Procédures sévères

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une occlusion de l'artère cérébrale moyenne, un modèle d'AVC provoquant un déficit moteur, une perte de poids et une anorexie possible, l'autre moitié une opération témoin, toutes recevant des injections et des prélèvements sanguins avant d'être tuées à quatre semaines pour prélèvement des fémurs. Le porteur décrit une douleur peropératoire et une mobilité réduite, et justifie le modèle par la "nécessité" d'un contexte pathologique homogène. L'étude vise à décrire la fragilité osseuse après un AVC et l'effet de bisphosphonates, des retombées thérapeutiques renvoyées "à terme".

Objectifs

L’ostéoporose représente l’une des maladies métaboliques osseuses les plus fréquentes ayant comme principale conséquence la fracture, dont les paralysies ou parésies (paralysie partielle) constituent elles aussi un facteur de risque. La fracture est un facteur d’altération de la fonction et de la survie chez les patients ayant eu un AVC. La densité minérale et la micro-architecture osseuse sont deux déterminants clefs de la solidité osseuse. Les modifications concernant la micro-architecture de l'os chez les patients paralysés ou parétiques sont elles peu décrites. Les bisphosphonates (traitement ayant pour but de prévenir la perte osseuse) sont un des traitements les plus utilisés dans l’ostéoporose. Mais il n’existe à ce jour aucune stratégie thérapeutique chez les patients post-AVC afin de prévenir de l’ostéoporose et de leurs conséquences pouvant être dramatiques (les fractures). L’objectif principal de notre travail est l’étude de la densité minérale osseuse et de la micro-architecture osseuse au cours des paralysies ou des parésies. Ce travail permettra d’explorer les mécanismes de la fragilisation osseuse induite par ces conditions. Il sera mené chez l’animal dans un modèle de souris hémiplégiques. Ce choix est motivé par la nécessité d'un contexte pathologique homogène, la fréquence des hémiplégies vasculaires chez l’homme et de leurs complications osseuses ainsi que par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physiopathologiques. L’objectif secondaire de notre travail est l’étude de l’effet des bisphosphonates sur la micro-architecture osseuse dans ce même modèle.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la caractérisation de la micro-architecture osseuse, de son lien avec la différenciation des ostéoclastes (cellules qui résorbent l'os) et de l’effet des bisphosphonates après un accident vascualire cérébral. La connaissance de ces modifications micro-architecturales osseuses survenant après une hémiplégie et la connaissance des effets des bisphosphonates sur ces modifications sont essentielles pour l'établissement d'une stratégie de prévention des fractures par fragilisation dans ce contexte. Notre travail pourrait ainsi contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de la fragilisation osseuse conduisant à la fracture chez les patients paralysés. Il pourrait à terme conduire à l'ouverture de perspectives thérapeutiques visant à prévenir les modifications micro-architecturales osseuses et à réduire le risque de fractures ainsi que leurs complications trop souvent dramatiques, chez des patients fragiles et particulièrement exposés.

Procédures

La moitié des souris subira une intervention chirurgicale d'occlusion artérielle de l’artère cérébrale moyenne transitoire (2 heures en tout, modèle d'AVC) puis l'autre moitié subira une procédure sham (procédure controle, sans occlusion de l'artère). Toutes les souris auront une injection sous cutanée de biphosphonates ou vecteur le jour de la chirurgie. Puis auront lieu pour toutes les souris des injections intra péritonéale de molécules fluorescentes visibles en imagerie et anesthésiants. Ainsi que des prélèvements sanguins avant intervention, à 1 semaine et 4 semaine.

Impact sur les animaux

Les nuisances concernent principalement les souris qui subiront l'intervention "occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne (OACM)", avec pour conséquence un déficit moteur diminuant la mobilité, la perte de poids et l'anorexie possible. Ce modèle induit également une douleur peropératoire. Les injections péritonéales sont également une nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront tous mise à mort 4 semaines après la chirurgie afin de pouvoir prélever les fémurs pour l’étude de la microarchitecture osseuse et la moelle osseuse des tibias sera extraite en culture pour l’étude de la différentiation ostéoclastique chez toutes les souris afin de pouvoir répondre aux objectifs de l'étude.

Remplacement

Ce choix du modèle murin type souris est motivé par la nécessité d'un contexte pathologique homogène, la fréquence des hémiplégies vasculaires chez l’homme et de leurs complications osseuses aggravant le pronostic fonctionnel et vital chez ses patients, ainsi que par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physio-pathologiques. Il est en effet impossible de reproduire in vitro les conditions de motricité/marche de cellules isolées nécessaires pour cette expérimentation.

Réduction

A des fins de puissance, le protocole comportera 10 souris sur 4 groupes soit un total de 40 souris. Il était impossible de réutiliser un groupe afin de valider scientifiquement notre étude, ni même d’utiliser le côté non hémiplégique d'une souris car dans la littérature le côté non hémiplégique présente également une perte osseuse et représenterait donc un mauvais témoin. Nous avons décidé d'avoir 10 souris par groupe, en sachant qu’avec cette procédure nous avons 20% d'échecs, cela reviendra à 8 souris par groupe, ce nombre sera nécessaire pour une puissance statistique suffisante.

Raffinement

L'environnement sera adapté et une limitation des contraintes et des douleurs sera mise en place. Les souris à la réception dans l'animalerie, seront réparties de façon aléatoire dans un environnement enrichi (jeux, abris, substrats, cachette, blocs de bois). Une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant toute intervention sur l'animal. Les animaux seront élevés dans un environnement calme et surveillé de façon quotidienne. Si l'animal montre des signes de souffrance (stéréotypies, repli, perte de poids, vocalisations), il sera isolé dans un environnement riche et recevra un traitement analgésique. La chirurgie sera effectué sous anesthésie et les procédures de mesure de la densitométrie seront réalisées après une anesthésie également. Au vu de la procédure, l’analgésie est assurée avant le début de la chirurgie, en per-opératoire et dans les 72 heures post-opératoire (matin et soir). Les souris seront placées dans une couveuseaprès l'intervention et jusqu'au réveil de l'animal. Après avoir vérifié que l'animal retrouve sa mobilité, la souris sera remise dans sa cage et laissée sous le coussin chauffant pendant 12 heures. Parce que la perte de poids post-chirurgicale est généralement observée, la nourriture en purée sera placée dans une boîte de Pétri pour encourager à manger. Les 48 1ères heures, les animaux sont surveillés deux fois par jour, puis après cette période de manière quotidienne par l’animalier.

Choix des espèces

Ce choix est motivé par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physiopathologiques, au vu de la capacité de mobilité de cet animal semblable à l'homme et permettant les explorations adaptés pour répondre aux objectifs de l'étude. Les expérimentations in vitro ne permettent pas d'appréhendrer l'objectif de l'étude. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. Les animaux auront entre 8 et 10 semaines, un age ou les animaux sont dit matures que ce soit pour le modèle hémiplégique et osseux. De plus les animaux sont pris à cet âge-là dans la littérature.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une chirurgie crânienne sous anesthésie pour des injections, toutes reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours, et 600 sont opérées pour la pose de transmetteurs enregistrant les crises. Le porteur indique que ces souris, modèles de la sclérose tubéreuse de Bourneville, développent des crises d'épilepsie pouvant être létales pour 10 % d'entre elles. Les bénéfices avancés, de nouveaux biomarqueurs et pistes thérapeutiques, restent formulés au conditionnel.

Objectifs

Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels dans le cerveau. Ces modèles nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.

Bénéfices attendus

L'établissement de modèles murins pertinents de la sclérose tubéreuse de Bourneville avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement de malformations corticales et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.

Procédures

1200 souris seront utilisées dont 600 souris qui auront de la chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie de 3 minutes) pour subir des injections. Les 1200 souris seront soumises à des traitements pharmacologiques par injections quotidienne pendant 15 jours d'une durée de 1min. 600 souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale de 20 min afin d’enregistrer les crises épileptiques et les paramètres physiologiques en continue sans stress des animaux sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

La cinétique des signes cliniques des animaux épileptiques est bien connue et démontrent un phénotype précoce et sévère. Nous anticipons que le phénotype des animaux que nous avons générés, sera potentiellement moins sévère que celui des animaux épileptiques. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces animaux développent un phénotype équivalent et nous nous attendons à observer chez ces animaux la survenue des crises épileptiques même si plus tardives et moins fréquentes mais qui pourraient être léthales pour 10% des souris. Les traitements pharmacologiques par injection n'entrainent pas d'effet néfaste. Les injections répétées sont susceptibles d’entraîner des irritations, si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. La pose des transmetteurs pour permettre la télémétrie se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après les chirurgies. Il n'est pas connu de risque de rejet du transmetteur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Le développement corticale et l’épilepsie est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations endocrines. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes d'intérèt sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. les traitements pharmacologiques ne présentent pas de toxicité et ont déjà été testées in vitro ainsi que in vivo aux mêmes doses. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.

Réduction

L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. Dans ce modèle, un groupe de 25 animaux est suffisant donc des groupes de 25 animaux seront utilisés. L'estimation du nombre d'animaux a été réalisé en comptant une perte de 10% de nos animaux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton, de bâtonnets de bois et de tunnel. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites 2 fois par semaine. Le traitement pharmacologique choisi sera administré quotidiennement et sera effectué par un technicien expérimenté à l'aide de seringues très fine qui donnent une injection quasi indolore. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Les traitements pharmacologiques par injection ne provoquent pas d'effet néfaste. Les injections auront lieu alternativement à gauche ou droite. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. La pose de transmetteur sera faite sous anesthésie générale avec une analgésie. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après la chirurgie. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérèt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un fragment de tumeur de patient est implanté sous la peau du flanc par incision chirurgicale, puis les animaux reçoivent des injections et une irradiation ciblée de la tumeur, pour comparer deux approches de radiothérapie interne à la radiothérapie externe dans des cancers du pancréas et de l'ovaire. Le porteur décrit des douleurs aux points d'injection et une mise à mort dès une perte de poids de 20 % ou une tumeur dépassant 1 500 mm³. Les bénéfices pour les patients sont rattachés à un "transfert clinique" envisagé avec un industriel à l'issue de l'étude.

Objectifs

Les cancers pancréatiques et ovariens souffrent aujourd'hui de mauvais prognostics liés à un diagnostique tardif et d’options thérapeutiques très limitées. Ce projet a pour objectif d’évaluer deux approches de radiothérapie interne vectorisée établies au sein de l'équipe porteuse du projet dans des modèles dérivés de patient de cancer pancréatique et ovarien greffés chez des souris pour mimer au plus près ces cancers. Nous comparerons ces nouvelles approches thérapeutiques à la radiothérapie externe conventionellement appliquée pour le traitement de ces cancers. Nous souhaitons in fine démontrer les bénéfices des approches de radiothérapie interne vectorisée par rapport à la radiothérapie externe pour envisager le transfert clinique de nos approches.

Bénéfices attendus

La validation de l'efficacité thérapeutique de ces approches à fort potentiel de transfert clinique pourrait apporter une option de thérapie ciblée pour les 14’000 et 5'320 patients atteints de cancers pancréatiques et ovariens diagnostiqués chaque année en France. Une translation clinique est envisagée à la fin de cette étude avec le soutien d'un industriel.

Procédures

-injection en sous-cutanée via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (30 sec/animal) -anesthésie de l’animal à l’isoflurane (4% pour l’induction puis 2% pour le maintien) (3 min/animal) - incision de 0.3 à 0.8 cm avec un ciseau stérile sur le flanc gauche de l'animal (30 sec/animal) - création d'un tunnel sous cutané avec une pince fermée (30 sec/animal) - insertion d'un fragment de tumeur d’environ 30 mm3 à l’aide de pinces dans l’incision au fond du tunnel (1 minute/animal). - fermeture de l’incision à l’aide de 1 ou 2 points fil de chirurgie 6.0 non-résorbable (1 minute/animal) - acquistion scanner + tomographie par emission de positrion (15-35 minutes/animal) - injection par voie intraveineuse (veine caudale) via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (1 min/animal) - injection intrapéritonéale via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (1 min/animal) - irradiation de la zone tumorale 1x1cm avec un irradiateur XenX (Xstrahl) sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intrapéritonéale - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à une implantation d'un fragment tumoral sous-cutané. Effets indérisables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés selon une méthode adaptée pour l'animal (non anxiogène, indolore, perte de connaissance instantanée), pour l'expérimentateur (sans danger, sans risque de choc émotionnel), pour l'expérience (pas de modification des tissus nécessaire à l'expérimentation).

Remplacement

Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer la biodistribution et l'efficacité thérapeutique d’un radiopharmaceutique tout en considérant l'accumulation et la toxicité au niveau des tissus sains.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’évaluation de la pharmacologie de radiopharmaceutiques nous contraint à l’utilisation de plusieurs groupes contrôles. Néanmoins, le suivi par une technique d’imagerie non invasive (tomographie par emission de positron) couplé à la tomodensitométrie pour définir le meilleur modèle vivo pour les approches de radiothérapie, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas de sacrifices à chaque temps d’imagerie. La taille des différents groupes de cette étude a été défini avec l'aide de biostatisticiens pour fournir une puissance suffisante sur la base de l'analyse de nos résultats préliminaires. Les résultats de cette étude seront analysés en collaboration avec une équipe de biostatistique.

Raffinement

L'environnement des animaux est stable et contrôlé (air ambiant, température, humidité, luminosité). L'hébergement est enrichi d’accessoires permettant l'expression de certains comportements naturels par l'animal et participant ainsi à leur bien-être. Une alimentation et de l'eau mis à disposition des animaux. Les animaux sont hébergés en groupes restreints (n=5). Une surveillance sanitaire trimestrielle permet de s'assurer de l'absence de pathogène et d'agent pathogène opportunistique, assurant ainsi la bonne santé des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Les signes de douleur, souffrance, angoisse, changement de comportement ou d’aspect physique seront classés et rapportés selon la fiche de suivi clinique. Tout score ≥ 6 conduira au sacrifice de l’animal. De manière plus spécifique, les points limites pour ce protocole sont : - une perte de poids supérieure à 20% du poids initial - un volume tumoral > 1500 mm3. Ces points limites ont été établis lors d'expérimentations préliminaires afin de prévenir une dégradation de l'état général des animaux (e.g. perte de poids, réduction de la consommation alimentaire, déshydratation). L’utilisation de produits anesthésiques et analgésiques permettra de réduire ou supprimer la douleur de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle murin est particulièrement adapté pour ces expérimentations puisqu'il possède des mécanismes d'absorption, de métabolisme et d'élimination très proche de l'homme. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers pancréatiques et ovariens étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en âge adulte. Le sexe femelle est nécessaire pour les cancers ovariens.

64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale humaine est implantée dans leur cerveau, puis une sonde de microdialyse qui ressort du crâne et y reste jusqu'à la mise à mort, des prélèvements de liquide cérébral étant réalisés sur l'animal conscient et maintenu en contention entre le 11e et le 17e jour. Ils subissent aussi radiothérapie et imagerie sous anesthésie, la mise à mort survenant dès un point limite ou au plus tard à 90 jours. Le porteur présente la microdialyse comme un moyen de réduire le nombre d'animaux et affirme que le remplacement n'est "clairement pas possible".

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes et sont généralement agressives. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nouvelles molécules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique d'un médicament innovant (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine implantée chez l'animal. L’objectif du projet étant d'étudier la réponse immunitaire après traitement par ce médicament innovant en association avec la radiothérapie. Pour cela nous utiliserons une technique qui permet un dosage répété des molécules présentent dans l'environnement de la tumeur sans réaliser de biopsie du cerveau. Au cours d'une chirurgie nous plaçons une sonde dans la tumeur cérébrale de l'animal; celle-ci nous permettra de mesurer la réponse immunitaire durant plusieurs jours. Cette technique permet de réduire considérablement le nombre d'animaux comparé aux techniques traditionnellement utilisées qui necessiteraient la mise à mort de l'animal pour chaque point de mesure. Pour le suivi de l'évolution de la masse tumorale des différents traitements, nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament innovant pour le traitement du glioblastome. La technique de mesure utilisée permettra, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le tissu cérébral, d'obtenir des échantillons de façon dynamique tout en gardant l’animal en vie. Ces échantillons nous permettront un suivi au cours du temps de la réponse immunitaire après traitement du médicament innovant et de la radiothérapie.

Procédures

Implantation dans le cerveau des animaux de tumeurs cérébrales humaines, cette chirurgie dure environ 1h. Implantation d'une sonde de microdialyse : durée de la chirurgie environ 1h30 ; présence de la sonde qui ressort au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal. Prélèvement de liquide cérébral sur animal vigile hébergé en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement. Cette méthode de prélévement sera réalisée du jour 11 au jour 17 sur l'animal conscient; l'hébergement en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement induit une restriction des déplacements de l'animal. Protocole de radiothérapie et imagerie pour le suivi de l'évolution de la tumeur sur animal anesthésié

Impact sur les animaux

Implantation au niveau du cerveau de cellules tumorales d'origine humaine : chirurgie classée modérée car seule l’incision de la peau du crane peut provoquer une souffrance à l’animal. Nous utiliserons un analgésique local pour limiter la souffrance des animaux. Implantation de la sonde : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la sonde (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements adaptées au mode de prélèvement avec système de contention. Radiothérapie et imagerie sur l’animal : transport de l'animal jusqu’à la plateforme d'imagerie et de radiothérapie ; afin d’éviter toute nuisance à l’animal, le transport est réalisé en cages filtrées dans un sac de transport isotherme (pour le maintien d’une température optimale, des bouillottes chauffantes sont placées sous les cages si nécessaire). Les procédures de radiothérapie ou d’imagerie sont réalisées sur l’animal anesthésié. L'imagerie est un examen non invasif , il ne produit aucune forme de douleur.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. La mise à mort est réalisée dès l’apparition d’un point limite (altération des déplacements et/ou perte de poids) ou en cas d'efficacité du traiement au maximum 90 jours après le début des expérimentations.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales et les effets du traitement par radiothérapie avec ou sans médicament innovant, dépendent de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.

Réduction

La technique utilisée est une méthode permettant le recueil du liquide cérébral et de ses composants sans avoir à mettre à mort les animaux. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements peuvent être réitérés au cours du temps. Nous n’avons pas de réelle idée des variations attendues entre les différents groupes d'animaux, il est donc compliqué de définir un nombre d’animaux précis nécessaire pour une obtenir une solide étude statistique mais 8 animaux par groupe semble tout à fait pertinent.

Raffinement

Les deux procèdures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress de l'animal et de permettre un réveil rapide. Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la sonde (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment des prélèvements intracérébraux, en effet les animaux seront régulièrement observés pour vérifier que le comportement des animaux n’est pas altéré par le mode de prélèvement et les contraintes de contention. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en cancérologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur et de la sonde de prélèvement plus précise mais également par la nécessité d’obtenir de volumes de prélèvement suffisamment importants. De plus la taille du cerveau de rat offre une meilleur résolution pour l’imagerie. Des rats âgés de 6-8 semaines sont utilisés, à un stade où la taille et la forme du crâne correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.

Opérés pendant 90 minutes sous anesthésie générale pour recevoir une prothèse aortique et un cathéter veineux central, 24 porcs de 10 semaines doivent ensuite développer une infection de cette prothèse par un staphylocoque, avec une fièvre attendue qui peut durer tout le protocole. Deux fois par semaine, huit prises de sang de quinze minutes passent par le cathéter, sans anesthésie. À J15, les 12 porcs des groupes de phagothérapie reçoivent sous anesthésie générale une injection de virus antibactériens guidée par scanner, et les 12 des groupes antibiotiques de la vancomycine deux fois par jour pendant quinze jours, chaque injection durant en moyenne une heure, sans anesthésie. À J30, une dernière chirurgie de 90 minutes retire la prothèse et les tissus voisins. Les 24 porcs, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, sont tous mis à mort pour l'analyse bactériologique de la prothèse, le porteur jugeant "déraisonnable" de rétablir la circulation par une autre prothèse.

Objectifs

L’aorte, plus gros vaisseaux du corps humain, est sujette à de nombreuses pathologies, notamment les anévrismes, une dilation du vaisseau pouvant conduire à sa rupture, à l’origine de 15000 décès/an aux USA. Pour les traiter, le segment dilaté peut être remplacé par une prothèse en tissu. L’une des complications opératoires les plus fréquentes est une infection de cette prothèse vasculaire aortique (IPA). C’est une complication grave, qui peut être traitée en remplaçant la prothèse infectée et en associant une antibiothérapie. Cependant, 20% des patients sont non opérables et sont traités par une antibiothérapie au long cours seule. Ces patients présentent un risque élevé de mortalité. L’utilisation de virus capables de détruire une bactérie (phagothérapie) a montré son efficacité sur les infections bactériennes dans plusieurs études. Devant l’échec de l’antibiothérapie, il est apparu logique d’étudier l’efficacité de la phagothérapie dans les IPA. La sévérité des IPA est une problématique majeure en chirurgie vasculaire. La phagothérapie pourrait présenter un bénéfice majeur en élargissant les possibilités de traitements, et en représentant une alternative/un complément à l’antibiothérapie. Il s’agit du premier projet de recherche sur modèle porcin, évaluant la phagothérapie dans les IPA, et cherchant à proposer une nouvelle thérapie. Les résultats favorables de la phagothérapie dans d’autres infections et l’absence d’étude sur leur efficacité sur les IPA, ont conduit à mettre en place ce projet. Le modèle porcin se rapproche biologiquement le plus du modèle humain pour cette étude. Les objectifs de cette étude sont de valider les aspects techniques de l’administration de la phagothérapie dans notre modèle et d’évaluer l’efficacité de la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques. L'hypothèse principale est que la phagothérapie, dans les infections de prothèses aortiques, exerce une activité anti-infectieuse supérieure à l’antibiothérapie seule. L'objectif ultime est d'évaluer la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques dans les IPA chez des patients non opérables. Le transfert clinique en cas de résultats favorables paraît rapidement envisageable au vu de l’absence de traitement pour les patients.

Bénéfices attendus

Il s'agit de la première étude s'adressant à la phagothérapie dans les infections de prothèse aortique sur un modèle préclinique. L'objectif ultime est d'évaluer la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques en tant que traitement conservateur dans les IPA chez des patients inopérables, voire en tant que traitement adjuvant d’une chirurgie conservatrice. De plus, une application locale de phages est également envisageable chez l'homme, pour traiter les infections de prothèses aortiques par voie mini-invasive, c’est-à-dire libérées à l’intérieur d’un anévrysme pour l’exclure du flux sanguin. Le transfert clinique en cas de résultats favorables paraît rapidement envisageable vu le contexte pathologique de départ. Il s'agit de la combinaison d'un sujet extrêmement actuel, la phagothérapie à l’ère l'antibiorésistance, avec une pathologie sévère résistante aux traitements antibiotiques classiques. Le transfert clinique est aisément envisageable, vu le contexte pathologique.

Procédures

Tout d’abord, les animaux sont soumis à la chirurgie initiale de mise en place d’une prothèse aortique sous anesthésie générale. Celle-ci sera réalisée sur les 24 animaux avec une durée d’intervention de 90 minutes. La pose d’une voie veineuse centrale tunnelisee, sera effectuée sur tous les animaux au cours de cette chirurgie, permettant les prélèvements et l’administration de médicament. Des prélèvements sanguins seront réalisés chez les 24 animaux, sans anesthésie par le cathéter mis en place au cours de la chirurgie initiale. Ils seront effectués 2 fois par semaine, soit 8 fois au cours de la procédure. Un prélèvement sanguin dure en moyenne 15 minutes. Les animaux des groupes traités par phagothérapie seule ou en association aux antibiotiques, soit 12 animaux, recevront une injection locale de virus à activité antibactérienne par ponction guidée par scanner. Cette injection aura lieu une seule fois au cours de la procédure (à J15), elle sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 45 minutes. Les animaux des groupes traités par antibiotiques seules ou en association à la phagothérapie (12 animaux) recevront un traitement antibiotique par vancomycine. Cette injection se fera sans anesthésie à l’aide des cathéters, deux fois par jour pendant 15 jours dès J15. Une injection dure en moyenne 60 minutes. La chirurgie finale sous anesthésie générale permettra le prélèvement de la prothèse et des tissus biologiques. Elle sera réalisée à J30 sur les 24 animaux, avec une durée attendue de 90 minutes.

Impact sur les animaux

Il existe des complications pendant la chirurgie : risque de saignement par lésion d’un vaisseau, risque de lésion des intestins et risque d'embolisation d'un caillot sanguin. Ces complications sont rares. La cicatrice abdominale est à l’origine de douleurs abdominales qui sont courantes, avec une durée attendue de 7 jours. Elle entraine également le risque d’une perte d’appétit avec retard à la reprise du transit, normalement de courte durée (24-48h). Suite à la chirurgie, il existe un risque de saignement post-opératoire, pouvant être lié à une lésion d’un vaisseau, un risque d'obstruction de vaisseaux des membres postérieurs par un caillot sanguin qui s'embolise. Ces deux évènements sont rares mais peuvent survenir pendant toute la durée de l’étude. Il existe un risque rare d’obstruction (embolisation) d'une des artères destinées aux intestins. Cet effet indésirable survient principalement en post-opératoire immédiat (24-48h). L’étude a pour but de créer une infection de prothèse aortique, ainsi une fièvre est attendue, effet qui peut être ressenti pendant toute la durée du protocole. La fièvre se traduit par une perte d’appétit, un ralentissement dans le comportement du porc à type de fatigue associée à un isolement. Pour chaque étape (chirurgie, prélèvements etc), il existe un stress lié à l’isolement de l'animal de ses congénères pour les manipulations. En post-opératoire immédiat, l’isolement se fait pour une durée de 24 heures, pour permettre le repos/la surveillance rapprochée de l’animal et éviter l'arrachage de points de suture.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort les animaux à la fin du projet. Le but de cette mise à mort est de prélever la prothèse vasculaire posée initialement ainsi que les tissus biologiques entourant cette prothèse afin d’effectuer l’analyse bactériologique de la prothèse et des tissus biologiques (prélèvements aortiques au contact de la prothèse). Cela permettra également l’analyse histologique de tissus biologiques afin de comparer les degrés d’infection dans les groupes. Par ailleurs, en accord avec les recommandations des vétérinaires, la mise à mort est nécessaire afin d’éviter des nuisances et souffrances inévitables induites par l’ensemble de la procédure. Le rétablissement de continuité vasculaire par une autre prothèse dans ce contexte sceptique est jugé déraisonnable, étant donné les douleurs post-opératoires attendus et le risque attendu infectieux si l’animal était destiné à être réveillé.

Remplacement

Il n’existe aucune méthode de substitution permettant l’étude d’un traitement infectieux sur une infection bactérienne développé sur une prothèse vasculaire. En effet la prothèse vasculaire doit être dans des conditions d’analyses proches de l’humain, c’est à dire greffé à un tissu organique natif, soumis aux régimes hémodynamiques et sur un terrain susceptible de permettre le développement d’une infection bactérienne in vivo. Une prothèse aortique seule infectée par une culture de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline, ex vivo ne reproduirait pas l’effet sur : les tissus périphériques, l’hémodynamique, l’impact sur l’organisme avec les aspects cliniques, et les modifications histologiques artériels. De plus l’objectif est d’évaluer l’efficacité de la phagothérapie au sein d’un organisme vivant et dont la physiologie est proche de l’homme. De nombreuses études ont été faite pour évaluer l’efficacité de la phagothérapie sur des souches bactériennes en cultures in vitro. De nombreuses études d’efficacité in vivo sur des modèles animaux ont permis de montrer l’efficacité de la phagothérapie sur des pathologies spécifiques. Notamment dans le traitement des infections pulmonaire à Pseudonomas aeruginosa chez des souris atteintes de mucoviscidose par phagothérapie, ainsi que dans le traitement d’infection de matériel orthopédique à Staphylocoque doré résistant à la méticilline. Il s'agit de la première étude visant à évaluer l’efficacité de la phagothérapie sur modèle vivant d'infection de prothèse aortique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de résultats obtenus dans le cadre d'études antérieures. Le nombre de 24 animaux a été défini comme le nombre minimum d’animaux à utiliser pour mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le nombre d’animaux « n » nécessaires à l’obtention d’une valeur statistique permettant de conclure à une supériorité de la phagothérapie, a été calculé à l’aide d’un test statistique. Il a été décidé lors d de diminuer la sensibilité de notre test, c’est-à-dire la puissance statistique, afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le test statique sera utilisé pour comparer les différences des charges bactériennes entre les groupes de traitement et de contrôle. Toutes les analyses statistiques seront effectuées à l'aide du programme statistique. Les choix des groupes expérimentaux et témoins, se sont fait en fonction de modèles expérimentaux préalablement étudiés. Dans les groupes témoins (sans traitement) nécessaires à la réalisation de l’étude, l’effectif a été réduit au strict minimum. Le travail en aveugle pour les injections (le manipulateur ne connait pas le produit qu’il administre, phagothérapie ou antibiothérapie) n’est pas possible, les voies d’administration étant différentes en fonction du traitement. Afin de diminuer le nombre de geste invasif sur l’animal, il ne semblait pas convenable de réaliser des injections placebo. Les analyses des critères infectiologiques, cliniques et biologiques seront effectuées en aveugles.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum est respectée, permettant l’habituation des animaux au contact et à la manipulation par du personnel expérimenté. L’hébergement des animaux est réalisé en groupes sociaux (contact visuel, olfactif, physique) sur litière de copaux. Les porcs sont hébergés globalement 1 par box mais les boxes communiquent entre eux. Les animaux seront 3 par groupes, pour éviter l’isolement. La nourriture est distribuée au sol afin de favoriser le comportement de fouissage ; Le contact est réalisé à minima 3 fois par jour, pour le change de la litière, la distribution de nourriture et d’eau. Les porcs sont ainsi habitués à la présence de l’Homme dans le box/l’environnement et à son contact (tête, dos…). Des morceaux de pommes et des caresses sont distribués comme récompenses. Quotidiennement sont observés la prise alimentaire et de boisson, le comportement de fouissage, l’absence de bagarre, le temps passé couché pendant la phase d’habituation. Ensuite, tout au long du protocole, la présence/absence de ces mêmes comportements sont observés. Sont contrôlés également l’abattement, la position voussée du dos, la réticence au déplacement pouvant indiquer par exemple une douleur abdominale, de la fièvre... Les animaux sont gardés dans une animalerie avec un cycle d’alternance jour/nuit de 12h/12h. Des jouets en plastique fixés au mur ou ballon en plastique au sol sont mis à disposition. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse avec prémédication incluant anti-inflammatoire et opioïde pour la prise en charge de la douleur. Les animaux sont placés sur tapis chauffant tout au long de la chirurgie. En période post-opératoire, la douleur est prise en charge par des anti-inflammatoires, éventuellement associés à des opioïdes si besoin. Lors de la première chirurgie, un cathéter central sera mis en place pour limiter le nombre de piqûres et de gestes invasifs pour prélèvements sanguins. Les porcs sont surveillés de façon quotidienne au niveau du comportement et de la prise de la température. La surveillance hebdomadaire du poids sera également réalisée.

Choix des espèces

Le modèle de l’infection de prothèse aortique chez le porc est utilisé dans cette étude. Sur le plan scientifique, c’est l’animal le plus utilisé dans les domaines de la recherche en chirurgie aortique, la majorité des techniques chirurgicales sont expérimentées sur le porc. Les mécanismes d’action, au sein de l’organisme, des produits de cette étude, l’antibiothérapie et la phagothérapie, sont proches de celles de l’homme. Le modèle d’infection de prothèse aortique à Staphylocoque (bactérie étudiée dans cette étude) chez le porc est un modèle qui a été standardisé et utilisé dans de nombreuses études expérimentales. Sur le plan technique, le porc se rapproche le plus de l’homme. En termes d’anatomie vasculaire et d’hémodynamique. La technique chirurgicale, le risque de traumatisme chirurgical et infectieux, sont strictement comparables. Sur le plan éthique, cette espèce est la plus susceptible de survivre à une infection sévère comme les infections de prothèses aortiques. Elle présente une résistance étudiée et connue à la chirurgie aortique, et à ses complications. Nous utiliserons le modèle de l’infection de prothèse aortique chez le porc (30- 35 kg). Ils sont âgés de 10 semaines au début du protocole. Le choix s’est orienté vers des porcs de poids peu élevés, et s’explique de plusieurs manières. En effet cela permet de faciliter la manipulation des animaux, et de diminuer ainsi le stress ressenti. Cela permet également de faciliter la chirurgie, avec des conditions anatomiques plus favorables, et donc un meilleur taux de succès chirurgical. L’injection du traitement sous-scanner est également facilité par le choix de porc de petite taille, afin d’être adapté à la taille de la machine.

1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. De jeunes souris reçoivent une injection de cellules cancéreuses près du tibia pour développer une tumeur osseuse, puis des administrations répétées de molécules à tester, avant mise à mort pour prélever tumeur, organes et membres. Le porteur décrit une douleur modérée liée à l'injection près de l'os et une perte de mobilité liée à la tumeur, la taille de celle-ci servant de critère d'arrêt. Sur le remplacement, il affirme que des essais in vitro ont déjà eu lieu et qu'une évaluation chez la souris reste indispensable avant la clinique.

Objectifs

L’objectif scientifique est de vérifier que les résultats obtenus in vitro dans les cellules d’ostéosarcome murin sont applicables aux modèles d’ostéosarcome chez la souris immunocompétente dans un contexte environnemental complexe (vascularisation ; effets secondaires, micro-environnement osseux, implication du système immunitaire ...) avant toute application clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de valider l'efficacité thérapeutique de molécules impliquées dans la résorption osseuse et dans l'activité anti-tumorale avant d'entrer en phase clinique

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pendant quelques minutes et sous analgésie pendant 12 heures. L'injection des cellues cancéreuses sera réalisée en site para tibiale (durée : quelques secondes). La mesure du volume tumorale sera effectuée 2 à 3 fois par semaine (animal vigile, durée de la conrtention : quelques secondes). L'injection des molécules à tester sera réalisée par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse (durée : une minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont un stress lié à la contention et à l'anesthésie des animaux. Une douleur modérée associée à l'injection en paratibiale (injection intramusculaire proche de l'os). Le développement tumoral, bien que contôlé quotidiennement pourra entraîner une légère perte de mobilité. Une attention particulière sera portée à la mesure du volume tumoral qui constitue un critère d'arrêt décrit dans les points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort l'issue de l'étude pour prélèvement post-mortem (tumeur, organes, membres postérieurs)

Remplacement

Dans le cadre du développement clinique de nouvelles molécules à activité anti-tumorale et impliquée dans la résorption, des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées avec succès. Une évaluation pré clinique est cependant indispensable pour étudier les effets de ces molécules in vivo. Le modèle murin reste le plus adapté à ce type d'étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d'effectuer des analyses statistiques. Compte-tenu d’études comparables déjà publiées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique (n=8).

Raffinement

Afin de raffiner les procédures expérimentales, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter le plus précocement possible tout signe de douleur. La manipulation des animaux se fera sous anesthésie générale gazeuse, sur un tapis chauffant lors de la réalisation des gestes techniques. Une analgésie sera appliquée pour l'implantation des cellules tumorales et des points limites strictes et spécifiques du projet seront établis (développés ci-dessous). Les animaux seront hébergés en groupe, à raison de 4 par cage. L'environnement sera adapté afin que les animaux puissent avoir un comportement aussi naturel que possible (litière adaptée à l'espèce, frisottis, maisonnette en carton,...). L'alimentation et l'eau seront fournis

Choix des espèces

L’utilisation de souris immunocompétentes est choisie afin d’étudier le développement de nouvelles thérapies sur des tumeurs murines dans un environnement in vivo complexe (os et tumeur) sans s’affranchir de l’implication des cellules de l’immunité sur les effets observés. La souris est un modèle particulièrement adapté à l'oncologie. Nous utilisons de jeunes souris afin de mimer au mieux les tumeurs osseuses qui se développent chez l’enfant, l’adolescent ou le jeune adulte chez les patients. Réception de souris âgées de 4 ou 5 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 ou 6 semaines).

1 008 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes dans le cerveau, des gavages quotidiens pendant près d'un mois et des injections de substances qui déclenchent des crises, avec des états de mal épileptique pouvant durer deux heures et des isolements, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur reconnaît un stress et une douleur liés à la chirurgie, aux crises et aux administrations répétées, et prévoit d'administrer une benzodiazépine au-delà de deux heures de crise. Il affirme que les crises d'un cerveau entier ne se reproduisent pas in vitro et que la modélisation informatique manque encore de données.

Objectifs

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements (pharmacologiques et probiotiques) sur 1) la prévention et 2) la terminaison de l’état de mal épileptique (status epilepticus) et des crises spontanées, induits chez l’animal. L’état de mal épileptique (status epilepticus) est défini par une crise prolongée (plus de 5 min) qui induit à long terme des altérations neurologiques graves. Bien que la plupart des patients répondent bien aux benzodiazépines (médicament donné en première intention), certains patients sont réfractaires (un tiers) et nécessitent d’autres traitements. L’état de mal épileptique est généralement accompagné par l’occurrence de crises spontanées après une période dite de latence. Nous proposons ici d’utiliser 2 modèles d’épilepsie présentant un état de mal épileptique et des crises spontanées, et de tester l’efficacité de traitements chroniques (administrés par voie orale) sur la prévention et ou la terminaison des crises induites.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de traitements anti-épileptiques pharmacologiques et probiotiques nouveaux sur l’état de mal épileptique et les crises spontanées associées. Le but est de proposer ces traitements chez l’humain, soit pour prévenir de l’état de mal épileptique, présent dans de nombreux syndromes épileptiques, dont le syndrome de Dravet; soit pour terminer un état de mal épileptique afin d’éviter la survenue d’altérations neurologiques. L’état de mal épileptique prolongé (réfractaire aux traitements actuels) touche 1 tiers de patients épileptiques et peut avoir des conséquences délétères pour le cerveau, voire entrainer la mort des patients.

Procédures

- Chirurgie d’implantation d’électrodes EEG : anesthésie générale et analgésie, une fois par animal, 1008 animaux, durée de la chirurgie maximum 1h - Gavage oral : animaux vigile, une fois par jour pendant 27 à 35 jours selon les procédures (336 animaux par procédure) - Injection sous-cutanée : animal vigile, 12 fois pour 336 animaux, 2 fois pour les 672 autres - Injection intrapéritonéale : animal vigile, une fois pour 672 animaux et éventuellement une 2ème fois (pour stopper l’état de mal épileptique) pour 1008 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : 1) Une survenue de crises épileptiques et un état de mal épileptique (d’une durée maximale de 2h) , qui peuvent entrainer à plus long terme des altérations neurologiques 2) un stress et une douleur dus à la chirurgie pour l’implantation d’électrodes et au suivi des crises 3) un stress dû à l’isolement (de 2h à 24h) pendant les périodes d’enregistrement des crises 4) un stress et une douleur dus à l’administration chronique sous cutanée des convulsivants 5) un stress et une douleur dus à l’administration chronique par gavage des traitements proposés Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales induites par les crises ne peuvent être étudiées au niveau cellulaire chez l’humain. (2) Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier (et ceux malgré le développement de méthodes alternatives). (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.

Réduction

Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord les traitements préventifs avant de tester les traitements curatifs. Selon le « Guidelines for the Design and Statistical Analysis of Experiments Using Laboratory Animals (Festing, Altman) », il nous faut au minimum 10 animaux par groupe. L’induction d’un état de mal et des crises pouvant entrainer une mortalité, nous envisageons d’utiliser au maximum 14 animaux/groupe afin d’atteindre un nombre minimum de 10 en cas de perte d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec des tunnels en plastiques (ou des huttes en carton après implantation d’électrodes). La température est controlée. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Avant chirurgie, une dose d’analgésique est administrée (environ 45 min avant). Pendant la chirurgie, un gel est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le déssèchement de la cornée. Un spray d’anesthésique local est appliqué au niveau de la peau incisée pour limiter la douleur. De plus, l’animal est maintenu à une température de 37°C à l’aide d’un tapis chauffant avec rétrocontrôle. Puis, à la fin de la chirugie, une deuxième dose d’analgésique est administrée dans les 4h (soit 6h après la première) pour réduire la douleur postopératoire, puis un antalgique dans l’eau de boisson est donné pendant 48h. Une distribution d'aliment hydraté pourra être effectuée pour faciliter l'alimentation. Lors de l’induction d’un « état de mal » épileptique (status epilepticus), les animaux sont suivis par vidéo-EEG. Si cet état de mal dure plus de 2h, les animaux recevront une dose d’une benzodiazépine afin de stopper le phénomène épileptique, et ainsi limiter les conséquences. Les traitements que nous proposons de tester ont pour but de prévenir et/ou de terminer cet état de mal. Les administrations (intrapéritonéale, sous-cutanée ou par gavage oral) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.

Choix des espèces

L’espèce que nous avons choisi (rat Sprague Dawley) est le modèle le plus décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux l'épilepsie induit par les proconvulsivants utilisés dans cette étude. Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. De plus, la lignée Sprague Dawley choisie montre un taux de survie élevé suite à l’induction des crises proposées. Pour toutes les procédures, des animaux adultes seront utilisés (à partir de P60). Les modèles proposés ont montré leur efficacité chez le rat adulte.