Procédures sévères
Essais précliniques de traitement de la glycogénose de type 1a par thérapie génique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du sang et du foie, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles subissent une biopsie de phalange dans les premiers jours de vie, une induction de la maladie, une injection de vecteur viral dans la veine de la queue puis des jeûnes courts répétés. Le porteur indique que la maladie a été induite uniquement dans le foie pour éviter des hypoglycémies sévères et potentiellement mortelles, et que des points limites déclenchent une mise à mort en cas d'hypoglycémie. Il affirme que la correction des cellules hépatiques ne peut se mesurer qu'in vivo, sur l'"organisme en entier", et renvoie l'essai clinique à un stade ultérieur.
Objectifs
La glycogénose de type 1a est une maladie génétique rare caractérisée par une incapacité de l’organisme à produire du glucose (sucre) pour maintenir la glycémie autour de 1 g/L de sang entre 2 repas. La maladie se caractérise par des hypoglycémies sévères rapidement après un repas, ainsi que par l’accumulation de glycogène, polymère de sucre, et de graisses dans le foie. Ainsi, les patients présentent des foies très gros et gras, et développent à long terme des tumeurs hépatiques. A l’exception d’un contrôle nutritionnel très strict limitant les hypoglycémies, il n’existe actuellement aucun traitement curatif. La transplantation hépatique est la seule solution lorsque le développement tumoral est trop important. La thérapie génique consiste à apporter le gène « médicament » (gène sain) dans les cellules du foie grâce à l’utilisation de vecteurs viraux injectés dans la circulation générale. Ces virus délivreront l’ADN aux cellules hôtes ciblées mais ils ne pourront pas se multiplier dans les cellules et donc provoquer une infection virale. Ces vecteurs sont déjà utilisés pour traiter d’autres maladies métaboliques du foie comme l’hémophilie chez l’homme. Des preuves de concept ont mené au développement d’un nouveau vecteur (brevet déposé) qui permet, après une seule injection chez des souris atteintes de glycogénose de type 1a, de maintenir une glycémie très similaire à celle des souris saines pendant plusieurs mois, même lors de périodes de jeûne, et de rétablir les paramètres métaboliques, en corrigeant les niveaux de glycogène et de graisses du foie. Avant de débuter la phase d’essais cliniques, l’utilisation de ces vecteurs nécessitent une phase de validation préclinique comprenant des études d’efficacité de doses chez des souris malades, des études démontrant une absence de toxicité des vecteurs utilisés, une étude immunologique, et l’assurance qualité de la production des vecteurs en grande quantité. Dans ce projet, nous testerons l’efficacité de différentes doses du vecteur candidat chez des souris atteintes de glycogénose de type 1a. Cette étude sera complétée par l’analyse de vecteurs dont la capside (enveloppe du virus) a été légèrement modifiée afin d’augmenter l’efficacité de la thérapie génique.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet devrait permettre de définir la dose optimale de vecteur viral adéquate, efficace et non toxique, pour lancer un essai de thérapie génique pour des patients atteints de glycogénose de type 1a
Procédures
Les souris atteintes de glycogénose de type Ia seront obtenues par transgenèse ce qui nécessite une biopsie de tissu (au niveau de la 1ère phalange, inférieure à 1 mm) réalisée à l’âge de 7 à 10 jours, pour vérifier la modification de leurs gènes. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’induction de la pathologie chez les souris transgéniques sera réalisée par un traitement injecté dans le péritoine à l’âge de 3 semaines, pendant 5 jours de suite ; les souris saines recevront le même traitement. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Pour la thérapie génique, toutes les souris seront injectées dans la veine de la queue avec les vecteurs viraux ou une solution de sérum physiologique (souris « non traitées ») à l’âge de 10 semaines environ. Pour cela, les souris sont soumises à une contention de quelques minutes (5 minutes maximum). Avant et après traitement, une mesure du taux de sucre dans le sang (glycémie) sera réalisée, tous les mois, à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue grâce à l’utilisation d’un glucomètre (Dextro). Ce geste est réalisé en quelques secondes. Une prise de sang sera aussi réalisée en veine sub-mandibulaire. Pour cela, les souris sont soumises à une contention de 1 à 2 minutes. Au total ; les souris seront soumises à 10 interventions dont 1 biopsie, 6 injections, et 3 prélèvements de sang. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes, en particulier le foie pour analyser les taux de glycogène et de graisse.
Impact sur les animaux
Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas) et par des atteintes hépatiques menant au développement de tumeurs du foie. Sans contrôle nutritionnel strict, les hypoglycémies peuvent être fatales et mener à la mort. Les souris seront soumises à des jeûnes courts entre 2h30 et 6h, ce qui représente une période entre deux repas. Chez les souris saines, la glycémie est normalement régulée grâce à une production de glucose assurée principalement par le foie (dégradation des stocks de glycogène), mais aussi par les reins et l’intestin. Afin d’éviter la mort des animaux atteints de GSDIa et non traités, la maladie a été induite uniquement dans le foie des souris. Ceci permet de limiter les hypoglycémies au cours d’un jeûne long grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies quelques heures (2-3h) après une prise alimentaire car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucre hépatique. La connaissance du modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage pour leur éviter la perte d’énergie nécessaire pour atteindre les mangeoires. Avant la mise à jeun, une partie de leur cage est placée sur une plaque chauffante pour éviter les hypothermies. Un suivi très régulier de ces animaux est réalisé par le technicien en charge du protocole expérimental. En effet, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie qui se caractérisent par une diminution de la mobilité, prostration, et/ou refroidissement de l’animal est réalisé très régulièrement afin de pouvoir injecter une solution de glucose en cas de mal-être ou de valeurs trop basses de sucres mesurées à l’aide du dextro à partir d’une goutte de sang. Il est à noter que les souris femelles sont plus susceptibles de développer des hypoglycémies et le contrôle de leur comportement est renforcé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et du foie. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer la correction des cellules du foie et de déterminer les taux de glycogène et de sucre dans le foie. Le nombre de vecteur viral par cellule de foie sera aussi mesuré.
Remplacement
La validité des constructions virales peut être vérifiée par traitement de cellules en culture après mesure de l’expression du gène sain ou de la production de glucose. Cependant, l’efficacité de correction des cellules du foie ne peut pas être mesurée par une approche en culture cellulaire. En effet, les vecteurs viraux sont injectés dans la circulation générale et doivent pénétrer dans les cellules du foie après avoir traversé les vaisseaux sanguins. Notre étude nécessite donc de travailler sur l’organisme en entier afin d’évaluer le pourcentage de cellules hépatiques qui seront corrigées après injection du vecteur en veine caudale..
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique, l’étude préclinique nécessitera la comparaison de groupes de 12 souris. Les premières études de thérapie génique privilégiaient l’utilisation de souris mâles mais l’étude préclinique requiert une analyse de l’efficacité du traitement chez les mâles et les femelles puisque la pathologie touche autant les hommes que les femmes. Cependant, le nombre d’animaux a été limité à 6 souris/groupe pour l’étude préliminaire afin de sélectionner le vecteur qui permettra de mieux corriger les hépatocytes (étude préliminaire avant l’étude préclinique). L’étude préclinique sera réalisée avec le vecteur viral de référence. Elle sera complétée avec un deuxième vecteur sélectionné uniquement si l’étude préliminaire montre une efficacité de correction plus élevée après modification de la capside. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera l’obtention de 456 souris (mâles ou femelles) transgéniques et contrôles.
Raffinement
Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDIa, la pathologie a été induite uniquement dans le foie des souris ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères au cours d’un jeûne long grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. La connaissance des modèles animaux a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts des souris pour accéder aux mangeoires. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage. Un suivi de glycémie sera aussi réalisé si un animal est retrouvé prostré dans une cage, et/ou ne répondant pas ou peu aux stimulations du zootechnicien. En cas d’hypoglycémie (quantité de sucre dans le sang trop faible), la souris sera systématiquement injectée avec une solution de glucose. Enfin, une partie de la cage est placée systématiquement sur une plaque chauffante afin de maintenir la température corporelle de la souris. Une crème anesthésiante sera appliquée avant la prise de sang pour la mesure de glycémie afin de réduire la douleur. Les souris seront hébergées par groupe, dans un milieu enrichi pour favoriser la nidation et le refuge des souris dans des petites huttes. L’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, prise de poids, morsures...). En cas de petites plaies causées par les souris, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles aux propriétés cicatrisantes et antiseptiques sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de glucose par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Par ailleurs, le modèle de souris atteintes de glycogénose de type 1a uniquement dans le foie n'existe que chez la souris. Ce modèle a l’avantage d’être viable grâce au maintien de la production de glucose par les reins et l’intestin. Les protocoles seront réalisés chez des souris adultes âgées d’un minimum de 2 mois. L’induction de la délétion du gène G6pc1 sera réalisée chez des souris adultes âgées d’un minimum de 6 à 8 semaines. Le traitement des animaux par les vecteurs viraux sera réalisé 6 semaines après l’induction de la pathologie. La mise à mort des animaux sera effectuée 15 jours (procédure 2) ou 6 mois (procédure 3) après l’injection des vecteurs.
La protonthérapie à très haut débit pour protéger les tissus sains de la peroxydation radio-induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur cerveau ou leurs poumons sont irradiés sous anesthésie, avec des tests comportementaux nommés (open-field et reconnaissance d'objet) et des scanners, pour évaluer une protonthérapie censée épargner les tissus sains. Le porteur attend des troubles neurocognitifs après l'irradiation du cerveau et des fibroses pulmonaires après celle des poumons. Il indique qu'aucune étude in vitro n'a reproduit l'effet observé in vivo et juge "indispensable" le passage par un modèle vivant.
Objectifs
La radiothérapie est une des options thérapeutiques les plus importantes dans le traitement des cancers. Ce type de traitement consiste en l’utilisation de rayonnements ionisants ( photons ou des électrons) pour traiter les tumeurs. La principale limite de ce traitement est l’apparition de toxicités au niveau des tissus sains adjacents. La protonthérapie est une modalité particulière de radiothérapie qui consiste à irradier la tumeur avec un faisceau de protons au lieu de photons. L’avantage considérable de cette technique tient au fait que la plus grande partie de la dose va être déposée au niveau de la tumeur épargnant les tissus sains situés de part et d’autre de la tumeur, diminuant ainsi la toxicité du traitement. Cependant la protonthérapie nécessite des équipements très couteux et complexes à mettre en œuvre d’où son emploi limité au traitement de certaines tumeurs.
Bénéfices attendus
- Cette étude devrait permettre de mettre en évidence que la modification des lipides peut être utilisée comme un marqueur précoce de la préservation des tissus sains dans notre nouvelle technique d’irradiation. Ce type de marqueur précoce (24 heures) permettrait d’accélérer la recherche sur la protonthérapie à très haut débit puisqu’au lieu d’attendre plusieurs mois, les résultats seraient connus en quelques semaines. Cela permettrait de répondre aux questions nécessaires pour le passage vers la clinique plus rapidement telles que la dose optimale, le temps à respecter entre les 2 séances d’irradiation pour que la seconde irradiation conserve ses propriétés, etc.
Procédures
- Pour la procédure d’irradiation du cerveau, la seule intervention prévue sera l’irradiation en elle-même réalisée sous anesthésie générale (15 à 20 minutes par animal). Les animaux réaliseront également quelques tests comportementaux basiques (Open-Field et reconnaissance d’objet) qui n’entrainent aucun effet délétère pour l’animal. A différents temps, les animaux seront anesthésiés profondément et mis à mort pour fixation de leurs organes (sans réveil) - Pour la procédure d’irradiation des poumons, la première intervention prévue sera l’irradiation en elle-même réalisée sous anesthésie générale 15 à 20 minutes par animal. Les animaux seront imagés à 4 reprises : scanners thoraciques avant l’irradiation, deux mois post-irradiation, 4 mois post-irradiation et 6 mois post-irradiation. Ces scanner seront réalisés sous anesthésie générale 15 à 20 minutes par animal. A différents temps, les animaux seront anesthésiés profondément et mis à mort pour fixation de leurs organes (sans réveil)
Impact sur les animaux
Bien que l’irradiation et l’imagerie scanner en elles-mêmes ne soient pas douloureuses ni invasives, les souris seront anesthésiées tout au long des procédures pour éviter tout mouvement. Les nuisances seront issues des effets des irradiations : - Les effets indésirables attendus après irradiation du cerveau sont l’apparition de troubles neurocognitifs. - Les effets indésirables attendus après irradiation des poumons sont l’apparition d’inflammations, de lésions et finalement de fibroses pulmonaires.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés 24 heures, 3 mois ou 6 mois après irradiation selon les procédures pour prélèvements et analyses.
Remplacement
Les effets protecteurs des tissus sains après irradiation en électrons à très haut débit ont été décrits uniquement in vivo sur le poumon et le cerveau de souris. Pour reproduire et analyser ces effets après irradiation en protons, il nous faut donc reproduire les mêmes conditions expérimentales in vivo cette fois avec des protons. En ce qui concerne la possibilité de recourir aux tests in vitro pour l’étude de la modalité d’irradiation, aucune étude in vitro étudiant par exemple les dommages à l’ADN sur cellules en culture, n’a montré de différence alors que de nombreux modèles in vivo ont démontré l’existence de l’effet étudié sur des animaux. Il est donc indispensable de passer sur un modèle vivant intégré et autonome.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide de tests statistiques On réalisera un suivi de la fibrose pulmonaire par imagerie non invasive pour éviter l’euthanasie de souris supplémentaires.
Raffinement
l’irradiation et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse à l’isoflurane. Ce sont des procédures indolores et non invasives mais les souris devront rester immobiles dans leur système de contention tout le long de la procédure. - les animaux seront surveillés 5 jours/7 pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal être. Les souris seront pesées 2x/semaine et euthanasiées si on constate une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial. Nous savons par expérience que les doses de 10 Gy sur le cerveau ou 13,5 Gy sur le thorax sont très bien tolérées chez la souris, notamment au niveau cutané et ne nécessitent pas de soins spécifiques. Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance en cas de besoin. Dès l’irradiation, l’alimentation usuelle des animaux sera complétée par des aliments gélifiés et des petits granules disposés directement dans le fond de leur cage. L’accès à la nourriture sera ainsi plus aisé.
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en cancérologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Nous travaillerons sur des souris âgées de 8 semaines, soit de jeunes adultes, car un dispositif élaboré de contention des animaux avec masques créés par imprimante 3D a été réalisé pour des animaux de 8 semaines
Etablissement et maintien d’une banque de xénogreffes de tumeurs humaines sur souris immunodéficientes.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
15105 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Elles servent à greffer et faire proliférer des fragments de tumeurs humaines, avec des greffes orthotopiques, des ovariectomies ou castrations et des injections intracardiaques, pour entretenir une banque de modèles tumoraux sur cinq ans. Le porteur décrit une gêne respiratoire, une occlusion intestinale, une ascite, une exophtalmie et des difficultés à se déplacer selon la localisation des tumeurs, et précise qu'aucun test statistique n'encadre les effectifs. Il présente cette banque comme une source de matériel tumoral pour la recherche pharmacologique et juge le modèle vivant "indispensable".
Objectifs
Les xénogreffes résultent de la greffe chez la souris de fragments tumoraux de patients obtenus suite à un prélèvement chirurgical»). Ces xénogreffes sont actuellement considérés comme le modèle tumoral le plus proche des tumeurs des patients et permettent la réalisation d’études biologiques et pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ainsi elles constituent un outil essentiel pour étudier la biologie des cancers humains et pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou posologies de médicaments. Elles permettent également dans certains essais cliniques, une aide à la prescription pour le clinicien quand il a été possible de montrer l’efficacité d’une molécule sur la xénogreffe issue de la tumeur du patient. Ce caractère prédictif dépend toutefois de la possibilité de sélectionner les xénogreffes appropriées et donc d’avoir pu constituer des ensembles représentatifs de la diversité des tumeurs de patients. Cela nécessite le développement d’un grand nombre de modèles tumoraux différents pour une même pathologie. De même, certaines études biologiques nécessitent d’une quantité importante de matériel tumoral, à l’état frais, et ne seraient pas réalisables sans le passage en xénogreffe. Une banque de PDX maintenue sur souris constitue donc une source importante de matériel tumoral à l’état frais, sans les limitations des prélèvements issus des patients. Notre laboratoire a déjà développé un nombre important de modèles de différents types tumoraux (sein, poumon, côlon, mélanome, rétinoblastome, ovaire, lymphomes,…), notre objectif est donc de : - Maintenir les modèles pertinents existants comme source de matériel tumoral nécessaire pour les études biologiques et pharmacologiques - Obtenir de nouveaux modèles (tumeurs ou sous-types tumoraux) pour lesquels il existe un besoin et un rationnel scientifique ou clinique - Développer des modèles de métastases - Développer des modèles résistants pour comprendre les phénomènes de résistance aux traitements et les moyens de les contourner
Bénéfices attendus
Les xénogreffes issues des tumeurs patientes constituent un modèle préclinique cliniquement pertinent, dont les applications sont nombreuses, en recherche fondamentale et translationnelle. En recherche fondamentale, elles permettent d’étudier la biologie des cancers humains sans les limitations associées aux prélèvements issus des patients (matériel en quantité insuffisante, difficultés logistiques ou d’accès aux prélèvements, etc.), car elles constituent une source de matériel tumoral humain illimité, pouvant être conditionnée de façon différente selon les applications (à l’état frais, congelé, fixé, dissocié en single cell, etc.). Pour la recherche pharmacologique, le développement exponentiel de thérapies ciblées et individualisées dans le cancer ces dernières années a rendu nécessaire la mise au point de modèles précliniques représentatifs de la diversité et la complexité de la pathologie cancéreuse observée chez les patients. Les xénogreffes d’origine humaine constituent aujourd’hui l’outil d’analyse pharmacologique le plus proche de la clinique. Ces nouveaux modèles permettent de sélectionner les meilleurs composés anti-tumoraux : optimisation des modalités thérapeutiques, prédiction des effets du médicament, évaluation de l’effet sur la croissance locale et la dissémination métastatique, identification de marqueurs de réponse ou de résistance au traitement Par ailleurs, l'évaluation préclinique est une étape importante et obligatoire dans le développement d'un médicament avant son utilisation clinique. Ces expériences pharmacologiques sont possibles grâce au maintien des tumeurs sur souris, comme source de matériel tumoral.
Procédures
La greffe de matériel tumoral sera faite dans la majorité des cas en sous cutané. Des souris supplémentaires sont greffées au niveau de leur site d’origine ou bien autre site qui par l’absence de système immunitaire permet d’améliorer la prise tumorale Ces greffes seront réalisées1 fois / animal et sous anesthésie ; durée d’anesthésie chimique
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau ou du péritoine. L’utilisation d’anesthésique et d’analgésique permet de prendre en charge ces douleurs. Lors des anesthésies, une baisse de température corporelle est observée chez la souris ; pour éviter la baisse de température, les animaux sont placés sous lampe chauffante et tapis chauffant. Les injections de cellules ou l’administration de molécules par voie orale ou par injection ne provoquent pas de douleurs chez les animaux au-delà de l’injection elle-même Par ailleurs, la croissance des tumeurs surtout quand elles sont greffées au niveau de leur site d’origine pourraient provoquer une perte de poids et aussi une gêne pour se déplacer juste après la greffe. L’alimentation gélifiée ajouté dans la cage et la réhydratation aident à diminuer l’inconfort des animaux. Les gênes causées par le développement des tumeurs orthotopiques ou bien apparition des métastases peuvent être : - gêne respiratoire par le développement des tumeurs au niveau des poumons - Diarrhée, perte de poids plus de 72h ou occlusion intestinale pour les tumeurs de colon, - apparition d’ascite pour les tumeurs de l’ovaire - difficulté à se déplacer pour les greffes au niveau de l’os et au niveau de la glande mammaire - exophtalmie pour les tumeurs de l’œil - Difficultés de déplacement ou boitillement avec ou sans déformation du genou pour les tumeurs intra-osseuses
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour des prélèvements post-mortem
Remplacement
l'utilisation des animaux se justifie par le fait que la tumeur interagit avec son environnement pour se développer qu'elle soit placée en sous- cutanée ou dans une localisation proche de son site originel (vascularisation, stroma…). Un modèle vivant intégré est donc indispensable pour étudier les interactions entre la tumeur et ses organes cibles mais également avec l’organisme dans sa totalité. Ces modèles vont nous permettre d'étudier le développement de la maladie en essayant de mimer et comprendre leur mécanisme oncogénique dans des modèles orthotopiques. Par ailleurs, nous pourrons également explorer et valider l'efficacité de nouvelles thérapies dans des modèles sous-cutanés rares voire inexistants pour certains types de cancers ou des modèles orthotopiques particuliers, le plus proche de clinique. Il n'e'xiste donc pas de méthode alternative capable de répondre à la question scientifique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son strict minimum, notamment grâce au calcul du taux de prise du modèle établi qui permet de ne greffer que le nombre d’animaux nécessaires au maintien de la xénogreffe. Par ailleurs, nous recherchons continuellement à améliorer nos techniques de congélation/décongélation des tumeurs pour éviter de garder des animaux greffés en continue pour le maintien de modèles non utilisés. A noter que pour l’apprentissage des nouveaux gestes expérimentaux, le personnel sera formé d’abord sur les animaux euthanasiés et une fois le geste maîtrisé, leur formation est complétée sur les souris en vie. Pour cette étape, afin de réduire le nombre d’animaux et après l’avis favorable du vétérinaire, nous utiliserons les animaux greffés par ailleurs et dont les tumeurs n’ont pas poussé. Aucun test statistique n’a été mis en œuvre
Raffinement
Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : utilisation d’anesthésique et d’analgésiques systématique lors des chirurgies, addition d’alimentation hydraté en post-opératoire, hydratation supplémentaire de l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie ; Les animaux seront surveillés le jour de la chirurgie pour les greffes en SC et interscapulaires (90% des greffes) et pendant 24h pour les ovariectomies, les castrations, les greffes autres que les SC et interscapulaires. sous-capsule rénales et l’ injection des cellules en intracardiaque. Par la suite, les animaux sont surveillés 1 fois par semaine par le personnel dédié. Par ailleurs, sauf exception, les greffes sont programmées et réalisées au plus tard le jeudi matin. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.
Choix des espèces
Choix de l’espèce « Souris » c’est le modèle in vivo d’un mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique Choix de la lignée murine : nécessité d’un déficit immunitaire pour éviter le rejet de la xénogreffe d’origine humaine par la souris. Différentes souches sont utilisées en fonction des types et sous-types tumoraux pour favoriser la prise et la croissance des modèles de xénogreffes La greffe a lieu entre 5 à 11 semaines pour que les souris aient fini leur croissance mais suffisamment tôt pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience peut diminuer avec l’âge. Les animaux à cet âge supportent également mieux l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.
Modèle d’ischémie reperfusion chez le rongeur (2022-B-021)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 1440
490 souris et 1440 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Le thorax est ouvert et l'irrigation du coeur interrompue pendant quinze minutes à une heure, suivie d'une reperfusion pouvant durer jusqu'à quatre heures, pour reproduire un infarctus et tester des molécules en développement. Le porteur décrit une douleur et un stress liés à la chirurgie, une perte de poids et une mise à jeun pouvant atteindre seize heures. Il conclut que la mesure des paramètres cardiaques ne peut être réalisée que sur des animaux vivants et juge "indispensable" l'analyse histologique qui impose leur mise à mort.
Objectifs
Selon l’organisation mondiale de la santé, la première cause de mortalité dans le monde est l’infarctus du myocarde. Ce projet a pour but de développer deux types de modèles afin de tester et démontrer l’efficacité de molécules en développement. Le premier modèle (infarctus aigu) permet de recueillir de nombreux paramètres cardiaques qui servent à tester de nombreuses molécules en développement. Le second modèle (infarctus du myocarde chronique) est utilisé pour tester l’efficacité d’une molécule en développement sur différents paramètres cardiaques afin de voir si cette dernière améliore la survie et restaure les fonctions cardiaques chez les personnes ayant subi un infarctus du myocarde..
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester l’efficacité de molécules en développement afin de trouver un candidat médicament susceptible de traiter les pathologies liées à l’infarctus et ainsi d’améliorer la prise en charge / le pronostic de ces patients.
Procédures
Au cours de sa vie, un animal ne pourra être impliqué que dans une procédure de cette demande de projet. Pour tous les animaux l’identification (quelle que soit l’identification) dure 30 secondes. Pour les procédures comportant l’anesthésie chimique, le temps d’injection de l’anesthésique est estimé à 30 secondes. Les temps d’intervention sur l’animal estimés pour chaque procédure sont les suivants : - Mise en place de la sonde dans le coeur en passant par la carotide (20 min), mise en place de l’électrocardiogramme (20 min), ouverture du thorax de l’animal (20 min) + interruption de l'irrigation localisée d'une partie du coeur (ischémie) pouvant aller de 15min à 1h00 + reperfusion cardiaque pouvant aller de 30 min à 4h00 soit un total de 6h00. - Mise en place d’un cathéter en veine jugulaire (15min), mise en place d’un cathéter en fémorale ou carotide (15min), ou mise en place de la sonde dans le coeur en passant par la carotide (20 min), mise en place de l’électrocardiogramme (20 min), ouverture du thorax de l’animal (20 min) + ischémie cardiaque pouvant aller de 15min à 1h00 + reperfusion cardiaque pouvant aller de 30 min à 4h00 soit un total de 6h15. - Ouverture du thorax + réalisation de l’ischémie cardiaque + fermeture du thorax (30 min) pour la première étape puis pour la seconde étape mise en place d’un cathéter en fémorale ou carotide (15min) ou mise en place d’une sonde dans le coeur en passant par la carotide (20min), mise en place d’un électrocardiogramme (20min) soit au total un maximum de 40 min. Les différents types d'administration prendront moins d'une minute par animal.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures de ce projet incluant des gestes chirurgicaux, un certain niveau de douleur et de stress sont attendus nécessitant une anesthésie et analgésie pré et post-opératoires appropriées. Une perte de poids et une réduction de l’activité peuvent être observées dans les 72h suivant les interventions Dans le cadre de ce projet, les signes cliniques de la pathologie (exemple : essoufflement de l’animal, prostration, yeux mi-clos, …) sont attendus et feront l’objet d’un suivi spécifique. Une mise à jeun (durée maximum de 16h00) pourra également être mise en place. Les animaux auront alors toujours accès à l'eau. Cette mise à jeun pourra avoir un impact sur l’induction de la pathologie en maximisant la zone touchée par l'ischémie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des trois procédures car il est indispensable de réaliser des analyses histologiques pour quantifier la taille de l’ischémie.
Remplacement
Des modèles animaux artificiels (exemple : rats ou souris mannequins, peau synthétique) existent afin de permettre à l’expérimentateur en formation d’acquérir certains gestes de base tels que la pose de points de suture ou des injections et prélèvements simples. Cependant, la chirurgie présentée dans ce projet ainsi que la mesure des paramètres physiologiques dans ce type de modèle ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants.
Réduction
Une mise au point du modèle préalable aux études permettra une réduction du nombre d’animaux impliqué dans les études. C’est pour cette raison qu’une procédure dédiée à la mise au point des modèles d’ischémie, a été incluse dans ce projet. Pour la mise au point du modèle, nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux surnuméraires ou issus d’un précédent projet, (après avis favorable de la structure du bien être animal et du vétérinaire désigné) ce qui rentre dans le cadre d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. L'ensemble de ces conditions s'inscrivent dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux. Les modèles d'infarctus du myocarde aigu et chronique seront réalisés sur un nombre limité d’animaux mais suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents en fonction de l’effet attendu de la molécule testée.
Raffinement
L’expérimentateur s’assurera que toute manipulation sera conforme à la réglementation en vigueur et entrainera un minimum de stress ou de douleur chez l’animal. Préalablement à toute expérimentation, des points limites (exemples : yeux mi-clos, prostration, poils hérissés, essoufflement, etc …) sont définis en accord avec la littérature scientifique et la réglementation en vigueur. La mise en place des points limites permettra un meilleur suivi des animaux lors de la réalisation des différentes procédures de ce projet mais également de maintenir leur bien-être tout au long de l’expérimentation ainsi que la mise en place d’une prise en charge précoce et adaptée de l’animal si cela est nécessaire. Dans le cas où le bien-être de l’animal serait dégradé après 48h de traitement, une euthanasie sera réalisée immédiatement sur décision du directeur d’étude et /ou du vétérinaire désigné. Avant tout acte de chirurgie, l’anesthésie ainsi que l’analgésie nécessaires au suivi pré et post opératoire de l’animal devront être validées par le vétérinaire désigné. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur couverture chauffante avec rétrocontrôle de la température afin que les animaux soient maintenus à 37°C. L’ajout de système de réchauffement complémentaires pourra être utilisés en cas de baisse de température de l’animal (exemple : bouillotes, etc..). Le réveil des animaux s’effectuera dans un environnement permettant le maintien de la température corporelle (ex: lampe chauffante, enceinte thermorégulée, etc…). Les animaux inclus dans le modèle chronique seront hébergés individuellement après chaque chirurgie jusqu’à la fin du suivi post opératoire (7 à 10 jours) et/ou après cicatrisation totale de l’animal. Afin de limiter le stress dû à l’hébergement en cage individuelle et de maximiser le bien-être de l’animal, de l’enrichissement spécifique à chaque espèce sera utilisée (exemple : igloo, bûchette, coton, etc…). De plus, quelques soit la procédure, les animaux pourront être hébergés individuellement 24h avant le début de la chirurgie afin de minimiser l’impact du stress dû à l’hébergement individuel en post-chirurgie et standardiser l’impact de l’individualisation des animaux.
Choix des espèces
D'un point de vue scientifique, nous disposons d'un grand nombre d'articles et de données validées sur le rat et la souris dans ce type de modèle de maladie. C'est pour cette raison que nous souhaitons inclure ces deux espèces dans notre projet. Ce type de modèle de maladie est réalisé chez des animaux adultes car il s’agit de reproduire des maladies de l’Homme adulte.
BARLOC
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
180 bars européens vont être utilisés dans ce projet, dont 64 dans un test de nage classé sévère qui entraîne leur mise à mort, les 116 autres étant gardés vivants pour d'autres projets. Après plusieurs semaines en eau appauvrie en oxygène, chaque bar testé nage de façon forcée pendant une à deux heures, sans anesthésie, ce qui peut provoquer fatigue, stress et, en cas d'anomalie cardiaque, des crises brèves et généralement mortelles. Le projet étudie la tolérance de cette espèce à la désoxygénation des océans. Le porteur affirme que le recours au modèle animal ne peut être évité car les processus étudiés relèvent de l'organisme vivant, et souligne l'intérêt économique du bar comme espèce exploitée par la pêche.
Objectifs
Le taux d’oxygène dans les océans a baissé d’environ 1 à 2% depuis 1960 et cette désoxygénation des océans pourrait s’accentuer dans les décennies à venir. Elle conduit certaines espèces marines à migrer vers des habitats plus riches en oxygène, conduisant dans certaines zones géographiques à l’effondrement des pêcheries et de l’aquaculture. Pour garantir une pêche durable, il est donc essentiel d’évaluer et anticiper l’impact de la désoxygénation des océans sur les espèces marines, notamment celles d’intérêt économique comme le bar. Dans ce projet, nous nous proposons donc d’étudier les mécanismes physiologiques à la base de la tolérance à l’hypoxie chez le bar européen (Dicentrarchus labrax).
Bénéfices attendus
Dans le contexte des effets du changement global sur l'écosystème marin, ce projet permettra de valider un nouvel outil pertinent pour étudier la tolérance des poissons à la désoxygénation.
Procédures
Tandis que n=90 poissons seront maintenus en condition de normoxie (c’est-à-dire dans une eau normalement oxygénée), n=90 poissons seront placés en condition d’hypoxie modérée (teneur en oxygène réduite à 50% sur 48h). Ils seront maintenus dans ces conditions de désoxygénation durant au moins 6 semaines avant le début des tests de nage. Ensuite, les poissons (n=32 « normoxie » et n=32 « hypoxie ») subiront chacun 1 test en tunnel de nage. Chaque individu sera pêché rapidement, sans anesthésie préalable (pour éviter la sédation répétée des congénères) puis transféré du bac d’élevage vers le tunnel (en quelques dizaine de secondes) dans un seau opaque avec couvercle. Le poisson sera introduit dans le tunnel de nage puis laissé au calme durant 1h avec un faible courant d’eau pour s’habituer doucement au tunnel avant l’exercice plus intense. La période d'exercice de nage durera de 1 à 2h selon la vitesse de nage testée (faible, moyenne ou élevée). Dans la mesure où nous imposerons au poisson de nager, en réduisant éventuellement l’oxygénation du milieu, le test en tunnel de nage est classé procédure sévère.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont les suivantes : - une fatigue physique des animaux qui pratiqueront le test de nage (durée du test : 1 à 2h selon la vitesse de nage imposée) - des malaises si certains d'entre eux présentent des anomalies cardiaques (lorsqu'elles surviennent, les crises sont soudaines, brèves et généralement létales) - du stress lié à la manipulation de gravité légère (pêche, introduction dans le tunnel), lié au changement d'environnement (bac d'élevage versus tunnel de nage) ou encore lié à l'exercice physique lui-même (notamment lors de la nage imposée à vitesse soutenue de 4-6 longueurs corporelles/seconde, maintenue en moyenne 10 minutes avant épuisement). Nous précisons que la pêche du poisson et son transfert dans le tunnel de nage ne devraient pas excéder quelques dizaines de secondes dans la mesure où la salle d’expérimentation est attenante au hall d’élevage. L’émersion de l’animal ne devrait pas durer plus de quelques secondes, juste le temps des transferts du bac d'élevage au seau (
Devenir
Le tunnel de nage étant de classe sévère, les n=64 poissons qui auront subi les tests de nage ne pourront pas être réutilisés pour d'autres projets. Par conséquent, ils seront mis à mort à l'issue des expériences. Les animaux du projet qui n'auront pas subi les tests en tunnel de nage (n=116 poissons restants) seront gardés en vie et intégrés dans d'autres projets.
Remplacement
L'économie du modèle animal ne pourra pas être faite dans la mesure où les processus étudiés s’appliquent à l’organisme vivant, dans son intégrité et toute sa complexité.
Réduction
Les nombres d'animaux envisagés pour ce projet (n=180 en élevage puis n=64 en expérimentation) sont en conformité avec les exigences de Réduction. Ils permettent en effet de tenir compte des contraintes zootechniques et notamment de la densité minimale d’animaux requise pour satisfaire le comportement naturellement grégaire de l'espèce étudiée. Ils permettent aussi de s'assurer de la robustesse de nos analyses statistiques (analyse de variance ANOVA) compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés.
Raffinement
Nous répondrons également aux exigences de Raffinement : tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum l'angoisse et la souffrance des animaux expérimentés. Nous manipulerons les animaux avec soin : nous ferons en sorte que la pêche à l'épuisette soit réalisée rapidement et en perturbant le moins possible les autres animaux (sans trop d'agitation de l'eau). Le poisson sera transporté dans un seau opaque avec couvercle et nous veillerons à ce qu’il ne soit émergé que très transitoirement, juste le temps d'être transféré du bac d'élevage au seau (
Choix des espèces
Cette étude sera réalisée chez une espèce de poisson marin, le bar européen (Dicentrarchus labrax). Il s’agit, depuis plusieurs années, du modèle d’étude privilégié par notre groupe de recherche. Nous en maîtrisons parfaitement l’élevage et possédons des compétences zootechniques telles que nous pouvons garantir un excellent état de santé et de bien-être de nos animaux. Nous possédons par ailleurs des connaissances affirmées sur la physiologie et le comportement de ce poisson. Enfin, il s’agit d’une espèce commercialement exploitée et, à ce titre, les connaissances sur sa capacité à répondre aux contingences environnementales futures sont indispensables pour gérer durablement cette ressource à forte valeur économique. Les bars utilisés dans ce projet seront au stade juvénile (poissons âgés d'environ 1 an et n'ayant pas encore atteint la maturité sexuelle - maturation sexuelle atteinte à 3 ans chez les bars mâles et 5 ans chez les bars femelles).
Compréhension et optimisation des mécanismes immunitaires associés aux anticorps thérapeutiques dans un modèle souris d’infection par le virus influenza
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de la grippe en intra-nasal et reçoivent des anticorps inhalés, une vingtaine subissant en plus une parabiose, chirurgie qui relie deux animaux, avant prélèvement des poumons et des organes lymphoïdes. Le porteur indique que la grippe provoque perte de poids et prostration et qu'aucun anti-douleur ne peut être administré car il fausserait l'évaluation des traitements. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit les infections respiratoires et que le modèle murin est nécessaire avant les essais chez l'humain.
Objectifs
Les infections respiratoires provoquent le décès de plus de 3 millions de personnes chaque année dans le monde. Les pneumonies virales sont particulièrement problématiques du fait de l’augmentation importante des phénomènes de résistances aux chimiothérapies anti-microbiennes, la dérive antigénique des et/ou l’émergence de nouveaux virus. Aujourd’hui, les anticorps (Ac) sont administrés exclusivement par voie intraveineuse (i.v). Or, cette voie n’est pas appropriée pour le traitement des maladies pulmonaires. En effet, les Ac ne diffusent pas jusqu’au au territoire pulmonaire. Depuis plusieurs années, des données précliniques soutiennent l’intérêt de l’inhalation pour améliorer l’efficacité des Ac. Cette voie d’administration est d’ores-et-déjà une référence pour l’utilisation de bronchodilatateurs ou de corticoïdes chez les patients atteints d’asthme ou de bronchopneumopathies obstructives. L’inhalation permet d’administrer d’Ac directement dans le poumon, sous la forme d’un aérosol. Lors d’infections respiratoires, ceci permettrait une plus grande rapidité d’action des Ac, une forte concentration à proximité de l’agent pathogène, tout en limitant le passage systémique et les potentiels effets secondaires des Ac. Nous avons démontré que le processus d’aérosolisation permettait d’administrer des Ac ayant conservé leurs propriétés physiques et immunologiques, grâce à l’utilisation de dispositifs médicaux adéquats et au développement de formulations spécifiques. Nous avons également démontré qu’un Ac dirigé contre une bactérie responsable de pneumonies, administré par inhalation, atteignait les poumons en plus grande quantité comparativement à une administration par voie i.v. Ceci était associé à une meilleure efficacité. Des études préliminaires ont montré qu’une administration pulmonaire unique d’un Ac anti- bactérien ou anti-grippe avec certains agents immunomodulateurs permet de protéger les individus face à une seconde infection. Ce projet vise donc à décrire et comprendre les réponses immunitaires anti-infectieuses à long terme induites par des Ac administrés par voie pulmonaire en combinaison avec des agents immunomodulateurs dans un modèle pertinent d’infection grippale afin de favoriser leur transfert vers la clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet, basé sur des données préliminaires solides, vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes basées sur des combinaisons d’anticorps et d’immunomodulateurs inhalés pour induire une réponse à long terme contre des pathogènes respiratoires. Cette approche Ac/immunomodulateurs offrirait une alternative thérapeutique aux antibiotiques/antiviraux, contre des pathogènes résistants, avec un effet durable permettant de prévenir les infections secondaires. Cette demande s’inscrit dans plusieurs programmes, dont un programme de collaboration européen, un laboratoire d'Excellence et un projet de co-maturation Ces stratégies thérapeutiques innovantes visent à traiter à la fois des infections respiratoires d’origine virale avec un tropisme nasal, et associée à des pneumonies. En clinique, ces infections sont rencontrées dans des contextes aigües (infections communautaires, nosocomiales) mais également récurrentes (infections saisonnières) et représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’inhalation d’Ac en combinaison avec des immunomodulateurs, pourrait offrir les avantages d’une nouvelle option thérapeutique face à l’antibiorésistance et d’un effet à long terme pour prévenir de nouvelles infections (chez un même individu) par ce pathogène, qui est rencontré à la fois lors d’infections respiratoires aigües mais aussi chroniques. Plus largement, l’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs pourraient être exploitée dans d’autres pathologies infectieuses respiratoires (infections à d’autres virus comme le virus respiratoire syncytial ou le SARS-CoV-2). Les effets à court terme et à long terme des Ac sont déjà documentés et utilisés pour le traitement de diverses pathologies. Il s’agit ici d’utiliser une voie optimale pour l’administration des Ac à visée respiratoire (voie inhalée) et de potentialiser leurs effets en combinant les Ac avec des immunomodulateurs pour en faire des médicaments plus efficaces contre la réapparition d’infections secondaires. La voie inhalée propose une administration non-invasive directement dans le territoire malade (nez ou poumon) pour une action rapide dans le tissu malade.
Procédures
_Infection et ré-infection par voie intranasale : sous anesthésie générale, 2930 animaux, 1 fois, durée: 30 secondes _Administration des agents immunomodulateurs par voie intranasale/oro-trachéale : sous anesthésie générale, 2930 animaux, 1 fois, durée: 30/90 secondes _Administration des agents immunomodulateurs par voie intraveineuse : animal vigile, 195 animaux, 1 fois, durée: 30 secondes _Prélèvement de sang : sous anesthésie générale, 2930 animaux, 1 fois/semaine, durée: 30 secondes _Parabiose : sous anesthésie générale, 20 animaux, 1 fois, durée: 1 heure
Impact sur les animaux
Des données préliminaires obtenues au laboratoire vont nous permettre de limiter le nombre de doses à tester pour les anticorps/agents immunomodulateurs, à celles ne présentant aucune toxicité pour l’animal. Les infections respiratoires sont indolores puisque le poumon n’est pas un organe nociceptif (ne transmet pas de signal de douleur). Cependant, ces infections peuvent générer une inflammation et une gêne respiratoire qui peuvent être douloureuses selon leurs intensités. Aucun traitement antidouleur ou anti-inflammatoire ne peut malheureusement être envisagé pendant l’évolution de la maladie car ceci entrainerait un facteur confondant avec l’évaluation de l’efficacité des stratégies thérapeutiques. Les effets indésirables associés au modèle d’infection grippale chez la souris démarrent entre J2 et J5 post-infection, selon la dose infectieuse et le traitement, avec une pic entre J7 et J9. Ils se caractérisent notamment par une perte de poids provoquée par une altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir ou de boire, poil hirsute…). L’amélioration progressive des symptômes culmine entre J10-12 post-infection avec un retour au poids initial. Le prélèvement de sang par ponction du sinus submandibullaire sur animal vigil engendre du stress pendant la durée de la contention et peut également provoquer un hématome sur la zone de piqure. Concernant le modèle de parabiose, les effets indésirables connus sont une perte de poids, une augmentation du stress (associé à une production de corticostérone), une altération des capacités d'exploration/nidation et une diminution des capacités motrices qui dure entre 0 et 7 après la chirurgie et sont totalement rétablis après 4 semaines.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux anticorps thérapeutiques/immunomodulateurs anti-infectieux inhalés. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux infections respiratoires et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles murins d’infection à influenza sont très bien décrits dans la littérature et permettent de mimer les phénomènes observés chez l’Homme. Les outils transgéniques, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans la protection à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs, sont disponibles chez la souris.
Réduction
Au total, 2930 animaux seront utilisés pendant 5 ans. Ce nombre d’animaux a été optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …). Les modèles murins d’infection à influenza sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont réalisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences inutiles. La souris est le modèle le plus adapté pour ces études précliniques car nous pouvons étudier la mécanistique de l’effet à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs délivrés par voie pulmonaire sur les cibles immunitaires mises en jeu dans l’effet recherché. Nous comparerons des lots d'animaux infectés/non infectés et des lots d'animaux traités (Ac/immunomodulateurs)/non traités. Pour chaque cas, différentes doses d'agent infectieux ou de molécules thérapeutiques seront testés afin d'améliorer la transposabilité de nos résultats à la clinique.
Raffinement
Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin et fragments de boîtes d’oeufs. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale et l’atteinte des points limite. Un soin particulier sera apporté les 7 jours suivants une infection. De la nourriture en gel sera déposée de manière préventive dans les cages afin de faciliter l’accès à l’eau et à la nourriture pour les animaux les plus impactés par l’infection. Afin de limiter une surmortalité associée à la procédure chirurgicale, les animaux sélectionnés seront hébergés par paire et observer quotidiennement pendant au moins deux semaines avant la procédure afin de s’assurer d’une cohabitation harmonieuse. Des traitements analgésiques et antibiotiques seront administrés en post-opératoire. L'usage des éléments d'enrichissement et de la litière sera progressivement rétablit après la chirurgie afin d'éviter toute blessure à l'animal.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses à long terme font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes, (2) sont directement liées au contexte inflammatoire de l’hôte et (3) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration Le choix de deux modèles expérimentaux différents s’explique par leurs caractéristiques immunologiques spécifiques qui à terme pourraient moduler l’effet à long terme des Ac. Le modèle infectieux à Influenza présente une cinétique d’apparition des symptômes lente (6 à 7 jours). L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux Ac. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec certaines procédures. Ce facteur poids rend les animaux plus résistants à l’infection et là encore pourrait gêner la correcte évaluation de l’efficacité de la réponse immunitaire au traitement.
Métabolisme et homéostasie du tissu adipeux dans un modèle murin de pathologie de type autisme (EU3/3)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souris génétiquement modifiées portant une mutation liée à un trouble de type autisme subissent des tests métaboliques, gavage de glucose, injections d'insuline et prélèvements de sang répétés, avant l'euthanasie pour prélever leurs organes. Le projet cherche à comprendre pourquoi ces souris perdent leur tissu adipeux, en lien avec la pathologie neurodéveloppementale. Le porteur affirme que seule une étude in vivo permet d'identifier l'effet de la mutation et qu'il n'existe pas d'autre modèle animal mimant la maladie.
Objectifs
L'intégrité des connections entre les neurones (synapses) est indispensable au bon fonctionnement du cerveau. Nous travaillons sur une protéine qui est essentielle pour le bon développement du système nerveux et la mise en place des synapses. Cette protéine est codée par un gène qui vient d'être identifié comme à risque pour l’apparition de troubles neurodéveloppementaux. En effet, les patients ayant une mutation dans ce gène présentent une déficience intellectuelle ainsi que des troubles de type autisme. Nous avons caractérisé une nouvelle mutation de cette protéine par des analyses in vitro. Pour aller plus loin dans la compréhension de l’impact de cette mutation sur le fonctionnement cérébral, seule une étude in vivo pourra permettre d’identifier comment notre variant perturbe la mise en place des circuits neuronaux. Dans ce but, nous avons créé un modèle de souris portant cette mutation, afin d’étudier les effets potentiels sur l’apprentissage et le comportement. De façon inattendue, les animaux mutants perdent leur tissu adipeux. Dans cette étude nous souhaitons comprendre comment le variant affecte le métabolisme des souris en lien avec la pathologie neurodéveloppementale. De telles connaissances pourraient permettre i) de mieux comprendre ce qui se passe chez les patients pour améliorer leur prise en charge médicale, en particulier en s’intéressant à leur métabolisme et à leur alimentation, ce qui n’est pas du tout fait aujourd’hui ; ii) d’ouvrir des pistes de recherches à visée thérapeutique pour ces patients.
Bénéfices attendus
La souris permet l’utilisation d’approches génétiques pour reproduire les mutations trouvées chez l’homme. Les caractéristiques des souris utilisées sont bien connues ce qui permet d’étudier l’effet du variant de notre protéine cible sur le comportement, l’apprentissage, et la physiologie. Le modèle mutant que nous venons de développer n’existe pas et représente un outil très important pour pouvoir mimer la pathologie humaine. C’est le premier modèle de cette pathologie découverte récemment. Grâce à ce projet, nous allons pouvoir déterminer quel est l’impact de ce variant sur le métabolisme et le maintien du tissu adipeux, en lien avec la pathologie neurodévelopementale. Personne ne s’est encore intéressé aux problèmes potentiels de métabolisme et d’alimentation chez ces patients, et ce nouvel aspect peut avoir un réel impact pour une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Les animaux subiront des tests non-invasifs pour caratériser leur croissance, leur composition corporelle et leur métabolisme. Pour caractériser le métabolisme du glucose, tous les animaux vigiles subiront une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 5 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte espacés sur 2 heures (2 secondes par prélèvement. Après une semaine de repos, tous les animaux vigiles subiront une injection intra-péritonéale (volume et aiguille respectant les recommandations / 3 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte de sang à la queue, espacés sur 2 heures (2 secondes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Pour l'étude de la thermorégulation, les animaux subiront un stress léger lié à la manipulation lors des tests de composition corporelle (1min30/semaine), de motricité (3 fois 10 min) et de comportement (2 fois 15 minutes). Lors de la mesure du métabolisme respiratoire (48h) on peut attendre un stress modéré lié à l’individualisation nécessaire pour l’analyse. Pour le test de tolérance au glucose, on peut attendre une perte de poids de 10 à 15% liée au jeun (12h sur la nuit, de 20h à 08h) et les animaux subiront une administration orale de glucose. Pour le test de résistance à l’insuline, le jeun de 4h le matin n’induit pas de perte de poids et les animaux subiront une injection intrapéritonéale d’insuline. Dans ces deux derniers tests, les prélevements sanguins à la queue induisent une douleur légère. Pour l'étude de l'influence d'un régime hypercalorique, qui reprend les mêmes tests mais sur des animaux ayant une nourriture plus riche, on attend les mêmes effets indésirables. L'élevage (accouplements pour production des cohortes) implique l'isolement d'animaux pour accouplement. Seuls les mâles seront isolés, pour une période maximale de 2-4 semaines.
Devenir
A la fin de chaque procédure, nous euthanasierons les animaux afin de réaliser le prélèvement des organes et les analyses moléculaires et biochimiques nécessaires à la compréhension des mécanisme d’action de notre variant.
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être remplacé, car seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet du variant de notre protéine neuronale sur le fonctionnement cérébral et le métabolisme. De plus, il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu d’utiliser au maximum 80 souris sur une période de 2 ans. Le nombre nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats a été calculé avec un logiciel de statistique, sur la base de publications précédentes et de notre expérience (niveau de significativité : p=0.05). Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos procédures expérimentales car des différences ont été observées dans le développement des symptômes chez les garçons et les filles porteurs de la mutation. Les deux procéduresexpérimentales étant réalisées à des températures d’élevage différentes (28° vs 22°), nous ne pouvons pas utiliser le même lot contrôle. Pour l'élevage, nous utiliserons 40 animaux mutés, qui est le nombre nécessaire pour produire les lots d'expérimentation.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 par cage afin de limiter stress et angoisse. Leur environnement sera enrichi par un carré de ouate et un tunnel en plexi rouge. Le tunnel permet aux animaux de s’habituer à l’analyse de composition corporelle qui est pratiquée elle aussi dans un système de tunnel de contention rouge. La nourriture et l’eau sont disponibles ad libitum et ils suivront un cycle naturel jour/nuit (12h/12h). Lors du change qui sera fait de façon hebdomadaire, on conservera le tunnel et une partie du nid pour garder les odeurs des animaux dans la cage propre et limiter le stress. Pour réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement, y compris les weekends, et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés et seront répertoriés avec des grilles de douleur/suivi. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance sont détectés. Enfin, les animaliers s’occuperont toujours des mêmes souris qui seront changées selon un planning hebdomadaire strict afin d’éviter de les stresser. Les administrations seront réalisées avec des solutions à température ambiante (administration orale de glucose) ou tiédie (injection intrapéritonéale d’insuline).
Choix des espèces
Seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet du variant de notre protéine neuronale sur le fonctionnement cérébral et le métabolisme. Nous avons choisi le modèle murin car nous avons pu reproduire par modification génétique le modèle de la pathologie humaine. Il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie. Nous commencerons les tests à environ 10 semaines, puisque nous avons observé précédemment une diminution de poids à cet âge. Dans nos deux procédures, les animaux subissent les mesures du métabolisme respiratoire, les analyses du métabolisme du glucose et l’euthanasie aux mêmes âges.
Caractérisation d’un nouveau gène candidat PLCB1 impliqué dans les myopathies congénitales à spirales cylindriques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris génétiquement modifiées, dépourvues d'une protéine liée à une myopathie humaine, subissent une série de tests moteurs, de la mesure de force à la marche forcée sur cylindre rotatif, avant d'être tuées sous anesthésie pour prélever leurs muscles. Le porteur indique que ce modèle présente une morphologie anormale de plusieurs organes et une faible espérance de vie, la plupart des animaux privés du gène fonctionnel mourant au sevrage vers trois semaines. Il affirme que seule la souris permet de reproduire les défauts musculaires observés chez l'humain, la protéine étant conservée à 97 %.
Objectifs
Après avoir identifié une mutation candidate dans un gène engendrant une protéine impliquée dans la production de lipides chez une famille avec deux enfants atteints de myopathie à spirales cylindriques, nous souhaitons valider l'impact de cette mutation dans la maladie avec un modèle souris afin de valider un nouveau gène de myopathie et le diagnostic de cette famille. Cette mutation est présente sur les 2 copies présentes du gène chez les enfants et correspond à une perte de fonction, c'est-à-dire que nous avons démontré qu'elle entrainait une diminution de la lecture du gène dans les cellules entrainant donc une diminution de la production de protéine. Ce projet vise donc à caractériser un modèle souris ne possédant pas cette protéine dans le but de valider le rôle de la perte de fonction du gène dans la maladie grâce à des études du tonus et de la force musculaires et de la forme, de l'aspect et du fonctionnement moléculaire du muscle chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront tout d'abord de valider l'implication de ce gène dans les myopathies congénitales, et d'identifier une nouvelle cause génétique possible. De plus, ils permettront de mieux comprendre les protéines impliquées dans ces pathologies, dans le muscle sain et dans le développement de la maladie. Valider un nouveau gène dans les myopathies congénitales permet tout d'abord d'avoir de nouveaux diagnostics pour les familles de patients et aussi d'avoir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le développement de traitements de la maladie.
Procédures
Les souris sont marquées afin d'être identifiées et un suivi journalier sera assuré. Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques entre 3 semaines et 8 mois d'âge maximum : - La mesure de la force du corps : les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 3 min maximum et elle sera mesurée 1 fois par mois. - La mesure de la force des pattes : le test sera effectué pendant 30 sec maximum et sera réalisé une fois par mois. - L'évaluation de la capacité de l'animal à se mouvoir : les animaux sont placés dans une enceinte contenant des cages individualisées pour le suivi de l'activité locomotrice pendant 24h. Ce test se fera 1 fois par mois. - La mesure de l'endurance et de la résistance à la fatigue : le test dure 5 jours et les souris marcheront sur un cylindre rotatif pendant 5 à 15 min par jour. Ce test ne sera réalisé qu'une seule fois durant l'étude. - La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ : il s'agit d'un test qui ne sera réalisée qu'une seule fois par souris et la durée totale, de l'anethésie jusqu'à la fin des mesures, sera de maximum 1h. Au maximum, 28 tests de phénotypages seront effectués sur les souris vivant jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, un seul gène est muté générant chez la souris un phénotype sévère et dommageable entrainant une faible espérance de vie, de 3 semaines d'après la littérature existante. A ce jour, seul le modèle ne portant qu'une seule copie fonctionnelle du gène a été observé , les animaux ne portant pas le gène fonctionnel mourant pour la plupart au moment du sevrage, c'est-à-dire à trois semaines de vie. Les souris observées ont été décrites comme présentant une morphologie anormale des ovaires, un foie plus grand, une rate plus grande, des noeuds lympahtiques plus grands, une morphologie anormale des reins et des yeux. Les animaux ne présentent pas d'infertilité contrairement aux animaux ne portant pas le gène fonctionnel. Les caractéristiques musculaires de ce modèle n'ont encore jamais été évaluées, à notre connaissance. Les différents tests phénotypiques permettant de suivre et mesurer la force, la résistance à l'exercice et la capacité à se mouvoir de la souris pourront induire du stress pendant une durée pouvant aller de 1 min à 15 min maximum et pourront induire de la fatigue à la fin des tests.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour tous les tests jusqu'au test de la mesure des propriétés contractiles des muscles. A l'issu de ce test qui est réalisé sous anesthésie, les animaux sont mis à mort sous anesthésie et les organes seront prélevés pour des études moléculaires des muscles. Cela concerne l'ensemble des animaux d'expérience, soit 60. Pour ce qui est des animaux permettant le maintien de la lignée durant l'étude, une fois que le nombre souhaité d'animaux d'expérience sera atteint, les animaux ayant permis leur naissance seront mis à mort afin d'éviter la multiplication d'animaux alors que l'étude sera terminée.
Remplacement
Pour caractériser la myopathie à spirales cylindriques et identifier l'impact de la mutation du gène d'intérêt, nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l'Homme, il nous permet de valider la pathogénécité de cette mutation. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation de l'atteinte musculaire seraient impossible à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les études réalisées. De plus, l'étude sera longitudinale afin de travailler sur les mêmes animaux sans en multiplier leur nombre. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d'accouplements avec deux femelles pour un mâle. L'observation des souris permettra d'optimiser au mieux leur nombre. Nous prévoyons cependant 185 animaux pour cette étude. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisée avec un test maximum par jour.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d'améliorer le bien-être de l'animal. Si des difficutés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l'animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupes de 2 à 4 par cage et la qualité de l'air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d'accouplements seront constitutées de deux femelles par cage facilitant l'élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance, il seront donc surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaines. Si une perte d'état rapide est observée chez les animaux, l'étude sera alors stoppée. De même, en cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l'étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d'évaluer et de comprendre l'impact de la perte de fonction de la protéine d'intérêt dans la myopathie en spirales cylindriques, une pathologie humaine, nous avons besoin d'étudier son effet sur les fibres musculaires, de préférence chez les mammifères. La protéine que nous étudions est très bien concervée chez la souris avec 97% d'homologie. Ceci suggère une fonction très similaire chez l'humain et la souris. De plus, la structure des muscles est similaire chez la souris et l'humain. Les myopathies causant des défauts structuraux du muscle, la souris nous permettra de reproduire le plus fidèlement possible les défauts observés chez l'humain et ainsi de modéliser au plus près la maladie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherche dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier l'impact de la mutation sur le phénotype d'un individu entier ainsi que sur la structure de la fibre musculaire. Le modèle utilisé étant déjà décrit comme ayant une faible espérance de vie, les études phénotypiques seront faites à 3 semaines de vie. Les souris seront néanmoins obervées et suivies attentivement de la naissance jusqu'à la mise à mort.
Evaluation pharmacologique de composés naturels ou de synthèse pour le traitement de la Covid-19
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le SARS-CoV-2 en intra-nasal ou intra-gastrique puis gavées de molécules jusqu'à dix jours, avant prélèvement d'organes, l'infection provoquant posture courbée, détresse respiratoire et prostration. Le porteur présente le projet comme une plateforme de prestation de service à destination de futurs clients académiques ou privés, testant des antiviraux à la demande. Il affirme qu'il est "crucial" d'utiliser un organisme vivant entier et que des modèles in vivo sont "incontournables".
Objectifs
Le SARS-CoV2 est le virus responsable de la maladie appelée COVID-19. Le manque de vaccin et d'antiviraux a révélé un besoin urgent d'études in vivo pertinentes afin d'évaluer de nouvelles molécules potentiellement anti-SARS-CoV2. Différents modèles de souris dont un modèle de souris génétiquement modifiées pour être sensibles au virus SARS-CoV2 a été décrit dans la littérature. Ces souris, disponibles dans le commerce sont un outil de choix pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 et pour évaluer les vaccins et les produits thérapeutiques COVID-19. L’ambition de ce projet est de proposer une plateforme technologique, à destination de futurs clients, académiques ou privés, où des souris sensibles au virus seront utilisées pour tester de nouvelles molécules antivirales pour le traitement de la COVID-19. Pour comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus, il est en effet crucial à ce stade, d’utiliser un organisme vivant dans son ensemble. Différentes techniques in vitro ont déjà été utilisées en amont. Nous avons donc pour objectif de contribuer au développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est l'épidémie de Covid-19.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle souris pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 contribue à comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus. Ce modèle préclinique in vivo permet d’évaluer des vaccins et des produits thérapeutiques Covid19
Procédures
Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée mais le nombre de prélèvements est limité. Pour chaque injection (sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse) mais également pour le gavage la durée maximale est de 1min, cela comprend le temps de la contention et de l'injection. Pour les prises de sang, l'animal est anesthésié dans la boite à induction pendant 2 à 3 min, puis la prise de sang est réalisée. L’animal est ensuite remis dans sa cage et surveillé. L’ensemble dure maximum 5 min. Certains animaux seront soumis à 2 tests de tolérance au glucose au cours de la procédure Pour des procédures dites « classiques », les souris anesthésiées seront infectées par le SARS-CoV2 selon la voie définie (voie intra nasale ou voie intra gastrique), un gavage de molécules tous les jours pendant maximum 10 jours avant prélèvement d’organes
Impact sur les animaux
Chez la souris, l’infection au SARS-CoV2 induit les signes cliniques d’une maladie infectieuse : posture courbée, pelage en piloérection, respiration difficile, prostration ou perte d’activité et perte de réponse à un stimulus.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Il n’y a pas de possibilité de replacement, vu le contexte hautement pathogène
Remplacement
L’amplitude de l'épidémie de Covid-19 ainsi que l'absence de traitement de référence rend urgente la découverte de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de l'étude de l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection, qui résulte non seulement de l’effet de ce composé sur le virus mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur cet agent pathogène. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies sont incontournables. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie.
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre calculé de souris nécessaires sera au maximum de 4500 sur 2 ans. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules antivirales à tester, doses différentes de la molécule antivirale). Le nombre d'études variera en fonction de la demande des utilisateurs de la plateforme. Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre de souris requises pour une année.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Pour les souris mâles en condition d’obésité et de diabète un change supplémentaire sera réalisé en fonction de l’état de la litière en particulier dû à la production d’urine. Des sacs dégradables contenant la litière sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid, comme enrichissement du milieu. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal. Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée aux procédures expérimentales par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) pendant tous les gestes douloureux, lors des différentes injections des traitements potentiels (injection intraveineuse, injection intra-musculaire...). Tout animal présentant des signes de douleur, souffrance ou stress sera mise à mort. Les critères d’arrêt utilisés sont: - Le suivi quotidien du poids - La combinaison de plusieurs des signes cliniques : posture courbée, piloérection, difficulté respiratoire, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Une grille de scoring permettra le suivi quotidien et une intervention précoce en cas de signes dus à la pathologie.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux d'infection au Sars-CoV-2 sont actuellement utilisés par la communauté scientifique : les primates non humains, les chats, les furets, les hamsters et les souris. Les souris sont largement utilisées dans les études d'immunologie et de lésions pulmonaires, ont un système immunitaire bien caractérisé et un cycle de reproduction rapide. Leur taille, leur reproduction et leur croissance rapides constituent des avantages non négligeables pour accélérer la complétion des études associées à des tests statistiques pour conclure à l'efficacité des interventions potentielles. Souris de 5 à 10 semaines minimum et jusqu’à 30 semaines.
Evaluation de l’efficacité in vivo d’anticorps thérapeutiques contre le virus Nipah en modèle hamster
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
30 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit des anticorps puis une infection par le virus Nipah en intra-nasal sous anesthésie, avant d'être tué pour prélèvement du sang et des organes. Le porteur indique que l'infection provoque des atteintes neurologiques et respiratoires comparables à celles observées chez l'humain, suivies par une matrice de score. Il affirme que l'évaluation de l'activité d'un anticorps sur un virus passe encore obligatoirement par un modèle animal.
Objectifs
Le virus Nipah (NiV) est un virus ayant émergé dans les années 90 en Asie du Sud-Est, contre lequel il n’existe pas à l’heure actuelle de vaccin ou traitement. Le virus Nipah est un virus pouvant se propager via les animaux mais également par des contaminations interhumaines. Il est responsable d’encéphalites sévères et/ou de syndromes respiratoires chez l’humain, avec un taux de mortalité relativement élevé (jusqu’à 75% selon les souches). Ce pathogène constitue un problème de santé publique majeur. La maladie induite par ce virus figure sur la liste de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) des maladies prioritaires en matière de recherche et développement. Ce projet collaboratif propose l’évaluation d’anticorps à visée thérapeutique, préalablement criblés in vitro, dans un modèle maîtrisé pour le virus Nipah.
Bénéfices attendus
Dans le contexte d’absence de traitement ou vaccin contre le virus Nipah, le développement et l’évaluation de ces anticorps permettraient d’identifier un ou plusieurs candidats. Ce/ces anticorps pourront ensuite être potentiellement utilisés chez l’Homme en contexte de traitement après une exposition potentielle au virus chez les personnels de santé ou manipulateur du virus, ou en traitement curatif chez les patients.
Procédures
La procédure expérimentale soumettra chacun des animaux, de la réception jusqu’à la fin du protocole à : des anesthésies gazeuses (au nombre de 3 prévues au protocole, hors cas de gestion de la douleur), une administration des anticorps par voie intra-péritonéale (sur animal anesthésié), une administration du virus par voie intra-nasale (sur animal anesthésié), et enfin à une anesthésie puis mise à mort pour réaliser les prélèvements de sang et des organes d’interêt.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus Nipah engendre, dans les modèles d’études caractérisés, des atteintes neurologiques et troubles respiratoires, relativement comparables à ceux observées chez les humains. Les animaux inclus dans cette étude seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tous symptômes comme décrits dans la matrice de score (modifications de l’aspect, perte de poids, diminution de la réactivité, troubles de la démarche, troubles respiratoires, signes neurologiques).
Devenir
L'étude implique que les organes puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux (n=30), ceux-ci étant répartis en 5 groupes expérimentaux. Par conséquent, seule la mise à mort des 30 individus de l'étude permettra d'obtenir des données virologiques suffisantes permettant de comparer l'efficacité des anticorps comme mesure thérapeutique antivirale.
Remplacement
Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire (classiquement utilisée depuis des décennies). Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Suite au développement et à la caractérisation in vitro d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines du virus Nipah, l’activité antivirale de ces anticorps a pu être évaluée par criblage contre le virus Nipah (souche Malaisie). Ces différentes étapes ont abouti à l’identification de 3 candidats. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ceux-ci, ils doivent désormais être confrontés dans un modèle plus complexe mimant l’infection par le virus Nipah. Ces tests in vitro ne permettent pas actuellement de répondre à des questions globales telles que la mise en place de la pathologie, le développement symptomatologique ou la mise en place des réactions immunitaires suite à une réponse à un traitement et à une épreuve virale. L’étude de l’activité d’un anticorps sur un virus passe donc encore obligatoirement par l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Les animaux inclus dans cette étude seront infectés par une dose étudiée précédemment et permettant une observation de symptômes chez la totalité des individus. Des prélèvements seront réalisés sur chaque animal afin de collecter du sang pour des analyses complémentaires mais également pour permettre une formation à des gestes techniques adaptés aux conditions de sécurité biologique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par 3 dans des cages adaptées au système d’hébergement. Malgré le confinement plus strict lié aux activités du laboratoire, les conditions d’hébergement classiques sont maintenues. Les observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon une matrice de score établie pour ce modèle et selon le virus utilisé et les signes cliniques attendus. En période de week-end avant challenge viral, un système de vidéosurveillance permettra de visualiser si les animaux ont toujours de la nourriture et de la boisson. À tout moment, en cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en zone sera programmée pour procéder à une observation des animaux et à une possible décision d’arrêter le protocole.
Choix des espèces
Le hamster doré est le modèle de référence pour l’étude du virus Nipah. Il a été développé il y a quasiment 20 ans puis a été utilisé dans le cadre de divers projets collaboratifs. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines selon la disponibilité. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études pré-cliniques portant sur le virus Nipah.
Evaluation de l’effet de composés thérapeutiques dans les Encéphalomyélites auto-immunes (EAE)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune, modèle de sclérose en plaques, leur est induite par injections, puis des molécules candidates sont injectées jusqu'à cinq semaines, avec un suivi moteur quotidien de la marche et du tonus de la queue. Le porteur indique que la maladie réduit les capacités motrices et qu'aucun anti-douleur ne peut être administré pour ne pas fausser l'effet des composés testés, les souris étant tuées pour prélèvement d'organes. Il affirme que la culture de cellules ne permet pas d'intégrer les mécanismes de compensation de l'animal.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le pouvoir protecteur et thérapeutique de candidats médicaments, dans les maladies démyélinisantes du système nerveux central.
Bénéfices attendus
Cette étude participera directement à la découverte et la mise au points de nouveaux composés thérapeutiques dans le cadre du traitement de la sclérose en plaques.
Procédures
Les souris sont soumises à une induction d'encéphalomyélite allergique une unique fois induite par 4 injections sous-cutanée de 10 secondes chacune. Les molécules testées sont injectées en intrapéritonéal à raison de 3 injections par semaine (5 secondes par injection) jusqu’à 5 semaines. Les tests moteurs réalisés consistent en une observation des capacités motrices des souris dans des conditions non contraintes sorties de leur cage (tonus de la queue, qualité de la marche). A partir du 7ème jour après induction, ces tests sont journaliers, durent 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les composés testés n'ont dans des études préliminaires jamais démontré d'effet toxique sur les animaux. Cependant, l'induction de l'encéphalopathie allergique expérimentale n'est pas sans conséquences sur le bien-être animal, avec une réduction de ses capacités motrices, qui est cependant transitoire et strictement encadré par le suivi des points limites. Bien que la manipulation des souris se fasse dans l’environnement le plus apaisant possible (limitation du bruit et de la luminosité), la manipulation des souris en dehors de leur cage ainsi que les injections est susceptible de générer un inconfort. Les molécules testées ayant pour but de traiter la pathologie, les plus efficaces amélioreront le bien-être des animaux dans ces conditions expérimentales en réduisant leurs atteintes motrices.
Devenir
A l'issu de la procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement et analyse des organes.
Remplacement
Le projet est basé sur des études in vivo pour permettre de développer des stratégies thérapeutiques dans le cadre des études translationnelles entre la clinique et la recherche. Dans ce cas, la culture de cellules ne permet pas d’appréhender la physiologie pour intégrer les mécanismes de compensation développés par l’animal. Toutefois, dès que possible les mécanismes cellulaires et moléculaires sont étudiés sur culture cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est calculé pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Des points limites prédictifs ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance. Afin de minimiser les souffrances infligées aux animaux, des cupules d'eau gélifiées sont mises à disposition à l'apparition des premiers symptomes. Afin de ne pas fausser les effets des composés thérapeutiques testés, aucun anti-douleur ne peut être ajouté, cependant les souris sont surveillées quotidiennement à partir du jour 7 post induction afin de monitorer les symptomes et les souris sont sacrifiées en cas d'atteinte du point limite.
Choix des espèces
Des points limites prédictifs ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance. Afin de minimiser les souffrances infligées aux animaux, des cupules d'eau gélifiées sont mises à disposition à l'apparition des premiers symptomes. Afin de ne pas fausser les effets des composés thérapeutiques testés, aucun anti-douleur ne peut être ajouté, cependant les souris sont surveillées quotidiennement à partir du jour 7 post induction afin de monitorer les symptomes et les souris sont sacrifiées en cas d'atteinte du point limite.
Marqueurs prédictifs de la variabilité cognitive et sociale individuelle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère, environ deux cent quarante tuées à l'issue pour des analyses du cerveau et cent vingt souris 'visiteuses' gardées pour d'autres projets. Les souris expérimentales subissent une chirurgie d'implantation, une série de tests comportementaux de l'adolescence à l'âge adulte, puis un isolement de trois semaines avec restriction alimentaire, que le porteur désigne comme la principale nuisance. Le projet cherche des marqueurs de la variabilité cognitive et sociale entre individus, avec une visée à terme sur la psychiatrie humaine. Le porteur affirme qu'il ne peut être mené ni par des modélisations informatiques ni sur une espèce autre que les mammifères.
Objectifs
Notre objectif est d'établir les interactions, et potentiellement, les origines, de la variabilité cognitive & sociale inter-individuelle, d'en comprendre les mécanismes de mise en place et de déterminer si nous pouvons l'orienter. Nous étudierons pour cela comment les interactions entre profils sociaux et cognitifs émergent.
Bénéfices attendus
Ce projet qui repose sur l’établissement de profils comportementaux individuels et sur leur évolution au cours de la vie possède une dimension translationnelle importante car il entend identifier les profils « extrêmes » pouvant évoluer vers un état pathologique et identifier les marqueurs neurobiologiques de ces facteurs de vulnérabilité. Si cette approche s’avère fructueuse, nos résultats pourraient en outre apporter des éléments en faveur de la réduction du nombre d’animaux dans les expériences comportementales et favoriser les études dimensionnelles et personnalisées comme cela commence à se faire chez l’humain en psychiatrie.
Procédures
Les animaux expérimentaux (120 mâles et 120 femelles) seront soumis à une procédure chirurgicale de 5 minutes. Des tests comportementaux nécessaires pour définir des profils sociaux et cognitif sont réalisés à l’adolescence et l’âge adulte grâce à quatre tâches ( deux tâches de 3 jours et deux durant 5 min et 1h). Uniquement à l'âge adulte, un isolement de 3 semaines sera réalisé.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet la majeure nuisance sera un isolement à l'âge adulte . Lors de cette procédure, les animaux subissent une restriction alimentaire
Devenir
Dans les trois procédures, les animaux expérimentaux seront euthanasiés pour nous permettre de determiner des paramètres neurorbiologiques en lien avec les profils sociaux et cognitifs. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d'étudier le développement de la cognition sociale et de l’organisation d’interaction sociale dans un groupe chez des animaux sains et conspécifiques, d'en comprendre les bases neurales et biologiques, il ne peut donc pas être remplacé par des modélisations informatiques, ni être conduit chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
La réduction des animaux est faite par le suivit des mêmes animaux de l'adolescence à l'âge adulte pour eviter d'avoir deux groupe indépendants.
Raffinement
Le raffinement de nos mesures est dans la mise en place d'un environement semi-naturel avec mesure semi-automatique des comportements. Nous avons également un enrichissement minimum des animaux standard (cabane, sizzle, cotton).Pour ces chirurgies d’implantation de puces, les animaux sont anesthésiés grâce à un gaz . Nous rasons les poils, mettons un antiseptique et procédons également à une anesthésie locale de la peau avant ouverture. Afin de réduire les effets anxiogènes de l'isolement social, des objets permettant de faire un nid seront disposés dans les cages de vie. A l’âge adulte, Après ces deux tâches qui nécessitent une mise temporaire en cage individuelle à l’âge adulte, les souris sont replacées en cages collectives pour les manipulations suivantes. Nous avons déjà réalisé ces regroupements qui se passent généralement sans problème. Les animaux seront évalués dans les 3 premiers jours après le regroupement grâce à une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.. Durant les procédures de restriction alimentaire ou de changement de régime alimentaire, afin de s’assurer de la bonne adaptation des animaux à cette procédure, ils seront suivis chaque jour selon une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités cognitives et sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Notre projet consistant à étudier le comportement des animaux à différents stades de développement, nous utiliserons donc les animaux à l’adolescence puis à l’âge adulte.