Procédures sévères
Suivi fonctionnel et biologique de souris Apc pré-cachectiques et cachectiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Porteuses d'une mutation du gène Apc qui leur fait développer un cancer de l'intestin, une partie des souris de ce projet sont étudiées à 11 semaines, avant la fonte musculaire liée au cancer, ou à 15 semaines, quand elle a commencé. Avec des témoins sauvages issus des mêmes portées, 208 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère ou sans réveil, toutes tuées à l'issue pour analyses. Elles subissent une prise de sang derrière l'œil, une mesure de la composition corporelle et de la force d'un muscle de la patte sous anesthésie, des tests d'agrippement et de Rotarod éveillées, puis des prélèvements de tissus sous anesthésie. Les souris Apc qui présentent du sang dans les fèces ou un prolapsus, des symptômes que le porteur dit "évocateurs d'une souffrance animale", sont retirées du protocole et tuées par dislocation cervicale sous anesthésie.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez la souris Apc, un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en évidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez les souris Apc.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associée au cancer.
Procédures
Procédure 1. Aucune intervention. Procédure 2. Prélèvement sanguin rétro-orbital et analyse de la composition corporelle (PIXImus) sous anesthésie gazeuse (induction: isoflurane 4%: maintenance: isoflurane 2%), test d'agrippement et Rotarod sur animal vigile, mesure de force in situ du muscle tibialis anterior sous anesthésie gazeuse (induction: isoflurane 4%: maintenance: isoflurane 2%). Procédure 3. Prélèvements tissulaires sous anesthésie 100 mg/kg kétamine + 10 mg/kg xylazine.
Impact sur les animaux
Concernant les souris contrôles, aucune nuisance n'est attendue à l'exception du prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse. Concernant les souris Apc et s'agissant d'un génotype dommageable (le suivi et l'entretien de la lignée Apc est décrit dans la Procédure 1), certaines nuisances peuvent apparaitre (sang dans les fécès, prolapsus). Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée par dislocation cervicale sous anesthésie 100 mg/kg kétamine + 10 mg/kg xylazine.
Devenir
Tous les animaux de la Procédure 1 seront gardés en vie et seront utilisés dans les Procédures 2 et 3. Tous les animaux seront mis à mort au terme des Procédures 2 & 3 afin de procéder aux différentes analyses
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal, surface de section transversale des fibres musculaires qui permet d'apprécier l'ampleur de la perte de masse musculaire, à l'aide de l'outil https://www.sealedenvelope.com/power/continuous- superiority. Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives par l’utilisation de tests ANOVA 2 facteurs (time x genotype) pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien être animal est une préocupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
L'essentiel des études expérimentales consacrées à la cachexie associée au cancer a été réalisé en utilisant des modèles souris de cancer. En travaillant sur le modèle souris nous pourront donc comparer nos données à celles de la littérature scientifique. Par ailleurs notre expertise scientifique et technique sur le modèle souris, nous permettra de réaliser ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l'age de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris Apc seront utilisées comme animaux contrôles.
Projet d erecherche préclinique sur l’utilisation de CAR T cells dans les traitements de lymphomes
- Recherche appliquée
- Cancers
7 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent en intraveineuse des cellules tumorales induisant un lymphome, puis des injections de cellules CAR-T, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires et un suivi par imagerie. Le porteur indique que le lymphome peut provoquer une perte de poids, une baisse d'activité et la mort quand il est agressif, les points limites déclenchant une mise à mort anticipée. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité du lymphome dans un "organisme entier", rendant l'étude in vivo "nécessaire".
Objectifs
Les cancers font partie des maladies les plus complexes à traiter. Parmi les différents types de cancer les lymphomes représentent 200 000 personnes en France avec 14 000 nouveaux cas par an. Ainsi, le lymphome est le sixième cancer en termes d’incidence et le 1er chez les 15-25 ans. Depuis quelques années, des thérapies cellulaires innovantes utilisant des lymphocytes T (ou cellules T), un des principaux acteurs de notre système immunitaire, ont émergé en oncologie. Les avancés scientifiques ont permis de modifier génétiquement ces cellules pour qu’elles expriment un récepteur spécifique (appelé CAR pour Chimeric Antigen Receptor) afin qu’elles ciblent et attaquent les cellules cancéreuses. Ce type de thérapie cellulaire (CAR-T) s’est avéré très efficace et potentiellement curatif pour les patients atteints de certains types de cancer. Malheureusement, on observe encore trop de patients qui présentent un échappement au traitement avec des CAR -T. Notre projet permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitement des lymphomes avec des CAR-T et de proposer de nouvelles stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de traiter 100% des patients atteints de lymphome et l’on observe de plus en plus d’échappement aux thérapies déjà existantes. Ces études permettront à la fois d’expliquer le mécanisme d’échappement des lymphomes à ces traitements mais aussi d’expliquer le mécanisme d’action des CAR-T. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus in vitro au préalable mais également avec ce qui est attendu des différents traitements observés lors des phases clinique chez l’homme. De plus, ces études permettront de tester de nouvelles thérapies plus innovantes à base de CAR-T et donc de proposer de nouveaux traitements plus efficaces aux patients atteints de lymphome.
Procédures
Les animaux recevront une injection de cellules tumorales en intraveineux et une ou plusieurs injections intraveineuses de thérapie cellulaire (CAR-T). Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par semaine afin d’avoir un suivi du nombre de CAR-T dans le sang. Le suivi du développement du lymphome implique également une injection intrapéritonéale de luciférase ainsi qu’une anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
L’injection en intra-veineux de cellules tumorales chez la souris va induire le développement d’un lymphome qui va se développer d’autant plus vite que la souris sera immunodéficiente. Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps une perte de poids, une diminution de l’activité et induire une mortalité en cas de lymphome agressif
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’un lymphome ou son échappement à une thérapie CAR-T dans un organisme entier. lCette complexité rend nécessaire l'utilisation d'étude in vivo en complément des études in vitro pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments.
Réduction
Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne seront testés, in vivo, que les meilleures CAR-T obtenues in vitro . Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisé dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). La bonne connaissance des cellules tumorales utilisées permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort selon des critères d’interruption prédéfinis. L’utilisation de l’imagerie permettra également d’inclure dans ces points limites un niveau de développement tumoral à partir duquel l’animal sera mis à mort éthiquement. Les injections intraveineuse et l’imagerie se feront sous anesthésie générale avec administration préalable d’analgésique. De plus, les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière avec administration d’analgésique en cas de besoin. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée de façon à éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction et maintien de 3-5%).
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit car elle permet d’avoir accès à des souches mutantes et/ou immunodéficiente et/ou génétiquement modifiée. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.
Domestication et programme de sélection artificielle chez le poisson zèbre (Danio rerio)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
12 648 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, dont 2 340 en gravité sévère. Ils subissent un marquage par aiguille sous sédation, des mesures de cortisol et d'agressivité par isolement, un test de résistance à un choc thermique poussé jusqu'à la perte d'équilibre et, pour 2 340 larves, un test de résistance virale suivi sur 72 heures. L'objectif est de concevoir un programme de sélection artificielle pour améliorer le "potentiel aquacole" de l'espèce sur plusieurs générations, soit une finalité de production. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" cette expérimentation portant sur l'"organisme entier".
Objectifs
L'objectif de ce projet est double. Il vise : (i) A suivre les conséquences d'un processus de domestication chez les poissons sur plusieurs générations (ii) A concevoir un programme de sélection artificielle multi-fonctions et de comparer son impact sur l'évolution du potentiel aquacole au fil des générations à celui des programmes de sélections artificielles traditionnellement appliqués en pisciculture (mono-fonction). Pour ce faire, il sera pris en compte des réponses portant sur la croissance, le comportement, le bien-être et la reproduction des poissons. Plus en détail, la méthode in vivo utilisée sera fondée sur l'étude de traits fonctionnels morphlogiques, physiologiques, comportementaux, moléculaires, génomiques et génétiques. Nos hypothèses de travail sont les suivantes : (i) a. En raison de la relaxation de la sélection naturelle et des pressions de sélection du nouvel environnement, nous émettons l'hypothèse que plusieurs changements apparaitrons dans la population de poissons zèbre sauvages au fil des générations, comme cela a été démontré chez d'autres espèces de vertébrés. (i) b. Puisque le syndrome de domestication semble être robuste entre les différents programmes de sélections (chez les mammifères et oiseaux), la deuxième hypothèse est que si ces changements sont dus à la domestication elle-même (et non pas au programme de sélection), les animaux devraient évoluer de manière similaire entre les populations qui subiront des programmes de sélections artificielles différents. Le syndrome de domestication est ici définit comme regroupant un ensemble de caractéristiques comportementales et physiologiques convergentes chez plusieurs espèces ayant subit des programmes de sélection différents. (ii) Nous émettons également l'hypothèse qu'un programme de sélection artificielle multi-fonctions peut conduire à une amélioration du potentiel aquacole, ainsi qu'à une plus grande robustesse de ce potentiel, par rapport à un programme de sélection mono-fonction. Nous définissons ici le potentiel aquacole comme étant la quantité mesurable d'expression de traits/fonctions souhaitables, favorable à la domestication et ultérieurement, à la production.
Bénéfices attendus
La domestication reste un processus difficile. Il échoue souvent (i) en raison de limitations zootechniques, de contraintes socio-économiques, d’erreurs de conception ou de caractéristiques intrinsèques des espèces/populations, (ii) conduit à un problème de bien-être animal, ou (iii) entraîne des productions peu durables avec un faible potentiel d’adaptation pour faire face aux changements dans les attentes humaines et aux changements globaux. Cela soulève la nécessité d’améliorer les approches de domestication pour façonner la production d’espèces de demain. Récemment, les programmes de domestication ont récolté les avantages des progrès de la génétique, de la génomique et de la physiologie pour concevoir des programmes de sélection artificielle (PSA). Ces PSA visent à modifier intentionnellement traits/fonctions biologiques des populations contrôlées par l’homme afin d’améliorer les performances des organismes d’élevage. La plupart des PSA se concentrent sur peu de fonctions biologiques particulières mais sans tenir compte de l’évolution d’autres au cours des générations domestiquées. Pourtant, une domestication réussie nécessite l’expression favorable de plusieurs traits impliqués dans diverses fonctions biologiques ainsi que le maintien du potentiel d’adaptation des populations domestiquées. De plus, la PSA monofonction peut entraîner la co-sélection d’expressions de traits délétères, ce qui peut condamner la production animale. L’élaboration de PSA qui tiennent compte de toutes les fonctions biologiques importantes (c.-à-d. un PSA multifonction) pourrait surmonter les pièges des PSA monofonction et améliorer la production. Cependant, le développement de PSA multifonctions est difficile car ils nécessitent (i) d’effectuer une évaluation intégrative de divers traits (du gène aux phénotypes de toutes les fonctions biologiques), (ii) de définir les expressions optimales recherchées des caractères qui peuvent varier en fonction des objectifs de domestication, et (iii) de parvenir à un consensus entre des résultats parfois discordants obtenus pour différentes fonctions. Pour favoriser une aquaculture plus efficace et durable. Notre projet vise à proposer une approche d’un PSA multifonction pour faciliter les futurs développements aquacoles et avoir compréhension de l’évolution de cette espèce sous différents processus de domestication.
Procédures
6336 individus seront soumis à des contrôles de croissance réguliers sous anesthésie (moins de 5 min/individu, répétés 7 fois à 20 jours d'intervalles). Parmis ces 6336 individus, 3696 seront soumis à une indentification par VIE sous sédation (introduction d'une aiguille, moins de 5 min/individu). Suite à cette identification, 2640 individus seront aléatoirement sélectionnés pour évaluer le niveau de cortisol (hormone impliquée lors d'un stress physique ou émotionnel) dans l'eau et seront par conséquent isolés (1h). Ils seront ensuite soumis à une évaluation des paramètres de reproduction impliquant une anesthésie et un massage des paroies abdominales pour évacuer le sperme (pour les mâles, 1 fois, moins de 2 min/individu) puis à un test d'aggressivité impliquant un isolement (18h d'acclimatation + 1h de test). Toujours parmis ces 6336 individus, suite aux contrôles de croissance, 1584 individus seront soumis à une évaluation du potentiel adaptatif (plusieurs semaines) puis à la même évaluation des paramètres de reproduction que décrits précédemment ; et 1056 individus seront soumis à un test de résistance à un choc thermique (1h). 2340 nouveaux individus seront soumis à un test de résistance virale impliquant une infection par balnéation des larves et un suivi des mortalités sur 72h.
Impact sur les animaux
La technique d’identification utilisée implique l’introduction d’une aiguille chez l’animal. Elle pourrait induire des nuisances comme une douleur ou des infections. Les tests de cortisol (hormone impliquée lors d'un stress physique ou émotionnel) dans l’eau et comportemental implique d’isoler les individus. Or le poisson zèbre est une espèce grégaire. Ces expérimentations peuvent donc induire un stress chez les individus. Nous nous attendons à ce que les tests de résistance thermique et de résistance virale est un impact très négatif sur les individus. En effet, l’objectif de ces tests est de connaitre la résistance maximale des individus. Cela entrainera donc un stress ainsi qu’une probable souffrance pour les individus.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort soit afin de limiter la douleur (test de résistance virale, resistance thermique) soit afin d'être utilisés pour des prélèvemens de tissus biologiques.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer cette expérimentation animale qui a pour but de mettre en évidence l’efficacité d’un programme de sélection artificielle et ses conséquences au niveau de l’organisme entier, sur plusieurs générations.
Réduction
La petite taille des Danio rerio ne nous permet pas de réaliser un nombre conséquent d’analyse sur un même individu. Le nombre d’animaux utilisé est le minimum nécessaire pour évaluer chacun des paramètres utiles pour répondre à notre objectif. De plus, nous avons réduit au minimum le nombre de famille afin de nous permettre la production des 5 générations nécessaire au projet sans consanguinité. En effet, nous effectuerons des croisements interfamiliaux, en croisant des reproducteurs sélectionnés entre les familles. La méthode de croisement est basée sur la "duplication" du nombre d'ancêtres pour la progéniture à chaque génération. Ainsi, chaque poisson à la F1, aura 2 ancêtres, à la F2, 4 ancêtres, et ainsi de suite jusqu'à la F5 où chaque poisson aura 32 ancêtres. Hormis la méthode de croisement basé sur la duplication du nombre d'ancêtre, aucune approche statistique n'a été réalisée.
Raffinement
Les procédures d’identification, contrôle de croissance et de collection du sperme peuvent engendrer un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau et/ou une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (identification). De ce fait, les animaux seront préalablement sédatés ou anesthésiés avant la manipulation. De plus, lors de l’identification, un analgésique sera utilisé en complément de la sédation. Le test de résistance virale peut induire un stress et/ou des infections et conduire à la mort de l’animal. De ce fait, ce test sera réalisé sur une courte période (72h) afin de limiter le stress et la douleur. De plus, les animaux ayant subi cette procédure seront immédiatement mis à mort à la fin de la manipulation. L’isolement provoqué par les tests de cortisol et le test comportemental peut entrainer un stress chez l’animal mais nécessite un animal éveillé, que l’on ne peut donc pas anesthésier. De ce fait, ce test sera réalisé sur une courte période (30 minutes pour le cortisol et 19h pour le test comportemental – 18h d’acclimatation + 60 min de test filmé) afin de limiter le stress et la douleur. Le test de résistance thermique, peut entrainer un stress chez l’animal mais nécessite un animal éveillé, que l’on ne peut donc pas anesthésier. Nous utiliserons donc la perte d’équilibre comme point limite pour retirer l’animal de l’expérimentation et le mettre à mort. De plus, nos structures expérimentales d’hébergement sont équipées d’un enrichissement intégré de l’environnement. Il s’agit d’un fond imprimé de gravier qui fournit une sensation de profondeur dans le réservoir. La conception est basée sur le fait démontré que le poisson zèbre à une préférence pour le visuel gravier dans le fond du réservoir. Pour chaque procédure, les points limites portent sur la surveillance du comportement des poissons et l'apparition d'éventuelles blessures au niveau cutané. De telles observations nous amènent à retirer l'animal de l'expérimentation et à le mettre à mort.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un poisson avec un cycle de vie court ce qui nous permettra d’obtenir rapidement plusieurs générations. De plus, c’est un poisson facile à élever et de nombreuses données sont disponible. Les animaux seront utilisés à tous les stades de développement, du stade embryon à l’âge adulte. Le projet visant à comprendre comment les animaux évoluent sous l’impact de la domestication, cela inclut d’étudier des paramètres liés à chaque stade développement. De plus, le projet visant à produire plusieurs générations, cela inclut de réaliser un cycle de vie complet de l’individu. Plus précisément, les contrôles de croissance débuteront au stade larvaire et se poursuivront jusqu'à l'âge adulte, le test de résistance virale se fera sur des larves âgées de 3 jours post-fécondation et l'ensemble des autres expérimentations se feront à l'âge adulte.
Utilisation de modèles d’hypertrophie bénigne de prostate pour l’étude de composés pharmacologiques
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une supplémentation hormonale quotidienne pendant une à douze semaines, avec parfois une castration, pour induire une hypertrophie de la prostate, puis subissent des mesures de pression artérielle, une cystométrie par cathéter implanté dans la vessie et une mesure de la fonction érectile par chirurgie du nerf caverneux réalisée sans réveil. Le projet, mené dans le cadre d'un partenariat avec une entreprise pharmaceutique, teste des composés contre cette pathologie masculine fréquente. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro pertinent n'existe et que l'interaction des mécanismes en jeu "nécessite un modèle animal".
Objectifs
L’hypertrophie bénigne de la prostate (HBP) est la forme de tumeur (bénigne) la plus fréquente chez l’homme. Des changements pathologiques de ce trouble peuvent être rencontrés chez quasiment la moitié des hommes âgés de 50 ans, et l’incidence augmente avec l’âge. L’HBP se caractérise par une augmentation de la taille de la prostate. Cette tumeur bénigne va ainsi exercer plus de pression sur l’urètre et la vessie et interférer avec l’écoulement normal de l’urine. L’HBP est une histopathologie caractérisée par une hyperplasie stromale et épithéliale et par un dysfonctionnement de la vessie. Bien que les causes de l’HBP soient encore peu déterminées, les symptômes peuvent être classifiés en deux types : irritatifs, du fait du dysfonctionnement de la vessie et obstructifs, au niveau de l’urètre et de la prostate. Ces derniers découlent à la fois d’une prolifération anormale de la prostate et de l’augmentation du tonus basal contractile du muscle lisse urétral et prostatique. Bien que les traitements pharmacologiques existants soient le plus souvent efficaces à court et moyen terme (alpha-bloquant, anticholinergique, inhibiteur de la 5-alpha réductase etc…), ils n’en restent pas moins symptomatiques et le traitement chirurgical reste inévitable à terme, accompagné d’effets secondaires souvent lourds (dysfonction érectile, infertilité masculine, dépression). Ainsi, les effets secondaires de ces différentes options de traitement continuent de poser des difficultés thérapeutiques et encouragent le développement de nouvelles thérapeutiques plus efficaces qui permettraient idéalement d’éviter le traitement chirurgical. En raison de l'étiologie inconnue de la pathologie, il est nécessaire de conduire une recherche visant tout d’abord à développer et optimiser un modèle animal reproduisant les signes histologiques et cliniques de cette pathologie, pour ensuite permettre la réalisation de tests précliniques sur ce modèle visant à inverser le phénotype pathologique induit.
Bénéfices attendus
L’HBP entraînant des symptômes du bas appareil urinaires (SBUA) est une pathologie définie par des symptômes et ainsi, difficile à appréhender hors d’une situation physiologique. La mise en place d’un modèle animal est donc indispensable pour pouvoir trouver des traitements sûrs et efficaces. Sachant que l’étiologie de l’HBP est encore mal connue, ce projet permettrait d’une part de mettre en évidence et d’optimiser un modèle animal qui mimerait, de manière pertinente, en même temps l’augmentation de taille de la prostate et les SBUA observés chez les patients. D’autre part, ce projet permettrait de sélectionner les nouveaux candidats médicaments pour le traitement de l’HBP. En effet, le projet pourra fournir une preuve de concept pour une nouvelle molécule ou un nouveau traitement, en donnant des indications sur son efficacité pour soigner l’HBP. Et selon le type de protocole suivi, des analyses supplémentaires peuvent aussi être réalisés, qui vont renseigner sur ses effets (bénéfique ou délétère) sur la pression artérielle et la fonction érectile.
Procédures
Les interventions que vont avoir les animaux sont : - Une administration sous-cutanée ou intrapéritonéale d’hormone une fois par jour, pendant 1 à 12 semaines, avec ou sans orchidectomie, pour induire le modèle d’HBP, concomitant ou précédant leur traitement. Et après l’induction du modèle ou de manière concomitante, une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute ; tandis que l’orchidectomie, si elle a lieu, dure environ 30 minutes. - Mesure de la pression artérielle de manière non invasive au niveau de la queue. Elle sera réalisée en début (2 mesures) et en fin de traitement (2 mesures), précédée d’entraînements (3 entraînements avant les 2 mesures). Chaque mesure ou entraînement dure entre 5 et 20 minutes. - Une cystométrie suite à l’implantation d’un cathéter par chirurgie au niveau de la vessie, est réalisée sur animal conscient, placé dans une cage à métabolisme. La cystométrie consiste à évaluer la fonction vésicale de l’animale par perfusion de sérum physiologique dans la vessie et un suivi de la pression intravésicale et des cycles urinaires. Cette mesure est réalisée une seule fois pour chaque animal, et les animaux sont placés dans la cage métabolique pendant une période maximale de 4 heures. - Mesure de la fonction érectile suite à une chirurgie permettant la stimulation du nerf caverneux et l’installation d’un cathéter au niveau du tissu érectile afin d’enregistrer l’augmentation de la pression intracaverneuse (signe de l’érection). Cette mesure est sans réveil, donc réalisée une fois par animal, et la mesure dure environ 2 heures incluant le temps de chirurgie. - Si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ses interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Impact sur les animaux
La supplémentation hormonale est un modèle largement utilisé chez les rongeurs dans la littérature pour étudier l’hypertrophie bénigne de la prostate. Selon l’expérience de notre laboratoire, les rats supplémentés en testostérone et/ou œstrogène (pendant 1-12 semaines) ne présentent pas des signes de douleur ni de comportement anormal durant le traitement. Une légère perte de poids peut être observée chez les rats pendant la semaine après la procédure d’orchidectomie, leur courbe de poids reprend normalement par la suite. Les procédures d’évaluation des différents symptômes, qui vont durer le temps de la mesure, sont soit indolore, soit réalisée de manière à diminuer la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal.
Devenir
Tous les animaux vont avoir une supplémentation hormonale permettant d’induire le modèle d’HBP, suivi d’un traitement par le composé à tester et des composés témoins. Ensuite, une mesure de la pression artérielle, cystométrie, et une mesure de la fonction érectile peuvent être réalisées. Ainsi, au vu des traitements réalisés sur les animaux, ils seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant l’étude de l’HBP associée aux SBUA, qui est donc une pathologie définie par des symptômes et ainsi, difficile à appréhender hors d’une situation physiologique. De plus, l’étiologie de l’HBP est encore mal connue, mais pourrait être la résultante de la dérégulation de plusieurs mécanismes physiologiques qui serait initiée par une dérégulation hormonale. Ainsi, l’interaction entre les différents mécanismes impliqués nécessite un modèle animal.
Réduction
Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. Ce calcul est basé sur la sensibilité du modèle, ainsi que sur les effets attendus lors d’un traitement par une molécule de référence. Ainsi, notre expérience au laboratoire a permis de définir ces paramètres, et donc d’estimer un nombre minimal de 12 animaux par groupe, afin d'avoir une puissance statistique satisfaisante pour conclure sur le potentiel efficacité et la sûreté des composés testés. Les tests statistiques utilisés pour une petite population sont le t-test non apparié pour les comparaisons 2 à 2, et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence. De même, quand le composé étudié nécessite en même temps l’analyse des effets sur la cystométrie, la pression artérielle et/ou la fonction érectile, ces paramètres seront évalués sur tous les animaux d’un groupe afin de limiter le nombre de groupes.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible: - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - La procédure d’orchidectomie se fait sous analgésie et anesthésie générale. - la méthode choisie pour l’évaluation de la pression artérielle (PA) est une méthode non-invasive. La mesure de la PA étant particulièrement sensible au stress et à la douleur, aucune douleur de l’animal n’intervient au cours de cette mesure. Cette méthode est basée sur la même technique sphygmomanométrique utilisée pour mesurer la PA chez l’homme. De plus, afin de limiter le stress potentiel des animaux lors de leur contention, les rats sont entraînés avant le début de la mesure de leur PA. - l’évaluation fonctionnelle de la vessie est un modèle qui a été développé pour être réalisé sur animal conscient. - - l’évaluation de la réponse érectile se fait sous analgésie et anesthésie générale et les animaux sont euthanasiés avant leur réveil. A noter que toutes les procédures expérimentales ne seront pas forcément appliquées aux animaux. Les procédures expérimentales appliquées à chaque groupe de rats seront attribuées en fonction de leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitant l’utilisation d’animaux tels que le chien ou le chimpanzé. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Pour l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Enfin, la littérature montre que les souches de rats choisis pour le projet (Wistar, WKY et SHR) sont plus susceptibles de développer une HBP après supplémentation hormonale. Les animaux seront utilisés adulte, à partir de 8 semaines d’âge. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.
Progeria : Evaluation d’un traitement par therapie génique dans un modèle murin de progéria
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
18 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation reproduisant la progéria, décrite par le porteur comme un "phénotype dommageable" avec vieillissement accéléré, anomalies squelettiques et mort prématurée vers seize semaines, et reçoivent une injection unique de thérapie génique dans la veine caudale avant un suivi du poids et de la survie. Les souris encore vivantes après vingt semaines sont euthanasiées. Le porteur affirme avoir besoin d'un "organisme entier" et présente sa lignée comme le "seul modèle mammifère" reproduisant fidèlement la maladie.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’une approche de thérapie génique, sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), qui récapitule le tableau clinique de la pathologie humaine. Cette maladie génétique extrêmement rare se déclare dès l’enfance et conduit à l’apparition de signes cliniques assimilables à un vieillissement prématuré et à une mortalité précoce, vers l’âge de 13,5 ans, des suites d’infarctus du myocarde ou d’accidents vasculaires. Il existe donc un fort besoin médical pour ces patients car à l’heure actuelle aucun traitement n’est disponible Nous souhaitons dans le cadre de ce projet évaluer une approche de thérapie génique en utlisant des vecteurs contenant un gène modifié, et produisant directement dans la cellule des molécules qui vont bloquer la chaine de production à l’origine de la maladie. Les vecteurs utlisés pour cette étude présentent la particularité d’être non pathogènes (réponse inflammatoire réduite) tout en conservant la faculté virale de pénétrer dans les cellules, et de rester actifs longtemps ; leur usage évite donc d’avoir à renouveler régulièrement les injections. Après administration des vecteurs contenant le gène modifié, nous suivrons notamment le poids et la survie ds animaux afin de compléter une étude réalisée par notre partenaire. Ces travaux vont nous permettre de développer des preuves de concept thérapeutiques précliniques permettant de passer à une phase d’essai clinique chez les patients. 18 souris seront utilisées pour cette étude.
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun traitement de la progeria et les enfants décèdent très jeunes d’une viessllement prémature. A court terme, ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace ; A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement de l’approche de thérapie génique visant à obtenir la preuve clinique de son efficacité chez l’Homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.
Procédures
Injections par la voie intraveineuse via la veine caudale (1 fois à l'age de 30 jours, et sur deux groupes de souris composés de 6 traité et 6 placebo), suivie de poids 2 fois par semaine de tous les groupes (6 souris groupe non-traité, 6 souris placebo et 6 souris traité)
Impact sur les animaux
Le phénotype du modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, il présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes pour la mutation, présentent un décrochage dans les courbes de poids, avec des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les males et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des 7 publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 117 jours, soit 16,5 semaines environ. Enfin, des anomalies squelettiques sont également à noter, comme une lordokyphose, ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris.
Devenir
Les procédures consistent au suivi du poids et de la survie des souris. Notre modèle de souris conduit à la mort prématurée des souris vers l’âge de 16-18 semaines. Les souris qui survivent après 20 semaines seront euthanasiées sans analyse post-mortem.
Remplacement
Cette étude a pour but d’évaluer un traitement par therapie génique de la maladie de progéria ou le vieillissement prématuré. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie. Notre modèle de souris mutantes est le seul modèle mammifère disponible à ce jour reproduisant fidèlement les anomalies observées chez les patients atteints de cette maladie. Elle permet donc de réaliser des essais pré-cliniques et valider notre approche en vue d’une mise en oeuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme.
Réduction
Cette étude est dans le but de compléter une étude réalisée auparavant par notre partenaire. Nous utiliserons des tests statistiques afin de définir le nombre minimum d'animaux à étudier pour mettre en évidence un bénéfice thérapeutique. Pour cela, 18 souris seront utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement enrichie des maisonnettes en carton ou de kraft. Nous évitons l’isolement mais aussi la surpopulation des animaux par cage. Les animaux seront observés tous les jours, ils seront stabulés avec des congénères d’une même portée. Une nourriture appropriée leur est fournie afin d’éviter toute malnutrition. L’apparition de signes d’inconfort ou de souffrance (perte d’appétit, prostration…) nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score de douleur qui a été mise en place.
Choix des espèces
Le génome de notre modèle de souris reproduit exactement la même séquence génomique humaine, il a fait l’objet d’une étude poussée et reproduit les anomalies phénotypiques et moléculaires du HGPS. C’est donc le modèle le plus pertinent pour évaluer l’approche de thérapie génique pour ce syndrome. Les animaux seront traités à partir de l'age de 4 semaines, avant que la pathologie ne se développe, jusqu'à l’atteinte du point limite.
Etude de l’effet – d’injections de la neurotoxine 6-hydroxydopamine (6OHDA) dans le cerveau de souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de la neurotoxine 6-OHDA dans les deux striatums du cerveau, avec des complications possibles que le porteur détaille, douleur, déshydratation, difficulté à avaler, hypothermie, externalisation du pénis et obstruction de l'urètre, et subissent trois tests comportementaux évaluant l'exploration, la motricité fine et l'anxiété. Les souris sont ensuite tuées pour prélever le système nerveux. Le porteur indique que l'objectif n'est pas thérapeutique mais de disposer de "matériel de référence" pour calibrer ses propres méthodes d'étude de la maladie de Parkinson.
Objectifs
L’un des objectifs de notre unité est d’étudier la maladie de Parkinson. Dans ce périmètre nous avons développé plusieurs méthodologies afin d’étudier les effets sur le système nerveux central et en particuliers les neurones dopaminergiques. Dans ce cadre, nous avons développé une méthode permettant d’estimer le nombre de neurones . Nous avons également récemment entrepris la mise en oeuvre de tests comportementaux et le dévelopement d’une méthode d’analyse de l’activité synaptique à l’aide d’un microscope adapté. L’objectif de ce projet est de disposer de matériel de référence (induction maitrisée de la perte dopaminergique) afin d’évaluer la sensibilité et la variabilité de nos méthodes. Cette étape d’évaluation pourrait nous permettre, à l’avenir, de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats significatifs.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront au laboratoire de disposer de données de référence pour les derniers outils d’étude de la maladie de Parkinson récemment développés au laboratoire tels que les tests comportementaux, l’approche stéréologique pour l’estimation des populations neuronales (en particulier les neurones dopaminergiques) et l’étude de l’activité des neurones. A terme l’analyse de ces données nous permettra d’évaluer le niveau de maitrise de nos méthodes et de réduire finement le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de données significatives dans notre laboratoire.
Procédures
Chaque animal de ce projet subira une injection stéréotaxique dans le striatum gauche et dans le striatum droit (durée de la procédure : entre 15 et 30 minutes). La moitié des animaux recevra 1 µL de chlorhydrate de 6-OHDA . L’autre moitié recevra de la même façon la substance contrôle. Ce geste opératoire nécéssite également trois injections Sous-Cutanée : une de buprénorphine, une de bupivacaine, et une de solution glucosée. Au cours des 72 heures suivant l’opération des injections Sous-Cutanée d’analgésique seront réalisées en début et en fin de journée si besoin. Les souris seront soumises à trois tests comportementaux : une fois avant la chirurgie et 3 semaines après (avant leur mise à mort). Les trois tests permettent d'observer le comportement exploratoire (15 minutes/animal), la motricité fine (5 minutes/animal) et l'anxiété (5 minutes/animal). Les tests sont réalisés qu’une seule fois, il n’y a pas de répétition lors d’une même session.
Impact sur les animaux
Les souris qui subissent une injection intracérébrale de 6-OHDA peuvent souffrir de diverses complications postopératoires. Les principaux effets indésirables sont la douleur post-opératoire, la déshydratationune difficulté pour avaler, l’hypothermie, une externalisation du pénis et l’obstruction de l’urètre. Un traitement analgésique de 72h pour le traitement de la douleur post-opératoire sera appliqué (injection sous-cutanée de buprénorphine en début et fin de journée), le maitien en cage chauffées à 27°C afin d’éviter l’hypothermie est appliqué pendant une semaine. L’aphagie et la déshydratation peuvent survenir dans les deux semaines suivant la chirurgie. Concernant l’externalisation du pénis, les délais de traitement préconisés sont d’environ 1 semaine, la détection et la lubrification précoces permettent d’accélerer la rémission. La réalisation des tests comportementaux peut engendrer un stress des animaux lié au changement d'environement et à une manipulation plus fréquente. La probabilité d'apparition de ces effets dans cette procédure est faible d'une part grâce à l'hébergement des souris en éclairage inversé qui permet de solliciter les animaux pendant leur phase d'éveil et d'autre part compte tenu de la fréquence faible (2 fois en 3 semaines) des tests comportementaux.
Devenir
L’objectif du projet étant de disposer du système nerveux central des animaux le responsable du projet ne peut pas envisager de garder tout ou partie des animaux en vie.
Remplacement
Une partie de ce projet consiste en l’étude du comportement des animaux afin d’identifier des signes précoces de l’apparition de la maladie de Parkinson qui pourront nous permettre dans certains cas d’éviter d’atteindre des stades cliniques plus dommageables pour les animaux. Les études comportementales peuvent difficilement être réalisées in silico. De plus, l’approche permettant d’estimer la perte en neurones dopaminergiques ne peut être réalisée que dans un système biologique complet. L’objet de ce projet est la description phénotypique d’un modèle après exposition.
Réduction
Ce projet comporte 2 groupes d’animaux : un groupe témoin et le groupe expérimental subissant l’injection de la neurotoxine 6-OHDA. Pour les estimations de population de neurones par stéréologie, les études précédemment publiées utilisent entre 5 et 8 animaux par groupe et par répétition. Nous avons décidé que les données obtenues à partir de six individus par groupe et par répétition nous permettrait d’obtenir des résultats significatifs. Le taux de mortalité pour cette procédure dans le cas de l’application du protocole renforcé est de 5.07%. Cette procédure étant nouvelle dans notre laboratoire nous estimons prudent de considérer un taux de mortalité plus élevé. Dans ce contexte, pour s’assurer que six individus puissent donner lieu à l’analyse des données nous constituerons des groupes de 7 animaux. La procédure sera répétée deux fois en tout pour chaque groupe si besoin. Nous utiliserons un total de 28 animaux : 2 fois 7 animaux témoins et 2 fois 7 animaux traités au 6-OHDA. Le fait d’organiser l’étude des groupes en deux répétitions pourra nous permettre au besoin d’ajuster les conditions de suivi et de traitement en fonction des souffrances évaluées sur les souris des premiers groupes. Si le nombre d’individus analysés lors du premier essai (7 témoins et 7 lésés) est suffisant, la répétition ne sera pas nécessaire.
Raffinement
Pour notre projet, nous avons décidé d’appliquer un protocole de suivi post-opératoire renforcé permettant de limiter le taux de mortalité à 5.07%. D’un point de vue organisationnel, les injections seront réalisées en début de semaine afin de pouvoir appliquer aisement les conditions de suivi du protocole renforcé. L’environnement sera également enrichi avec notamment la mise à disposition de carrés de coton manipulables qui permet aux animaux de se fabriquer un nid ce qui aura un effet bénéfique sur le maintient de leur température corporelle. La grille de suivi clinique utilisée est spécifiquement adaptée à cette procédure et aux complications potentiellement rencontrées. Le suivi clinique du matin consistera notamment en une palpation corporelle : pli de peau pour la déshydratation et l’observation de la zone uro-génitale : externalisation du pénis et gonflement de la vessie.
Choix des espèces
La lignée de souris C57Bl /6 est fréquemment utilisée dans les modèles d’études expérimentales portant sur la maladie de Parkinson, nous-même avons déjà accumulé un nombre conséquent de données à partir de cette lignée. Les animaux utilisés dans ce projet seront de jeunes souris sevrées âgées de 6 à 8 semaines. A ce stade de développement la population de neurones dopaminergiques est mature donc stable et homogène, ce qui est un point important pour la calibration de notre méthode d’estimation.
Evaluation du potentiel effet perturbateur endocrinien de substances et d’effluents sur des poissons sexuellement matures
- Protection de l’environnement
Autres poissons : 8320
11 880 poissons, poissons zèbres et autres espèces, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils sont maintenus vingt et un jours dans une eau contenant des substances chimiques ou des effluents, avec des effets que le porteur décrit comme irréversibles, changement de sexe, baisse de la fécondité et modification du comportement. Les poissons exposés sont tués à la fin de l'essai, ceux des groupes témoins pouvant être réutilisés. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'absence de test alternatif validé par l'OCDE et par la conformité réglementaire de son activité.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer l’impact des substances chimiques sur le système endocrinien des groupes de poisson exposés, composés de mâles et de femelles sexuellement mâtures, sur une durée limitée de leur cycle biologique (21 jours).
Bénéfices attendus
Le projet visant à évaluer l’effet néfaste des substances et effluents testés sur la santé des organismes aquatiques, il participe activement à la protection et la préservation de l’environnement.
Procédures
Pas de prélèvements prévus sur animaux vigiles. L'exposition se fait via le milieu d'essai, les animaux baignants dans des concentrations en substance maintenues constantes durant 21 jours tout au long des procédures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont les suivants : - Changement de sexe des organismes exposés (par exemple : les femelles peuvent développer des caractères sexuels masculins, les mâles peuvent produire de la vitéllogénine,…) ; - Diminution du nombre d’œufs pondu par la femelle et/ou diminution de la qualité du sperme chez le mâle ; - Diminution du taux de fécondité ; - Changement du comportement pouvant impacter l’ensemble des activités métaboliques des poissons exposés (par exemple : diminution de l’appétit, aggresivité,…) ; L’ensemble de ces nuisances seraient irréverssibles, même si les poissons ne sont plus exposés.
Devenir
Les poissons issus du contrôle et du contrôle solvant pourront être réutilisés. Les poissons exposés à des substances chimiques seront mis à mort à la fin de la procédure. Lorsque des prélèvements terminaux sont réalisés sur les organismes, tous les organismes sont mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives non animales comprennent : les méthodes in sillico (références croisées, modèle mathématique prédictif tel que le modèle « Quantitative Structure-Activity Relationship ») ; les méthodes in vitro (comprenant les tests sur lignées cellulaires ou sur organoïdes) ; et les recherches bibliographiques (partage de données entre industriels, Fiches de Données de Sécurité). Malheureusement les méthodes ci-dessus ne peuvent être appliquées pour plusieurs raisons : Premièrement, l’insuffisance de données disponibles pour les molécules testées. Les méthodes in sillico ont une forte dépendance aux bases de données disponibles concernant la substance d’essai (notamment aux fiches de données de sécurité). Néanmoins dans le cadre de notre activité, ces données sont absentes ou insuffisantes pour permettre d’établir des modèles robustes. De plus certains processus, comme les effets sur le comportement ou les effets à long termes, sont difficiles à paramétrer dans ces modèles. Deuxièmement, le manque de concordance entre les lignées cellulaires seules et les organismes complets. Les méthodes in vitro ne peuvent prendre en compte l’ensemble des interactions complexes tissus-organes ce qui empêche de connaitre l’effet global d’une molécule sur un organisme. Troisièmement : les limites expérimentales. Dans le cas d’utilisation de culture cellulaire, le milieu de culture peut en lui-même constituer un biais. En effet, il peut potentiellement interagir avec les xénobiotiques et empêcher, ou aggraver, leur toxicité ce qui ne permet pas de statuer sur son danger réel en cas de rejet dans l’environnement. Dernièrement, la validité réglementaire des méthodes alternatives. La mise sur le marché européen des produits de consommations s’appuie sur des règlements adoptés au sein des pays membres de l’Union Européenne. Malheureusement à ce jour, aucun test alternatif n’a été standardisé et intégré aux normes de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economique) concernant les perturbateurs endocriniens. L’activité de l’établissement s’appuyant sur les normes de l’OCDE, et les Bonnes Pratiques de Laboratoires, l’utilisation de méthodes alternatives non standardisés peut conduire à une invalidité des études auprès des instances réglementaires. Par conséquent, pour les raisons citées, il n’est pas encore possible de remplacer l’expérimentation animale au sein de notre établissement.
Réduction
Comme cité plus haut, l’établissement utilisateur suit les normes de l’OCDE dans le cadre de son activité. Ces normes intègrent les règles des 3R et définissent un nombre d’organisme le plus réduit possible tout en garantissant la robustesse des tests statistiques. Concernant la partie statistique, celle-ci est détaillée dans deux documents : 1) la norme relatif au projet (par exemple, pour le présent projet, il s’agit de l’annexe 8 de la norme OCDE 229 montré en Figure 1), et 2) le guide « Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OCDE Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54 ». De plus, avant de démarrer l’essai préliminaire, une veille bibliographique est réalisée. Si cette veille permet de déterminer la Concentration Maximale Tolérée, et donc la gamme de concentration de l’essai définitif, alors l’essai préliminaire n’est pas réalisé. Dans le cas contraire, les organismes témoins de l’essai préliminaire peuvent être réutilisés dans l’essai définitif.
Raffinement
Les mesures visant à réduire les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure sont les suivantes : 1) Les organismes sont acclimatés pendant deux semaines avant le début de la procédure afin de réduire le stress lié au changement de conditions de maintien (passage des conditions d’élevage aux conditions expérimentales) ; 2) Les conditions environnementales (température, luminosité, paramètres physico-chimiques de l’eau) sont réglées de manière optimales. Elles sont strictement maintenues et sont contrôlées régulièrement afin d’éviter toutes variations environnementales pouvant impacter le bien-être des organismes ; 3) Une ronde quotidienne est mise en place et permet d’observer quotidiennement les organismes afin d’évaluer leur état de santé ; 4) Une feuille de points limites a été établie afin de détecter le plus précocement possible d’éventuels signes de souffrance. Si l’organisme dépasse un certain seuil, ce dernier est retiré du test et mis à mort .
Choix des espèces
Danio rerio, Oryzias latipes et Pimephales promelas sont des espèces recommandées par l’OCDE. En effet, elles sont reconnues comme étant des espèces modèles en biologie, c’est-à-dire qu’elles possèdent des qualités importantes pour la recherche dont : 1) une biologie bien connue (dimorphisme sexuel bien documenté, génétique maîtrisée) ; 2) elles sont faciles à maintenir en élevage et à faire se reproduire (descendance nombreuse, développement rapide) ; 3) elles sont économiquement accessibles et faciles à manipuler en expérimentation (petite taille) ; 4) elles sont robustes (résistance à la consanguinité, aux maladies et aux stress environmentaux) ; et 5) les résultats expérimentaux obtenus avec ces espèces sont transposables à d’autres poissons d’eau douce. L’ensemble de ces critères montre que ces espèces sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisant compte tenu de l’activité de l’établissement utilisateur. Des poissons adultes, sexuellement mâtures et identifiables doivent être utilisés pour la procédure. En effet la procédure vise a étudier la reproduction et le développement de caractères sexuels secondaires.
Rôle des cellules immunitaires des méninges dans le développement et la physiopathologie du Système Nerveux Central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
11 232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, une partie sous anesthésie sans réveil. Adultes et nouveau-nés reçoivent des injections sous-cutanées, intra-péritonéales ou intracérébrales de vecteurs viraux, certains souriceaux subissant une imagerie sous anesthésie dont ils ne se réveillent pas, pour étudier le rôle des cellules immunitaires des méninges dans le développement du cerveau. Le porteur mentionne des études comportementales vers trente jours sans en préciser la nature. Il affirme qu'on "ne peut pas se passer" du modèle animal, tout en évoquant des cultures de neurosphères qui pourraient réduire le nombre de souris.
Objectifs
La surface du système nerveux central (SNC) est protégée par des membranes : les méninges. La découverte récente de la diversité des populations immunes y résidant et leur capacité à interagir avec le cerveau (influence sur le comportement, migraine, méningites, sclérose en plaque, …) ouvre de nouvelles perspectives en termes de recherche fondamentale et thérapeutique. Les cellules immunitaires les plus représentées dans les méninges sont les macrophages. D’autre part les méninges pénètrent profondément dans le cerveau entre les sous structures majeures du cerveau dont l’hippocampe, le siège de la neurogénèse. Dans ce contexte, mon projet a plusieurs objectifs : -1 : étude de l’implication des Macrophages Méningés (MM) et autres cellules immunitaires méningées au cours de la neurogénèse cérébrale physiologique- 2 : étude de leur implication dans la coordination de la croissance cerveau/crâne (rôle d’interface très important) -3 : étude de leur implication dans les troubles cognitifs postnataux dus à une inflammation au cours du développement cérébral (correspondante au troisième trimestre de gestation chez l’homme). Notre première stratégie sera de supprimer les macrophages méningés (MM) : soit par injection sous cutanée locale dde drogue dans des souris de type sauvage (déplétion chimique) ; soit par une approche génétique utilisant différents modèles de souris transgéniques. La seconde stratégie sera d’inactiver localement les gènes trophiques exprimés spécifiquement par les macrophages. Ces deux stratégies seront réalisées d’une part chez des souris adultes stimulées par activité physique, et d’autre part à des stades développementaux clés dans la maturation du système nerveux central. Nous évaluerons les conséquences de l’absence ou du dysfonctionnement des macrophages sur la neurogenèse cérébrale et le comportement.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules immunitaires des méninges interagissent avec le développement du cerveau. Du fait de la complexité des interactions cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport des cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un modèle animal, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre la réponse immune du système nerveux central (SNC) dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro. Les retombées de ces recherches au niveau fondamental mais aussi appliqué (découverte de thérapies ciblant les maladies inflammatoires et neurodégénératives) pour l’Homme constituent une justification éthique importante pour faire valoir notre projet impliquant des expériences sur animaux in vivo. Concrètement, nous espérons que ce projet nous apportera les bénéfices suivants : - A court/moyen terme, une meilleure compréhension du rôle physiologique des macrophages méningés (MM) dans 1) le neurodéveloppement, 2) la formation biomécanique du crâne et des méninges, 3) le comportement. - A moyen/long terme : permettre l’identification de candidats exprimés/sécrétés par les macrophages méningés (MM) impliqués dans la neurogénèse afin de pouvoir développer des stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des MM dans les troubles neurodéveloppementaux ou dans des maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous cutanées, intrapéritonéales, de molécules non toxiques à des volumes et des doses en accord avec l'âge et le poids des souris. Une minorité d’animaux seront soumis à des injection intracérébrales. Chez les adultes de 6 à 8 semaines : i) Injection sous cutanée sous la peau du crâne (acte de 30s sur animal vigile) d’un composé non toxique permettant de dépléter uniquement les macrophages des méninges tous les 2 jours pendant 15 jours soit 7 injections chez les animaux de type sauvage, ou 2 injections à 24 h d’intervalle juste avant la fin de l’expérience chez les animaux transgéniques. ii ) Injection unique intra- péritonéale (acte de 30s sur animal vigile) d’un composé non toxique permettant de tracer la formation des nouveaux neurones. iii) Injection intracérébrale de vecteurs viraux (virus inactivé transporteur de molécules) chez certains animaux de type sauvage : injection unique avec analgésie préventive sous anesthésie générale (durée 1h). iiii) prélèvement sanguin unique au coin de l’œil : sous anesthésie générale gazeuse en un geste de 30s juste avant la mise à mort de l’animal. Chez les souriceaux 0 à 10 jours : i) Injection sous la peau de la nuque (acte de 30s sur animal vigile) 3 injections maximum (une injection tous les 2 jours) chez les animaux de type sauvage et 2 injections chez les animaux transgéniques) dans le cas d’un composé non toxique permettant de dépléter uniquement les macrophages des méninges. 2 injections à 8 jours d’intervalle dans le cas de l’injection d’un marqueur de calcification. ii) Injections intra- péritonéales (acte de 30s sur animal vigile) : une injection unique dans le cas d’un composé non toxique permettant de tracer la formation des nouveaux neurones, 2 injections à 24h d’intervalle dans le cas d’un composé activant le système transgénique (uniquement pour certains modèles), une injection unique de toxine bactérienne ou alternativement 2 injections par jour à 6 h d’intervalle pendant 5 jours soit 10 injections totales d’une cytokine pour les animaux rentrant dans l’étude sur l’inflammation périnatale. iiii) Injection intracérébrale de vecteurs viraux (virus inactivé transporteur de molécules) chez certains animaux de type sauvage : injection unique avec analgésie préventive sous anesthésie générale (durée 20mn). V) Imagerie intra-vitale dans une procédure : pendant 1h sous anesthésie générale sur des souriceaux de 15 jours qui ne seront pas réveillés.
Impact sur les animaux
Les différents effets indésirables pouvant intervenir sont : une douleur au site d’injection en particulier pour les injections sous cutanées sous la peau du crâne ou sous la peau de la nuque, une mauvaise réaction à la molécule injectée ou un impact sur la croissance, du stress en particulier au moment des études comportementales à 30 jours, du stress pour la mère et pour les souriceaux, de la douleur au réveil lors des injections intracérébrales. Un contrôle quotidien de l’état de santé des souris, avec une grille de score pour chaque procédure permettra la détection d’anomalies. Si nous détectons une douleur, souffrance ou détresse, que nous n’arrivons pas à réduire par analgésie, l’animal sera euthanasié immédiatement. Dans le cas particulier des souriceaux, nous vérifierons également le comportement maternel, l’allaitement et la croissance des souriceaux. A la fin de chaque procédure les souris seront euthanasiées selon les méthodes réglementaires pour prélever méninges et cerveau.
Devenir
Chaque procédure nécessite l'euthanasie de tous les animaux selon les méthodes réglementaires pour prélever méninges et cerveau afin de les analyser.
Remplacement
L’objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules immunitaires des méninges interagissent avec le développement du cerveau. Du fait de la complexité des interactions cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport de cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un animal modèle, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre la réponse immune du SNC dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro. Les retombées de ces recherches au niveau fondamental mais aussi appliqué (découverte de thérapies ciblant les maladies inflammatoires et neurodégénératives) pour l’Homme constituent une justification éthique importante pour faire valoir notre projet impliquant des expériences sur animaux in vivo. Puisque nous ne pouvons pas nous affranchir du modèle animal, nous réduirons au maximum le nombre d’animaux utilisés en suivant la règle des 3R. Certains axes du projet seront développés en utilisant en parallèle une approche de culture de neurosphères afin d’évaluer l’effet sur la neurogenèse de certains facteurs protéiques sécrétés par les macrophages présélectionnés par notre étude in vivo. Ceci nous permettra, nous l’espérons, de réduire encore le nombre de souris et les remplacer par un modèle in vitro.
Réduction
Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Nous utiliserons des tests statistiques adéquats pour planifier nos expériences en fonction de la littérature et des données internes de l’équipe. Nous utiliserons plusieurs tissus du même animal (méninges, cerveau, crâne et sang). Les données quantitatives générées seront analysées statistiquement par le test de t de Student. Pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, le nombre d’individus nécessaire est de 20 animaux par groupe dans chaque procédure et 40 animaux par groupe pour les études comportementales. Nous utiliserons donc 11232 souris pour l’ensemble de ce projet sur cinq ans. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les études comportementales seront réalisées avant l'euthanasie de l'animal et le prélèvement des structures cérébrales. Les souriceaux utilisés pour l’étude de la neurogénèse (déplétion génique ou chimique des macrophages et mastocytes des méninges) se verront prélever les méninges et le crâne dans le cadre de l’étude sur la formation du crâne. Les souris proviendront d’établissements éleveurs, fournisseurs localisés et de collaborateurs.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, concues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. Les conditions de l’animalerie sont contrôlées (température, hygrométrie, photopériode). Les cages de 530cm2 seront utilisées pour limiter le stress des animaux (100cm2 de surface par animal au minimum, dômes protecteurs et matériel pour la confection de nids). Des précautions supplémentaires seront prises sur les souriceaux : après manipulation l’utilisateur se frottera les mains avec la sciure en provenance de la cage de la mère, ce qui limitera les dépôts d’odeur et favorisera la réintégration au sein du nid. Les souriceaux seront réchauffés grâce à une lampe à infra-rouge, avant d’être replacés. Les injections seront réalisées par des personnes formées à la manipulation des nouveaux nés avec du matériel adapté aux nouveaux nés. L’état de santé des animaux sera évalué quotidiennement selon 5 grands critères : 1-apparence globale (apparence physique et grimace), 2- Respiration et oxygénation (fréquence respiratoire et/ou coloration des extrémités), 3- évolution pondérale individuelle 4 – comportement (provoqué ou non) et continuité de l'accouplement, 5- autres observations (saignement ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté). Une grille de score spécifique à l'âge avec évaluation de la douleur sera complétée. Les points limites nécessitant l’observation accrue, soulagement de l’animal (buprénorphine sous cutanée 0,1mg/kg qui sera répétée toutes les 12 heures) ou l'arrêt de la procédure avec euthanasie seront détaillés dans chaque procédure. Ce sont : poils hirsutes, dos arrondi, fréquence respiratoire augmentée et rythme instable, pâleur ou cyanose, perte de poids individuelle >20%, comportement anormal, hypo-mobilité, isolement, défaut d’alimentation ou d’hydratation, diarrhées, saignements, et en particulier pour les souriceaux, abandon par la mère, décoloration.
Choix des espèces
De nombreux modèles physiopathologiques étant partagés entre l’homme et la souris, nous utiliserons des souches de souris consanguines ainsi que des lignées génétiquement modifiées. De plus, le vaste développement de modèles transgéniques (pour cibler et visualiser des populations cellulaires précises) et l’utilisation d’une grande variété de drogues déjà testées chez la souris permet de tester plus rapidement et plus efficacement nos hypothèses. Enfin, nos modèles d'étude sont fréquemment utilisés chez la souris et leur physiopathologie est donc bien décrite. Pour toutes ces raisons, le modèle murin représente le modèle le plus prometteur pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines (J42 à J56) mâles et femelles afin d’évaluer l’impact des macrophages méningés sur la neurogénèse adulte avec ou sans activité physique. Nous utiliserons également des souriceaux à des âges clés du développement neuronal. Ainsi pour les études de neurogenèse et de croissance cerveau-méninges- crâne, les gestes techniques seront réalisés entre J0 et J9 avec analyse à J3 ou J7 ou J10 en fonction des questions posées. Pour les études cognitives, les gestes techniques seront réalisés de J1 à J5 (correspondant au 3ème trimestre de gestation chez l'homme) avec analyse à J8 ou J30.
Création de modèles de cathétérisation vasculaire et non vasculaire chez le rongeur destiné à des études toxicologiques, pharmacodynamiques ou pharmacocinétiques
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 12000
15 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale pour poser à demeure un cathéter dans un vaisseau, un organe ou le cerveau, puis peut recevoir jusqu'à quatre prélèvements sanguins ou gavages par jour, avec un hébergement isolé jusqu'à sept jours. L'établissement décrit une activité de fourniture de rongeurs cathétérisés "prêts à l'emploi", les animaux étant ensuite expédiés vivants aux laboratoires ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Il justifie l'élevage d'animaux "surnuméraires" par les taux d'échec chirurgical et conclut que la complexité des mécanismes exclut un modèle in vitro.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) de cathéters dans des vaisseaux, des organes ou le cerveau permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit le prélèvement de fluides biologiques (sang, bile, liquide cérébro spinal)
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles cathétérisés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques grâce au prélèvement de fluides biologiques comme le sang, la bile ou le liquide cérébro spinal chez l’animal tout en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des injections ou des prélèvements de manière répétée à différents sites d’injection ou de prélèvement. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (devenir d’un médicament dans le corps, toxicité d’un médicament, maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, ...) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel cathétérisé. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins ou à des gavages (maximum 4 prélèvements sanguins/gavages par jour). Les actes de prélèvements, de gavages et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 7 jours. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place du cathéter suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel cathétérisé. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles cathétérisés a pour objectif de mettre à disposition des modèles prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou leurs interactions face à une substance, de comprendre la vie d’une substance à l’intérieur d’un organisme ou sa toxicité, ce qui entraine l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les cathétérisations permettent le suivi de paramètres biologiques ou encore l’administration de substances répétées ou en continu en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des prélèvements ou des injections répétés à différents sites. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation (en fonction du stress observé de l’animal à réception, par exemple). Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel cathétérisé, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Étude du vieillissement précoce dans un modèle de lésions cérébrales associées à la prématurité chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
950 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et quelques-unes transférées vers un autre projet, dont 290 dans des procédures classées sévères. Nouveau-nées, elles reçoivent des injections d'une substance pro-inflammatoire deux fois par jour pendant cinq jours, puis selon les groupes une chirurgie du crâne, une perfusion intracardiaque ou l'implantation d'électrodes suivie d'une crise d'épilepsie provoquée, pour étudier un vieillissement cérébral précoce lié à la prématurité. Le porteur indique une surmortalité inférieure à 10 % pendant les injections et des hématomes douloureux, les crises d'épilepsie étant volontairement déclenchées lors des enregistrements. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit les interactions du système nerveux et que le recours à la souris est "nécessaire".
Objectifs
La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons de très faible poids de naissance qui survivent au delà de l’enfance est en hausse. Cependant, le cerveau de ces prématurés reste extrêmement vulnérable et peut ainsi présenter des lésions. L’inflammation périnatale que subissent dans 20 à 40% des cas les enfants prématurés et la grande vulnérabilité des cellules cérébrales en développement à ce stress inflammatoire est à l’origine de l’apparition de la plupart de ces lésions. Elles induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte qui sont regroupées sous le terme d' "Encéphalopathie du Prématuré". Certaines cellules cérébrales, appelées cellules gliales, sont les relais majeurs des modifications environnementales dans le cerveau, dont les réponses inflammatoires. Ces cellules résidentes du système nerveux central, analysent de manière continue leur environnement et participent à la stabilisation de ce dernier. On sait aujourd’hui que les mécanismes qui permettent la maturation cérébrale sont les mêmes que ceux qui sont perturbés au cours du vieillissement. Nous cherchons donc à comprendre l’impact de l’inflammation périnatale sur le vieillissement en émettant l'hypothèse que celle-ci peut être à l'origine d'un vieillissement prématuré.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait la caractérisation des conséquences à long terme des lésions cérébrales du prématuré et ainsi la mise en place d'outils de prévention chez les individus concernés. Par ailleurs, si nos hypothèses sont avérées, nous aboutirions à la mise en place d'un modèle de neurodégénérescence chez des souris issues d'un brassage génétique par opposition aux modèles habituellement consanguins, présentant des modifications génétiques ciblées et à 7 mois de vie.
Procédures
Les souriceaux recevront l’injection d’une substance pro inflammatoire 2 fois/ jour pendant 5 jours (animal vigile, moins de 30s par injection). Après ces injections, un premier groupe de souris subira une procédure chirurgicale sous anesthésie générale pour sectionner une partie de la boite crânienne et réaliser ensuite une échographie doppler pour mesurer le débit sanguin (l'ensemble chirurgie et échographie durera une heure maximum). Une perfusion intra-cardiaque sera réalisée sur un 2e groupe à différents stades et sous anesthésie (3 min en moyenne de perfusion). Au sein de ce groupe, certains animaux auront subi un prélèvement sanguin 2 jours avant l'étape de perfusion (sous anesthésie, durée de moins d'1 minute). Une étude comportementale dans un espace défini sera réalisée sur un 3e groupe à différents temps et d’une durée variable en présence d’autres souris ou non. Et enfin sur le 4e groupe, une intervention chirurgicale sous anesthésie d’une durée de 15 à 25 mn, sera réalisée pour implanter des électrodes au niveau du crâne. Le lendemain de l’intervention il sera injecté un produit provoquant une crise d’épilepsie (trouble neurologique provoquant des convulsions) et il sera ensuite procédé à un électroencéphalogramme pendant une heure.
Impact sur les animaux
Les effets des injections de la substance induisant une inflammation sur les souris sont connus et modérés. On rapporte ainsi une surmortalité estimée à moins de 10% lors de la période d'injection ainsi qu'un retard de croissance chez les animaux recevant de la substance pro-inflammatoire. Cette surmortalité est principalement dûe à un éventuel rejet du souriceau par la mère ainsi que dans quelques cas par l'invasivité même de l'injection pouvant occasionner l'apparition d'un hématome douloureux pour l'animal. Ces deux événements indésirables constituent des points limites entrainant l'euthanasie de l'animal. Aucune nuisance particulière n'est attendue au cours du vieillissement des animaux ni n'ont été observé précédemment lors du vieillissement d'animaux de ce modèle. Ainsi, passé la periode d'injection de 5 jours, les effets indésirables classiques : cyanose, perte de poids, troubles respiratoires ne sont pas attendus de même que des crises d'épilepsie spontanées (elles sont induites lors de l'enregistrement à l'encéphalogramme) et constituent donc des points limites. L'étape d'imagerie cérébrale se déroule entièrement sous anesthésie et analgésie. Pendant cette période,aucun effet indésirable particulier n'a été mis en évidence et l'animal est euthanasié dès la fin de l'acquisition, avant réveil. Aucun effet indésirable n'est dès lors attendu lors de cette procédure. Lors de la procédure d'électroencéphalogramme, les animaux subissent la chirurgie d'implantation des électrodes 24h avant l'acquisition des données pendant laquelle ils sont éveillés. Ainsi, pendant cette période de 24h + temps d'analyse, ceux-ci peuvent montrer des signes de gène du fait du dispositif d'électrodes et sont donc étroitement surveillés. L'arrachage du dispositif ou la présence de saignements post-opératoires sont des évènements indésirables rares mais possibles entrainant l'euthanasie de l'animal. Aucune surmortalité du fait du dispositif n'a été observée du fait de cette chirurgie et l'animal est euthanasié dès la fin de l'acquisition. L'acquisition se fait à la suite de l'injection d'une molécule induisant des crises d'épilepsie. Leur survenue est donc attendue.
Devenir
L'euthanasie des animaux en fin des procédures d'échographie cérébrale fonctionnelle et d'électroencéphalogramme répond à une nécessitée d'ordre éthique puisque celles-ci imposent une chirurgie au niveau du crane de l'animal. Par ailleurs, à la fin des autres procédures, les animaux seront euthanasiés et les cerveaux prélevés pour analyses.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication de la neuroinflammation dans le développement d'un vieillissement précoce. Cela suppose des interactions complexes entre types cellulaires bien distincts du système nerveux central : les cellules gliales responsables de l'activité immunitaire et de fonctions de nutrition des neurones d'une part, et les neurones d'autre part. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions complexes in vitro ou dans un système de cellules en culture, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal présentant un système nerveux central fonctionnel dont la structure est proche de celle de l'homme pour reproduire ces interactions complexes.
Réduction
Le nombre d'animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d'étude. Ce nombre minimum nous permettra d'être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. L'analyse statistique de nos données peut nécessiter un nombre d'animaux différents selon l'hétérogénéité des résultats attendus de chaque procédure. Pour autant, les tests étant organisés en plusieurs séries, s'il advenait que l'accumulation des résultats montre une différence assez importante pour conclure à un résultat avant la réalisation de toutes les séries d'une expérience, alors, les dernières séries (devenues inutiles) seraient annulées. Quelques animaux de ce projet seront réutilisés dans un autre projet pour approfondir certaines analyses.
Raffinement
Hébèrgement : Les animaux seront hébergés en groupe, en milieu enrichi (sopalin , maisons en pexiglas) pour minimiser leur stress. Suivi quotidien : Pendant la période d'injection les animaux seront remis dans leur nid et on vérifiera quotidiennement que le retour au sein du nid se fait bien. A la fin de l'étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Des grilles de scoring cliniques seront proposées en fonction de l'âge des animaux. Ces grilles définissent des points limites à différents stades. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux sera réalisée par les équipes animalières et le scoring clinique sera effectué tous les jours jusqu'au 10ème jour de vie des animaux, puis 3 fois par semaine jusqu'au jour 21 puis 2 fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Si l'un des points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Gestion de la douleur : tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale et un analgésique sera administré après le réveil d’une intervention chirurgicale. Enfin, le transport des animaux est effectué par un transporteur agrée fournissant des cages adaptées ainsi que des géloses nutritives pour les animaux.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre microglie et neurones lors des processus de neurodégénérescence, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition car elle présente un hippocampe (la structure anatomique responsable des processus de mémorisation dans le cerveau et qui est préférentiellement touchée par le vieillissement) dont la circuiterie neuronale est très proche de celle de l'homme. Le modèle d'inflammation périnatale utilisé ici a été développé au sein de notre laboratoire et caractérisé jusqu'à 2 mois de vie des animaux. Notre objectif étant l'étude du vieillissement de l'animal et, notamment, de confronter notre hypothèse d'un vieillissement précoce nous nous intéressons à 3 temps de vie plus tardifs de nos animaux : 7, 12 et 16 mois de vie. Ces temps correspondent, à peu de choses près, respectivement chez l'homme au milieu de vie (40-45 ans), à la fin de phase active (60-65 ans) et à la personne âgée (80 ans).
L’impact de la valence sur l’engramme olfactif 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 20 dans des procédures classées sévères et les autres modérées. La tête fixée par une pièce métallique vissée au crâne, elles subissent des tests olfactifs en réalité virtuelle sous restriction d'eau pendant un à quatre mois et des privations de nourriture de 16 heures, et sont hébergées seules, pour étudier la mémoire émotionnelle des odeurs. Le porteur reconnaît que l'isolement social peut provoquer stress, agressivité et déficits immunitaires, qu'il dit réduire au minimum. Il justifie l'effectif par les nombres "habituellement utilisés dans les études de référence" plutôt que par un calcul de puissance statistique.
Objectifs
Les odeurs ont une capacité unique à nous transporter dans des moments reculés de notre passé, notamment ceux associés à des émotions fortes. Elles jouent également un rôle très important dans les choix que nous faisons au jour le jour, notamment lorsqu’il s’agit de notre alimentation. Mais qu'est-ce qui, dans le système olfactif, confère aux odeurs ces propriétés particulières ? Dans cette étude, nous étudierons les voies anatomiques et les mécanismes physiologiques par lesquels les odeurs laissent une empreinte émotionnelle si forte dans nos mémoires.
Bénéfices attendus
Cette recherche peut fournir des indications importantes sur les mécanismes neuronaux qui attachent une valence hédonique à un objet. Dans de nombreux troubles neurodégénératifs, à mesure que la maladie progresse (en particulier dans le cas de la dégénérescence du lobe frontal), les patients souffrent car ils sont moins connectés au monde qui les entoure. La valeur qu'ils attribuent à différents éléments peut être déformée, ce qui peut entraîner des changements radicaux dans leur personnalité, inquiétants pour eux et leurs proches. Si cette recherche permet de découvrir l'ensemble des connexions qui attribuent une valeur émotionnelle aux odeurs, elle peut donner un aperçu de la physiopathologie de ces troubles. Outre les maladies neurodégénératives, des études récentes ont également montré que les enfants atteints de troubles du spectre autistique (TSA) n'adaptent pas leur comportement de reniflage lorsqu'on leur présente des substances odorantes aversives ou appétissantes, alors que les enfants au développement normal le font. Cela suggère une déconnexion entre l'intégration des informations sensorielles et les processus de mémoire émotionnelle dans les TSA, et ce travail pourrait permettre de comprendre comment les odeurs se voient attribuer une signification émotionnelle qui conduit à un comportement adaptatif.
Procédures
Dans cette étude, toutes les souris (490) seront fixées à la tête et soumises à des tests comportementaux, 90 d'entre elles seront euthanasiées sans autres manipulations et 400 d'entre elles verront leurs tissus préservés pour des études anatomiques. Les tests comportementaux consisteront à présenter des odeurs à des souris qui décideront de s'en approcher ou de les éviter dans la réalité virtuelle. Les animaux ne recevront de l'eau que pendant le comportement (restriction hydrique) afin de maintenir leur motivation et, dans certains cas, ils seront privés de nourriture pendant 16 heures avant les tests comportementeaux. Ils seront logés individuellement pendant la restriction d'eau (généralement 1-2 mois, 4 mois maximum) et de nourriture afin d'éviter les brimades et les combats.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les souris seront placées dans un appareil comportemental dans lequel elles devront utiliser leur odorat pour trouver une récompense hydrique et éviter les petites bouffées d'air ou d'eau salée. Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir les souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. Au début, la fixation dans l'appareil peut être stressante, mais les souris s'habituent rapidement et restent calmes dans ces conditions. Pour les motiver à effectuer des tâches dans l'appareil, la totalité de l'apport en eau quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux. La restriction d'eau, si elle est bien contrôlée, permet de maintenir la motivation des animaux sans qu'ils soient trop déshydratés. Des contrôles quotidiens de l'état de santé permettent de s'assurer que les souris restent dans des conditions saines. Une restriction calorique de 16 heures à certaines occasions ne provoquera pas d'effets indésirables chez des animaux par ailleurs en bonne santé, car les souris seront nourries ad libitum pendant au moins 2 jours après les expériences. Les souris seront logées individuellement pendant la restriction d'eau afin d'éviter les combats, mais elles seront manipulées tous les jours par l'expérimentateur et exposées aux images, aux sons et aux odeurs du laboratoire, qui impliquent d'autres souris. L'isolement social peut provoquer du stress, de l'agressivité et des déficits immunitaires, il sera donc réduit au minimum.
Devenir
Sur les 490 souris soumises à une restriction hydrique, 90 seront mis à mort et 400 seront gardé en vie. Ces 400 pourront être mises à mort et utilisé pour contrôles histologiques en fin d’expérimentation.
Remplacement
La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront une tâche comportementale : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.
Réduction
Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 490 souris sur 5 ans. Les techniques d’enregistrement (électrodes très fines et lentilles à gradients d'indices) que nous prévoyons d’utiliser permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés car un grand volume de données pourra être collecté sur plusieurs jours au sein d’un même animal. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences. Notre estimation du nombre d’animaux ne peut se baser sur une étude de puissance statistique car notre étude ne reposera pas sur un test unique. Dans ce type d’étude, les valeurs comparées dans les tests statistiques sont rarement basées sur les individus, mais plutôt sur la totalité des neurones enregistrés ou bien sur des groupes de neurones. Ainsi, les effectifs indiqués correspondent aux nombres d’animaux habituellement utilisés dans les études références du domaine.
Raffinement
Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début de leur entraînement, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L'accoutumance à l'expérimentateur et aux conditions expérimentales permettra également aux animaux d'accomplir les tâches comportementales avec un minimum de stress.
Choix des espèces
Ce projet vise à comprendre les mécanismes neuronaux qui explique comment la valence hédonique d'une odeur affecte son encodage dans le cortex olfactif, et comment cette information est acheminée pour guider les comportements adaptatifs. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que la souris est en train d’apprendre et d'exprimer leur préférences olfactifs : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. La souris est la seule espèce de mammifère qui possède un système olfactif très similaire à celui des humains dans lequel nous pouvons entraîner les animaux à s'approcher et à éviter différentes odeurs tout en enregistrant et en manipulant l'activité dans des groupes de neurones génétiquement et anatomiquement circonscrits. La boîte à outils pour ces manipulations chez la souris est bien plus développée que pour tout autre organisme modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Par précaution par rapport à ce dernier point, nous utiliserons uniquement des animaux dont le poids est compris entre 20 et 45g.
Traiter l’herpès simplex de type 1 pour prévenir la maladie d’Alzheimer : Evaluation chez des souris non-transgéniques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une chirurgie d'une heure au plus pour induire des lésions de la maladie d'Alzheimer, une infection par le virus de l'herpès HSV-1 et une immunothérapie anti-HSV-1, ces deux derniers gestes faits à la micro-aiguille sous anesthésie. Le porteur décrit une souffrance "importante" pendant la phase aiguë de l'infection, jusqu'à quinze jours, avec pelage altéré, lésions oculaires, perte de poids, agitation ou léthargie, et 30 % des souris développent une infection mortelle. Leur mémoire est testée en les forçant à nager jusqu'à une plateforme immergée, puis dans un V-Maze de reconnaissance d'objets qui peut causer, selon lui, "une angoisse pour une souris qui réalise que sa mémoire est déficiente". Pour un résultat annoncé comme "la preuve de concept de futures thérapies", les survivantes sont tuées à la fin du projet afin d'analyser les lésions de leur cerveau.
Objectifs
Environ 80% des sujets âgés sont porteurs du virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1). Chez l’humain, la première infection par le virus HSV-1 est asymptomatique dans 94% des cas. Elle survient dans et autour de la bouche et du nez. En quelques heures, le virus se réplique au niveau du site d’infection puis infecte les neurones des ganglions trijumeaux où il entre en dormance (latence). La multiplication du virus s'arrête, mais le matériel génétique viral persiste toute la vie de la personne infectée. La réactivation du virus, à partir de cet état latent, peut survenir lorsqu'une personne subit divers facteurs de stress (fatigue, fièvre, déficit immunitaire, etc.). Cette réactivation génère des nouvelles particules virales qui migrent via les axones des nerfs infectés et infectent ainsi des sites distants tels que les yeux, les lèvres et le nez, et le cerveau. La maladie d'Alzheimer (MA) est liée à l'accumulation de protéines tau anormales (tauopathie) et de peptides β-amyloïdes (Aβ) dans le cerveau. Des arguments basés sur des études épidémiologiques suggèrent fortement que le virus HSV1 est impliqué dans la pathologie de la MA, et que le HSV1 peut déclencher expérimentalement la production de protéines anormales impliquées dans la MA et responsables de la dégradation des neurones. Comme le HSV1 reste latent toute la vie dans l'organisme et peut se réactiver régulièrement, il pourrait induire des pics d'apparitions des lésions de la maladie d'Alzheimer et conduire progressivement vers cette maladie. L'avenir de la prévention contre la MA pourrait ainsi reposer sur le développement d’immunothérapies bloquant le virus HSV1. Nous souhaitons progresser dans la compréhension des mécanismes qui associent HSV1 et la MA et dans la réalisation de thérapies anti-HSV1 pour lutter contre la MA. Dans ce contexte, les objectifs de ce projet sont : i. D'induire une infection par HSV1 dans un modèle murin de MA et de caractériser l'impact de HSV1 sur l'évolution de la maladie d’Alzheimer. ii. Utiliser une immunothérapie anti-HSV1 innovante et évaluer son efficacité pour prévenir et/ou réduire la progression de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Ce projet établira la preuve de concept de futures thérapies contre la maladie d'Alzheimer avec une approche innovante d'immunothérapie anti-HSV1.
Procédures
Les différentes interventions sont les suivantes : - Une procédure chirurgicale d'une durée de 1 heure maximum permettant Inoculation d'induire des lésions de la maladie d'Alzheimer. - Infection par le virus HSV1 avec une micro-aiguille, sous anesthésie générale de courte durée (20-30 minutes). - Etudes comportementales une seule fois par animal. Ils permettent d'étudier la mémoire des animaux. Deux tâches sont effectuées pour chaque animal. La première dure 4 minutes par jour, pendant 5 jours. La deuxième dure 9 minutes par jour pendant 3 jours. - Administration d’un traitement contre HSV1 grâce à une immunothérapie (virus HSV1 inactif) administré avec une micro-aiguille, sous anesthésie générale de courte durée (20-30 minutes)..durée ?
Impact sur les animaux
Concernant les différentes interventions, les effets attendus sont les suivants : ° Douleur post-chirurgie. ° Réduction des capacités cognitives (légère et en général uniquement détectable dans des tâches comportementales très élaborées). ° La souffrance des animaux dans le modèle murin d'infection à HSV1 est importante lors de la phase aigüe de la maladie (jusqu'à 15 jours post infection). Elle s’exprime par des modifications physiques (changement d’apparence du pelage, lésions oculaires, perte de poids), mais également du comportement (agitation ou léthargie). ° 30 pour cent des animaux développent une infection mortelle. ° Un premier test de mémoire réalisé ici repose sur la capacité à l’animal à trouver une plateforme cachée dans une piscine remplie d'eau en s’aidant d'indices visuels situés. Ce test implique de forcer les souris à nager dans une piscine, où elles doivent trouver une plateforme immergée. Ces tests peuvent entraîner une fatigue chez la souris. ° Le test de V-Maze permet d’évaluer la mémoire via la reconnaissance d’objet. Ce test peut entrainer une angoisse pour une souris qui réalise que sa mémoire est déficiente.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet Nous voulons étudier l'impact de HSV1 et d'immunothérapies anti-HSV1 sur les lésions de la maladie d'Alzheimer qui ne peuvent être étudiées qu'en post-mortem par histologie ou biochimie.
Remplacement
L'apparition. des lésions de la maladie d'Alzheimer et leur diffusion dans le cerveau dépend de l'interaction entre les lésions, le système immunitaire et le cerveau de l'organisme hôte. Il n'y a actuellement aucun modèle disponible pour effectuer une analyse complète de la dynamique d'apparition des lésions sans utiliser des animaux. La pathologie liée à HSV1 dépend de l'interaction entre le virus HSV1 et le système immunitaire de l'hôte lors d'une infection par le HSV1 dans la lèvre, puis des interactions ultérieures qui se produisent dans les ganglions cibles. Il n'y a actuellement aucun modèle disponible pour effectuer ces expériences sans l'utilisation d'animaux. L'observation des effets d'immunothérapies nécessite un système immunitaire très intégré, qui ne peut être obtenu que chez des modèles animaux (ou l'homme). Chaque procédure fait intervenir toute la complexité des systèmes biologiques intégrés (apparition et diffusion des lésions de la maladie d'Alzheimer, induction et diffusion de la pathologie virale, interactions avec le système immunitaire) et ne peut pas être réalisé in vitro ou avec des modèles non-mammifères.
Réduction
Tout d'abord, le critère principal sur lequel nous basons notre étude statistique est l'induction des lésions de la maladie d'Alzheimer dans un modèle souris. Pour l'ensemble de notre étude nous allons étudier 200 animaux. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à des études préliminaires. Les analyses vont être menées de façon progressive (lots de 10 animaux) et des calculs de puissance statistique basé sur des résultats intermédiaires permettra de réduire le nombre d'animaux si un effet fort est détecté ou d'annuler l'expérience si aucune lésion de la maladie d'Alzheimer n'est induite.
Raffinement
Pendant toute l'étude, les animaux sont hébergés dans environnement à température contrôlée, avec cycle jour-nuit de 12h optimisés pour l’hébergement des souris. Eau et nourriture seront fournies. L'environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. Les animaux seront hébergés par groupes. Les animaux seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision d'un vétérinaire. L'administration de HSV1 est réalisée sous anesthésie générale à l’aide d’aiguilles garantissant un dosage précis du virus Des points limites sont mis en place pour limiter la douleur. Toute intervention chirurgicale sera effectuée sous anesthésie générale suivi d’un traitement au paracétamol (antalgique et antipyrétique) dans l’eau de boisson pendant 48h. En cas de manifestation de douleur, une analgésie sera discutée avec le vétérinaire. Ces mesures garantissent que les conditions de douleur et de souffrance inutile des animaux sont contrôlées.
Choix des espèces
Les humains sont le seul hôte naturel du HSV-1. Cependant, le modèle murin que nous souhaitons utiliser pour cette étude, le modèle souris BALB/c qui lorsqu’il est infecté dans la lèvre, montre des signes d'infections aiguës résolutives et développe une infection latente à long terme, identique à ce qui se produit dans l'infection chez l'homme. De plus, la réponse immunitaire des souris BALB/c est comparable à celle observée chez l'homme. Puisque les souris BALB/c sont également de petits mammifères, elles sont idéales comme modèle pour étudier comment les interactions entre le système immunitaire des mammifères et le HSV-1 influencent l'histoire naturelle de la maladie. Nous avons identifié un état de protection unique dans ce modèle et les mécanismes qui le fournissent doivent être découverts et compris, afin qu'ils puissent être exploités pour des stratégies thérapeutiques à l'avenir. La robustesse de notre modèle de HSV1 repose entre autres sur l’utilisation de souris BALB/c femelles âgées de 6 semaines. L'utilisation de souris plus jeunes ou plus âgées peut introduire des variables susceptibles d'affecter la robustesse de notre modèle. En effet, les souris plus âgées développent une résistance à la maladie aiguë. L'induction de pathologie Alzheimer a été décrite suite à l'inoculation d'extraits de cerveaux Alzheimer chez les souris sauvages. Notre procédure d'induction de pathologie devrait donc être efficace chez les souris BALB/c.