Procédures sévères

1 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de vésicules bactériennes qui provoquent un sepsis, un dysfonctionnement d'organe potentiellement mortel suivi par un score clinique jusqu'à une perte de 20 % du poids. Une moitié est tuée à un stade précoce, l'autre gardée pour l'étude des séquelles avant d'être tuée à son tour. Le projet étudie le rôle de ces vésicules dans la gravité du sepsis, le porteur indiquant que les modèles animaux restent "essentiels" pour tester les traitements à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Le sepsis est un problème majeur de santé publique, défini comme un dysfonctionnement d'organe potentiellement mortel causé par une réponse dérégulée de l'hôte face à une infection. Les sepsis dus à une infection par des bactéries Gram-négatif sont associés à une mortalité plus élevée que ceux associés à une infection par des bactéries Gram-positif. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des souches septiques ne sont pas encore totalement compris. Nous avons montré que les bactéries Gram-négatives Escherichia coli (E.coli) pathogènes et responsables de sepsis produisent des vésicules à partir de leur membrane externe, appelées OMV pour outer membrane vesicle en anglais, ayant des propriétés particulières qui contribuent à la virulence de ces souches. En effet, ces OMV spécifiques ont la capacité d'induire seules un sepsis particulièrement grave. Nous postulons donc que ces OMV jouent un rôle majeur dans la sévérité des infections bactériennes et notamment du sepsis. Notre objectif est de comprendre comment ces OMV contribuent à la physiopathologie des infections par des infections à Gram négatif et au sepsis en particulier (mise en place et aggravation / séquelles à court et moyen terme).

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des OMV d’E. coli dans l’induction et l’aggravation du sepsis et ses conséquences néfastes à court et moyen terme. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie des sepsis mais aussi donneront des pistes pour adapter les traitements de supports à utiliser chez les patients septiques admis en unité de soin intensif.

Procédures

Les animaux se subiront aucune intervention vigile autres que des injection intra-péritonéales, intra-veineuse ou sous-cutanées, à une fréquence faible (2 fois sur toute la procédure). Les animaux qui se verront administrer les OMV par voie intra-vésicale seront au préalablement anesthésiés par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane) durant toute la durée de l'intervention, qui durera environ 5 minutes. Ces animaux seront privés d’eau 2h avant cette instillation et jusqu’à 2h après cette procédure. Sur tous les animaux, nous procéderons à une anesthésie terminale par injection de 100μl d’un mélange de rompun/ketamine 1000 (2 ml de ketamine, 500μl de Rompun QSP10ml NaCl 0,9%) avant une prise de sang à la veine cave d’un volume de 700µL à 1mL en environ 15 secondes et qui sera suivie par l'euthanasie de l'animal par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures expérimentales prévues chez la souris peuvent entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets systémiques (sepsis). Ainsi, les paramètres cliniques (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) seront observés et quantifiés toutes les heures pendant 8 heures le jour de l’administration des OMV puis quotidiennement à partir du deuxième jour et jusqu’à la fin des expériences (sauf les pesées qui seront réalisées seulement 2 fois par semaine) et serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant impact des OMV et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20%.

Devenir

A l'issue des procédures 1 et 2, la moitié des animaux sera euthanasiée pour évaluer l'impact des OMV sur les temps précoces après induction d'un sepsis afin d'établir leur rôle dans la phase aigüe. L'autre moitié des animaux sera gardée en vie et utilisée pour la procédure 3 qui vise à évaluer le rôle des OMV dans l'apparition de séquelles à court et moyen terme après apparition du sepsis. A l'issue de la procédure 3, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser un score lésionnel macroscopique et microscopique.

Remplacement

Des expérimentations alternatives in vitro ont été préalablement réalisées pour démontrer l'effet des OMV sur les cellules impliquées dans l’induction du choc septique (plaquettes sanguines, neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales) et valider ainsi la preuve de concept du projet. Cependant, les modèles animaux sont des éléments essentiels de la recherche sur le sepsis pour étudier de manière exhaustive les différentes étapes de l’induction d’un sepsis et pour tester l’effet des traitements habituellement prescrits à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Le modèle d’injection des OMV par voie systémique, par voie intrapéritonéale et par voie intra-vésicale ainsi que les infections par des E. coli ont été validés dans l’équipe, ce qui facilite les étapes d'optimisation réduisant ainsi le nombre d'animaux requis pour ce projet. Nous utiliserons 10 animaux par groupes (et 5 animaux pour le groupe contrôle). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2 avec un nombre de 5 animaux par cage), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Pour les procédures d’injection des OMV par voie systémique, les animaux seront surveillés de manière permanente jusqu’au sacrifice (qui aura lieu entre 2 à 12h après l’injection des OMV). Pour les autres procédures, les paramètres cliniques (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) observés et quantifiés quotidiennement (sauf les pesées qui seront réalisées seulement 2 fois par semaine) et serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20%. Le dépassement de ces points limites conduira à l’euthanasie de l’animal concerné selon le décret N°2013-18 du 1er février 2013 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.

Choix des espèces

La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du sepsis. Les doses d’OMV à utiliser sont déjà validées dans cette espèce. Souris de 7 à 8 semaines pour toutes les procédures sauf la procédure 3. Dans la littérature, les souris utilisées pour l’étude du sepsis sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées comme adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.

1 536 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes cérébrales et, pour la moitié, une restriction d'accès à la nourriture qui provoque une perte de 20 à 25 % du poids en une à deux semaines, au-delà de laquelle le porteur indique que l'animal meurt en quelques jours. Ils sont isolés après chirurgie et tués en fin de protocole pour vérifier la position des électrodes. Le projet teste la stimulation cérébrale profonde comme modèle d'anorexie mentale, le porteur la jugeant "indispensable" et urgente pour les patients déjà implantés.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est une maladie sévère affectant principalement les femmes jeunes et pour laquelle aucun traitement biologique, en dehors des soins nutritionnels, n’a pu démontrer son efficacité. Plusieurs protocoles dans le monde proposent l’implantation d’électrodes dans les Noyaux Accumbens (NAcc), alors même que peu d’études précliniques testent ces techniques pour mieux en comprendre les déterminants et les limites. L’AM associe troubles de la motivation et comportements compulsifs. Le substrat neurobiologique de ces différents processus implique le système cortico-striatal qui est composé de différents territoires corticaux moteur ou préfrontal (i.e. cortex cingulaire antérieur, le cortex préfrontal ventromédial et le cortex orbitofrontal) et différents territoires du striatum : dorsal (caudé et putamen) et ventral (NAcc). Le noyau sous-thalamique (NST), une structure des ganglions de la base classiquement associée aux fonctions motrices, est utilisé comme cible chirurgicale dans le traitement de la maladie de Parkinson par la technique de stimulation cérébrale profonde. Des travaux chez le rat ont souligné l’importance de cette région cérébrale dans les fonctions cognitives et motivationnelles et dans les mécanismes de prise de décision et de contrôle des impulsions et compulsions. Ces implications fonctionnelles du NST ont conduit à le proposer comme cible chirurgicale potentielle pour traiter les troubles obsessionnels compulsifs et les addictions. Il est indispensable et urgent de développer des modèles précliniques dans cette indication. D'abord pour tester les effets de la neuromodulation de structures déjà utilisées pour la stimulation cérébrale profonde dans l’AM et, ensuite, pour tester les effets sur d’autres structures associées aux même processus mentaux mais jamais évoqués dans l’AM (NST). Le but de ce projet est de valider un modèle préclinique chez le rat de stimulation cérébrale profonde dans les troubles alimentaires par l’étude de deux cibles : le NAcc et le NST.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait de répondre à de nombreuses questions concernant la stimulation cérébrale profonde pour les patients déjà implantés et les suivants. Quelle est la cible la plus appropriée ? Quel mécanisme explique l’effet thérapeutique observé ? Quels paramètres sont à privilégier et quels sont leurs effets (stimulation continue ou intermittente, haute ou basse fréquence, durées d’impulsion, intensité) ? Il existe un bénéfice translationnel direct et immédiat (même équipe en charge de ce projet préclinique et du projet clinique) de ce protocole. Il faut souligner le caractère urgent sur le plan déontologique de pouvoir apporter des réponses pour les patients déjà implantés.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet sera soumis une fois à un acte chirurgical , réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée. L’ensemble des animaux sera soumis à l’implantation d’électrodes de stimulation cérébrale profonde. L’intervention dure environ 90 minutes. Tous les animaux auront deux prélèvements de sang au niveau de la queue après application d’une anesthésiant local (avant et après la procédure comportementale de restriction et d’accès à une roue d’activité). Chaque prélévement dure moins de 15 secondes. La moitié des rats du protocole sera exposée à une période de restriction d’accès à l’alimentation (1h30 par jour d’accès à volonté) d'une durée maximale de 14 jours.

Impact sur les animaux

Il s’agit des conséquences de l'anesthésie, de la chirurgie, de la restriction calorique, de l’isolement et des prélèvements sanguins. Lors de l'induction anesthésique l'injection intrapéritonéale peut entrainer une gène modérée au point d'injection puis sur le site de diffusion du produit anesthésique. Dans les jours suivant l’opération une perte légère de poids et une activité réduite peuvent être constatées. Les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids de l’implant fait en ciment dentaire. Rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés pendant la période de récupération après chirurgie. La restriction calorique par restriction du temps d’accès à la nourriture, indispensable dans ce modèle d’anorexie mentale, entraine une perte de poids de 20-25% en 7 à 14 jours en moyenne. La perte de poids jusque 20% n’entraine la plupart du temps aucune modification de l’état général en dehors d’une augmentation du niveau d’activité physique (constitutif du modèle Activity-Based-Anorexia). Au-delà de 25% de perte de poids il est constaté une altération de l’état général qui conduit en quelques jours à la mort de l’animal. L’isolement est rendu nécessaire par le port du stimulateur sur le haut du crâne, stimulateur qui pourrait être endommagé par les partenaires de cage. Mais aussi afin d’empêcher les phénomènes de coprophagie des fèces du partenaire de cage. Les découvertes récentes sur la place du microbiote sur le métabolisme énergétique et l’effet des transferts de microbiote d’un animal à l’autre rendent nécessaire de contrôler ce paramètre via l’isolement. Le rat étant un animal social l’isolement peut entrainer des comportements répétitifs, une apathie. Cela peut entrainer en situation de perte de poids et des difficultés à réguler la température corporelle venant aggraver la perte de poids. Cette dimension fait cependant partie du modèle ABA. Le prélèvement sanguin à la queue peut être à l’origine d’un hématome sous-cutané du premier tiers de la queue. Le prélèvement est considéré comme indolore, une gêne modérée peut être ressentie lors de la ponction.

Devenir

Afin de permettre de vérifier la localisation exacte de l’électrode implantée et afin de réaliser des mesures de l’activité électrique de certaines populations de neurones (effet de la stimulation) les rats sont mis à mort à la fin du protocole expérimental.

Remplacement

La modélisation comportementale préclinique d’une pathologie comme l’anorexie mentale nécessite l'étude de comportements chez l’animal vigile et libre de ses mouvements et choix. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce type d’objectif.

Réduction

Les paramètres de stimulation optimaux étant inconnus pour l’anorexie mentale et aucune donnée n’étant disponible chez le rongeur, il est nécessaire de tester sur 4 groupes, 2 cibles (NAcc/STN), 2 conditions de stimulation (ON/OFF), 3 types de fréquence, 3 intensités, 2 largeurs d’impulsion. La mesure de l’effet préventif de la stimulation cérébrale profonde sur le développement du phénotype ABA sera réalisée par l’application d’une restriction alimentaire secondaire pour les rats des groupes contrôles (AL/ALW). Cela permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires. S’agissant d’une étude utilisant une chirurgie stéréotaxique, 12 animaux par condition testée sont nécessaires afin d’anticiper les erreurs de placement d’électrodes de stimulation. Le taux d’échec est d’environ 40 % et ne peut être formellement démontré que post-mortem. Soit (12*4*3*2)+(12*4*2)+(12*4*3*3*2)+(12*4*2)= 1344 rattes. Ce à quoi il faut ajouter un groupe de rats mâles pour estimer l’effet du sexe sur les variables mesurées. Le nombre de rat mâle sera minimisé au maximum pour n’être utilisé que dans la combinaison de conditions (STN/NAcc) optimale chez les femelles soit 12*4*2*2*1*1*1 = 192 rats. Soit 1536 animaux maximum sur 5 ans. Plusieurs approches combinées permettront de réduire au cours de l’étude le nombre d’animaux nécessaires. La taille de l’effet de la stimulation cérébrale profonde sur l’activité compulsive en roue en situation de restriction calorique n’étant pas connue à ce jour, les analyses statistiques intermédiaires permettront principalement de réduire le nombre d’animaux finalement nécessaires. L’obtention d’un effet robuste pour une condition expérimentale entrainera l’arrêt du test dans cette condition et l’absence d’effet entrainera l’arrêt pour futilité. Un taux d’échec d’implantation bas entrainera la réduction de la taille du groupe. La limitation matérielle induit des protocoles comportementaux par bloc de 4 animaux par condition et permet de facto les analyses intermédiaires et induisent une réduction optimale du nombre d’animaux. Les groupes contrôles stimulation OFF pourront s’avérer futiles plus ou moins rapidement selon la taille d’effet mesuré. Les groupes contrôles sans roue d’activité et sans restriction pourront aussi s’avérer inutiles en cas de résultat robuste dans une modalité de stimulation. Cette modalité pourra devenir le standard à laquelle sera comparé un autre paramètre.

Raffinement

Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton… changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). Les cages translucides permettent aux rats isolés après chirurgies de se voir. Les animaux bénéficient d'une habituation aux salles d'experimentation avant le début du protocole. Les animaux bénéficient d'une anesthésie générale pour l'ensemble de la chirurgie d'implantation. Lors de la procédure chirurgicale une injection en sous cutanée de 3 mL de NaCl 0,9% est réalisée afin de limiter la déshydratation et améliorer la récupération post chirurgie. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques ou antibiotiques spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) l’animal sera isolé et aura accès ad libitum à une nourriture enrichie. Un traitement antalgique pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc) ou une injection intrapéritonéale de glucose. Le protocole prévoit un retour à une alimentation ad libitum continue si la perte de poids est supérieure à 25%. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie appropriée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude des comportements compulsifs. Les rats ont été les premiers et sont encore prioritairement utilisés dans la modélisation préclinique de l’anorexie mentale, via l’Activity-Based-Anorexia ou ses variantes. L’étude de comportements en situation cherchant à modéliser un trouble mental requiert que l'animal soit vigile, libre de ses mouvements et que les structures cérébrales clefs soient présentes. L’équipe a une longue expérience des chirurgies dans le NST du rat, ce qui permet un meilleur taux de succès des chirurgies. Cette structure cérébrale étant très petite, la souris rendrait les chirurgies plus difficiles. Afin d’étudier les animaux à un stade proche de l’équivalent de l’adolescence (réduire) tout en limitant les risque de la chirurgie (raffinement) nous réaliserons nos expériences chez de jeunes adultes femelles 6-9 semaines (environ 150-200 g). Une expérience avec des rats mâles est prévue afin d’estimer l’effet du sexe.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie est génétiquement modifiée pour développer des symptômes de maladies neurodégénératives, comme une démarche altérée et des tremblements, et toutes subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau puis sont isolées pendant toute l'expérience. Elles sont tuées soit par prélèvement d'organes incompatible avec leur survie, soit à cause des effets indésirables des produits testés. Ce projet réglementaire évalue la tolérance de candidats médicaments injectés dans le cerveau, le porteur affirmant qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'évaluer si les futurs candidats médicaments sont bien tolérés après leur injection dans le cerveau. Les souris utilisées pourront être soit des animaux non génétiquement modifiés, soit des animaux génétiquement modifiés pour rentrer dans le cadre de certaines pathologies. Dans ce dernier cas, on évaluera la tolérabilité des molécules visant à atténuer l'expression d'une protéine humaine liée à un gène inséré dans le génotype de la souris. 3 souches de souris transgéniques pourront être utilisées permettant d’étudier des symptômes apparaissant dans les pathologies suivantes : maladie de Machado-Joseph, ataxie cérébelleuse de type 2 ou bien maladie de Parkinson. Ces modèles animaux reproduisent de façon plus fidèle la physiopathologie humaine. Pour ces 3 pathologies, l'accumulation anormale de la protéine va entrainer la mort des neurones dans des zones du cerveau contrôlant la motricité.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments qui seront bien tolérés par l'homme et permettant de traiter de nombreuses maladies neurodégénératives comme la maladie de Machado-Joseph, une pathologie humaine ayant une incidence de 1-2 personnes sur 100 000 et qui peut être plus élevé chez certaines ethnies, l'ataxie cérébelleuse de type 2 A qui a une prévalence de 1 à 2 sur 100 000 personnes, ou la maladie de Parkinson qui touche jusqu'à 8.5 millions de personnes dans le monde. Les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est toléré (avec l'utilisation d'animaux non génétiquement modifiés et génétiquement modifiés).

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie et une chirurgie sous anesthésie (45 minutes) pour réaliser l'administration du produit dans le cerveau, des administrations d'anti-douleur (jusqu'à 5 administrations, moins de 30 secondes pour chaque administration), des prélèvements de sang sur animaux vigiles (2 minutes) ou anesthésiés (pas de réveil après le prélèvement).

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés pour réaliser l'injection des candidats médicaments dans le cerveau et ils recevront jusqu'à 5 injections d'anti-douleur. Pour les animaux génétiquement modifiés, des symptomes liés à l'expression de la proteine humaine se développeront (par exemple une démarche altérée, des tremblements, une baisse de l'activité, une éventuelle perte de neurones dans des structures précises). Les animaux seront isolés pendant toute la durée de l'expérience.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal, ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule après son injection dans le cerveau. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Une analyse statistique pourra éventuellement être envisagée et sera adaptée au modèle. Aucune analyse statistique ne sera réalisée sur la grille d'observation.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire. Un raffinement spécifique à cette étude sera réalisé par la mise en application d'une grille d'observation spécifique à l'espèce permettant d'objectiver la contrainte subie par l'animal.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur une pathologie précise dont certains symptomes sont induits après modification génétique de l'expression d'une proteine, qui peut être par exemple impliquée dans la maladie; ou bien pour évaluer la tolérabilté d'un candidat médicament. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement .

158 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe des cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, avec prélèvements sanguins réguliers et traitements, la tumeur pouvant provoquer perte de poids, ataxie et apathie. Le projet crible des molécules d'immunothérapie contre le lymphome cérébral. Le porteur indique qu'un criblage in vitro a limité le nombre de molécules testées, mais qualifie les expériences in vivo d'indispensables avant tout essai clinique.

Objectifs

Les lymphomes primitifs du système nerveux central (LCP) sont des lymphomes qui se développent dans le cerveau. Ils peuvent être associés à une atteinte de l’œil, des méninges et du liquide céphalo-rachidien. Ce sont des lymphomes rares de mauvais pronostic avec les traitements actuels. Dans le cerveau, les tissus (microenvironnement) entourant le lymphome ne peuvent développer que des réactions immunologiques peu efficaces. . Cette caractéristique peut être responsable d’une mauvaise efficacité des traitements anti-lymphomateux et en particulier des immunothérapies qui représentent un progrès majeur pour le traitement des lymphomes systémiques (se développant en dehors du système nerveux central). Dans ce projet, notre collaborateur procèdera au criblage de nombreuses molécules de notre partenaire industriel sur des modèles in vitro afin de sélectionner les molécules candidates à tester sur des modèles in vivo. Ceci permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés. Nous évaluerons l’efficacité clinique de cette sélection de molécules sur nos modèles de LCP murins. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de molécules et de combinaison de molécules, et d’évaluer leur impact sur le microenvironnement immunologique cérébral. La perspective de ce travail est de développer des essais thérapeutiques cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre d’une part, d’identifier des molécules et/ou associations de molécules innovantes efficaces contre le lymphome cérébral et documenter comment ces molécules modulent le microenvironnement immunologique cérébral. A partir des connaissances ainsi acquises, des essais cliniques pourront ensuite être proposés chez les patients avec l’objectif d’améliorer le pronostic de cette maladie.

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront greffées dans le cerveau des animaux sous anesthésie générale (environ 40min). Des prélèvements sanguins seront réalisés tous les 15 jours sur ces animaux (durée du geste

Impact sur les animaux

L’implantation de tumeur cérébral entraine, chez les animaux implantés dont la tumeur a pris, les symptômes suivants (possiblement) : perte de poids, ataxie, apathie. Les traitements par chimiothérapie peuvent également entrainer des effets secondaires en fonction de leur nature qui vont principalement se traduire par une perte de poids. L’état général des animaux sera évalué dès l’apparition des premiers symptômes en regard avec la grille de score. Pour limiter au maximum leur souffrance, les animaux recevront des soins supports ou seront euthanasiés.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Le criblage initial sur des modèles in vitro permettra de limiter le nombre de molécules/association de molécules à tester sur des modèles in vivo, et limitera ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour les expérimentations in vivo. Ces expérimentations in vivo restent néanmoins indispensables en amont des essais cliniques chez les patients et pour étudier le microenvironnement cérébral.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés au plus bas tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un outil statistique.

Raffinement

Pour limiter la souffrance des animaux, les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Les animaux seront observés 5 fois par semaine pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal être. Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 3 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine minimum afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant l’apparition de signes de souffrance des animaux tels que décrits dans la grille de score.

Choix des espèces

La souris est le modèle communément utilisé en cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. L’existence de souches immunodéprimées nous intéresse particulièrement pour l’établissement de modèles tumoraux à partir de xénogreffes. Nous travaillerons sur des souris adultes âgées de 6 semaines chez qui le cerveau est totalement développé.

11 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal porte deux tumeurs greffées et reçoit des injections répétées et des séances d'irradiation, le développement tumoral pouvant provoquer nécrose et automutilation. Le projet teste des nanoparticules activées par radiothérapie associées à des immunothérapies contre le cancer. Le porteur affirme que ces mécanismes immunitaires dans un organisme entier ne peuvent être reproduits en culture cellulaire, un tri in vitro ayant précédé les greffes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer un traitement sur des souris possédant un système immunitaire intact et porteuses de deux tumeurs (une sur chaque flanc droit et gauche, pouvant être de nature identique ou différente). Le principe sera d’étudier la réduction du volume tumoral sur la tumeur gauche non-traitée, à la suite du traitement de la tumeur droite et de mettre en exergue l’effet à distance du traitement appliqué via le système immunitaire de l’organisme (effet abscopal). Le traitement de la tumeur droite sera induit par l’injection de nanoparticules activées par radiothérapie, ou par de la radiothérapie seul, ou par une combinaison de ces traitements avec un agent immunomodulateur. Les immunomodulateurs (AIM) peuvent agir à différents niveaux dans le cadre de la réponse immunitaire antitumorale. Par conséquent, il sera intéressant de regarder l’effet de nos nanoparticules sur les différents niveaux de fonctionnement du système immunitaire, c’est pourquoi différents AIM seront évalués en combinaison avec les nanoparticules et la radiothérapie pour ce projet.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules activées par la radiothérapie ont démontré leur capacité à tuer les cellules cancéreuses plus efficacement que la radiothérapie seule. D’autres données ont montré que ces nanoparticules sont capables de rendre la tumeur plus attractive pour les cellules immunitaires, par rapport à la radiothérapie seule. Cela permet donc une meilleure réponse immunitaire contre la tumeur. Ces observations font le lien avec les raisons justifiant l’utilisation des nanoparticules activées par la radiothérapie en association avec des agents immunothérapeutiques. Les traitements de patients par des agents immunomodulateurs (AIM) ne fonctionnent que dans 10 à 30% des cas. Dans la majorité des cas (70-90%), l’utilisation de ces agents ne fonctionne peu ou pas, car les tumeurs traitées ne présentent quasiment pas de réponse immunitaire anti-tumorale avant le traitement (au contraire des patients répondants). Ceci souligne la nécessité d’une réponse immunitaire anti-tumorale déjà présentes pour que ces traitements fonctionnent.

Procédures

Injection sous-cutanée : sous anesthésie locale, sur tous les animaux des procédures. 2 injections le même jour (flanc gauche et droit). Réinjection possible une fois, si disparition des greffes tumorales. Maximum 1min/animal. Injection intra-veineuse : animal vigile en contention dans un système permettant l’accessibilité à la veine caudale de l’animal. 1 injection/animal. Maximum 5min/animal. Injection intra-tumorale : sous anesthésie générale de courte durée sur tous les animaux des procédures impliquant l’injection de nanoparticules (ou glucose). 1 injection/animal. Maximum 2 min/animal. Injection intra-péritonéale : lors des procédures précisant l’administration d’agents immunomodulateurs ou lors de traitements de soin pouvant être répéter le cas échéant. Maximum 1 min/animal. Irradiation des tumeurs sous-cutanées : animal vigile en contention et protégé dans un système adapté permettant l’irradiation de la tumeur uniquement. 1 irradiation/jour sur une durée de 1 à 5 jours. Maximum 20 min/animal. Prélèvements sanguins : 1) Une fois avant traitement par ponction de la veine caudale. 2) Juste avant l’euthanasie, un prélèvement pourra être effectué au niveau de la veine mandibulaire sous anesthésie générale par ponction. Maximum 5min/animal.

Impact sur les animaux

Bien que l’animal soit dans un système de contention permettant uniquement l’exposition de la tumeur aux radiations, la radiothérapie peut parfois provoquer une perte de poids, une difficulté à se nourrir, liées à l’irradiation du système digestif de l’animal. L’injection des cellules tumorales en sous cutané et l’injection intra-tumorale sont des gestes pouvant occasionner une angoisse ou de la douleur pour l’animal. Bien qu’aucune toxicité ou effet secondaire ne soit attendue, les composés utilisés peuvent potentiellement occasionner de la douleur pour l’animal. Le développement tumoral peut également provoquer des nuisances pour la souris notamment avec l’apparition de nécrose et la mutilation de l’animal (ronge les zones nécrotiques).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés dés lors d’une atteinte d’un des points limites, ou lorsque l’animal arrive à la fin d’une des procédures décrites pour analyses. Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

L'étude porte sur des mécanismes complexes qui ont lieu dans un organisme entier et implique la réponse immunitaire. Il n'est pas possible de remplacer par une culture cellulaire ou un organoïde. En revanche, les lignées cellulaires cancéreuses ont d'abord été testées in vitro pour sélectionner les plus pertinentes pour être greffées sur des animaux.

Réduction

Les données des publications scientifiques avec les nanoparticules en combinaison avec la radiothérapie sur les cellules cancéreuses utilisées (prise de greffe, croissance tumorale, courbes de survies) ainsi que sur les agents immunomodulateurs (mode d’administration, dose efficace, toxicité) nous ont permis de réduire au maximum le nombre d’animaux requis pour cette étude. L'expérience acquise et un calcul de puissance de test statistique ont contribués à limiter au strict minimum dans l’étude le nombre d’animaux nécessaire afin d'optimiser l’évaluation du traitement, soit 11520 au maximum sur 5 ans. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de 5 animaux/cage, dans des conditions apyrogènes (nourriture stérilisée et eau disponible à volonté), dans des portoirs ventilés avec température et humidité ambiante contrôlées. Du coton et ou du kraft sera mis à disposition dans la cage afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des maisonnettes qui leur servent d’abri. L'inconfort, la douleur ou l'angoisse des animaux potentiellement liés à la toxicité du composé (bien qu’aucune toxicité ne soit attendue) seront traités par des médicaments adaptés. Aussi, pour éviter toute souffrance aux animaux, ils seront sous anesthésie générale lors des procédures d’injections intra-tumorale et sous anesthésie locale lors des procédures d’injections sous-cutanées. Une habituation des animaux sera mise en place pour les systèmes de contention en amont des injections intra-veineuse et des irradiations. Enfin, des points limites adaptés seront mis en place pour permettre de limiter la douleur à son minimum tout au long des procédures expérimentales. Tout animal présentant une perte de poids par rapport au poids initial sans reprise sera euthanasié. Une dégradation de l’état général (signe de faiblesse, poil hérissé, refus de s’alimenter) entraînera l’isolement de l’animal. Des mesures thérapeutiques seront mises en place telles que l’administration de compléments nutritifs. Si malgré les traitements mis en place les signes cliniques persistent ou progressent, l’euthanasie sera réalisée. Tout animal présentant une nécrose ulcérant de la tumeur ou un volume tumoral total trop important sera euthanasié.

Choix des espèces

La sélection de cette espèce de rongeur est basée sur le fait que les modèles de tumeurs greffées chez des souris immunocompétentes (ayant un système immunitaire pleinement fonctionnel) sont très répandues pour l’étude de traitements anti-cancéreux à travers toute la recherche en immuno-oncologie. Les lignées cellulaires choisies sont issues soit de la souche BalbC (ex : cellules CT26), soit de la souche Black6 (ex : cellules B16F10). Ces souris ayant un système immunitaire pleinement fonctionnel, il est nécessaire d’injecter les lignées cellulaires dans la souche de souris d’origine afin d’éviter tout rejet de greffe. Des souris de 7-8 semaines, jeunes adultes, ont été sélectionnées. Pour des raisons techniques, le poids des animaux doit être au minimum de 20 grammes afin d’assurer de bonnes conditions de traitement par radiothérapie. Pour les irradiations localisées, les animaux sont disposés dans des systèmes de contention exposant uniquement la zone d’intérêt. Ces systèmes sont adaptés à des souris de taille adulte.