Procédures sévères

100 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une constriction de l'aorte et une lipectomie sous anesthésie, des échocardiographies et des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline, pour étudier le dialogue entre le tissu adipeux et un cœur soumis à une surcharge de pression. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs et des troubles de cicatrisation, que l'injection d'insuline peut entraîner une hypoglycémie sévère, et il prévoit une perte d'environ 20 % des souris liée à la chirurgie. Sur le remplacement, il affirme que la complexité du cœur, "organe entier", est impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

•L'objectif principal est d’étudier les mécanismes impliqués dans le dialogue entre le tissu gras et le cœur en ciblant le rôle des cellules immunitaires. •Nos données précédentes ont montré qu’une augmentation de la pression dans le cœur induite par constriction de l'aorte (TAC), altère la fonction et la structure du cœur mais également celle du tissu gras. Il en résulte l’activation de diverses voies de signalisation entre cœur et tissu gras. Ce dialogue entre les deux organes entraine une inflammation venant aggraver les altérations cardiaques. • Afin de mieux comprendre cela, nous proposons d’étudier les cellules impliquées et de caractériser les modifications qui se déroulent au moment de l’inflammation cardiaque.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à découvrir de nouvelles voies impliquées dans l’inflammation cardiaque, permettant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques

Procédures

Échocardiographie : d’une durée de 3-4 minutes sur animaux vigiles. Ce test est effectué en début et fin d’expérimentation. Injections : d’une durée de 30 secondes par souris sur animaux vigiles. Cette procédure est réalisée avant et après chaque opération et avant la dissection. Test de tolérance à l’insuline (TTI) et test de tolérance au glucose (TTG): comprends une injection de 30 secondes par animale puis prélèvement pour la mesure de glycémie (30 secondes) pour une durée totale de 150 minutes. La constriction aortique (TAC) : La constriction sera effectuée sur animaux anesthésiés puis des sutures seront faites dans une durée totale de 15 minutes par souris. La lipectomie : Cette opération sera effectuée sur animaux anesthésiés puis des sutures seront faites pour une durée totale de 10 minutes par souris

Impact sur les animaux

La chirurgie peut entrainer des douleurs qui se manifestent par des signes de comportement anormal (lordose, tremblements, prostration, difficulté pour boire et s’alimenter et difficultés de locomotion). La chirurgie peut également entrainer des problèmes de cicatrisation (gonflement, déhiscence et retard de cicatrisation) qui seront surveillés et signalés au responsable de l’animalerie afin d’obtenir un conseil et traitement du vétérinaire (crème cicatrisante…). Lors de la réalisation du test métabolique de tolérance à l’insuline, l’injection d’insuline peut entraîner une hypoglycémie sévère. La lipectomie peut entrainer dans de rares cas une perte de poids qui sera donc contrôlée en pesant les souris chaque jour la première semaine et en comparant aux autres animaux de la litière. La TAC est effectuée par des chirurgiens de l’équipe. Le taux de survie post-chirurgie étant de 80%, nous nous attendons à une légère perte de souris qui a été prévue dans le calcul du nombre de souris.

Devenir

Pour l’ensemble de ce projet, les animaux seront mise à mort par un personnel parfaitement formé à cette technique avant le prélèvement des organes.

Remplacement

L’évaluation de l’action combinée de la TAC en présence ou non de lipectomie sur les mécanismes conduisant à l’aggravation du remodelage cardiaque nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Pour cela, nous utilisons le modèle expérimental de la souris. Dans les cas des études in vitro, nous privilégions l’utilisation de lignées cellulaires au lieu des lignées primaires afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à notre étude a été calculé pour nous assurer de l’obtention de résultats concluants permettant de répondre clairement aux questions posées. En effet, nos procédures expérimentales optimisent le nombre de souris utilisées tout en assurant la reproductibilité et la robustesse des observations. Précédemment au laboratoire nous avons établi la caractérisation de nos modèles murins à l’aide de ce protocole, ce qui nécessite ici moins de contrôles. De plus, nous essayons de regrouper les protocoles similaires afin d’utiliser les mêmes souris pour plusieurs analyses par notre équipe et nos collaborateurs au sein de notre institut de recherche pour les études du muscle squelettique, du cœur et du tissu adipeux. Nous prévoyons des prélèvements pour histologie, culture cellulaire, etc… sur le même animal.

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chaque procédure. La lipectomie sera réalisée sous anesthésie. Les animaux recevront également un analgésique post-opératoire administrée en fin de l’intervention. La TAC sera effectuée également par des chirurgiens de l’équipe. Les souris seront anesthésiées puis positionnées sur un coussin chauffant. Le premier jour suivant l’opération, les souris recevront un analgésique en sous-cutanée. Pour les tests métaboliques, la moitié des animaux seront soumis à un test de tolérance au glucose et l’autre moitié à un test de tolérance à l’insuline, ce qui implique moins de prélèvements par animal, en début et fin de procédure. Tout signe de perte de poids, de souffrance, prostration, déshydratation des animaux conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en plastique et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet d’en limiter la répétition.

Choix des espèces

La pathologie cardiaque est bien caractérisée chez les mammifères avec des méthodes d’analyse facilement accessibles. Par ailleurs, l’évaluation de l’action de la surcharge en pression sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires impliquant le tissu adipeux, nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Le modèle expérimental choisi est donc la souris. Ce modèle murin présente l’avantage, à travers une constriction aortique (TAC), de récapituler les différentes altérations du cœur observées pendant l’augmentation de la pression : altérations fonctionnelles (contractilité, relaxation) et structurelles (fibrose et hypertrophie) qui est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Nous étudierons des souris mâles sauvages, jeunes adultes de 5 mois. Cet âge de souris correspond à l’âge adulte chez l’Homme ce qui permet d’étudier l’augmentation de pression à l’âge adulte et non pas à l’âge jeune ou âgé. Également, dans la littérature c’est un âge couramment utilisé pour ce même type d’étude comportant des souris opérées de TAC.

3 600 souris et 3 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections répétées de tétrachlorure de carbone et un régime gras et sucré pour induire une fibrose du foie, et le modèle STAM prévoit d'injecter de la streptozotocine à des souriceaux de deux jours, avec une mortalité attendue de 10 à 12 %. Le porteur fixe un point limite à 20 % de perte de poids et décrit une douleur "légère" malgré la gravité sévère déclarée. Il affirme que recréer in vitro une pathologie aussi complexe serait "difficile", ce qui rendrait le recours au rongeur "nécessaire".

Objectifs

L’apparition d’une fibrose hépatique est une complication principale des maladies chroniques du foie, d'origine alcoolique, virale, parasitaire, biliaire ou autre. Elle se caractérise par un dysfonctionnement des hépatocytes mesurable par une augmentation des taux circulants des enzymes hépatiques, de la bilirubine, et par une altération de la production de protéines comme l’albumine et la prothrombine. La stéatose hépatique non alcoolique (NASH) est une pathologie caractérisée par des anomalies du bilan hépatique avec augmentation du taux de transaminases dans le sang. Son diagnostic repose essentiellement sur l’analyse histologique d’une biopsie hépatique qui montre une augmentation des lipides stockés dans les cellules hépatiques accompagnée d’une inflammation, et d’une fibrose plus ou moins marquée en fonction de l’avancement de la maladie. Elle survient chez un patient qui n'a pas d'autre maladie hépatique d'origine virale, auto-immune, génétique ou toxique, et surtout qui n'a pas une maladie alcoolique du foie. La stéatohépatite métabolique, chez environ un tiers des patients, évolue à travers différents degrés de fibrose vers une cirrhose et favorise l'apparition d'un carcinome hépato-cellulaire (CHC). La fibrose et la NASH peuvent évoluer vers une forme plus grave et non réversible, la cirrhose qui favorise l'apparition d'un carcinome hépato-cellulaire. La greffe de foie reste la seule solution envisageable pour le patient à ce stade de la maladie. Etant donnée la complexité des mécanismes impliqués dans ces deux pathologies, il est difficile de prédire le potentiel thérapeutique d’une molécule uniquement sur la base de résultats in vitro. Ce projet aura donc pour but de tester des molécules chimiques ou biologiques dans des modèles rongeur (rats et souris) de fibrose hépatique et de NASH.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la fibrose hépatique et la NASH. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour lesquelles les options sont pour le moment limitées à des traitements symptomatiques et à une greffe de foie.

Procédures

Pour induire une fibrose hépatique chez la souris ou le rat adulte, 2 administrations intrapéritonéales de CCl4 seront effectuées chaque semaine avec 3-4 jours d’intervalle pendant toute la durée des études. Pour causer une stéatohépatite, ces injections seront associées à un régime enrichi en graisses et en sucres qui sera fourni à volonté tout au long des études. Les études de fibrose dureront 6 semaines en cas d’évaluation d’un composé préventif, 10 semaines en cas d’évaluation d’un composé thérapeutique. Les études de stéatohépatite dureront au maximum 10 semaines. Elles comprendront au minimum 3 groupes de 10 à 12 animaux. Pour reproduire de manière plus complète la maladie humaine, un modèle progressif de stéatohépatite métabolique, fibrose et carcinome hépato-cellulaire (Modèle STAM) sera induit chez les souris. Il consistera à injecter à des souriceaux mâles de 2 jours de la streptozotocine, ce qui induira un désordre métabolique, puis à leur fournir à partir de leurs 4 semaines une nourriture riche en sucres et graisses. Ces études dureront au maximum 16 semaines, avec au moins 5 groupes de de 10 souriceaux mâles. Ces souriceaux seront obtenus en acquérant des femelles gestantes. Les souriceaux femelles ne seront pas intégrés aux études. L’induction pouvant causer environ 10-12% de mortalité, 12 souriceaux mâles seront initialement intégrés à chaque groupe. Les animaux recevront des composés chimiques ou biologiques à tester par toutes voies possibles (intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale avec analgésie, orale sur animaux vigiles, sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile, ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable). Les anesthésies pour les administrations de composés dureront moins d’une heure. Les volumes administrés respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits administrés. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang…).

Impact sur les animaux

Dans le cas des modèles de fibrose hépatique et de stéatohépatite chez la souris et le rat adulte, peu de nuisances sont attendues chez les animaux à part de faibles pertes de poids suite aux administrations de CCl4, et le développement d’un surpoids suite au régime gras et sucré. Dans le cas du modèle progressif de stéatohépatite métabolique, fibrose et carcinome hépato-cellulaire, de la mortalité est attendue chez les souriceaux suite à l’induction (environ 10-12% des animaux). Ensuite, ils développeront une obésité. Les administrations et prélèvements, compte tenu de l’analgésie et de l’anesthésie mises en place le cas échéant, pourront générer une douleur légère et un stress léger, de très courte durée.

Devenir

Après les trois procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Pour les modèles de fibrose hépatique et de stéatohépatite chez les souris et rats adultes, d’après la littérature et d’après les études déjà réalisées dans notre laboratoire, un nombre minimum de 10 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (analyse histologique). Ce nombre pourra monter jusqu’à 12 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (quantification d’expression de gènes, marqueurs circulants). Pour le modèle STAM, des souris femelles gestantes seront hébergées jusqu’à mise bas et seuls les souriceaux mâles seront conservés, la maladie étant moins bien induite chez les femelles. Il faudra compter environ 1 femelle gestante pour 3 souriceaux mâles. L’objectif sera d’avoir à terme 10 souriceaux mâles par groupe. Du fait de la mortalité suite à l’induction (10-12%), un effectif de 12 souriceaux par groupe sera initialement visé. En conséquence, par groupe de 10 souriceaux mâles final, en prenant en compte la mortalité, 4 souris gestantes seront acquises pour obtenir 12 souriceaux mâles.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. Une perte de poids au-delà de 20% constituera un point limite. En cas de perte de poids (à partir de 10% sur certains animaux), de l’eau gélifiée et de la nourriture humidifiée seront placés au fond de toutes les cages. L’administration d’un anti-émétique pourra être décidée sur recommandation vétérinaire. Si une déshydratation associée à une perte de poids est constatée, les animaux seront réhydratés en sous-cutané. En cas de douleur constatée ou suspectée, une analgésie (opiacé) sera réalisée. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus des modèles pathologiques et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le choix du rongeur se base sur trois points : La fibrose hépatique et la stéatohépatite métabolique sont bien documentées dans la littérature chez le rat et la souris La combinaison d’un modèle de fibrose induit au CCl4 avec un régime gras et sucré est aussi décrite dans la littérature chez le rat. Le modèle de développement de cancer du foie sur fond de stéatohépatite métabolique est décrit dans la littérature chez la souris. Lors du développement d’un candidat médicament, les études de toxicité pour toute nouvelle molécule doivent être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), pour les modèles de fibrose et stéatohépatite au CCL4 chez l’adulte, étant donné que ces modèles sont bien décrits dans la littérature sur des rongeurs sevrés de plus de 6 semaines. A l’inverse, le modèle STAM impliquera l’utilisation de souris adultes gestantes puis de leurs nouveaux-nés dès la naissance (premier acte à 2 jours de vie).

10 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une injection chirurgicale de cellules cancéreuses directement dans un organe, un suivi par imagerie et des prélèvements de sang, puis reçoivent des composés une à deux fois par jour, pour tester des traitements anticancéreux. Le porteur indique une perte de poids, des saignements après la chirurgie et une baisse d'activité liée à l'atteinte de l'organe. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la progression d'une tumeur dans un organe, ce qui rendrait le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

Les cancers font partie des maladies les plus complexes à traiter. Notre projet propose de trouver de nouvelles thérapies anticancéreuses et permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitement à base d’anticorps ou de molécules pharmaceutique mais également de proposer des stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.

Bénéfices attendus

L’inoculation de cellules directement dans l’organe permet dans un premier temps de limiter la diffusion de cellules cancéreuses dans d’autre organe et de pouvoir cibler l’organe d’intérêt avec nos traitements ; L’évaluation de l’efficacité des composés sur le développement de la tumeur dans l’organe nous permettra d’orienter le traitement en cliniques dans vers les tissus cancéreux les plus sensible à notre composé.

Procédures

1) Injection de cellules tumorales dans l’organe d’intérêt avec acte chirurgical, sous anesthésie une seule fois dans l'étude, 2) l'imagerie de la tumeur une fois par semaine se fera sous anesthésie pendant 5 min après une injection de sonde bioluminescente, 3) Prélèvements sanguins une fois par semaine: prélèvement en moins d'une minute avec anesthésie pas plus de 2 fois dans l'étude ou intraveineux sans anesthésie ou en moins d'une minute, 4) Administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d'une minute par animal, une à deux fois par jour pendant la durée de l’étude.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps une perte de poids, des saignements à la suite de l’acte chirurgical, une diminution de l’activité et potentiellement un effet due à la diminution de fonctionnalité de l’organe. Les animaux seront également manipulés délicatement mais rapidement afin d'éviter au maximum le stress de la manipulation, des administrations et du gavage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’une tumeur dans l’organe. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'études in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments. Afin de réduire au maximum le nombre d’étude et donc le nombre d’animaux utilisés, les différentes stratégies antitumorales seront préalablement testées in vitro.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne soient testés, in vivo, que les meilleures molécules ou anticorps obtenus in vitro. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisés dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation de 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu et relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d'étude. La bonne connaissance des études permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique. Pour cela, un programme d'analgésie ainsi qu'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel et de critère d'arrêt de souffrance sont mis en place.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une maladie proche de la sclérose en plaques leur est induite par injections d'un mélange immunogène et de toxine, provoquant une paralysie progressive des pattes arrière, pendant qu'elles reçoivent des composés à tester sur une vingtaine de jours. Le porteur cherche des molécules candidates pour les maladies démyélinisantes et met les souris à mort pour analyser leurs tissus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de ces maladies, ce qui rendrait l'animal "indispensable".

Objectifs

Les maladies démyélinisantes humaines sont caractérisées par la démyélinisation du système nerveux central suite d’une réaction inflammatoire chronique. Elles évoluent de manière rémittente et entrainent une invalidité progressive. La plus fréquente étant la sclérose en plaque, Plus de 2 millions de personnes souffrent de sclérose en plaques dans le monde; 10 000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année. Les corticoïdes sont utilisés sur de courtes périodes lors des crises aigües. La plupart des traitements contre la démyélinisation (parmi lesquels l’interféron bêta-1a, le fingolimod ou encore le natalizumab) réduisent la réponse immunitaire mais ne sont toutefois pas dénués d’effets secondaires. Par ailleurs, ils ne sont pas curatifs. L’objectif du projet est la découverte de molécules présentant des avantages thérapeutiques par rapport à l’offre médicamenteuse actuelle pour les maladies démyélinisantes humaines.

Bénéfices attendus

L’objectif du projet est la découverte de molécules présentant des avantages thérapeutiques par rapport à l’offre médicamenteuse actuelle pour les maladies démyélinisantes humaines afin qu’ils puissent progresser dans les phases de test pré-clinique puis clinique

Procédures

1/ 2 à 4 injections par voie sous-cutanée du mélange immunogène (1 minute) 2/ 2 injections à 2 jours d’intervalle de toxine pertussique par voie intra-péritonéale (1 minute par injection soit moins de 5 minutes sur les 2 jours) 3/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse, une à deux fois par jour (en fonction des voies) pendant un maximum de 22 jours (1 minute par administration, soit moins de 5 minutes par jour) 4/ 1 à 2 prélèvements sanguins au cours de l’étude à la veine sub-mandibulaire ou au sinus rétro-orbital (sous anesthésie à l’isoflurane et après application locale d’analgésique) (5 minutes par prélèvement comprenant le temps de l’anesthésie).

Impact sur les animaux

Le modèle murin d’encéphalomyélite allergique expérimentale, représentatif des pathologies humaines, induit une paralysie progressive des pattes postérieures des souris (entre les jours 10 et 22, fin de la période d’étude). Certains composés pourraient présenter une toxicité inattendue dans ce modèle (les molécules présentant une toxicité dans d’autres modèles murins ne seraient pas évalués dans ce modèle) Injections : par voie sous-cutanée de 2 à 4 fois au cours de l'étude. Ainsi que 2 injections à 2 jours d’intervalle de toxine pertussique par voie intra-péritonéale. Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse, une à deux fois par jour (en fonction des voies) pendant un maximum de 22 jours. Prélèvements sanguins : 1 ou 2 prélèvements au cours de l'étude.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort et divers tissus seront collectés pour caractériser les effets des composés testés

Remplacement

A ce jour, aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité des mécanismes mis en œuvre lors des maladies démyélinisantes. L’utilisation de modèles animaux est indispensable, en complément d’études in vitro préliminaires, pour juger de l’efficacité d’un nouveau candidat médicament.

Réduction

Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide qui documente ce modèle afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique appropriée en suivant les recommandations du réseau national des CEEA. Quelques études préliminaires et une analyse rétrospective nous permettront de déterminer le nombre de souris nécessaire pour attendre le degré de significativité requis. Par ailleurs, seules les molécules présentant les meilleures caractéristiques in vitro et ayant démontrées une efficacité dans d’autres modèles murins de maladies inflammatoires seront étudiées en seconde intention (en fonction de leur mécanisme d’action) dans le modèle murin de l’encéphalomyélite allergique expérimentale.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. Par ailleurs, ils seront stabulés dans une armoire ventilée thermostatée, permettant ainsi un contrôle plus fin de la température La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Des soins appropriés seront apportés en fonction de la progression des signes cliniques afin de les soulager (nourriture en gel placée dans la cage, administration de dextrose en cas de perte de poids préoccupante, palpation de l’abdomen des animaux afin de faciliter la miction, ajout de matériel anti-dérapant au fond des cages, préhension adaptée des animaux). Un programme d’anesthésie et d’analgésie sera mis en œuvre : une anesthésie par inhalation d'isoflurane sera effectuée lors des prélèvements sanguins au sinus retro-orbital et lors de la mise à mort. De la tétracaïne sera appliquée localement en cas de prélèvement au sinus rétro-orbital. Par ailleurs, de la buprénorphine sera administrée dans l’eau de boisson dès l’apparition des 1ers signes de paralysie. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est la souris comme décrit dans la littérature. Le projet utilisera des souris adultes au moment de l’inclusion dans l’étude comme décrit dans la littérature

Les expériences menées sur ces macaques doivent démontrer l'efficacité d'un logiciel de traitement d'images IRM développé avec l'entreprise Olea Medical, et la chaîne de biomarqueurs IRM du projet est intégrée à une plateforme commerciale. 12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués par injection létale 45 jours après un AVC provoqué. Après la pose d'un collier sous anesthésie et quatre mois et demi d'entraînement sous restriction hydrique, ils subissent une occlusion de l'artère cérébrale moyenne, avec un risque de mortalité estimé à 18 %, ainsi que des séances d'imagerie et des prises de sang répétées sous anesthésie. Le porteur écrit que le recours au primate non-humain "apparait donc essentiel" et justifie le choix d'adolescents parce qu'ils "n'ont jamais été utilisés dans d'autres études".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est un déficit neurologique soudain, causé par un caillot dans une artère cérébrale (accident dit ischémique) ou une hémorragie cérébrale (accident dit hémorragique). Le traitement le plus récent de l’accident ischémique est la thrombectomie, qui vise à traiter le caillot responsable de l’occlusion par une action endovasculaire mécanique et ainsi restaurer l’apport sanguin de la région cérébrale irriguée. L’étendue de la pénombre ischémique, la partie du cerveau affectée par l’infarctus mais encore viable, est un indicateur important de l’issue de l’AVC. Sauver la pénombre est une priorité pour diminuer la mortalité et limiter les séquelles lourdes. Notre projet a pour principal objectif de vérifier la sécurité de la procédure qui consiste à incliner de 15° vers l’arrière le corps et la tête du sujet pendant l’occlusion, permettant ainsi d’augmenter l’apport sanguin vers le cerveau. Cette approche a déjà fait ses preuves chez le rongeur et son innocuité doit être validée chez le primate, pour rendre l’essai clinique possible. Cette approche d'inclinaison permettrait de sauver des patients dans la phase critique d’urgence qui risquent de décéder ou d’être lourdement handicapés. La mesure du métabolisme de l'oxygène (CMRO2 : Cerebral metabolic rate of oxygen) représente donc une mesure complémentaire reflétant l’atteinte ou la survie de cette zone de pénombre pour définir avec précision le tissu cérébral à risque lésionnel, et peut donc être un biomarqueur des déficits post-AVC. Après la phase aiguë, il pourrait également servir pour prédire la récupération de ces déficits à long terme. Cette mesure CMRO2 via l’IRM n’ayant jamais été validée à la phase aiguë, notre projet prévoit d’utiliser l’approche d'inclinaison afin d’en évaluer la valeur prédictive. Nos données rétrospectives sont utilisées pour développer un logiciel de post-traitement clinique de la CMRO2 avec Olea Medical. Son efficacité pour suivre un traitement comme l'inclinaison sera démontrée grâce aux nouvelles expériences. Des analyses corrélatives seront réalisées entre les mesures de déficits moteurs observés chez l'animal via une tâche de prise alimentaire nécessitant une dextérité motrice qui sera affecté par l’AVC et mettra en jeu des mécanismes d’adaptation comportementale que l’on pourra corréler avec nos marqueurs d’activité cérébrale dans les régions corticales et sous-corticales associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la reperfusion cérébrale dans les mécanismes de récupération fonctionnelle post-AVC. Grâce à l’étape d’habituation et d’entraînement des animaux à la réalisation de la tâche de prise alimentaire et à la manipulation pour le test de la motricité, le stress des animaux sera réduit, car ceux-ci participeront d’eux même à leur mise en chaise et seront habitués aux sorties quotidiennes. La restriction hydrique augmentera leur motivation pour réaliser la tâche. Notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant la procédure de l’HDT15°, un traitement non pharmacologique de première intention pour améliorer la reperfusion cérébrale et limiter les processus lésionnels, tout en favorisant la récupération fonctionnelle de nombreux patients atteints d’AVC. Nous pourrons ainsi avoir une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans les phases précoces post-AVC, grâce aux nouveaux outils IRM pour mesurer la consommation d’oxygène cérébrale. En déterminant cette mesure de la CMRO2 au sein des structures cérébrales corticales et sous-corticales participant à la compensation fonctionnelle cela ouvrira certainement une meilleure prise en charge et un meilleur suivi thérapeutique des patients atteints d’AVC, avec une approche de plus en plus personnalisée. En combinant l’imagerie TEP avec l’IRM de diffusion à haute définition, nous allons avoir l’opportunité de caractériser les marqueurs d’inflammation sous-jacent aux processus lésionnels et de compensation et ainsi de mieux comprendre comment les zones cérébrales non-lésées peuvent compenser pour pallier la perte de fonction d’une région cérébrale ayant subi une lésion ischémique. L’IRM étant largement plus répandue et accessible en urgence que l’imagerie TEP, les marqueurs IRM pourront avoir un impact clinique très important. Afin d'être largement disponible pour une utilisation clinique dans les maladies cérébro-vasculaires, le pipeline de biomarqueurs IRM est implémenté dans une plateforme commerciale et sera optimisé pour une utilisation à la phase aiguë.

Procédures

Une légère anesthésie sera réalisée pour poser le collier des animaux (1 heure). L’apprentissage et la réalisation de la tâche alimentaire se fera sous un contrôle hydrique (4 mois et 15 jours). En fonction des performances de l'animal et de son apport hydrique venant des aliments obtenus dans la tâche, la quantité d'eau dans la bouteille sera ajusté pour donner un apport hydrique constant. Un apport nutritionnel complémentaire, composée de croquettes primates et légumes, sera dispensée dans la cage après chaque séance et sera pris en compte dans l’apport hydrique quotidien. Les jours de repos (week-end), les animaux auront un accès libre jusqu’au dimanche, où l’apport hydrique de référence pour chaque animal sera repris. Des imageries seront réalisées pour évaluer les lésions cérébrales et évaluer la valeur prédictive du CMRO2 ou de l’intensité du phénomène d’inflammation mesuré par IRM de diffusion ou l’imagerie (1/2 journée par imagerie). Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux, lors des étapes d’imagerie sous anesthésie. Ces prélèvements de sang seront plus nombreux lors de l’étape d’occlusion-reperfusion. Finalement un dernier prélèvement sanguin ainsi qu’un prélèvement de liquide céphalo rachidien (LCR) sera effectué avant l'euthanasie scientifique de l’animal. A la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés par injection intraveineuse létale d’un agent euthanasiant vétérinaire suite à une sédation à la kétamine, après prélèvement du LCR sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement du projet peut induire un léger stress à l’animal au tout début de cette étape mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. La partie du projet impliquant une intervention d’occlusion/reperfusion constitue une source potentielle de nuisances importantes. En effet l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, va provoquer des lésions cérébrales dans une zone localisée du cerveau. Ces lésions impliquent une perte des capacités motrices et cognitives de l’animal en post-opératoire, qui implique un isolement et un confinement de l’animal durant quelques jours, jusqu’à la récupération quasi-totale de sa motricité. Une étude précédente utilisant ce même modèle d’AVC chez le macaque a montré que la phase aigüe de l’AVC est la plus critique en termes d’effets indésirables sur les animaux (18% de risque de mortalité estimé). Une surveillance accrue des animaux sera donc réalisée lors de cette phase. Cette approche peut aussi induire des micro-accidents vasculaires par augmentation de la pression sanguine et de la rupture des vaisseaux cérébraux. C’est pour mesurer les risques de produire des effets indésirables découlant de ces potentiels accidents vasculaires induit par l’approche thérapeutique testée qu’il est essentiel de valider cette approche thérapeutique de reperfusion. Les parties de l’étude intégrant la phase d’entraînement et les examens d’imagerie sont considérées légères et modérés tandis que l’intervention d’occlusion/reperfusion qui présente des risques de déficits lésionnels étant classée en procédure plutôt sévère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure sévère pour tous les animaux.

Devenir

A l’issu de la procédure, 45 jours après l’intervention, les animaux seront euthanasiés. Cette sortie de la procédure par une euthanasie sur tous les animaux est principalement justifiée par le fait qu’elle nous sera indispensable, pour valider les mécanismes au niveau cellulaire, des outils d’imagerie développés dans ce projet. Seulement des approches histologiques au niveau cellulaire, sur du tissu cérébral post-mortem, peuvent nous permettre de valider ces outils IRM de la CMRO2 ainsi que des processus inflammatoires.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour valider l’efficacité et l’innocuité d’un nouveau traitement de l’AVC ischémique. En effet, les alternatives non animales (in silico, in vitro ou ex vivo) ne permettent pas d’étudier la sécurité de l'angulation de la tête et du corps à 15° lors de l'occlusion, les interactions entre les déficits moteurs observés et les marqueurs cérébraux associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération. Avant de tester cette procédure chez l’Homme, il est donc nécessaire de l’évaluer avec un modèle animal pertinent. Il est donc judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’Homme dans le cadre de l’AVC ischémique. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec des analyses comportementales. Ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Ainsi, les informations obtenues sur le PNH seront plus facilement transposables et applicable à l’humain qui subit une perte de fonction similaire découlant d’un AVC. Enfin, le macaque cynomolgus est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations mesurées grâce à un calcul de puissance est de 8 animaux. Au total, nous prévoyons 12 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux pour réaliser des corrélations (n=8) chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2 à 4). En effet, en nous basant sur la précédente étude ayant utilisée ce modèle PNH d’AVC par occlusion de l’artère cérébrale moyenne, nous estimons à 18% le taux possible de mortalité suite à la procédure d’AVC. Si le nombre d’animaux atteignant un point limite s’avérait inférieur à notre prévision, dû probablement à l’effet bénéfique de l'angulation de la tête et du corps de 15° sur la reperfusion cérébrale, nous limiterons le nombre total d’animaux au nombre nous donnant une puissance statistique suffisante. Si nous réussissons à mener nos 8 premiers animaux à pouvoir faire toutes les étapes du protocole et que nous obtenons une puissance statistique suffisante, nous nous gardons la possibilité de réduire le nombre prévu de 12 à 8 animaux.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères, chaque sujet étant son propre contrôle. De plus, le fait que nos deux principales mesures d’imageries, l’IRM de la CMRO2 et la TEP, seront réalisées simultanément grâce à la caméra hybride, nous pourrons limiter le nombre d’examens par animaux dans cette étude. Dès leur arrivée et tout au long de l’étude, en dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (4 ou 2), lorsque possible. Pour maximiser les effets bénéfiques de l’environnement, même durant les périodes post-AVC, les animaux seront toujours maintenus en hébergement par paire, pour limiter les effets délétères de l’isolement. Les animaux disposeront d’une quantité d’eau de boisson contrôlée et d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids.

Choix des espèces

L’organisation du système nerveux central est très différente selon les espèces, aussi bien au niveau macroscopique (taille des différentes structures) qu’au niveau moléculaire. Ce projet sera donc réalisé chez le macaque cynomolgus, du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du cerveau et des comportements entre ces deux espèces. Les animaux utilisés seront adolescents car ce sont des animaux qui n’ont jamais été utilisés dans d’autres études.

8 970 animaux non-humains, soit 4 680 souris et 4 290 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrose leur est provoquée par section de ligaments du genou ou par injection intra-articulaire d'un produit toxique, avant l'administration de molécules à tester et des tests comportementaux mesurant la douleur. Le porteur décrit une maladie douloureuse et handicapante chez l'humain et attend un dépistage de molécules efficaces. Il qualifie ses procédures de "stricte nécessité" et affirme qu'aucune méthode sans animaux n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’arthrose ou ostéoarthrite (OA) est une pathologie qui appartient à la famille des rhumatismes et entraine des douleurs au niveau des articulations. C’est une affection chronique inflammatoire qui se manifeste par des douleurs persistantes aux articulations causées par l’usure anormale (dégénérescence) du cartilage et de l’ensemble de l’articulation. Elle affecte des millions de personnes chaque année et est la maladie articulaire avec le plus de prévalence chez la population âgée. Cette maladie rhumatismale touche une part importante de la population (environ 70% de la population à un certain moment dans leur vie) et a donc des impacts sociaux et économiques majeurs sur les patients et le système de santé. Les thérapies actuellement disponibles pour traiter cette maladie ne réussissent pas à lever de façon adéquate la douleur chez beaucoup de patients, et les effets secondaires des traitements limitent considérablement leur utilisation. De plus, les traitements utilisés ne traitent que les conséquences de la maladie, c’est-à-dire l’inflammation et la douleur. Il y a donc un besoin urgent de trouver des molécules efficaces qui pourraient réverser ou tout du moins ralentir l’évolution de la pathologie tout en soulageant les symptômes. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de l’arthrose avec la mise en place de différents modèles animaux d’arthrose chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la réponse à la douleur et l’inflammation mais aussi la structure de l’articulation dans des modèles animaux mimant l’OA chez la souris ou le rat. Ce projet a déjà été déposé en 2019.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans l’arthrose. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui soulageraient à la fois les symptômes de l’arthrose (inflammation, douleur) et ralentiraient l’évolution de la pathologie (dégénérescence articulaire).

Procédures

tous les animaux de la procédure 1 (sauf le groupe 1, opéré à blanc) subiront une chirurgie pour sectionner certains ligaments du genou pour induire une arthrose. La chirurgie de 30-45minutes aura lieu au jour 0 sur animal anesthésié et analgésié. tous les animaux de la procédure 2 subiront une injection intra-articulaire de monoiodoacétate ou de collagénase II (sauf le groupe 1, sérum physiologique) pour induire l’arthrose. La procédure d'injection dure moins de 10 minutes et se fera sur animal anesthésié. les traitements pourront être administrés après l'induction du modèle. selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra- veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale (sur animal vigile) ou par voie intra-articulaire (sur animal anesthésié). tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Des tests comportementaux pour mesurer la douleur (test de von Frey) ou l’inconfort (incapacitance) seront également réalisés : une fois avant le début des traitements mais après l’induction du modèle afin de procéder à l’allocation des groupes (durant la 1ère semaine), puis 1-2 fois par semaine pendant 12 semaines après la chirurgie pour la procédure 1 ou 4-6 semaines après l’induction du modèle chimiquement induit pour la procédure. Le premier type de test dure une trentaine de minutes (incluant l’acclimatation) et le deuxième type de test (procédure n°4) dure environ 5 secondes de mesure et le test est répété trois fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque répétition.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une arthrose (dégénérescence articulaire) associée à de la douleur (visible par les tests comportementaux mis en place) sans autre effet indésirable attendu. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) ni aux tests comportementaux (procédure légère pour évaluer la douleur).

Devenir

euthanasie pour récupérer différents organes, dont les articulations, pour analyses histologiques ou autre

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation et la douleur implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie de l’arthrose humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur la réponse à la douleur et l’inflammation ou la structure de l’articulation, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (kruskal-wallis test).

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, injection intra-articulaire) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Nos études étant basées sur des modèles de douleur, l’utilisation d’analgésiques ou d’anti-inflammatoires n’est pas applicable. Toutefois, pour les modèles d’induction d’OA par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique sera administré en phase pré- et post-opératoire. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études d’OA en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat SD est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Cependant, il est envisageable d’utiliser d’autres souches de rat comme par exemple le rat Lewis ou wistar qui sont également des modèles de laboratoire bien connus. Chez la souris, la souche C57Bl/6 représente la souche de choix pour les études d’OA mais d’autres souches pourront également être utilisées dépendant de leurs susceptibilités à l’induction de la pathologie en fonction du modèle. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier des objectifs et besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés de 6-12 semaines au début de l’étude selon les recommandations de la littérature pour ce type de modèle (Disease Models & Mechanisms 2015 8: 17-30).

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgées de dix-sept mois, elles subissent une chirurgie stéréotaxique de cinquante minutes pour injecter dans le cerveau une protéine toxique, puis des traitements chroniques par gavage ou injections deux fois par jour, des tests de coordination motrice et un prélèvement intracardiaque. Le porteur inscrit ce projet dans le développement préclinique de candidats-médicaments pour ses partenaires. Il affirme que la complexité des interactions cellulaires dans le cerveau ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal.

Objectifs

La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Elle est caractérisée par des troubles de la coordination motrice, de la rigidité musculaire, des tremblements et une lenteur d’exécution des mouvements. La maladie de Parkinson frappe aujourd’hui 200,000 personnes en France. Le manque de médicaments efficaces contre la maladie représente un défi majeur pour la santé humaine. La neurodégénérescence est causée notamment par la toxicité de l’alpha-synucléine mal-conformée et est amplifiée par des dysfonctions lysosomales. En effet, la fonction lysosomale est fortement perturbée dans la maladie de Parkinson. Des mutations sur le gène codant pour la protéine lysosomale GBA ont été identifiées comme un facteur de risque important pour le développement de la maladie. Notre modèle animal est basé sur: 1/ l’injection d’oligomères/fibrilles de l’alpha-synucléine dans la substance noire, 2/l’inhibition chronique de l’activité GBA et 3/ sur l’âge avancé des souris (17 mois), la maladie de Parkinson étant associée à l’âge. La finalité de ce projet est de déterminer le potentiel neuroprotecteur de plusieurs candidats-médicaments dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Il s'intègre dans des projets de développement précliniques de nos partenaires.

Bénéfices attendus

Le projet s'intègre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet subiront la procédure décrite: une chirurgie stéréotaxique (50 minutes), sous anesthésie générale et une analgésie systémique. Leur état clinique sera surveillé pendant cinq jours post-opératoire pour détecter un effet indésirable ou des signes de souffrance. La procédure inclue des traitements chroniques (deux fois par jour maximum, d'une durée de 30 secondes maximum) par gavage ou injections sous-cutanées ou intra-nasale ou intra-péritonéales. Les fonctions motrices seront évaluées avec des tests de coordination motrice (3 différents tests par 3 sessions de 1minute maximum espacées de 10 min). Ces tests seront rapides (maximum 5 minutes par jour). Les animaux subiront un prélèvement intra-cardiaque sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Les traitements quotidiens des souris (par gavage, par injections sous-cutanées, intra-nasales ou intra-péritonéales) peuvent induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests de motricités peuvent également induire un stress chez les souris puisqu'elles seront placées dans des environnements inhabituels.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des échantillons biologiques au plus tard 6 semaines après la chirurgie.

Remplacement

Les rongeurs sont un excellent modèle pour l'analyse comportementale (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices) pour analyser les mécanismes physiopathologiques à la base de maladies neurodégénératives humaines, en l'occurrence la maladie de Parkinson. Les processus pathophysiologiques de cette pathologie impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales (striatum, substance noire). Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre de souris (n par groupe) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Ceci permet donc de réduire le nombre d'animaux nécessaire et d'optimiser l'utilisation de chaque souris. La motricité fine des souris sera évaluée, des études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuels effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie de Parkinson.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnel en carton), (ii) des approches d'analgésies avant, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort. Si un point limite est atteint, durant l'étude, les souris seront euthanasiées en utilisant les méthodes d’euthanasie autorisées.

Choix des espèces

La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie de Parkinson. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris.