développement des métastases osseuses en stimulant la lyse osseuse (principale caractéristique des patients souffrants de métastases osseuses d’origine pulmonaire) et en favorisant une immunité pro-tumorale. L’inhibition pharmacologique de MCT4 sur des modèles murins montre une diminution du développement tumoral de plusieurs cancers. Néanmoins, dans les métastases osseuses, cette approche n’a jamais été essayée alors qu’elle s’avère prometteuse. PDL1 est une protéine impliquée dans l’inactivation des cellules immunitaires anti tumorales (lymphocytes T CD8+). Son rôle est documenté dans les cancers pulmonaires et les métastases des tissus mous mais inconnu au sein de la métastase osseuse des cancers pulmonaires. Les immunothérapies PD-1/PD-L1 sont une avancée majeure dans le pulmonaire métastatique. Dans les métastases osseuses l’efficacité de ces traitements n’est pas connue. Aussi, nous souhaitons étudier le rôle de ces protéines dans la métastase osseuse en réalisant des injections intra tibiales de cellules cancéreuses qui expriment en forte quantité ou sans expression de ces protéines. Nous étudierons également des traitements inhibant ces protéines et observerons l’effet sur les métastases osseuse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice est de comprendre le rôle de PDL1 et MCT4 dans la métastase osseuse ainsi que déterminer si l’utilisation de traitement ciblant pharmacologiquement ces protéines présente un intérêt thérapeutique dans un modèle de recherche pré-clinique.

Procédures

Les animaux ne seront pas soumis à des prélèvements vigiles ni de procédures chirurgicales. Les animaux seront anesthésiés une fois lors de l’injection des cellules cancéreuses dans le tibia (5 min) puis une fois par semaine pour le suivi radiographique (5 min) des lésions osseuses pour une durée maximale de 12 semaines. Les animaux traités par voie intra veineuse auront 9 injections de traitement ou de contrôle au total sur 3 semaines (1 min). Les animaux traités par voie orale auront une prise quotidienne de traitement pendant 3 semaines (15min).

Impact sur les animaux

Les modèles expérimentaux de cancérologie sont des modèles dommageables et il est attendu un développement de cancer chez les animaux. La douleur peut survenir et se manifester par une boiterie chez les souris. Aussi, nous utiliserons un protocole strict de suivi des animaux en utilisant des échelles de points limites. Ces points limites sont les situations prédéfinies à ne pas atteindre pour respecter le bien-être animal. Les animaux seront sortis de la procédure avant atteinte des points limites expérimentaux et les pilotes expérimentaux permettrons de suivre le délais d’apparition de ces situations sur un petit nombre d’animaux avant utilisation d’un plus grand nombre. Les injections de traitement répétées peuvent conduire à un inconfort momentané et des blessures chez les animaux et pour y remédier, nous procèderons à des injections à différents endroits.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole. A la fin de la procédure, les tumeurs osseuses, ainsi que les organes des souris qui sont le siège de métastases (généralement poumons, os, foie) seront prélevés pour peser les tumeurs. Les tumeurs et les organes métastatiques seront ensuite fixés et inclus en paraffine afin de réaliser des études histologiques.

Remplacement

Remplacement : Bien que l’étude in vitro permette la compréhension de nombreux processus du cancer, cela ne prend pas en compte l’environnement tumoral, dont l’impact est majeur. L’étude d’une tumeur in vivo permet la considération des cellules tumorales, immunitaire, osseuses, fibroblastiques (autres cellules de l’environnement tumoral) ainsi que la vascularisation de l’hôte, leur interactions et fonctionnement ensemble. Un tel modèle est impossible à recréer in vitro, ainsi, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable à notre étude. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.

Réduction

Réduction: Nous avons utilisé une approche statistique et consulté la littérature pour déterminer la taille des groupes d’animaux nécessaire à la réalisation à chaque protocole de l’étude. Pour chaque groupe, nous allons réaliser une analyse du tissu osseux qui nécessite 10 animaux, une analyse de l’expression des gènes qui nécessite 4 animaux et une analyse des populations cellulaires qui nécessite 4 animaux soit 18 animaux.

Raffinement

Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 3, dans des cages à couvercles filtrants de 424 cm² avec un milieu enrichi (objets partagés par les animaux, frisottis, épaisseur de litière importante, copeaux doux) et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. Afin de réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation de deux semaines sera observée à la suite de leur réception. La litière sera changée de moitié toutes les semaines pour réduire le stress des animaux. Pendant cette période les animaux seront uniquement manipulés afin de les habituer au contact de l’utilisateur et réduire leur stress, nous les familiariserons à boire à la pipette afin de pouvoir leur administrer le traitement anti MCT4 de cette manière plutôt que de réaliser un gavage afin de limiter leur stress. Lors de l’injection des cellules tumorales, les cellules seront stériles, vérifiées sans champignons et sans bactéries, les souris seront anesthésiées et la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. L’état de bien-être des souris sera évalué quotidiennement en évaluant la qualité de la fourrure de l’animal, un isolement ou manque de dynamisme. En cas de douleur les animaux seront traités avec de la rimadyl (carprophène) associée à la buprénorphine (à la posologie adaptée et par voie sous cutanée). Les soins et traitements des animaux seront réalisés par le personnel compétent de l’animalerie définis avec le vétérinaire désigné. L’identification d’un point limite (perte de poids, respiration pénible, réticence à se déplacer, volume tumorale supérieur à 10% de du poids de l’animal) entraînera la sortie de l’animal de l’étude et sa mise à mort. Lors des injections de traitements anti-PDL1, nous privilégierons l’injection intra veineuse (différents sites d’injection caudale, jugulaire et saphène) aux injections intra péritonéales afin de limiter l’inflammation du péritoine. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.

Choix des espèces

Les souris C57/Bl6 et C57/Bl6 nude sont couramment utilisées en recherche cancérologique. Les souris nude présentent une déficience en lymphocytes T. Le phénotype dommageable est dû à la mutation génétique qui prévient le rejet des cellules tumorales humaines par la souris. Dans le contexte de notre étude, les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.

180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque de 70 minutes avec ligature d'une artère coronaire pendant 30 minutes pour provoquer un infarctus, puis un traitement pharmacologique et une échocardiographie à 28 jours. Le porteur indique des risques d'hypotension, de refroidissement et de douleurs postopératoires aux nerfs intercostaux, et prévoit la mise à mort pour prélever les tissus cardiaques. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative ni de modélisation possible" pour l'ischémie-reperfusion myocardique et décrit un "besoin" urgent de nouveaux traitements.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la seconde cause de mortalité en France (environ 150 000 morts/an). Elles ont le plus souvent pour origine une atteinte ischémique (déprivation en oxygène) du myocarde, pouvant évoluer à plus long terme vers une insuffisance cardiaque (IC), ou le cœur n’est plus capable d’assurer la perfusion des tissus. Alors que l'incidence de l’IC augmente continuellement du fait du vieillissement de la population, les traitements demeurent insuffisants. Une meilleure connaissance des mécanismes à l’origine du développement de l’IC pourrait ainsi permettre de proposer des nouvelles thérapies. La recherche dans ce domaine demeure un enjeu majeur de santé publique. Notre projet vise à identifier des nouvelles interventions pour contrer le développement de l’IC, dans des modèles murins expérimentaux mimant la pathologie humaine. L’équipe s’intéresse en particuliers au stress oxydant qui est augmenté suite à un infarctus du myocarde. Cela entraine des effets délétères sur le coeur, pouvant altérer sa fonction de contraction. Notre projet consistera donc à évaluer le rôle préventif de l’inhibition des voies du stress oxydant, sur un modèle d’IC induit de manière chirurgicale chez le rat mimant un infarctus du myocarde. Nous étudierons ainsi les effets protecteurs de plusieurs composé sur le développement de l’IC par échocardiographie et analyse des tissus.

Bénéfices attendus

Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge de l’infarctus du myocarde, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité grace à la revascularisation, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer une IC dans à long terme. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la mortalité reste élevée (50 % de mortalité à 5 ans) et les traitements ne sont pas curatifs. A ce jour, l’IC post-infarctus constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Cela nécessite de mieux comprendre les mécanismes qui régissent l’altération de la fonction cardiaque à partir de modèles expérimentaux qui reproduisent les différentes composantes de la pathologie humaine. Ceci est un gage d’une meilleure transposition vers la clinique dont le besoin de nouveaux traitements est urgent.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’ischémie-reperfusion myocardiaque (ligature coronaire). La durée totale de l’intervention est de 70 min, dont 15 min entre l’intubation oro-trachéale et l’accès au coeur, 30 min de ligature coronaire et 15 min pour la fermeture du thorax. Pour les groupes traités, un traitement pharmacologique sera mis en place 24 h après la chirurgie. A l’issue des 28 jours, les rats seront soumis à une échocardiographie non invasive et non douloureuse.

Impact sur les animaux

Au cours de la procédure chirurgicale, les nuisances ou effets indésirables (qui seront surveillés) sont l’hypotension et le refroidissement corporel. Après la chirurgie thoracique, d’éventuelles douleurs post-opératoires au niveau des nerfs intercostaux pourront être réduites par injection d’analgésiques. A plus long terme, le développement d’une insuffisance cardiaque sera surveillé (au vu des points limites).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour récupérer les tissus cardiaques pour analyser les effets bénéfiques des traitements sur le développement de l’insuffisance cardiaque.

Remplacement

Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, le développement de l’insuffisance cardiaque met en jeu, entre autres, des systèmes hormonaux, des adaptations des systèmes circulatoire, rénal, central si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative ni de modélisation possible pour l’ischémie-reperfusion myocardique. De plus, les études in vivo répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique.

Réduction

La stratégie d’expérimentation repose sur l’hypothèse d’une modification du développement de la pathologie par les interventions pharmacologiques. Pour calculer le nombre d’animaux utilisés pour chaque expérimentation nous utilisons nos résultats d’expériences préliminaires. D’après l’ensemble de nos estimations, chaque groupe (malade, sain, traité) comportera 15 rats. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur un même rat: fonction cardiaque par échocardiographie, histologie, expression génique et protéique.

Raffinement

Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabannes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Les animaux seront élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l’état général). Les manipulations seront réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésiques avant la chirurgie et d’analgésique à différents temps (avant la chirurgie, après la chirurgie et si l'animal montre des signes de douleurs). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les rats sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.

Choix des espèces

Le modèle d’infarctus du myocarde chez le rat est bien maitrisé au laboratoire et mime le développement de la pathologie humaine. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques nécessaires à l’évaluation de l’insuffisance cardiaque. Nous utiliserons des rats de 8-10 semaines pour réaliser les interventions chirurgicales de manière optimale chez des animaux matures et pour éviter la mortalité liée au vieillissement.

D'anciens reproducteurs mâles, retenus pour leur agressivité, infligent à des souris mères des défaites sociales de 10 minutes répétées sur six jours, afin d'exposer indirectement leurs souriceaux à l'agression physique de leur mère. 532 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, d'autres mères étant aspergées d'urine de mâle ou séparées de leurs petits 10 minutes par jour pendant six jours. Le porteur indique que la défaite sociale induira une "douleur physique" chez les mères et que la "douleur psychique" est "la base du modèle", puis exclut toute analgésie qui pourrait interférer avec l'étude. 160 souriceaux passent ensuite, à l'adolescence et à l'âge adulte, des tests de comportement social, d'anxiété, d'anhédonie et de résignation, sans que ces tests soient nommés. 270 souris restent en vie, 200 souriceaux et 40 femelles réaffectés à l'élevage si le comportement maternel n'est pas atteint, et 30 mâles agressifs gardés pour de futures défaites sociales, les 262 autres étant mises à mort.

Objectifs

Les expériences de vie précoce pendant l’enfance, qu’elles soient positives ou négatives, peuvent laisser des traces indélibiles sur le cerveau et le développement psychologique. En effet l’exposition précoce à des traumatismes psychosociaux, incluant entre autres la maltraitance infantile, est indiscutablement l’un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Différents modèles animaux chez la souris ont été mis en place pour étudier les conséquences du stress précoce sur le développement cérébral et psychologique, mais ces modèles se concentrent principalement sur des périodes tardives du développement (après le sevrage), et nos connaissances des effets à long terme sur le cerveau du stress infantile sont extremement limitées. Nos connaissances des mécanismes cellulaires participant à la formation et à la persistance des mémoires traumatiques précoces sont aussi très lacunaires. Afin d’étudier ces mécanismes, nous nous proposons ici de mettre en place et de tester la validité d’une procédure de stress indirect (l'expositition indirecte de souriceaux à l'agression physique de leur mère) basée sur l’experience sensorielle et la contagion émotionnelle, pouvant mimer chez la souris un traumatisme psychologique infantile avant le sevrage des animaux. Nous testerons finalement comment cette expérience peut precipiter la survenue de comportements de type anxieux et dépressifs à l’adolescence et l’age adulte.

Bénéfices attendus

Il n’existe actuellement aucun modèle animal permettant d’étudier les conséquences du trauma infantile sur le cerveau. Pour autant, l’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de cout et d’efficacité. La mise en place d’un modèle pertinent de trauma psychosocial infantile permettrait dans ce cadre de mieux comprendre, d’un point de vue fondamental, comment le stress précoce affecte le cerveau et son développement. Cela permettrait également de disposer d’un outil pertinent pour étudier les mécanismes cellulaires mis en jeu dans la formation et la persistance des mémoires traumatiques précoces, et comment elles influent notre comportement. Si l’objectif à court terme de cette recherche fondamentale n’est pas la mise au point d’un outil thérapeutique visant à améliorer la prise en charge de populations cliniques victimes de trauma psychosocial pendant l’enfance, il est certain qu’une étape indispensable vers cet objectif est la compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu.

Procédures

- 8 mères ne subiront aucune manipulation (groupe contrôle) - 16 mères subiront une aspersion d'urine de mâle. - 16 mères subiront une séparation de leurs petits de 10 min pendant 6 jours. - 16 mères seront exposées à une défaite sociale durant 10 min et répétées sur 6 jours - 16 mères seront aspergées d'urine de mâle et isolées 10 min de leur petit, et cela, à un rythme d'une fois par jour sur 6 jours. - 60 mâles seront utilisés pour sélectionner des individus agressifs. - 40 souris sentinelles seront utilisées pour sélectionner des individus agressifs. - 360 petits seront pesés soit entre 3 et 8 jours postnatal soit entre 14 et 21 jours apres la naissance. - 160 petits seront utilisés dans des tests comportementaux, deux fois par test (une fois pendant l'adolescence, l'autre fois à l'age adulte). Ces tests sont effectués au cours de sessions uniques, allant de 3 à 10 minutes, et visent à mesurer les comportements sociaux, les conflits motivationnels et l'anxieté, l'anhédonie et la résignation des animaux.

Impact sur les animaux

Le modèle de défaite sociale (DS) induira de la douleur physique chez les mères sujettes directement au modèle. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant possiblement un phénotype anxiodépressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier comment ces changements comportementaux sont transmis aux souriceaux des mères exposées ou modifient leur comportement. L’exposition indirecte à la défaite sociale des souriceaux n’aura aucune incidence d’un point de vue physique, puisqu’elle n’est effectuée que sur les mères. Il est possible cependant que dans l’éventualité où la DS perturberait le comportement maternel, cela induise une détresse physiologique et sensorielle des souriceaux en diminuant la qualité des soins fondamentaux promulgués par leur mère. C’est pour cette raison qu'une attention particulière sera donnée au monitoring des souriceaux et du comportement maternel tout au long du protocole. Par ailleurs si notre hypothèse est validée, il est possible que le modèle induise chez les souriceaux une détresse psychique liée au stress, ce qui est notre objectif, afin d’étudier les substrats neurobiologiques et conséquences comportementales de ce stress. Etant donné que les tests de comportement sont basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, il est possible que les tests utilisés puissent induire un stress léger chez les animaux. Ces tests sont cependant de courtes durées (10 minutes maximum), et ne sont pas basés sur des situations hautement aversives. Ces tests ne sont d’ailleurs pas connus pour induire de changements physiologiques ou comportementaux durables chez les animaux.

Devenir

Pour la validation du modèle, tous les animaux experimentaux (200 souriceaux et 40 femelles) seront réaffectés à notre élevage de souris (à condition que nos résultats ne montrent aucune atteinte au comportement maternel), afin de permettre la génération de nouveaux souriceaux. Les souris agressives utilisees pour la defaite sociale (nous estimons à la moitié le nombre de souris qui rempliront les critères d'agressivité, soient 30 souris) seront par ailleurs maintenues en vie pour de futures experiences de défaite sociale. Les souris sentinelles servant à selectionner les souris agressives, les souris non agressives, et toutes les souris utilisées pour etudier les effets du modèle sur le comportement seront mises à mort à la fin des expériences.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.

Réduction

Nous souhaitons ici pouvoir évaluer une taille d’effet forte et être confiants dans les effets que nous observons, garantissant ainsi la fiabilité de nos conclusions et la reproductibilité future du modèle. Nos effectifs intègrent donc le fait de pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DS susceptibles : c’est-à-dire qui ont un comportement altéré à la suite du modèle de DS, DS résilients : qui ne présentent pas de modification comportementale à la suite du modèle). Basé sur la literature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté. C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des males et des femelles en considerant ici le sexe comme une variable d’analyse. Seuls les mâles agressifs sélectionnés pourront être réutilisés pour la suite des expériences. Les effets du modèle sur le comportement des souriceaux sera testé à la fois à 22 jours et à l’âge adulte (63 jours) sur les mêmes souris, plutôt que d’utiliser des cohortes différentes pour ces différents temps de mesure, diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. En l’absence d’effet délétère sur le comportement maternel et la survie des souriceaux, les animaux utilisés pour la validation du modèle pourront réintégrer l’élevage. Les tests statistiques seront adaptés à de petits effectifs expérimentaux.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton, papier) et de bâtons de bois pour favoriser le comportement de ronger qui est important pour cette espèce (Raffinement hébergement). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure seront réalisées avant les tests comportementaux. Les mères seront habituées à la manipulation au moins une semaine avant la naissance des petits. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Nous incluons ici une procédure pilote en trois étapes pouvant chacune donner lieu à un arrêt total des expériences. La phase du projet étudiant l’impact de la DS indirecte sur les jeunes sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux mères contrôles au cours de cette procédure pilote (Raffinement des procédures). Des grilles d’évaluation de la douleur physique et de la qualité des soins maternels ont été créées pour définir précisément les points limites. Ce modèle visant à induire des atteintes psychiques, l’analgésie et le renforcement positif, ou tout traitement pouvant interférer avec l’étude ne peuvent être envisagés (réduction des douleurs physiques et psychiques associées aux procédures).

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris et la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Des souris OGM (phénotype non-dommageable) seront utilisées permettant d’induire l’expression permanente d’un rapporteur fluorescent dans les neurones activés pendant une fenêtre temporelle précise. Le choix de cette lignée est donc motivé par le fait que si notre modèle induit un phénotype robuste chez la descendance des souris exposées à la défaite sociale, elle nous permettra de visualiser les neurones activés pendant la défaite sociale, et d’étudier plus en avant la formation, la consolidation et le rappel de cette trace mnésique, ce qui est un objectif à long terme de ce projet. Les mâles agressifs seront d’anciens reproducteurs adultes, car c’est à cet âge que le comportement agressif est le plus marqué. Les souris femelles « sentinelles » seront âgées de 8 semaines (même âge que les mères qui seront utilisées pour la validation du modèle et la mesure de ses effets comportementaux). Mères expérimentales: jeunes adultes (8 semaines) ce qui est nécessaire pour la mise à la reproduction. Progéniture des mères expérimentales : de 3 jours après la naissance à l’âge adulte, car le modèle vise à induire un stress postnatal très précoce, pendant la période infantile. Les effets comportementaux du modèle seront testés après sevrage (à 21 jours) et à l’âge adulte (à 63 jours), puisque nous souhaitons connaitre les conséquences comportementales à long terme du modèle.

664 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un conditionnement chimique par hydroxyurée ou busulfan, une greffe de cellules humaines de myélome par voie intra-fémorale ou intraveineuse, puis quatre semaines de traitements par gavage quotidien et injections, avec prélèvements sanguins hebdomadaires et imagerie sous anesthésie, pour tester des molécules ciblant la protéine PIM2. Le porteur décrit un suivi du développement tumoral jusqu'à l'apparition de signes comme la perte de poids et la léthargie, sans détailler de test comportemental. Sur le remplacement, il affirme que le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro et conclut au caractère "indispensable" du recours à la souris, les retombées pour les patients restant au conditionnel.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est un cancer du sang (hémopathies) parmi les plus fréquents, en deuxième position après les lymphomes. Il représente 1% de la totalité des cancers et environ 10% des hémopathies. Malgré l’apparition de nouveaux traitements, le MM reste aujourd’hui une maladie incurable avec une médiane de survie moyenne à 6 ans (Rapport InVS 2018). Des travaux ont montré que la surexpression de la proteine PIM2 dans les cellules tumorales du MM était associée à une maladie plus agressive et à une survie réduite pour les patients. Le ciblage thérapeutique de la protéine PIM2 ouvre donc de nouvelles perspectives thérapeutiques dans cette maladie. Des tests in vitro ont été réalisés au sein du laboratoire montrant l’efficacité de molécules pour inhiber la protéine PIM2 dans les cellules de MM et induire la mort des cellules. L'expérimentation animale est cependant rendue indispensable du fait de l'impossibilité de reproduire le microenvironnement tumoral in vitro et de mener ce type d'exploration directement chez l'Homme. Notre projet a pour objectif d’utiliser un modèle murin de xénogreffe de lignées de MM pour tester différentes molécules ciblant la protéine PIM2. Les traitements que nous voulons tester sont d’une part des inhibiteurs chimiques de la protéine PIM2 (utilisés seuls ou en association avec d'autres inhibiteurs) et, d’autre part, une thérapie de type ARN qui inhibe le gène PIM2. Globalement, ce projet consiste à implanter, chez des souris immunodéprimées, des cellules de lignées de myélome multiple (MM) humaines dans le but de pouvoir étudier la progression tumorale après injection de molécules à visée thérapeutique dans le MM.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’établir de nouveaux modèles murins de myélome pertinents pour reproduire la pathologie humaine et pour tester de nouvelles thérapeutiques dans le MM. La première étape permettra de déterminer les meilleures conditions d’implantation des cellules de MM chez une souris immunodéficiente avec une prise de greffe permettant un développement tumoral durable, et la deuxième étape caractérisera précisement la progression et dissémination tumorale dans les conditions définies comme optimales à l’étape 1. Enfin, grâce à ces étapes d'optimisation, nous pourrons évaluer à l’étape 3, l'impact de traitement inhibant la protéine PIM2 sur la progression tumorale. Nous testerons deux nouvelles possibilités de traitement ciblant cette protéine, soit au moyen d'association d'inhibiteurs chimiques, soit au moyen d'une thérapie ARN originale, toutes deux jamais testés à ce jour dans le MM. Ces stratégies thérapeutiques pourraient trouver leur place dans la prise en charge des patients atteints de MM.

Procédures

Pour obtenir des modèles murins fiables et robustes des myélomes humains, les souris devront recevoir un conditionnement unique par traitement chimique par hydroxyurée ou busulfan (20 sec par voie intrapéritonéale) puis une greffe unique de cellules tumorales humaines par voie intra-fémorale (5 minutes) ou à défaut, dans le sang par voie intraveineuse en rétro-orbital (20 sec) ou caudal (1 minutes). Les traitements évalués seront administrés sur une durée totale de 4 semaines selon des protocoles différents. L'une des molécules (les anti-MCL1) sera administrée 1 fois par semaine par voie intraveineuse en rétro-orbital (20 sec) ; l'autre molécule (les inhibiteurs de PIM) sera administrée quotidiennement par gavage (30 sec). Enfin dans le cadre du suivi de ces animaux greffés, des prélèvements de sang hebdomadaires en submandibulaire (1 minutes) à partir de la 2eme semaine post-greffe seront réalisés ainsi que des analyses par imagerie bioluminescence, méthode non invasive réalisée après injection intrapéritonéale du substrat (20 sec) dès l'étape 2, au plus tôt une semaine après la greffe et au maximum une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le maintien de ces souris en hébergement protégé permettra de prévenir tous les risques d’infection. Egalement le développement tumoral peut engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de myélome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).

Devenir

A l'issue de toutes nos expérimentations (une fois toutes les procédures cumulées réalisés sur les animaux), tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes d'intérêt pour mener nos investigations en terme de dissémination et infiltration tumorale chez l'animal.

Remplacement

Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'efficacité de nos différentes molécules (inhibiteurs chimiques et oligonucléotide) pour induire la mort des cellules de MM (cellules de lignées de MM et cellules primaires de patients atteints de MM). Le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro du fait de sa complexité, de nombreux acteurs impliqués dans le développement tumoral et la résistance aux traitements. Il est par ailleurs impossible de conduire ce type d’expérimentation chez l’Homme rendant indispensable le recours à des modèles murins.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Aussi, avant de mener les expérimentations à visée thérapeutique nécessitant des lots d’animaux importants (10 animaux par lots), les choix des conditions expérimentales seront étudiés en amont sur des lots réduits mais suffisants (6 animaux par lots) afin de trouver la technique la plus optimale en termes de prise de greffe : choix du type de souris (NSG, RagGC ou BRGS), du type de conditionnement (hydroxyurée, busulfan ou irradiation) et enfin du type d’injection (intra-veineuse ou intra-fémorale). Des combinaisons de conditions vont être testées successivement à l'étape 1 (en commençant par les plus relevantes au regard de notre expérience) et si une s'avère pertinente et validée, nous ne testerons pas les autres. Les tailles des groupes de souris sont choisies de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Les statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques car la normalité de la loi sur la population considérée n'est pas certaine. Pour les échantillons indépendants, le test de Mann-Whitney sera appliqué. Pour les échantillons appariés, le test de Wilcoxon sera utilisé. Pour les comparaisons de plus de 2 groupes, les tests non-paramétriques de Kruskal-Wallis (pour les échantillons indépendants) ou de Friedman (pour les échantillons appariés) seront utilisés avec le test de comparaison multiple de Dunn pour comparer chaque groupe par rapport à un groupe contrôle.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, un suivi régulier et adapté des souris a été instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Pour cela des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats seront réalisés. Les interventions de chirurgie sont réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques seront systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des conditions adaptées et bénéficient d’un enrichissement adapté, à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage (aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage). La technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique de nos modèles de façon non douloureuse tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaire à une caractérisation en cinétique. Aussi, un suivi strict sera établi afin de détecter toute souffrance animale potentielle avec une surveillance quotidienne de l’état général des animaux (posture et comportement) réalisé par le personnel de l’établissement et une surveillance bihebdomadaire de l’état de santé (suivi du poids et score de grimace) réalisé par le responsable du projet.

Choix des espèces

Seul un modèle à l'échelle d'un organisme vivant peut reproduire la complexité des interactions entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement et permet d'être au plus près de l'effet obtenu chez l'homme lors du test de nouvelles thérapeutiques. Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de souris sévèrement immunodéprimées pour permettre la prise tumorale. Plusieurs lignées murines sont parfaitement adaptées à ce type de greffes, notamment les RagGC (RAG2-/- IL2 gammaC-/-), les NSG (NOD SCID IL2gammaC-/-) ainsi que les BRGS (BALB/c RAG2-/- IL2gammaC-/- SIRPA.NOD) que nous testerons à l’étape 1. L’espèce avec laquelle nous obtenons la meilleure prise de greffe sera alors utilisée pour l’ensemble des expérimentations aux étapes 2 et 3. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 6 semaines jusqu'à 5 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.

10 620 rongeurs, 8 400 souris et 2 220 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un candidat médicament puis une stimulation électrique ou sonore déclenchant une crise d'épilepsie, certains après implantation d'une canule dans le cerveau sous anesthésie, pour tester des molécules antiépileptiques. Le porteur indique que la crise tonico-clonique provoquée peut aller jusqu'à l'arrêt respiratoire, les animaux étant tués juste après la convulsion ou en fin de test car les procédures ne permettent pas de les maintenir en vie dans de bonnes conditions. Il reconnaît des alternatives in vitro pour présélectionner les molécules mais affirme la nécessité du modèle animal pour l'étape finale.

Objectifs

L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieures et supérieurs accompagnés d'un arrêt respiratoire temporaire ou définitif. Des symptômes précurseurs sont parfois observés avant l'apparition d'une convulsion généralisée comme une hypersalivation ou une respiration bruyante. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte. Des fourmillements, picotements, sensation ou encore secousses musculaires incontrôlées au niveau d'un membre peuvent être observés chez l'Homme. Des mouvements de la tête ou des yeux ou encore des signes émotionnels (peur, rire..) peuvent également faire partie des symptômes. Le projet consiste en l'utilisation de tests basés sur l’induction de crises épileptiques par le moyen de stimulation électrique ou sonore permettant de tester l'innocuité et/ou l'efficacité de substances pharmacologiques en développement.

Bénéfices attendus

Les modèles de crises généralisées et partielles induits par une stimulation sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou les traitements sont inefficaces (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet antiépileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.

Procédures

Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments seront administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Si applicable, l'implantation d'un guide canule est réalisée sous anesthésie générale sur environ 60 minutes. Dans chacune des procédures décrites, le rongeur sera exposé à un stimulus, d'un durée maximale de 60 secondes chez la souris et de 3 secondes chez le rat. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés avant le test (à minima 24 heures avant la stimulation, durée de l'ordre de la minute) pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les tests modélisant des crises induisent un stress physique chez les rongeurs, également retrouvé chez les patients lors de la survenue d'une crise épileptique (avec l'apparition de mouvements involontaires saccadés ou un raidissement des membres/du corps). Des symptômes annonciateurs peuvent être également observés chez l'homme comme la nervosité, l'irritabilité ou une hypersalivation. Chez l'animal, ce stress est principalement lié à la stimulation appliquée sur une très courte durée et qui conduit à l'apparition de symptômes convulsifs. La survenue de crises tonico-cloniques peut conduire à la mort des patients épileptiques et peut donc dans certains cas provoquer une certaine souffrance chez l'animal. Des points limites prédictifs limitent cet impact. Lorsque les animaux sont implantés avec un guide canule, ils sont mis en cage de réveil et maintenus isolés pendant environ 7 jours à partir de la chirurgie afin de protéger le guide canule de leurs congénères. Le prélèvement de sang au cours d'une expérience peut également conduire à un léger stress chez l'animal vigile.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés immédiatement après la stimulation si une convulsion tonique est observée ou à la fin du test en l'absence de convulsion tonique car ces procédures ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions.

Remplacement

Il existe des techniques alternatives in silico ou in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données : variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques. Il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Une solution anesthésiante sera appliquée. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique. Pour les études incluant une chirurgie pour administrer le composé par voie intracérébrale, une analgésie est assurée par l’administration d'un analgésique systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement de l'oeil.

Choix des espèces

Les modèles de convulsions induites par une stimulation externe sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur (souris et rat). Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer de nouveaux candidats médicaments (efficacité) et/ou l'innocuité d'un composé dans le cadre de l'épilepsie. Les rongeurs utilisés sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique .