Procédures sévères

12 480 souris et 3 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur induit une fibrose de la peau et des poumons, avec pose chirurgicale de pompes, injections intradermiques et administrations intranasales ou oropharyngées, pour cribler l'efficacité de nouvelles molécules contre la sclérodermie. Le porteur indique que la fibrose se développe sans autre effet indésirable attendu et fixe la mise à mort à un score de souffrance déterminé. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "indispensable" d'examiner l'"animal entier" et que ces essais ne peuvent être reproduits sur cellules, pour un total de 15 600 animaux.

Objectifs

La sclérodermie systémique (SSc, systemic sclerosis) est une maladie systémique du tissu conjonctif. Elle est caractérisée par des lésions de fibrose cutanée et/ou viscérale, une atteinte microvasculaire et une réponse immunitaire activée et dérégulée. La SSc est une pathologie rare, sa prévalence varie de 30 à 240 cas par million d’habitants. Cette maladie touche essentiellement les femmes (4 femmes pour 1 homme environ), et se déclare généralement entre 45 et 60 ans. La SSc est associée à une surmortalité significative. Le pronostic dépend essentiellement de la survenue d’atteintes viscérales et plus particulièrement d’une pneumopathie infiltrante diffuse (PID) parfois sévère, d’une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) ou d’une atteinte cardiaque primitive, qui représentent les 3 premières causes de mortalité au cours de la SSc. C’est une maladie multifactorielle qui implique des facteurs environnementaux et un fond génétique de susceptibilité. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché mais une prise en charge adaptée permet seulement d’atténuer les symptômes. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules efficaces. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet, le but étant d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels contre la sclérodermie. Le projet inclus un screening de nouvelles molécules, une étude si besoin de leur mécanisme d’action et évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement un médicament contre la sclérodermie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de l’sclérodermie avec la mise en place de différents modèles animaux de fibrose cutanée et pulmonaire chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la fibrose et l’inflammation dans des modèles animaux mimant les symptômes de la sclérodermie diffusée chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans des maladie chronique fibrotiques. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui soulageraient à la fois les symptômes de la fibrose et l’inflammation.

Procédures

Tous les animaux de la procédure 6 (sauf le groupe 1, opéré à blanc) subiront une chirurgie pour incorporer les pompes osmotiques. La chirurgie de 20-45minutes aura lieu au jour 0 sur animal anesthésié et analgésié. Tous les animaux de la procédure 1et 2 subiront des injections intradermiques, les animaux de la procédure 3 et 4 subiront des administrations intranasale et oropharyngée (sauf le groupe 1, sérum physiologique) et les animaux de la procédure 5 sauf le groupe 1, avec du véhicule) subiront des injections sous-cutanées et intramusculaires. Les traitements pourront être administrés avant, pendant ou après l'induction du modèle. Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale (sur animal vigile). Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer de la fibrose cutanée et pulmonaire, et l’inflammation sans autre effet indésirable attendu. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer différents organes, dont les articulations, pour analyses histologiques ou autre.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur la fibrose et l’inflammation implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie de fibrose humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur la réponse à la fibrose et l’inflammation et structure des organes viscéraux, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (Mann Whitney test) ou une analyse de variance (ANOVA).

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, administrations oropharyngée) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Toutefois, pour les modèles d’induction de fibrose pulmonaire par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique sera administré en phase pré- et post-opératoire. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces et la réponse respiratoire. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >6 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de fibrose cutanée et pulmonaire en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de souris C57Bl/6 est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Cependant, il est envisageable d’utiliser d’autres souches de souris comme les BALB/C ou des rats comme la souche de rat Sprague Dawley qui est également un modèle de laboratoire bien connus. Chez la souris, la souche C57Bl/6 représente la souche de choix pour ces études mais d’autres souches pourront également être utilisées dépendant de leurs susceptibilités à l’induction de la pathologie en fonction du modèle Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier des objectifs et besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés de 6-19 semaines au début de l’étude selon le type ou le stade de progression de la maladie sur des patients atteints de sclérodermie (Sclérodermie juvénile ou sclérodermie sur des patients adultes).

482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une injection de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou directement dans le cerveau par stéréotaxie sous anesthésie prolongée, passent des tests de mémoire, puis subissent des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien avant mise à mort. Le porteur indique des risques de saignement lors de la craniotomie, de traumatisme lié à l'aiguille dans le cerveau et d'infection oculaire après injection rétro-orbitaire. La retombée annoncée, remplacer l'injection intracérébrale par une voie intraveineuse chez les patients, reste renvoyée aux étapes précliniques à venir.

Objectifs

A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle de souris de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA..

Bénéfices attendus

Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (virus adeno-associé) induisant l'expression de la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les couples reproducteurs commerciaux seront utilisés. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (70 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d'un anti-douleur, injection stéréotaxique). Deux tests comportementaux permettent de mesurer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes sous anesthésie) et sanguin (1 minute) sera réalisé sous anesthésie avant d'appliquer une méthode d'euthanasie réglementaire (après injection d’un anti-douleur). Plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques (anti-douleur) seront effectuées lorsque nécessaire.

Impact sur les animaux

Parmi les effets indésirable s attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (virus adeno-associé) pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux et un risque d’hypothermie.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).

Remplacement

Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (482) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.

Raffinement

Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’anesthésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l'injection sur les yeux de l'animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L'applicateur est formé au geste d'injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.

Choix des espèces

Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (entre 6 et 12 mois) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 4-6 mois puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.

1 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 140 étant classées au niveau sévère. Elles subissent des gavages, des prélèvements de sang répétés, dont un dans le cœur, et l'administration d'un composé provoquant une colite avec perte de poids, diarrhées et sang dans les selles. Le projet vise à mesurer l'effet d'additifs alimentaires, édulcorants et émulsifiants, sur l'intestin de deux générations de souris. Le porteur affirme que les interactions entre microbiote, intestin et système immunitaire ne peuvent être étudiées in vitro et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’utilisation d’édulcorants est largement répandue dans l’industrie alimentaire et des études récentes suggèrent un rôle néfaste sur la santé comme un risque accru de développer des cancers ou le développement de troubles métaboliques. Les effets des émulsifiants, dont l’utilisation dans l’industrie alimentaire est en constante progression, sont un peu moins étudiés mais ces additifs affectent l’équilibre du microbiote (flore) et sont suspectés d’altérer l’intégrité de la barrière intestinale. Les étapes précoces de la vie comme la gestation et la lactation constituent une fenêtre cruciale pour le bon fonctionnement de l’organisme chez l’adulte : des perturbations du microbiote et du métabolisme durant ces périodes critiques du développement peuvent augmenter le risque de développer des pathologies plus tard au cours de la vie. L’alimentation maternelle au cours de la gestation et de la lactation joue un rôle important dans la susceptibilité accrue à développer diverses pathologies chez les descendants. L’objectif principal de ce projet est de comprendre le rôle d’un type de cellules intestinales dans la mise en place des défauts intestinaux suite à l’exposition à des additifs alimentaires (édulcorants, émulsifiants). Nous étudierons les conséquences d’une exposition indirecte à ces composés durant la gestation/lactation sur le fonctionnement de l’intestin sur deux générations (parents et descendants). Nous examinerons aussi l’influence d’un régime alimentaire riche en gras sur les désordres intestinaux consécutifs à l’exposition aux additifs alimentaires. Enfin, nous analyserons la susceptibilité des descendants à développer des pathologies intestinales à l’âge adulte. Compte tenu de nos précédents résultats, qui ont montré un rôle clé de ce type cellulaire dans le maintien de l’équilibre de la composition du microbiote intestinal, nous anticipons une implication de ces cellules dans les dérégulations intestinales observées suite à l’administration de ces composés. L’impact des additifs alimentaires sera étudié dans la lignée déficiente pour ce type cellulaire en comparaison avec des souris contrôles. Ce projet sera abordé in-vivo chez la souris afin de tenir compte des interactions entre le microbiote, l’épithélium intestinal et le système immunitaire, trois acteurs requis pour le bon fonctionnement de l’intestin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet en santé humaine seront à court terme sur le plan des connaissances fondamentales des effets potentiellement néfastes d’une exposition indirecte aux additifs alimentaires comme les édulcorants et les émulsifiants sur le fonctionnement de l’intestin et des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Ces bénéfices pourront s’appliquer à large échelle puisque ces produits sont ajoutés à des centaines de produits alimentaires et sont utilisés par des millions de personnes dans le monde.

Procédures

- Gavage gastrique sur animal vigile (1 fois, 3 minutes) - Prélèvement de sang dans le cœur sur animal sédaté (1 fois, 10 minutes) - Tests d’intolérance au glucose : Prélèvements sanguins à la queue sur animal vigile (7 fois pendant 2h45 minutes), et prélèvements sanguins dans la veine de la mandibule sur animal vigile (2 fois, 3 minutes). 2 injections dans le péritoine sur animal vigile (3 minutes) - Administration dans l’eau de boisson d’un composé chimique induisant une colite intestinale (inflammation de l’intestin), sur animal vigile, pendant 5 à 7 jours.

Impact sur les animaux

Les dommages/effets indésirables causés pendant les actes expérimentaux prévus sont les suivants : douleur (piqûre, gavage, prélèvements sanguins répétés), mise à jeun, administration de composés. Les dommages/effets indésirables prévus sur les animaux suite au traitement induit par le Dextran Sulfate de Sodium sont les suivants : perte de poids, diarrhées et traces de sang dans les selles, comportement anormal, stress. Ces effets seront compris entre 3 et 5 jours.

Devenir

Les animaux du projet sont mis à mort à l’issue de chaque procédure, différents organes prélevès pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Ce projet doit être abordé de manière intégrée et ne peut être mené in-vitro puisqu’il met en jeu des interactions entre le microbiote, les cellules épithéliales et les cellules du système immunitaire. Il n’existe pas à ce jour d’alternatives non animales disponibles permettant d’être utilisées dans ce projet pour traiter ces questions.

Réduction

Des cohortes de 10 individus de chaque génotype, en tenant compte du risque de perte d’individus au cours du protocole, nous ont montré que cet effectif était adéquat pour obtenir des résultats satisfaisants statistiquement. Les paramètres mesurés seront analysés statistiquement. Si possible, les individus sont inclus dans divers protocoles et les prélèvements de tissus sont inclus dans différentes expériences. Afin d’éviter les biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux, dans la mesure du possible, l’acquisition des résultats est réalisée « en aveugle ». Enfin, nous disposons du modèle d’organoides intestinaux qui permet de disséquer des mécanismes moléculaires et cellulaires ex-vivo en s’affranchissant de toute contribution du microbiote et du système immunitaire, et permet aussi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certaines procédures pourraient engendrer chez les animaux, des points limites ont été définis. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, l’apparition d’hémorragies rectales ou d’un prolapsus (descente du rectum) seront considérés comme des points limites. En cas de signe de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés. Afin de réduire la douleur pendant certaines procédures expérimentales, les animaux seront anesthésiés à l’aide d’un analgésique et un anesthésique local.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Les animaux seront utilisés après le sevrage (4 semaines) afin d’évaluer les effets d’une exposition indirecte aux édulcorants/émulsifiants et/ou un régime riche en gras pendant la gestation et lactation, car le début de la vie est une fenêtre critique au cours de laquelle des déséquilibres de la composition du microbiote ou des désordres métaboliques sont susceptibles d’impacter à plus long terme l’équilibre physiologique. Nous utiliserons aussi des animaux à l’âge adulte (2 mois) afin d’étudier les conséquences à long terme d’une exposition précoce à ces différents composés.

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une chirurgie cérébrale, une instillation oculaire et une infection par le virus de l'herpès HSV-1, puis des tests de mémoire imposant de nager pour trouver une plateforme cachée et de reconnaître un objet. Le porteur indique que la phase aiguë de l'infection provoque une souffrance importante pendant une quinzaine de jours, avec perte de poids, lésions oculaires et léthargie, et que 30 % des souris développent une infection mortelle. Il présente le projet comme une "preuve de concept" de futures immunothérapies contre la maladie d'Alzheimer, un bénéfice renvoyé à l'avenir.

Objectifs

Environ 80% des sujets âgés sont porteurs du virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1). Chez l’humain, la première infection par le virus HSV-1 est asymptomatique dans 94% des cas. Elle survient dans et autour de la bouche et du nez. En quelques heures, le virus se réplique au niveau du site d’infection puis infecte les neurones des ganglions trijumeaux où il entre en dormance (latence). La multiplication du virus s'arrête, mais le matériel génétique viral persiste toute la vie de la personne infectée. La réactivation du virus, à partir de cet état latent, peut survenir lorsqu'une personne subit divers facteurs de stress (fatigue, fièvre, déficit immunitaire, etc.). Cette réactivation génère des nouvelles particules virales qui migrent via les axones des nerfs infectés et infectent ainsi des sites distants tels que les yeux, les lèvres et le nez, et le cerveau. La maladie d'Alzheimer (MA) est liée à l'accumulation de protéines tau anormales (tauopathie) et de peptides β-amyloïdes (Aβ) dans le cerveau. Des arguments basés sur des études épidémiologiques suggèrent fortement que le virus HSV1 est impliqué dans la pathologie de la MA, et que le HSV1 peut déclencher expérimentalement la production de protéines anormales impliquées dans la MA et responsables de la dégradation des neurones. Comme le HSV1 reste latent toute la vie dans l'organisme et peut se réactiver régulièrement, il pourrait induire des pics d'apparitions des lésions de la maladie d'Alzheimer et conduire progressivement vers cette maladie. L'avenir de la prévention contre la MA pourrait ainsi reposer sur le développement d’immunothérapies bloquant le virus HSV1. Nous souhaitons progresser dans la compréhension des mécanismes qui associent HSV1 et la MA et dans la réalisation de thérapies anti-HSV1 pour lutter contre la MA. Dans ce contexte, les objectifs de ce projet sont : i. D'induire une infection par HSV1 dans un modèle murin de MA et de caractériser l'impact de HSV1 sur l'évolution de la maladie d’Alzheimer. ii. Utiliser une immunothérapie anti-HSV1 innovante et évaluer son efficacité pour prévenir et/ou réduire la progression de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet établira la preuve de concept de futures thérapies contre la maladie d'Alzheimer avec une approche innovante d'immunothérapie anti-HSV1.

Procédures

Les différentes interventions sont les suivantes : - Une procédure chirurgicale d'une durée de 1 heure maximum permettant d'induire des lésions de la maladie d'Alzheimer. - Une instillation intraoculaire d'une durée de 10 minutes maximum permettant d'induire des lésions de la maladie d'Alzheimer. - Infection par le virus HSV1 avec une micro-aiguille, sous anesthésie générale de courte durée (20-30 minutes). - Etudes comportementales une seule fois par animal. Ils permettent d'étudier la mémoire des animaux. Deux tâches sont effectuées pour chaque animal. La première dure 4 minutes par jour, pendant 5 jours. La deuxième dure 9 minutes par jour pendant 3 jours. - Administration d’un traitement contre HSV1 grâce à une immunothérapie (virus HSV1 inactif) administré avec une micro-aiguille, sous anesthésie générale de courte durée (20-30 minutes).

Impact sur les animaux

Concernant les différentes interventions, les effets attendus sont les suivants : ° Douleur post-chirurgie ou post instillation oculaire. ° Réduction des capacités cognitives (légère et en général uniquement détectable dans des tâches comportementales très élaborées). ° La souffrance des animaux dans le modèle murin d'infection à HSV1 est importante lors de la phase aigüe de la maladie (jusqu'à 15 jours post infection). Elle s’exprime par des modifications physiques (changement d’apparence du pelage, lésions oculaires, perte de poids), mais également du comportement (agitation ou léthargie). ° 30 pour cent des animaux développent une infection mortelle. ° Un premier test de mémoire réalisé ici repose sur la capacité à l’animal à trouver une plateforme cachée dans une piscine remplie d'eau en s’aidant d'indices visuels situés. Ce test implique de forcer les souris à nager dans une piscine, où elles doivent trouver une plateforme immergée. Ces tests peuvent entraîner une fatigue chez la souris. ° Le test de V-Maze permet d’évaluer la mémoire via la reconnaissance d’objet. Ce test peut entrainer une angoisse pour une souris qui réalise que sa mémoire est déficiente.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet Nous voulons étudier l'impact de HSV1 et d'immunothérapies anti-HSV1 sur les lésions de la maladie d'Alzheimer qui ne peuvent être étudiées qu'en post-mortem par histologie ou biochimie.

Remplacement

L'apparition. des lésions de la maladie d'Alzheimer et leur diffusion dans le cerveau dépend de l'interaction entre les lésions, le système immunitaire et le cerveau de l'organisme hôte. Il n'y a actuellement aucun modèle disponible pour effectuer une analyse complète de la dynamique d'apparition des lésions sans utiliser des animaux. La pathologie liée à HSV1 dépend de l'interaction entre le virus HSV1 et le système immunitaire de l'hôte lors d'une infection par le HSV1 dans la lèvre, puis des interactions ultérieures qui se produisent dans les ganglions cibles. Il n'y a actuellement aucun modèle disponible pour effectuer ces expériences sans l'utilisation d'animaux. L'observation des effets d'immunothérapies nécessite un système immunitaire très intégré, qui ne peut être obtenu que chez des modèles animaux (ou l'homme). Chaque procédure fait intervenir toute la complexité des systèmes biologiques intégrés (apparition et diffusion des lésions de la maladie d'Alzheimer, induction et diffusion de la pathologie virale, interactions avec le système immunitaire) et ne peut pas être réalisé in vitro ou avec des modèles non-mammifères.

Réduction

Tout d'abord, le critère principal sur lequel nous basons notre étude statistique est l'induction des lésions de la maladie d'Alzheimer dans un modèle souris. Pour l'ensemble de notre étude nous allons étudier 292 animaux. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à des études préliminaires. Les analyses vont être menées de façon progressive (lots de 10 animaux) et des calculs de puissance statistique basé sur des résultats intermédiaires permettra de réduire le nombre d'animaux si un effet fort est détecté ou d'annuler l'expérience si aucune lésion de la maladie d'Alzheimer n'est induite.

Raffinement

Pendant toute l'étude, les animaux sont hébergés dans environnement à température contrôlée, avec cycle jour-nuit de 12h optimisés pour l’hébergement des souris. Eau et nourriture seront fournies. L'environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. Les animaux seront hébergés par groupes. Les animaux seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision d'un vétérinaire. L'administration de HSV1 est réalisée sous anesthésie générale à l’aide d’aiguilles garantissant un dosage précis du virus Des points limites sont mis en place pour limiter la douleur. Toute intervention chirurgicale sera effectuée sous anesthésie générale suivi d’un traitement au paracétamol (antalgique et antipyrétique) dans l’eau de boisson pendant 48h. En cas de manifestation de douleur, une analgésie sera discutée avec le vétérinaire. Ces mesures garantissent que les conditions de douleur et de souffrance inutile des animaux sont contrôlées.

Choix des espèces

Les humains sont le seul hôte naturel du HSV-1. Cependant, le modèle murin que nous souhaitons utiliser pour cette étude, le modèle souris BALB/c qui lorsqu’il est infecté dans la lèvre, montre des signes d'infections aiguës résolutives et développe une infection latente à long terme, identique à ce qui se produit dans l'infection chez l'homme. De plus, la réponse immunitaire des souris BALB/c est comparable à celle observée chez l'homme. Puisque les souris BALB/c sont également de petits mammifères, elles sont idéales comme modèle pour étudier comment les interactions entre le système immunitaire des mammifères et le HSV-1 influencent l'histoire naturelle de la maladie. Nous avons identifié un état de protection unique dans ce modèle et les mécanismes qui le fournissent doivent être découverts et compris, afin qu'ils puissent être exploités pour des stratégies thérapeutiques à l'avenir. La robustesse de notre modèle de HSV1 repose entre autres sur l’utilisation de souris BALB/c femelles âgées de 6 semaines. L'utilisation de souris plus jeunes ou plus âgées peut introduire des variables susceptibles d'affecter la robustesse de notre modèle. En effet, les souris plus âgées développent une résistance à la maladie aiguë. L'induction de pathologie Alzheimer a été décrite suite à l'inoculation d'extraits de cerveaux Alzheimer chez les souris sauvages. Notre procédure d'induction de pathologie devrait donc être efficace chez les souris BALB/c.