Procédures sévères

Pour reproduire chez la souris les lésions cérébrales liées à la prématurité, 2 452 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à 42 ou 60 jours de vie pour le prélèvement du cerveau. Pendant leurs cinq premiers jours, des souriceaux séparés de leur mère le temps des gestes reçoivent des injections d'interleukine-1 bêta, une molécule inflammatoire qui peut entraîner déshydratation, retard de croissance, hémorragie interne et la mort dans 5 à 10 % des cas. Viennent ensuite au sevrage un traitement censé éliminer certaines cellules du cerveau, puis à 2 mois un test de mémoire par trois chocs électriques précédés d'une sonnerie, un test de choix entre un congénère inconnu et un objet, et une chirurgie sous anesthésie pour mesurer l'activité des neurones. Les souris dont le poids varie fortement ou qui montrent isolement ou agressivité sont tuées avant terme, et le porteur ajoute 10 % de souriceaux aux groupes injectés pour compenser la mortalité qu'il anticipe.

Objectifs

La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection maternelle et naissance prématurée a été mis en évidence. En effet, l’inflammation systémique chez le fœtus peut entrainer une neuroinflammation et par conséquent, des lésions cérébrales connues sous le nom d’encéphalopathie du prématuré qui favorisent ensuite l’apparition de troubles du développement neurologique, en particulier les troubles du spectre autistique. Parmi les acteurs clés de la neuroinflammation, on retrouve les cellules microgliales (MG), cellules immunitaires résidentes du cerveau. La morphologie et les fonctions des MG sont altérées lors d’un stimuli inflammatoire précoce, conduisant notamment à des altérations moléculaires et comportementales (diminution du comportement social) caractéristiques des troubles du développement neurologique. Le remplacement spontané de ces cellules microgliales, après leur élimination par un traitement médicamenteux, pourrait contribuer à la correction de certaines de ces anomalies dont le rétablissement de la maturité des neurones et du comportement social. Les objectifs de cette étude sont donc d’abord de préciser les conséquences de cette inflammation précoce sur la mise en place des structures cérébrales et le comportement chez les adultes des deux sexes, et ensuite de déterminer le potentiel de ce traitement quant à la correction de ces troubles neurologiques.

Bénéfices attendus

Grâce à ce modèle souris d’inflammation précoce, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de l’élimination de cellules cérébrales altérées et leur remplacement pour traiter les troubles du développement neurologique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise.

Procédures

Les injections réalisées sur les souriceaux d’une molécule inflammatoire connue sous interleukine-1beta (IL-1β) durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Le traitement testé sera ensuite administré dans l’alimentation au sevrage des animaux à la troisième semaine de vie et pendant 3 semaines. Les animaux seront soumis à deux tests afin d’évaluer leur mémoire et leur comportement social à 2 mois. Pour la mémoire, les animaux recevront un léger choc électrique suite à une sonnerie à 3 reprises. Deux jours plus tard, ils seront placés dans cet environnement et leur comportement de peur lors du retentissement de cette sonnerie, se traduisant par une immobilisation de l’animal, sera évalué. En termes de comportement social, les souris auront le choix d’interagir avec un nouvel animal ou avec un objet, une préférence pour l’interaction avec l’animal est attendue. L’interaction avec le nouvel animal devrait susciter l’intérêt et constituera le critère d’évaluation (reniflements, etc.). Enfin, les animaux subiront une chirurgie à 60 jours afin de mesurer l’activité neuronale dans différentes zones cerveau. Pour cela, les animaux seront endormis et un antidouleur leur sera administré. L’imagerie est ensuite effectuée. L’animal est ensuite euthanasié.

Impact sur les animaux

Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre le premier et le 5e jour de vie. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps. Concernant le traitement médicamenteux pour éliminer les cellules microgliales, il sera administré pendant 3 semaines dans le régime alimentaire ou par injection pendant 5 jours selon les résultats d’une étude préliminaire. Les effets indésirables qui pourraient survenir incluent un changement de la structure du visage et du crâne. Les tests comportementaux peuvent également induire un stress chez l’animal, en particulier le test comprenant un choc à la patte. Pour cela, nous avons déterminé les durées minimales nécessaire afin d’étudier ces comportements pour minimiser la présence de nos animaux dans des environnements qui pourraient impacter leur bien-être. La chirurgie n’induira pas de nuisances, l’animal étant endormi par anesthésie et sa douleur contrôlée par un antidouleur, il est ensuite euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 42 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale et l’efficacité du traitement pour la protection du cerveau en développement.

Remplacement

L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral, ses conséquences et son traitement requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance du milieu physiologique et des interactions entre les différentes cellules et organes à plusieurs stades de développement. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux est utilisé pour traiter des données statistiquement exploitables. De ce fait, il est nécessaire d’avoir n=10 animaux par groupe expérimental, avec 10% d’animaux supplémentaires dans les groupes recevant la molécule inflammatoire, compte-tenu de la mortalité probable due à l’inflammation. Une seule et même analyse sera dupliquée seulement en cas de variabilité. Les études de mises au point de nos techniques sont également indispensables et comptent le nombre minimum d'animaux. Les analyses requièrent des processus de préparation différentes, un seul et même prélèvement ne peut donc pas servir pour plusieurs analyses.

Raffinement

Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles souris blanches ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal sans nécessité d’anesthésie. Après le sevrage les animaux seront hébergés avec un maximum de 6 animaux par cage. Pendant les 5 jours d’injection, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière pour détecter une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. L’administration de l’interleukine-1β permettra d’étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation et établir des stratégies neuroprotectrices. Cette inflammation au niveau du cerveau pendant les 5 premiers jours de vie permet de simuler une inflammation pendant la grossesse chez l’Homme. Suite à l’inflammation, les cellules altérées dans le cerveau seront éliminées par un traitement chez les souris avant l’adolescence et remplacées spontanément par des nouvelles cellules. La correction des troubles structuraux et comportementaux sera ensuite étudiée à l’âge adulte (2 mois). En plus d’une connaissance bien établie sur le développement neurologique chez la souris, les souris blanches présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que le nombre de souriceaux par portée, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère.

Une occlusion de l'artère cérébrale moyenne provoque chez les macaques une lésion du cerveau, avec perte des capacités motrices et cognitives, et un risque de mortalité estimé à 18 % d'après une étude antérieure. 12 macaques à longue queue adolescents vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour vérifier la sécurité d'une inclinaison du corps et de la tête de 15° vers l'arrière pendant l'occlusion. Avant l'AVC, ils passent quatre mois et demi d'entraînement à une tâche de prise alimentaire sous contrôle hydrique. Le porteur écrit qu'ils seront "toujours maintenus en hébergement par paire" même après l'AVC, et décrit ailleurs un "isolement et un confinement de l'animal durant quelques jours" après l'opération. Tous sont tués par injection létale 45 jours après l'intervention, pour des analyses du tissu cérébral qui doivent valider les mesures d'IRM.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est un déficit neurologique soudain, causé par un caillot dans une artère cérébrale (accident dit ischémique) ou une hémorragie cérébrale (accident dit hémorragique). Le traitement le plus récent de l’accident ischémique est la thrombectomie, qui vise à traiter le caillot responsable de l’occlusion par une action endovasculaire mécanique et ainsi restaurer l’apport sanguin de la région cérébrale irriguée. L’étendue de la pénombre ischémique, la partie du cerveau affectée par l’infarctus mais encore viable, est un indicateur important de l’issue de l’AVC. Sauver la pénombre est une priorité pour diminuer la mortalité et limiter les séquelles lourdes. Notre projet a pour principal objectif de vérifier la sécurité de la procédure qui consiste à incliner de 15° vers l’arrière le corps et la tête du sujet pendant l’occlusion, permettant ainsi d’augmenter l’apport sanguin vers le cerveau. Cette approche a déjà fait ses preuves chez le rongeur et son innocuité doit être validée chez le primate, pour rendre l’essai clinique possible. Cette approche d'inclinaison permettrait de sauver des patients dans la phase critique d’urgence qui risquent de décéder ou d’être lourdement handicapés. La mesure du métabolisme de l'oxygène (CMRO2 : Cerebral metabolic rate of oxygen) représente donc une mesure complémentaire reflétant l’atteinte ou la survie de cette zone de pénombre pour définir avec précision le tissu cérébral à risque lésionnel, et peut donc être un biomarqueur des déficits post-AVC. Après la phase aiguë, il pourrait également servir pour prédire la récupération de ces déficits à long terme. Cette mesure CMRO2 via l’IRM n’ayant jamais été validée à la phase aiguë, notre projet prévoit d’utiliser l’approche d'inclinaison afin d’en évaluer la valeur prédictive. Nos données rétrospectives sont utilisées pour développer un logiciel de post-traitement clinique de la CMRO2 avec Olea Medical. Son efficacité pour suivre un traitement comme l'inclinaison sera démontrée grâce aux nouvelles expériences. Des analyses corrélatives seront réalisées entre les mesures de déficits moteurs observés chez l'animal via une tâche de prise alimentaire nécessitant une dextérité motrice qui sera affecté par l’AVC et mettra en jeu des mécanismes d’adaptation comportementale que l’on pourra corréler avec nos marqueurs d’activité cérébrale dans les régions corticales et sous-corticales associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la reperfusion cérébrale dans les mécanismes de récupération fonctionnelle post-AVC. Grâce à l’étape d’habituation et d’entraînement des animaux à la réalisation de la tâche de prise alimentaire et à la manipulation pour le test de la motricité, le stress des animaux sera réduit, car ceux-ci participeront d’eux même à leur mise en chaise et seront habitués aux sorties quotidiennes. La restriction hydrique augmentera leur motivation pour réaliser la tâche. Notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant la procédure de l’HDT15°, un traitement non pharmacologique de première intention pour améliorer la reperfusion cérébrale et limiter les processus lésionnels, tout en favorisant la récupération fonctionnelle de nombreux patients atteints d’AVC. Nous pourrons ainsi avoir une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans les phases précoces post-AVC, grâce aux nouveaux outils IRM pour mesurer la consommation d’oxygène cérébrale. En déterminant cette mesure de la CMRO2 au sein des structures cérébrales corticales et sous-corticales participant à la compensation fonctionnelle cela ouvrira certainement une meilleure prise en charge et un meilleur suivi thérapeutique des patients atteints d’AVC, avec une approche de plus en plus personnalisée. En combinant l’imagerie TEP avec l’IRM de diffusion à haute définition, nous allons avoir l’opportunité de caractériser les marqueurs d’inflammation sous-jacent aux processus lésionnels et de compensation et ainsi de mieux comprendre comment les zones cérébrales non-lésées peuvent compenser pour pallier la perte de fonction d’une région cérébrale ayant subi une lésion ischémique. L’IRM étant largement plus répandue et accessible en urgence que l’imagerie TEP, les marqueurs IRM pourront avoir un impact clinique très important. Afin d'être largement disponible pour une utilisation clinique dans les maladies cérébro-vasculaires, le pipeline de biomarqueurs IRM est implémenté dans une plateforme commerciale et sera optimisé pour une utilisation à la phase aiguë.

Procédures

Une légère anesthésie sera réalisée pour poser le collier des animaux (1 heure). L’apprentissage et la réalisation de la tâche alimentaire se fera sous un contrôle hydrique (4 mois et 15 jours). En fonction des performances de l'animal et de son apport hydrique venant des aliments obtenus dans la tâche, la quantité d'eau dans la bouteille sera ajusté pour donner un apport hydrique constant. Un apport nutritionnel complémentaire, composée de croquettes primates et légumes, sera dispensée dans la cage après chaque séance et sera pris en compte dans l’apport hydrique quotidien. Les jours de repos (week-end), les animaux auront un accès libre jusqu’au dimanche, où l’apport hydrique de référence pour chaque animal sera repris. Des imageries seront réalisées pour évaluer les lésions cérébrales et évaluer la valeur prédictive du CMRO2 ou de l’intensité du phénomène d’inflammation mesuré par IRM de diffusion ou l’imagerie (1/2 journée par imagerie). Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux, lors des étapes d’imagerie sous anesthésie. Ces prélèvements de sang seront plus nombreux lors de l’étape d’occlusion-reperfusion. Finalement un dernier prélèvement sanguin ainsi qu’un prélèvement de liquide céphalo rachidien (LCR) sera effectué avant l'euthanasie scientifique de l’animal. A la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés par injection intraveineuse létale d’un agent euthanasiant vétérinaire suite à une sédation à la kétamine, après prélèvement du LCR sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement du projet peut induire un léger stress à l’animal au tout début de cette étape mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. La partie du projet impliquant une intervention d’occlusion/reperfusion constitue une source potentielle de nuisances importantes. En effet l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, va provoquer des lésions cérébrales dans une zone localisée du cerveau. Ces lésions impliquent une perte des capacités motrices et cognitives de l’animal en post-opératoire, qui implique un isolement et un confinement de l’animal durant quelques jours, jusqu’à la récupération quasi-totale de sa motricité. Une étude précédente utilisant ce même modèle d’AVC chez le macaque a montré que la phase aigüe de l’AVC est la plus critique en termes d’effets indésirables sur les animaux (18% de risque de mortalité estimé). Une surveillance accrue des animaux sera donc réalisée lors de cette phase. Cette approche peut aussi induire des micro-accidents vasculaires par augmentation de la pression sanguine et de la rupture des vaisseaux cérébraux. C’est pour mesurer les risques de produire des effets indésirables découlant de ces potentiels accidents vasculaires induit par l’approche thérapeutique testée qu’il est essentiel de valider cette approche thérapeutique de reperfusion. Les parties de l’étude intégrant la phase d’entraînement et les examens d’imagerie sont considérées légères et modérés tandis que l’intervention d’occlusion/reperfusion qui présente des risques de déficits lésionnels étant classée en procédure plutôt sévère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure sévère pour tous les animaux.

Devenir

A l’issu de la procédure, 45 jours après l’intervention, les animaux seront euthanasiés. Cette sortie de la procédure par une euthanasie sur tous les animaux est principalement justifiée par le fait qu’elle nous sera indispensable, pour valider les mécanismes au niveau cellulaire, des outils d’imagerie développés dans ce projet. Seulement des approches histologiques au niveau cellulaire, sur du tissu cérébral post-mortem, peuvent nous permettre de valider ces outils IRM de la CMRO2 ainsi que des processus inflammatoires.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour valider l’efficacité et l’innocuité d’un nouveau traitement de l’AVC ischémique. En effet, les alternatives non animales (in silico, in vitro ou ex vivo) ne permettent pas d’étudier la sécurité de l'angulation de la tête et du corps à 15° lors de l'occlusion, les interactions entre les déficits moteurs observés et les marqueurs cérébraux associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération. Avant de tester cette procédure chez l’Homme, il est donc nécessaire de l’évaluer avec un modèle animal pertinent. Il est donc judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’Homme dans le cadre de l’AVC ischémique. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec des analyses comportementales. Ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Ainsi, les informations obtenues sur le PNH seront plus facilement transposables et applicable à l’humain qui subit une perte de fonction similaire découlant d’un AVC. Enfin, le macaque cynomolgus est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations mesurées grâce à un calcul de puissance est de 8 animaux. Au total, nous prévoyons 12 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux pour réaliser des corrélations (n=8) chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2 à 4). En effet, en nous basant sur la précédente étude ayant utilisée ce modèle PNH d’AVC par occlusion de l’artère cérébrale moyenne, nous estimons à 18% le taux possible de mortalité suite à la procédure d’AVC. Si le nombre d’animaux atteignant un point limite s’avérait inférieur à notre prévision, dû probablement à l’effet bénéfique de l'angulation de la tête et du corps de 15° sur la reperfusion cérébrale, nous limiterons le nombre total d’animaux au nombre nous donnant une puissance statistique suffisante. Si nous réussissons à mener nos 8 premiers animaux à pouvoir faire toutes les étapes du protocole et que nous obtenons une puissance statistique suffisante, nous nous gardons la possibilité de réduire le nombre prévu de 12 à 8 animaux.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères, chaque sujet étant son propre contrôle. De plus, le fait que nos deux principales mesures d’imageries, l’IRM de la CMRO2 et la TEP, seront réalisées simultanément grâce à la caméra hybride, nous pourrons limiter le nombre d’examens par animaux dans cette étude. Dès leur arrivée et tout au long de l’étude, en dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (4 ou 2), lorsque possible. Pour maximiser les effets bénéfiques de l’environnement, même durant les périodes post-AVC, les animaux seront toujours maintenus en hébergement par paire, pour limiter les effets délétères de l’isolement. Les animaux disposeront d’une quantité d’eau de boisson contrôlée et d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids.

Choix des espèces

L’organisation du système nerveux central est très différente selon les espèces, aussi bien au niveau macroscopique (taille des différentes structures) qu’au niveau moléculaire. Ce projet sera donc réalisé chez le macaque cynomolgus, du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du cerveau et des comportements entre ces deux espèces. Les animaux utilisés seront adolescents car ce sont des animaux qui n’ont jamais été utilisés dans d’autres études.

3 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections d'une nanoparticule dérivée d'un virus de plante puis des cellules tumorales, avec jusqu'à six anesthésies et cinq prélèvements sanguins, pour développer des tumeurs cutanées ou des métastases pulmonaires. Le porteur indique que la croissance des métastases peut provoquer des difficultés respiratoires et la mort par congestion pulmonaire, et que les tumeurs cutanées peuvent nécroser, s'ulcérer et saigner. Il conclut qu'aucun autre système que l'animal ne reproduit la complexité des interactions entre système immunitaire et tumeur, jugeant le recours à un "organisme animal" nécessaire.

Objectifs

Les thérapies antitumorales qui existent aujourd’hui (chimiothérapie, immunothérapies…) permettent certes d’éradiquer certaines tumeurs mais d’autres restent résistantes. C’est pourquoi la recherche de nouvelles thérapies, à utiliser seules ou en combinaison avec celles déjà existantes, se poursuit. Dans l’organisme, il existe des cellules immunitaires qui, tels des chefs d’orchestre, sont capables après reconnaissance d’un fragment de tumeur, d’induire une réaction immunitaire qui détruit les cellules tumorales sans affecter les autres cellules. Afin de déclencher, chez le patient, une réaction immunitaire spécifique et efficace, des composés thérapeutiques innovants qui adressent une fraction de tumeur à ces cellules immunitaires d’intérêt sont développés. Les nanoparticules sont des objets de petite taille (10-100 nm) et de composition variable (protéines, lipides…) qui peuvent pendant ou après leur synthèse être modifiés pour enfermer ou exposer différentes molécules d’intérêt (par exemple une molécule de ciblage et un agent thérapeutique). Elles suscitent donc un grand intérêt pour ce genre d’applications. Ce projet vise à étudier le potentiel antitumoral d’une nouvelle particule thérapeutique dérivée d’un virus de plantes que nous avons produite. Celle-ci est non-toxique et particulièrement innovante car très adaptable, en effet, le fragment tumoral qu’elle renferme peut être facilement changé afin de déclencher une réponse très spécifique de la tumeur à détruire. Dans ce projet, nous souhaitons étudier chez la souris si cette nanoparticule est capable d’empêcher l’émergence de nouvelles tumeurs et/ou de réduire la taille de tumeurs installées. Nous étudierons l’effets des nanoparticules sur des métastases pulmonaires et sur deux tumeurs cutanées de types différents. Ainsi, nous souhaitons étudier si cette nanoparticule peut avoir des applications en thérapie anti-cancéreuse pour de multiples cancers.

Bénéfices attendus

La nouvelle nanoparticule utilisée dans cette étude pour de la vaccination anti-tumorale constitue une innovation intéressante qui pourrait enrichir les stratégies existantes pour lutter contre le cancer. En effet, si aujourd’hui les nouvelles immunothérapies ont certes permis d’améliorer la rémission de certains patients, d’autres demeurent résistants à ces composés. Pour ceux-ci, utiliser des nanoparticules innovantes seules ou en combinaison avec d’autres composés thérapeutiques déjà existants pourrait constituer une alternative thérapeutique. Par ailleurs, la nanoparticule utilisée dans cette étude peut-être facilement modifiée pour s’adapter au mieux à différentes pathologie tumorales, ce qui est un atout certain. A terme, des particules intégrant un (ou plusieurs) autre(s) fragment(s) tumoral(aux) d’intérêt pourraient être développées. Après des études précliniques et cliniques, elles pourraient, chez l’Homme, compléter les traitements existants pour lutter contre le cancer.

Procédures

Au cours de l’expérimentation, les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques. En effet, ils recevront une ou trois injections de nanoparticules espacées de 5 jours par voie intradermique dans l’oreille ou par voie sous-cutanée dans le flanc. 3 à 8 jours après ou avant ces injections, selon la procédure, les animaux recevront par ailleurs une injection de cellules tumorales soit par voie intraveineuses (modèle métastases) soit par voie sous-cutanée dans le flanc (modèle tumeur solide). Par ailleurs, au cours de la procédure jusqu’à 5 prélèvements sanguins seront effectués. Ils seront d’un volume adapté à leur fréquence pour laisser le temps à l’organisme de l’animal de régénérer tout son volume sanguin avant le prélèvement suivant. Ces trois types d’intervention seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse (complétée avec un anesthésiant local pour les injections intraveineuses). Les animaux subiront au total au plus 6 anesthésies générales espacées d’au moins 3 jours. Chaque anesthésie durera environ 10-15 minutes.

Impact sur les animaux

Les impacts cliniques prévus sur les animaux inclus dans cette étude sont décrits ci-dessous. Les injections de nanoparticules peuvent localement au niveau du site d’injection (oreille ou flanc) provoquer un une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude qui pourrait causer une souffrance limitée (démangeaisons, rougeur cutanée, croûte) pour l’animal pendant au plus 2 jours. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir au niveau du site d’injection. La non-toxicité des nanoparticules a été vérifiée en amont ainsi, en elles mêmes, les nanoparticules injectées ne seront pas sources d’effets indésirables elles pourraient en revanche avoir un effet bénéfique sur la croissance tumorale et donc réduire les nuisances associées. Les injections de cellules tumorales (flanc ou voie intraveineuse peuvent être sources d’inconfort/gêne locale. Dans le modèle des métastases, la croissance des foyers métastatiques sur les poumons des souris peut provoquer des difficultés respiratoires et conduire à terme à la mort de l’animal par congestion pulmonaire. Dans les modèles cutanés de tumeurs solides la croissance tumorale peut être source de douleur. Si la tumeur atteint une taille trop élevée, elle peut nécroser en son centre, ulcérer et/ou saigner. En outre, en plus des répercussions liées à la localisation des cellules tumorales, des nuisances systémiques peuvent apparaître : le comportement et les capacités locomotrices des animaux peuvent être affectés. Les prélèvements sanguins répétés (au plus 5) seront suffisamment espacés et d’un volume adapté pour laisser au temps à l’organisme de l’animal de regénérer son volume sanguin entre deux prélèvements. Ainsi les animaux ne devraient que très légèrement être affaiblis par la réduction transitoire de leur volume sanguin. Après le prélèvement, au niveau du point de prélèvement du sang, une croûte pourrait se former et démanger l’animal, cette dernière devrait se résorber rapidement. Enfin toutes les manipulations répétées des animaux préalables aux injections et aux prélèvements sanguins peuvent être sources de stress. Pour limiter le stress et la douleur occasionnés par les injections et les prélèvements sanguins, les animaux seront placés sous anesthésie générale gazeuse parfois complétée avec une anesthésie locale au niveau du site d’injection. Les animaux seront toujours manipulés par du personnel compétent, habitué et sensibilisé au bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue de récupérer différents organes. Leur analyse permettra de conclure quant aux effets de la vaccination avec des nanoparticules sur la croissance des tumeurs.

Remplacement

Lors d’études préliminaires in vitro nous avons confirmé la non-toxicité des nanoparticules et avons obtenu des résultats très encourageants qui démontrent que les nanoparticules étudiées ici sont capable d’adresser spécifiquement une molécule bioactive aux cellules ciblées capables ensuite in vitro d’être fonctionnelles. Nous avons également, chez des animaux non porteurs de tumeurs, montré in vivo que les nanoparticules sont capables d’activer le système immunitaire. Ici nous souhaitons étudier son potentiel effet anti-tumoral à empêcher la croissance tumorale voire à conduire à son éradication complète. Si la nanoparticule a un effet celui-ci sera la conséquence d’une activation de différentes mécanismes complexes du système immunitaire conduisant à la mise en place d’une réponse immunitaire spécifique de la tumeur et à la suppression spécifique des cellules tumorales. ll n’existe actuellement pas d’autre système que le modèle animal pour reproduire fidèlement la complexité des interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales. Ainsi le recours à un organisme animal est nécessaire.

Réduction

Nos premières études in vivo (décrites dans une autre demande APAFIS déjà autorisée) indiquent que l’injection dans les oreilles des particules induit chez la souris la mise en place d’une réponse immunitaire efficace. Nous n’avons pas encore étudié l’injection dans le flanc (études également autorisées dans une précédente demande) si celle-ci s’avère inefficace, nous nous limiterons, à l’étude de l’effet antitumoral des particules par la seule voie intradermique (oreille), réduisant alors le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Il est prévu de réaliser chaque expérimentation 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, 3 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 12 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience (effectif de 9 animaux) des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence des éventuels bénéfices du traitement avec la nanoparticule sur la mise en place des tumeurs chez les souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de nids et de bâtons à ronger. Les animaux seront surveillés et manipulés par des personnes compétentes et formées au bien-être animal. Quotidiennement, leur état général sera surveillé visuellement afin de déterminer l’éventuelle présence de signes de stress ou de souffrance (attitude prostrée, dos voûté, démarche anormale, …). Après l’injection des cellules tumorales, 3 fois par semaine, les animaux seront pesés et la taille des tumeurs cutanées sera mesurée. Par ailleurs, le nombre de cellules tumorales injectées a été choisi en accord avec les données de la littérature comme permettant l’induction de tumeurs dont la temporalité de croissance est bien connue ce qui nous a permis de définir des points limites ou une fin de protocole en amont d’une souffrance animale trop élevée. En cas d’atteinte d’un des points limites l’arrêt anticipé de l’expérimentation sera alors décidé. Les injections (intradermiques, intraveineuses, sous-cutanées) et les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Par ailleurs, dans le cas des injections par voie intraveineuse l’anesthésie générale sera complétée d’une anesthésie locale au niveau du site d’injection.

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain tant du point de vue des caractéristiques des cellules immunitaires que des mécanismes globaux. En particulier, la type de cellules que nous souhaitons cibler avec notre nanoparticule dans cette étude est décrite avec des caractéristiques proches chez l’homme et chez la souris. Ainsi, pour nos études précliniques, la souris est un modèle de choix. Il existe des procédures bien décrites dans la littérature qui permettent de mettre en place chez la souris des modèles de métastases ou de tumeurs solides afin d’étudier une nouvelle particule thérapeutique et de suivre ses éventuels effets bénéfiques sur les tumeurs. Nous utiliserons des souris femelles adultes jeunes (2 à 3 mois) qui possèdent un système immunitaire mature et fonctionnel.

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est provoquée par instillation intranasale de bléomycine sous anesthésie, puis elles reçoivent des injections intrapéritonéales d'inhibiteurs, avant prélèvement des poumons pour analyse. Le porteur indique que la maladie peut entraîner des difficultés respiratoires, des troubles du déplacement et des signes de douleur comme des vocalisations et un dos voûté, les souris étant surveillées et euthanasiées si leur état se dégrade. Sur le remplacement, il affirme avoir développé des cultures in vitro mais conclut qu'elles ne reproduisent pas la complexité de l'organe, ce qui justifierait le recours à la souris.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact des voies de signalisation responsables du recrutement des neutrophiles et de la formation des Neutrophil Extracellular Traps (NETs) dans la fibrose pulmonaire. En effet, nos résultats obtenus in vitro montrent que les neutrophiles et NETs entrainent un environnement fibrotique. Ainsi, nous voulons maintenant confirmer nos résultats chez la souris en utilisant un modèle de fibrose pulmonaire induite par instillation intranasale de Bléomycine. En effet nous nous attendons à une diminution de la fibrose pulmonaire induite par Bléomycine après inhibition du recrutement des neutrophiles et NETs et de leurs sous-effecteurs (que nous avons identifié in vitro).

Bénéfices attendus

Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de fibrose pulmonaire. En effet, il n’y a aucun traitement vraiment efficace de nos jours pour diminuer la fibrose pulmonaire. Nous avons déjà identifié la présence de NETs dans les poumons de souris atteinte de fibrose pulmonaire (induite par bléomycine) ainsi que dans les poumons de patients atteints de fibrose pulmonaire. Cette étude permettra de mettre en évidence les neutrophiles et les NETs comme cibles thérapeutiques permettant de contrecarrer la fibrose pulmonaire.

Procédures

Nous administrerons par instillation nasale de la bléomycine chez les souris C57BL/6 femelles placées sur un tapis chauffant sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une à deux minutes, et une fois les souris endormies, elles seront instillées nasalement avec de la bléomycine, tout en étant endormi). Les souris seront ensuite replacées dans leurs cages. L’administration des inhibiteurs/anticorps et de leur véhicule commencera 30 minutes avant l’administration de bleomycine, par injection intrapéritonéale et jusqu’à la fin de l’expérience. Chaque injection intrapéritonéale durera environ 30 secondes (le temps de contentioner la souris, de la position, de l'injecter et de la reposer dans sa cage).

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus des animaux développant une fibrose pulmonaire sont des problèmes de respiration, de déplacements et des signes de douleurs (vocalisation, agressivité). Les effets indésirables définis comme toutes atteintes à une ou plusieurs des 5 libertés fondamentales définissant le bien-être des animaux placés sous la responsabilité de l’être humain, sont les suivantes : - Une altération du déplacement. En effet, les animaux auront des problèmes de respiration causé par la fibrose pulmonaire, ce qui peux entrainer des problèmes de déplacements. - Des signes de douleurs. En effet, la fibrose pulmonaire peut être à l’origine de douleurs (causé par les problèmes de respiration), caractérisées par un comportement agressif de l’animal, des vocalisations, un manque de toilettage ou encore un dos vouté. - Des rougeurs peuvent apparaitre au niveau du site des IP.

Devenir

Les animaux seront mis à mort puis les poumons seront prélevées pour analyse ex vivo. Les critères d’analyses des échantillons utilisés seront l’évaluation 1) de fibrose pulmonaire, par marquage de la matrice extracellulaire en utilisant des techniques d’immunofluorescence ; 2) de la présence de neutrophiles/NETs/macrophages dans les poumons.

Remplacement

Remplacer : Nos recherches ont décrit les cultures in vitro comme une méthode de remplacement pour l’étude de l’activation des macrophages et fibroblastes, qui sont les cellules à l’origine du dépôt accru de matrice extracellulaire responsable de la fibrose. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur l’activation des macrophages et des fibroblastes et ainsi la mise en place d’un environnement fibrotique. Ces cultures ne récapitulent pas la complexité de l’organe (notamment les relations entre les cellules épithéliales pulmonaire et les cellules immunitaires, dont les neutrophiles), nous avons donc recours aux animaux.

Réduction

Réduire : Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur la fibrose pulmonaire (en quantifiant le collagène par immunofluorescence des poumons) avec un nombre de souris minimum. Les tests statistiques nous permettent d'estimer le nombre de sujet dans chaque groupe à 22. Les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. De plus, les résultats déjà publiés avec ce modèle et l’utilisation de ce modèle lors de mon post-doctorat nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Toutes ces données nous ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : Les signes cliniques attendus des animaux développant une fibrose pulmonaire sont des problèmes de respiration, de déplacements et des signes de douleurs. L’administration de bléomycine se fera sur un tapis chauffant, sans incision sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 1 minute, temps nécessaire à l’instillation intranasale de bléomycine). Afin d’évaluer le bien-être animal au mieux et de manière objective, nous avons établi des fiches d’évaluation du bien-être animal adaptées à cette procédure (cf. annexe 1). Cette fiche d’évaluation comprend des points limites qui sont précoces et adaptés. Notamment le poids des animaux et les sites d’injections seront surveillés et un suivi journalier est effectué (notamment lors des injections quotidiennes). De plus, les résultats obtenus avec ce même modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie et justifient les procédures proposées.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans le développement de la fibrose pulmonaire. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. En outre, le modèle de fibrose pulmonaire induit par instillation intranasale de bléomycine est couramment utilisé par la communauté scientifique. De plus, j’ai déjà utilisé ce modèle lors de mon post-docotrat pour étudier la cinétique de développement de la fibrose pulmonaire, et ce modèle m’a déjà permis d’identifier la présence de NETs dans les poumons des souris atteintes de fibrose pulmonaire induite par bléomycine. Les administrations de bléomycine seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines ce qui représentent l’âge adulte chez la souris. En effet, nous nous intéressons au développement de fibrose pulmonaire chez l’adulte et non chez l’enfant. Les prélèvements des poumons sur les souris se feront au maximum 28 jours après injection de bléomycine.

390 coqs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Jusqu'à 210 subissent une ablation chirurgicale des cæca, et tous sont gavés des matières à évaluer, jusqu'à vingt-quatre fois par an, avec des mises à jeun de 24 à 72 heures, pour mesurer la digestibilité d'aliments destinés à l'élevage. Le porteur indique un stress lié au confinement et des douleurs possibles après le gavage ou l'ablation, et précise que les coqs sont tués faute de pouvoir entrer dans le circuit de consommation. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet cette mesure.

Objectifs

L'objectif de ce projet est la caractérisation nutritionnelle des constituants des aliments (matières premières, minéraux, additifs...) et/ou des aliments eux-mêmes. Cette évaluation nutritionnelle est réalisée d’une part en analysant leur composition chimique, et d’autre part en déterminant leur digestibilité iléale (pour les protéines et acides aminés) et caecale (pour l’énergie et la matière grasse).

Bénéfices attendus

Le coq adulte est utilisé comme modèle pour l’évaluation des digestibilités iléale et caecale d’un grand nombre d’espèces monogastriques (volailles, porcs, chiens, chats, espèces aquacoles, …). Ce modèle a été choisi il y a plusieurs décennies car il permet de discriminer de manière sensible des matières premières ayant un profil analytique identique. L’utilisation de ce modèle permet donc de renseigner de manière précise les tables de formulation des aliments des monogastriques.

Procédures

Les gestes techniques réalisés sur les animaux seront les suivants : Une opération chirurgicale d’ablation des caeca sera réalisée sous anesthésie générale sur maximum 210 coqs au cours du projet (intervention bien sûr unique dans la vie de l’animal). Cette intervention dure en moyenne 45 minutes. Le gavage des matières à évaluer sera réalisé sur l’ensemble des animaux de ce projet. Cette intervention, qui ne dure que quelques secondes par coq, pourra être mise en œuvre maximum 24 fois par coq et par an. Les animaux pourront être mis à jeun sur des durées de 24h (voire 72h, dans ce cas maximum 3 fois dans la vie d’un même animal).

Impact sur les animaux

Le confinement des animaux dans des compartiments de surface réduite pendant une période prolongée peut être à l’origine de réactions physiologiques ou comportementales au stress (morbidité, prostration, …). L’ingestion de matières premières par gavage peut, dans de rares cas, provoquer des lésions ou douleurs. Les animaux peuvent subir des périodes de mise à jeun de 24h ou 72h. Les animaux concernés par l’ablation des caeca peuvent ressentir des douleurs post-opératoires ou manifester des signes d’affaiblissement, de prostration.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés car ces animaux ne peuvent pas entrer dans le circuit de consommation.

Remplacement

Les mesures de digestibilité des matières premières utilisées chez les monogastriques se font in vivo à l’aide d’une méthode standardisée aussi utilisée pour établir les valeurs tables de digestibilité publiées. Cette méthode, très sensible, permet de discriminer des matières ayant un profil analytique identique. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode in vitro permettant cette discrimination.

Réduction

Le nombre de 9 coqs intacts et 9 coqs caecectomisés par matière évaluée a été défini comme étant le nombre minimal permettant d’écarter les individus ayant régurgité ou présentant une anomalie, tout en conservant une quantité de fientes minimale nécessaire pour les analyses chimiques. Les fientes des coqs peuvent être poolées, ce qui permet, selon les quantités de fientes, d'obtenir 2 ou 3 échantillons à analyser. Ceci est un minimum requis afin d'assurer la fiabilité des données. L’exploitation des données par un test statistique n’est pas possible car le nombre de données par critère est déjà au minimum, il n’est que de 2. Un coq sera utilisé au maximum dans 24 bilans par an. Le nombre total de coqs par bande (130) permet de respecter le temps de repos entre 2 gavages, ainsi qu’une rotation régulière des lots d’animaux entre cages de gavage et cases de repos au sol.

Raffinement

L‘état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, alors il sera écarté de l’étude. Des points limites stricts et définis à l’avance seront appliqués tout au long du projet. Chaque logement est enrichi d’une ficelle ainsi que d’un perchoir. Les coqs ont la possibilité de se voir, de s’entendre et d’émettre des vocalises.

Choix des espèces

Le coq est le modèle de référence pour l'évaluation de la digestibilité iléale et caecale des constituants des aliments. Sa taille ainsi que la morphologie de son tube digestif permettent de réaliser des bilans avec gavage sur un temps court, sans période d’accoutumance au régime, et avec des résultats très répétables. En effet, une mise à jeun de 24h suffit pour une vidange totale du tube digestif. Les animaux de chaque bande arrivent à 1 jour d’âge et sont élevés dans des conditions classiques d’élevage jusqu’à 4 mois environ, âge auquel ils arrivent au stade adulte. Les coqs utilisés pour les bilans digestifs sont adultes, ils n’ont plus de besoins de croissance mais uniquement un besoin d’entretien stable.