Procédures sévères

1 000 souris et 2 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent par gavage quotidien des molécules jamais testées auparavant, à des doses pouvant atteindre 300 mg/kg par jour, avec prélèvements sanguins répétés et jeûnes allant jusqu'à 16 heures, pour cribler des produits chimiques en début de développement. Le porteur indique que les effets peuvent être sévères, avec convulsions, tremblements, prostration et pertes de poids, les animaux qui se dégradent étant mis à mort. Il affirme que les essais in silico et in vitro ne renseignent ni sur les effets à long terme ni sur la gravité, et présente le recours au rongeur comme "incontournable".

Objectifs

Ce projet concerne les premières études toxicologiques réalisées chez l’animal. A ce stade de développement d’un produit chimique, les informations sur la caractérisation du profil toxicologique sont parcellaires, et souvent inexistantes dans un organisme entier vivant. En accord avec le principe des 3R, le recours à l’animal doit être réduit au maximum. Les études in vivo sont cependant incontournables pour appréhender les effets d’un produit chimique sur un organisme entier. Dans le cas des études in vivo, la priorité est de garantir le bien-être des animaux en n’administrant les produits qu’à des doses appropriées. Pour ce faire et pour que les études exploratoires et de choix de doses soient les plus prédictives possibles, elles sont réalisées sur les mêmes espèces que les études constitutives du dossier de mise sur le marché des produits (rongeurs : rats et souris). Ce projet comprend une série d’études permettant d’évaluer la dose maximale tolérée par les rongeurs, ainsi que des informations sur le choix de doses pour les études futures. Il permet de fournir des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai par voie orale pendant une période courte. En effet l’exposition à un composé est souvent multiple (doses répétées) et peut produire des effets immédiats ou plus tardifs (par accumulation de la substance d’essai ou par sa biotransformation par exemple). Le projet est utilisé pour fournir des informations sur le potentiel toxique d’un produit au début de son développement. Ces études d’une durée inférieure ou égale à 15 jours permettent de cribler les molécules, d’arrêter le développement de molécules trop actives ou de définir les doses qui pourront être utilisées dans des études subaiguës et subchroniques requises par les autorités sans induire d’effets sévères. Ces études précoces sont conduites avec un nombre restreint d’animaux et leur suivi clinique est renforcé en particulier en début d’exposition. On distingue trois types d’essais précoces : Les études de tolérabilité et de choix de doses qui sont réalisées sur des rongeurs adultes, les études de tolérabilité et de choix de doses qui sont réalisées sur des rats juvéniles et les études de tolérabilité et de choix de doses qui sont réalisées sur des femelles gestantes afin d’éliminer précocement des molécules ayant un effet toxique sur le développement.

Bénéfices attendus

Ces études permettent avec un nombre restreint d’animaux d’arrêter précocement le développement de molécules trop actives ou de déterminer les effets toxiques généraux induits par l’exposition à la substance d’essai chez les rongeurs afin de définir les doses qui seront utilisées dans les futures études.

Procédures

Un gavage journalier sur animaux vigiles, se faisant en 15 secondes, tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l'âge des animaux. Des prélèvements sanguins réalisés en moins de 2 minutes par animal. Eventuellement, un prélèvement unique d’urine en cage à diurèse pendant un maximum de 16h.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus sur les animaux peuvent être sévères car les molécules n’ont jamais été testées au préalable dans l’espèce, à l’âge et aux doses choisies. Les signes de toxicité pouvant apparaitre en cours d'études incluent des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, convulsion, prostration, augmentation ou diminution de la mobilité et de l'agressivité, tremblement ou impact sur la température corporelle. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h pour l’analyse des concentrations de la substance à tester. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale, la veine sublinguale ou la veine saphène. Suite aux prélèvements, de petits hématomes peuvent apparaitre. Lors des prises d'urine les animaux sont isolés une nuit dans une cage à diurèse ce qui peut induire un stress léger sur l’animal. Pour certains prélèvements les rats peuvent être soumis à un jeûne de 16h maximum générant une perte de poids inférieure à 10% du poids corporel et réversible dès la réintroduction de la nourriture. Les produits ne seront administrés qu’à des doses appropriées : la dose maximale utilisée est en général 300 mg/kg/jour. On utilise donc des doses inférieures aux doses limites préconisées dans les lignes directrices pour le calcul de la toxicité aiguë (Dose létale 50%).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin d’étude pour évaluer l’effet de la molécule sur les organes lors de l'autopsie. Les animaux excédentaires exclus de l'étude après randomisation peuvent être gardés en vie et être replacés ou seront intégrés dans le processus de formation du personnel aux gestes techniques.

Remplacement

De nombreux essais in silico et in vitro sont utilisés pour identifier/confirmer des mécanismes d’action préalablement au recours aux études animales. Mais ils ne peuvent prendre en compte l’intégralité des mécanismes conduisant ou pas à l’apparition d’effets toxiques et ils ne peuvent pas donner d’informations concernant les effets à long terme ni la gravité des effets qui suit l'exposition au produit. De même, pour comprendre le mode d'action d'une toxicité spécifique, un enchaînement d’évènements biologiques au niveau moléculaire et tissulaire doit être identifié et caractérisé.

Réduction

Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. Un nombre de 3 à 6 animaux adultes et 4 pour les juvéniles ou les gestants (la gestation n’étant pas certaine au démarrage de l’étude). En fonction des effets attendus, une seule dose sera testée au préalable et les doses des autres groupes adaptés en fonction des signes observés.

Raffinement

Dans ces études, les animaux sont hébergés en groupe ou individuellement avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance ou leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes de reformation régulière. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal qui sera demandée par le directeur d’étude. En cas de problème un vétérinaire est présent sur le site pour assurer un traitement. En cours d’étude si besoin des prélèvements sanguins seront réalisés en fonction des recommandations du NC3R National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research). A la fin de chaque étude, une évaluation sur le bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal et le comité d’éthique.

Choix des espèces

Ces études sont réalisées chez le rongeur car ce sont les modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de leur utilisation fréquente dans les études toxicologiques et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Le stade de développement des animaux utilisés est : • Les études de tolérabilité et choix de doses sont réalisées chez de jeunes adultes ou adultes (en général de 6 – 10 semaines) • Certaines études décrites dans ce projet (procédure expérimentale 2) sont conçues pour étudier les effets d'un composé d'essai sur différents paramètres de la puberté (par exemple, chez les femelles, l'âge de l’ouverture vaginale et l'effet sur le cycle de l'œstrus sont déterminés). Cela nécessite donc l'utilisation d'animaux sexuellement immatures (juvéniles). En général au début de l’étude les animaux auront environ 20 jours (minimum postnatal (PND) 18). • Les études de tolérabilité et choix de dose de toxicité du développent visent à étudier le potentiel toxique d’une substance sur le développement et seront réalisées pendant la gestation puisque l’objet de l’étude porte sur le développement du fœtus lors d’une exposition in utero. De jeunes rats (8-12 semaines au début de l’étude) seront utilisés conformément aux recommandations des guidelines internationales.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Infectées par le virus West Nile, elles peuvent développer une perte de poids, une perte d'équilibre, une paralysie et mourir, un point limite de deux signes cliniques déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Le porteur compare la virulence de virus chimériques assemblés en laboratoire pour identifier les facteurs génétiques en cause. Il indique que la capacité du virus à infecter le système nerveux ne peut s'étudier qu'in vivo et présente ce modèle comme "nécessaire".

Objectifs

L’infection au virus West Nile (VWN) constitue un risque majeur pour la santé humaine et animale notamment chez les oiseaux sauvages et les équidés. Les symptômes liés à la maladie vont de la simple fièvre jusqu’à des atteintes neurologiques pouvant être mortelles dans les cas les plus sévères. Ce virus est présent dans de nombreux pays européens, avec 49 cas équins et 1 humain en 2015 ou encore 13 cas équins et 26 cas humains dans le sud de la France en 2018. Le VWN est retrouvé tous les ans dans le sud de la France. Sa transmission est assurée par les moustiques du genre Culex. Le réchauffement climatique impactant la distribution des espèces de moustiques, la répartition géographique de certains agents vectorisés par ces derniers, dont le VWN, peut se voir modifiée dans les prochaines années. La compréhension des mécanismes de la virulence chez l’hôte vertébré permet d’anticiper et de réagir rapidement face aux nouvelles épidémies. Actuellement, malgré la présence de traitement chez l’animal, aucun vaccin n’a été développé chez l’Homme. L’étude des facteurs impliqués dans la virulence s’ancre dans une dynamique de proposition de nouvelles cibles afin de disposer de solutions vaccinales. La souche WN Israël 1998 est considérée comme très virulente chez l’oiseau, tandis que la souche WN Italie 2008 est faiblement virulente. Des outils innovants en laboratoire ont rendu possible la génération de VWN modifiés, appelés chimères, par un assemblage artificiel de régions génétiques d’intérêts issus de ces deux souches et potentiellement impliquées dans la différence de leur virulence. Ces chimères ont déjà fait l’objet d’une étude dans des modèles cellulaires en laboratoire. Mais le VWN a la capacité à infecter le système nerveux. Cette capacité neuroinvasive ne peut s’étudier qu’à l’aide d’un modèle in vivo. L’évaluation de la virulence de ces chimères sur un modèle murin permettra de mieux comprendre le mécanisme de virulence de ces deux souches et d’identifier les facteurs génétiques potentiellement impliqués dans la virulence chez les vertébrés.

Bénéfices attendus

Nous avons choisi d’étudier la différence de virulence (dangerosité, capacité à se répliquer et à entraîner une possible mortalité) engendrée par la souche WN Israël 1998 et la souche Italie 2008 en modifiant leur génome. Pour cela, nous avons décidé d’échanger une partie de génome d’un virus avec une partie du génome de l’autre virus afin de reconstituer un génome entier, modifié, comprenant d’une part des fragments du premier virus et d’autre part des fragments du deuxième virus. Nous avons eu recours à une méthode au laboratoire permettant de remplacer un fragment génomique du virus Israël 1998, par le même fragment mais issu du virus Italie 2008. Ces virus ayant une virulence différente, cela permet de comprendre quel fragment peut être responsable d’une virulence amoindrie chez Italie 2008 par rapport à Israël 1998. A plus long terme, cette étude permettra d’identifier de nouvelles cibles pour la lutte antivirale.

Procédures

Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles (à la queue ou à la joue) ou sur souris anesthésiés (au sinus rétro orbital) par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement dure quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlés tous les jours.

Impact sur les animaux

Les souris sont sensibles à l’infection par WNV. Les signes cliniques décrits sont la perte de poids, perte d’équilibre et de motricité d’un membre, paralysie et la mort. Les animaux seront contrôlés tous les jours puis 2 fois par jour dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices.

Devenir

West Nile est un virus de classe 3, zoonotique. Les souris peuvent mourir de l’infection. Toutefois, un point limite (moment à partir duquel l’expérimentation sera arrêtée) est défini pour cette procédure expérimentale à savoir la présence simultanée de deux signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices. Dans le cas où les souris n’ont pas présenté ces signes avant la fin de l’expérimentation, elles seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes, et l’analyse de la quantité de virus dans ces différents prélèvements.

Remplacement

Les différences de comportement des constructions virales réalisées entre les virus WN Israël 1998 et Italie 2008 ont d’abord été étudiées sur des modèles alternatifs (culture cellulaire). Cependant, le modèle in vitro ne permet pas d’évaluer le pouvoir infectieux (développement de signes cliniques, présence de virus dans la circulation sanguine), la localisation du virus dans un organisme (« préférence ») et la virulence (mortalité). Le modèle in vivo est nécessaire pour cette étude.

Réduction

Au total 60 souris maximum seront impliquées dans ce projet d’étude. Six groupes seront constitués. Cinq souris seront utilisées par groupe afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement et scientifiquement. Le nombre de 5 souris par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure expérimentale par des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis pour une comparaison de moyennes d’échantillons indépendants (quantité moyenne de virus retrouvé dans le sang à un temps donné, suivi de mortalité), test t pour une comparaison de moyenne entre seulement deux échantillons,...). Un résultat sera considéré comme statistiquement significatif si la valeur « p » est strictement inférieure à 5% (p < 0,05). Un duplicat pourra être effectué en cas de la non infection des souris ou bien réaliser la même étude pour d’autres virus West Nile modifiés avec des facteurs génétiques d’intérêts.

Raffinement

Les souris seront plusieurs par cage (5/cage) avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton). Une surveillance bi-quotidienne des animaux est mise en place à compter de l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux trop sévèrement atteints, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte de poids, poils ébouriffés, dos voûté, troubles de la coordination des mouvements, perte d’équilibre, perte de motricité.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour le virus West Nile, de par sa grande sensibilité à l’infection après inoculation par différentes voies. Elle développe généralement des signes neurologiques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris auront entre 7 et 8 semaines. Les souris seront donc des adultes et cela facilitera les prélèvements sanguins car elles seront plus grosses.

Certaines souris sont séparées de leur mère trois heures par jour pendant leurs deux premières semaines, puis toutes subissent une chirurgie cérébrale, le plus souvent une injection virale suivie de l'implantation d'une fibre optique, avant d'être exposées à l'odeur d'urine de renard, à des chocs électriques, à une défaite sociale face à une souris agressive, ou à des récompenses dont la cocaïne. 1 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur affirme que ces agents stressants "n'induisent pas de modifications de comportement délétères sur le long-terme". Il veut pourtant comprendre comment un stress précoce altère les circuits neuronaux, "favorisant ainsi l'apparition de troubles psychiatriques". Toutes sont tuées après le test comportemental pour prélever leur cerveau, une partie rapidement pour des enregistrements électrophysiologiques.

Objectifs

Un stress précoce, notamment la négligence parentale ou la maltraitance, augmente considérablement l’apparition de troubles anxio-dépressifs et des addictions. Un trait commun à ces maladies mentales est l’incapacité de gérer des situations conflictuelles. Cette gestion repose sur un processus cérébral essentiel permettant d’évaluer finement le rapport risque/récompense de chaque action. Ces mécanismes sont contrôlés par des circuits cérébraux indispensables à la survie, car ils fournissent la motivation nécessaire à la réalisation d'actions permettant de préserver l'individu (se nourrir, se reproduire, etc.). Ainsi, la dissection des réseaux de neurones nécessaires au bon fonctionnement de ces systèmes est essentielle pour la compréhension et la recherche d’outils thérapeutiques pour les individus affectés par ces troubles du comportement. Le noyau latérodorsal du tegmentum (LDTg) est une région du cerveau classiquement associée au traitement et à la modulation des signaux récompensants. Notre équipe a récemment revisité ce dogme et démontré de profonds changements d’activité du LDTg en conditions de stress. Cependant, les mécanismes cellulaires ainsi que les circuits neuronaux impliqués dans ce processus restent peu connus. L’objectif principal de ce projet est de déterminer le rôle fonctionnel du LDTg lors de situations conflictuelles, et de comprendre comment l’exposition à un stress précoce altère ces circuits neuronaux favorisant ainsi l’apparition de troubles psychiatriques.

Bénéfices attendus

Les organismes vivants sont généralement confrontés à des situations conflictuelles. Une fonction de base du cerveau pour assurer la survie consiste à répéter des actions qui se sont avérées gratifiantes tout en évitant le danger. Par exemple, il est judicieux de revisiter un endroit où de la nourriture a été trouvée (récompense), mais pas si cet endroit est traqué par des prédateurs (aversion). En intégrant ces stimuli positifs et négatifs du monde extérieur, des mécanismes adaptatifs sont déclenchés afin d’assurer l'obtention de récompenses (nourriture, eau, sociales) tout en évitant les situations dangereuses. Dans ce projet, nous proposons de démêler les circuits cérébraux qui aident au processus de prise de décision. De plus, nous étudierons comment le stress au début de la vie peut induire des changements cellulaires dans ces circuits cérébraux. Nous lierons ces changements cellulaires à des défauts de comportement en enregistrant l’activité neuronale (grâce à la visualisation des flux de calcium) des souris performant un test comportemental où la souris peut obtenir une récompense tout en évitant les signaux de prédateurs. Enfin, nous évaluerons de nouvelles approches pour le traitement des troubles psychiatriques associés au stress impactant ces circuits.

Procédures

Chaque souris subira à 5 semaines une opération chirurgicale pour une injection et implantation d'un outil biologique permettant d'enregistrer l'activité des neurones. Certaines souris seront exposées à des agents stressants, dont l'odeur de prédateur (urine de renard), des chocs électriques de faibles intensités (chocs de 500ms à 0.2mA), de la défaite sociale aigue (domination physique par une souris agressive pendant moins de 5 minutes), ainsi que la séparation maternelle (3 heures par jour) pendant les deux premières semaines de la vie. Ces agents stressants n'induisent pas de modifications de comportement délétères sur le long-terme.

Impact sur les animaux

Le projet nécessite 5 principaux agents stressants, dont la chirurgie cérébrale, l’exposition à une odeur de prédateur (urine de renard), des chocs électriques de faibles intensités, de la défaite sociale aigue durant laquelle les souris sont soumises à une domination physique par une souris agressive ainsi que la séparation maternelle pendant les deux premières semaines de la vie. Ces agents stressants n'induisent pas de modifications de comportement délétères sur le long-terme.

Devenir

Pour chaque procédure, les souris seront mises à mort après le test comportemental, afin de récolter leur cerveau, pour une analyse histologique. Dans la procédure 2, 3 et 4, des cohorte de souris seront sacrifiéeset leur cerveau prélevé rapidement, dans le but de réaliser des enregistrement électrophysiologiques qui nous permettent de mesurer l'activité électrique des neurones.

Remplacement

Notre projet repose principalement sur des approches comportementales et virales ainsi qu'une approche d'enregistrement de l'activité neuronale. Actuellement, il n’y a pas de méthodes substitutives qui pourraient remplacer le recours à l’animal dans nos travaux. Il n’est pas non plus envisageable d’utiliser des modèles animaux moins sensibles. En effet, les structures étudiées dans ce projet chez la souris sont très similaires à ceux de l’Homme et leurs descriptions anatomiques bien détaillées. De plus, la souris est un modèle animal de choix de par les approches virales (AAV) et génétiques (lignées transgéniques) qui permettent une manipulation ciblée des structures cérébrales altérées par le stress.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire dans chaque procédure du projet est calculé par analyse de puissance afin de le réduire autant que possible, tout en conservant un significativité statistique fiable. Afin de limiter le nombre de souris utilisées, la moitié des souris de la tache 1 subiront les 3 types de stimuli récompensants et l’autre moitié les stimuli aversifs, du moins marqué au plus prononcé suivant l’ordre suivant : (i) nourriture, interaction sociale, cocaïne, ou (ii) odeur de prédateur, choc électrique et la défaite sociale aigue durant laquelle les souris sont soumises à une domination physique par une souris agressive (moins de 5 minutes) . Toujours dans le but de réduire le nombre de souris, les enregistrements électrophysiologiques (mesure de l'activité électrique des neurones) de la procédure 2 et 3 seront réalisés sur les mêmes souris ayant subi les tests comportementaux.

Raffinement

Par défaut, les animaux font l'objet d'une vérification visuelle quotidienne. Une manipulation donnant lieu à une véri­fication plus poussée est effectuée une fois par semaine lors de la pesée. Nous observons l'apparence physique, le poids corporel et les comportements naturels (grooming, mobilité de l'animal, interaction sociale etc...). Si observation d'un problème physique tel que défaut de toilettage prononcé (pelage hirsute, tâche d'urine ou de matières fécales, etc.), mise en place d'un renforcement du suivi quotidien et prise de mesures adaptées au problème (mise à disposition de nourriture hydratée, tapis chauffant si légère hypothermie, désinfection de la plaie si blessure). En cas de non amélioration de l'état de l'animal il sera mis à mort au plus tard 48h après la détection du problème. Pour les animaux ayant subi une chirurgie, nous mettons en place un suivi quotidien renforcé dans les 5 jours suivant la chirurgie. Des difficultés à atteindre la nourriture ou une infection de la plaie entraine la mise en place d'une pesée quotidienne, désinfection et administration d'anti-inflammatoires (carprofène). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas sous 48h, nous procèderons à sa mise à mort.

Choix des espèces

Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. La souris possède un éventail génétique vaste, une reproductibilité fiable et rapide, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. La souris constitue un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension des effets du stress, et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (enregistrement de l'activité électrique des neurones, comportement, chirurgie). Pour toutes ces raisons, ce choix d’espèce constitue un bon modèle pour notre étude. -Tâche 1 : souris utilisées à 5 semaines pour injection virale, puis 3 semaines de récupération post-opératoire puis implantation de fibre optique, puis 1 semaine de récupération post-opératoire suivie des analyses comportementales/ histologiques. -Tâche 2 : souris utilisées à PND1 (jour 1 PostNatal) pour le protocole de séparation maternelle, puis à 5 semaines pour injection virale, puis 3 semaines de récupération post-opératoire puis implantation de fibre optique, puis 1 semaine de récupération post-opératoire suivie des analyses comportementales/ électrophysiologiques/ histologiques. -Tâche 3 : souris utilisées à PND1 (jour 1 PostNatal) pour le protocole de séparation maternelle, puis à 5 semaines pour injection virale, puis 3 semaines de récupération post-opératoire puis implantation de fibre optique, puis 1 semaine de récupération post-opératoire suivie des analyses comportementales/ électrophysiologiques/ histologiques. -Tâche 4 : Optogénétique : souris utilisées à PND1 (jour 1 PostNatal) pour le protocole de séparation maternelle, puis à 4 semaines pour injection virale puis 3 semaines de récupération post-opératoire puis implantation de fibre optique, puis 1 semaine de récupération post-opératoire suivie des analyses comportementales/ électrophysiologiques/ histologiques. DBS : souris utilisées à PND1(jour 1 PostNatal) pour le protocole de séparation maternelle, puis à 7 semaines implantation de l’électrode puis 1 semaine de récupération post-opératoire suivie des analyses comportementales/ histologiques.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intracérébrales d'une molécule provoquant des lésions ou subissent un accident vasculaire cérébral expérimental, avec suivi par IRM et par test de préhension (Grip Test), avant mise à mort par exsanguination et perfusion d'un fixateur. Le porteur étudie le rôle d'une molécule appelée tPA exprimée après un AVC, avec un bénéfice pour les patients formulé comme une amélioration future de leur prise en charge. Il affirme que les techniques sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information et retient la souris comme l'espèce la plus étudiée dans ce domaine.

Objectifs

Notre projet vise à caractériser l'expression d'une molécule exprimée dans le cerveau (l'activateur tissulaire du plasminogène ou tPA) à la suite d'un accident vasculaire cérébral (AVC). Nous nous intéresserons tout particulièrement aux rôles de cette molécule à des temps très précoces après la survenue de l'AVC, dans le but d'améliorer la compréhension de la maladie et la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

A travers ce projet de recherche, les bénéfices attendus sont d'améliorer la prise en charge des patients souffrant d'un accident vasculaire cérébral (AVC) en améliorant nos connaissances concernant les mécanismes mis en jeu : - Etudier la cinétique d’expression de l'activateur tissulaire plasminogène (tPA) dans les neurones lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC) et comprendre son(ses) rôle(s) dans ces conditions. - Identifier des sous-populations de neurones exprimant l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) en réponse à l’atteinte vasculaire cérébrale (AVC). - Tenter de comprendre le(s) rôle(s) de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) exprimé par des neurones, dans la survenue ainsi que dans l'évolution de la maladie.

Procédures

Procédure 1 : Entrainement aux injections d'une molécule fluorescente marquant les neurones dans le cerveau (10 souris, 30 minutes/souris) - Entrainement aux injections d'une molécule créant des dommages cérébraux avec suivi de la lésion par imagerie par résonance magnétique (IRM) à 30 minutes, 1 heure ou 2 heures. (20 minutes/souris pour l'injection de la molécule et 10 minutes/souris pour l'IRM). Entrainement au modèle d'accident vasculaire cérébral (AVC) avec suivi de la lésion par IRM à 30 minutes, 1 heure ou 2 heures. 35 minutes/souris pour l'induction de l'AVC et 10 minutes/souris pour l'IRM. Procédure 2 : Injections d'une molécule fluorescente marquant les neurones dans le cerveau (30 minutes/souris), injections d'une molécule créant des dommages cérébraux (30 minutes/souris) puis mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque d'agent fixateur à 30 minutes, 1 heure ou 2 heures; 10 minutes/ souris. Procédure 3: Injections d'une molécule fluorescente marquant les neurones dans le cerveau, (30 minutes/souris), induction du modèle d'AVC (40 minutes/souris) puis mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque d'agent fixateur à trois temps d'interêt : (30 minutes, 1 heure ou 2 heures; 10 minutes/souris). Procédure 4: injections d'une molecule fluorescente marquant les neurones dans le cerveau chez des souris n'exprimant pas l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) (30 minutes/souris) et chez des souris contrôles (30 minutes/souris), induction du modèle d'AVC (40 minutes/ souris) puis imagées par IRM 24h après l'AVC (25 minutes/souris). La récupération fonctionnelle après l' AVC sera évaluée par Grip Test (J-3 baseline, 24h, 2,3,7 et 15 jours post AVC). A l'issue du quinzième jour de suivi, les souris seront mises à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque d'agent fixateur en vue de futures analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront être concernés par des effets indésirables tels que de la peur ou du stress à l'induction et durant l'anesthésie ou des douleurs physiques ou thermiques lors des procédures expérimentales.

Devenir

Procédure 1 : Les souris seront mises à mort pour prélèvement d'organe directement après la chirurgie ou bien à l'issue des IRM pour les 15 dernières souris des groupes entrainement aux injections de NMDA et entrainement au modèle thromboembolique. Procédure 2 : A l'issue de l'injection de NMDA , les souris seront mises à mort pour prélèvement d'organe. Procédure 3 : A l'issue de l'injection de l'ischémie cérébrale , les souris seront mises à mort pour prélèvement d'organe. Procédure 4 : A l'issue du quinzième jour de suivi post ischémie cérébrale par Grip Test, les souris seront mises à mort pour prélèvement d'organe.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est, avec le rat, l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Suite à une réflexion approfondie sur le plan expérimentale, nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisée ainsi que sur nos travaux précédemment publiés et la littérature. Afin de garantir des résultats statistiques fiables et puissant tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi d'utiliser un nombre minimum de 10 animaux par groupe pour les procédures 2 et 3 (procédures relativement reproductible) et 20 animaux par groupe pour la procédure 4 (procédure longue, incluant des données comportementales ayant besoin d'un échantillon suffisant pour garantir une robustesse des données). Pour la procédure numéro 1 nous estimons réduire le nombre d'animaux à travers la double utilisation des 15 derniers animaux des groupes "entrainement aux injections de NMDA" et "entrainement au modèle d'AVC thromboembolique" à travers une double utilisation entrainement/IRM. Aussi, pour l'ensemble des expériences, utiliser l'hémisphère controlatérale comme contrôle de lésion (induites par NMDA ou par le modèle thromboembolique d'AVC ischémique) contribuera fortement à réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Au sein de ce projet de recherche, différents moyens seront mis en oeuvre afin que les contraintes subies par les animaux soient minimales et que leur bien-être soit préservé au mieux. Ainsi, afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront toujours anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable : Les animaux seront euthanasiés si l'une des situations suivantes se présente : signes de douleur extérieure indexés sur le Mouse Grimace Scale (Score >5), absence de réaction, animal inactif dans sa cage ou montrant d’autres signes de détresse, arrêt de la prise alimentaire et de boisson, perte de poids >10% du poids initial. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques et la souris reste l’espèce de choix pour de telles études de plasticité cérébrale. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différente de l’homme. Pour la partie injection intracorticale de NMDA : Les souris seront âgées de 5 semaines au moment de l’injection des AAV9 Plat GFP et de 8 semaines (stade adulte) au moment de l’injection de NMDA. Pour la partie modèle d’AVC ischémique thromboembolique : Les souris seront âgées de 5 semaines au moment de l’injection des AAV9 Plat GFP et de 8 semaines (stade adulte) au moment de réaliser le modèle d'AVC. Pour comprendre le rôle du tPA neuronal dans la physiopathologie de l’AVC ischémique, les souris seront âgées de 5 semaines au moment de l’injection des AAV9 Plat Cre GFP et de 8 semaines (stade adulte) au moment de réaliser le modèle d'AVC. Pour les entrainements aux procédures d'injection d'AAV nous utiliserons des souris âgés de 5 semaines et 8 semaines pour l'entrainement au injection de NMDA, comme ça sera le cas lors des vrais expérimentations. Pour les entrainements aux procédures d'AVC thromboembolique, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines. L’âge de 8 semaines a été retenu car considéré comme âge « jeune adulte », c’est aussi l’âge le plus couramment utilisé dans la littérature.

650 ratons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Nouveau-nés, ils subissent la ligature d'une artère carotide, un séjour en caisson d'hypoxie, deux heures d'hypothermie, puis des injections de lactate le jour même et les deux jours suivants ou des polyphénols par l'eau de boisson de leur mère, et des IRM sous anesthésie à plusieurs stades de leur développement. Des tests de réflexes précoces et de mémoire, que le résumé ne nomme pas, et un test de dépression associé à une privation de nourriture, que le porteur dit susceptible d'être une "situation angoissante", complètent le protocole. Aucun n'est déclaré gardé en vie, mais la narration du devenir ne chiffre que 130 rats mis à mort pour prélever leurs organes, en précisant que les lésions cérébrales provoquées empêchent toute utilisation dans un autre projet. Le porteur affirme qu'il "n'existe pas de remplacement disponible" à sa méthode, les approches cellulaires s'affranchissant selon lui de la physiologie de "l'organisme entier".

Objectifs

L’hypoxie-ischémie néonatale est un problème de santé publique majeur tant par son occurrence (1-6 cas pour 1000 naissances) que par sa létalité et par les troubles cognitifs et/ou infirmités motrices qu’elle engendre. Elle est caractérisée par une diminution du flux sanguin cérébral au niveau du cerveau du nouveau-né. La seule thérapie actuellement appliquée est l'hypothermie thérapeutique modérée (diminution de la température corporelle de quelques degrés pendant 3 jours maximum), mais environ la moitié des nouveau-nés n’y répondent pas favorablement. Les objectifs de ce projet sont de développer des stratégies de neuroprotection dans le contexte de l'hypoxie-ischémie néonatale, sur un modèle de ratons. Pour répondre aux objectifs, les effets neuroprotecteurs du lactate (substrat énergétique neuronal, administré par voie intrapéritonéale) et de polyphénols (administrés dans l'eau de boisson de la mère) seront évalués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont : - le développement d’un complément alimentaire, riche en polyphénols, destiné à la femme enceinte pour prévenir les dommages induits par une hypoxie-ischéime néonatale - les résultats préliminaires de l'injection de lactate chez le rongeur permettront la mise en place d’une étude préclinique chez le porc, dont la physiologie est plus proche de l'humain. A long terme, cette neuroprotection de l’administration de lactate pourra être testée en clinique.

Procédures

Pour l'induction de l'hypoxie-ischémie, les animaux subiront une chirurgie puis une hypoxie. L'hypoxie-ischémie ser suivie par une hypothermie. Les animaux subiront une procédure chirurgicale (ligature de l'artère carotide commune ; réalisée une fois d'une durée inférieure à 10 minutes). Une hypothermie modérée sera mise en place à la sortie du caisson d'hypoxie-ischémie (1 fois, durée : 2 h). Une injection intra-péritonéale sera rélisée afin d'administrer le lactate (réalisée juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivant). Les animaux effectueront des examens par résonance magnétique nucléaire de diffusion sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (durée : 30 - 45 min). Ils effectueront aussi des examens par résonance magnétique nucléiare fonctionnelle sous anesthésie administrée en intra-veineux (1 fois, à P45, durée : 2 h). La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements de réflexes précoces et de mémoire. La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire

Impact sur les animaux

Lors de précédents projets, il a été noté une perte de poids chez un faible nombre de ratons, dans les 48-72 h suivant l’hypoxie-ischémie. Dans le caisson d'hypoxie-ischémie, tout comme lors de l'hypothermie, des difficultés respiratoires pourraient subvenir. L'administraton de lactate par injection intrapéritonéale pourrait engendrer une légère douleur due à l'insertion de l'aiguille. La réponse à l'hypoxie-ischémie est variable d'un individu à l'autre : dans de rares cas, des lésions cérébrales importantes pourraient subvenir. Elles représenteront un point limite. Un stress lié à l'anesthésie durant l'IRM, une perturbation du rythme cardio respiratoire entraîneront un arrêt de la séance d'imagerie. Les tests comportementaux pourraient être vecteurs de stress pour les ratons. La restriction alimentaire associée à la mesure d'un état dépressif pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 130). L'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.

Remplacement

Des modèles d’hypoxie cellulaires existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de l’hypothermie et de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par (i) le fait que la compétence dans le modèle d’hypoxie-ischémie chez le rat est maîtrisée au laboratoire (pas de mise au point nécessaire), (ii) nous disposons de nombreux contrôles antérieurs (moins de contrôles à refaire), (iii) l'imagerie par résonance magnétique de diffusion ou fonctionnelle est une technique d’investigation non invasive et permet donc une suivi dans le temps des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie ; une injection de Laocaïne sera réalisée avant l’incision et avant la suture. Les pertes de poids seront surveillées et à partir d'un certain point seront considérées comme atteignant un point limite. Des difficultés respiratoires post-opératoires entraîneront l'arrêt de la procédure. Les examens d'IRM seront réalisés sous anesthésie générale. Une modification du rythme cardiaque ou du rythme respiratoire entraînera l'arrêt de l'expérimentation. L'utilisation de gel ophtalmique durant les examens d'IRM préviendra le risque de sécheresse oculaire. L'IRM permet la quantification des volumes lésionnels.Le volume des lésions sera calculé, et au delà d'un certain pourcentage l'animal sera considéré comme atteignant un point limite. Une surveillance particulièrement accrue sera mise en place pour les 5 jours post-opératoires (couleur de la peau, estomac plein, mouvements, interactions avec la mère et les autres membres de la portée). Tous les tests de comportement seront réalisés par un unique expérimentateur, et dans une salle unique dédiée, permettant une habituation des animaux aux manipulations et à l’individu lui-même. Pour le test de dépression, nécessitant une privation de nourriture ponctuelle, la prostration de l’animal représentera un point limite. Au niveau de l’hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. Lors de ces observations quotidiennes, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés.

Choix des espèces

Le rat Wistar est utilisé depuis plusieurs années dans ce modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. Nous souhaitons suivre les animaux par IRM à 4 stades de développement: - P7, P9 et P30, par IRM de diffusion afin d'évaluer l'effet neuroprotecteur précoce des traitements administrés en phase aigüe de la pathologie (3 h et 48 h) et à P30 afin d’évaluer les effets neuroprotecteurs à long terme ; l’IRM fonctionnelle permettra, à P50 d’évaluer les effets de la neuroprotection sur le remodelage des circuits neuronaux et la récupération fonctionnelle.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un sepsis par ligature et ponction du caecum ou par injection de bactéries, après immunodépression chimique, puis elles sont tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la chirurgie et l'infection peuvent provoquer douleur, souffrance et affaiblissement. Il affirme que le modèle n'est absolument pas reproductible in vitro, le bénéfice annoncé se limitant à une meilleure compréhension du lien entre immunodépression et infection.

Objectifs

Ce projet de recherche représente une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes de développement d’une infection grave de type sepsis chez des sujets immunodéprimés. En effet, les infections abdominales sont fréquentes, à l’origine d’infections graves, appelées en fonction de la gravité sepsis ou choc septique, et responsables de nombreuses hospitalisations en soins intensifs. Cet état de sepsis entraîne une dysfonction du système immunitaire acquise propice à l’acquisition d’infections nosocomiales. Ces dernières sont responsables de la majorité des décès observés en réanimation pouvant survenir tardivement, plusieurs jours voire semaines après l’admission des patients. Ce phénomène d’immunosuppression acquise liée au sepsis a bien été étudié et caractérisé sur des modèles souris d’infection intraabdominale par CLP (« Cecal Ligature and Puncture » ou ligature et ponction du caecum) entrainant une lésion digestive (comparable aux sepsis abdominaux chirurgicaux). Cependant, la majorité des patients hospitalisés en réanimation pour sepsis sont des patients également immunodéprimés porteurs d’une pathologie hématologique les exposant aux infections d’origine digestive. Ces infections sont généralement liées à une leucopénie à l’origine d’une translocation bactérienne dans le sang. Cette bactériémie d’origine digestive, mais sans lésion du tube digestif, est généralement traitée par des antibiotiques associés aux mesures symptomatiques propres à la réanimation (remplissage vasculaire, analgésie…). Afin de se rapprocher au plus près des conditions décrites chez l’Homme, l’utilisation de la technique « Cecal Slurry », permettant l’injection directe de bactéries digestives dans la cavité péritonéale des souris mimerait ainsi les infections observées chez les patients d’hématologie. Plus précisément, une connaissance plus approfondie des modifications immunologiques induites par le sepsis chez des souris préalablement immunodéprimées permettrait de reproduire au mieux ce qui se produit chez l’Homme et ainsi de mettre en place des stratégies thérapeutiques chez les patients immunodéprimés hospitalisés en soins intensifs pour sepsis ou choc septique afin d’améliorer leur pronostic. Ainsi ce projet de recherche a pour but, dans un premier temps de comparer les deux techniques d’induction de sepsis : CLP et « Cecal Slurry » puis d’évaluer l’impact du sepsis chez les souris immunodéprimées.

Bénéfices attendus

Nos travaux devraient déboucher sur une meilleure compréhension des liens entre immunodépression induite et infection.

Procédures

L’induction du sepsis par CLP (« Cecal Ligature and Puncture » ou ligature et ponction du caecum) nécessitera une intervention chirurgicale de l’intestin des animaux sous anesthésie gazeuse d’environ 10min. Les animaux recevront au préalable une injection d’analgésique en sous cutané, cette injection durera moins d’une minute. Les animaux vigiles recevront un traitement antibiotique en intra-péritonéale une fois par jour pendant 5 jours, l'injection durera moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront en sous-cutanée une seule fois une injection permettant leur réhydratation, cette injection durera également moins d'une minute. Pour l’induction du sepsis par « Cecal Slurry », les animaux vigiles recevront une seule fois une injection en intra-péritonéale d’une quantité de bactéries commensales bien définie qui permettra d'induire un sepsis, geste réalisé en moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront un traitement antibiotique en intra-péritonéale deux fois par jour pendant 5 jours, l'injection durera moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront en sous-cutanée une seule fois une injection permettant leur réhydratation, cette injection durera également moins d'une minute. La myéloablation chimique des souris vigiles nécessitera une injection en intra-péritonéal 1 fois par jour pendant 2 jours l'injection durera moins d'une minute. L’induction de la pneumopathie par Staphylococcus aureus, nécessitera l’anesthésie des animaux par anesthésie gazeuse d’environ 5 minutes durant lesquelles les animaux recevront une suspension bactérienne par instillation intratrachéale.

Impact sur les animaux

L‘induction d’un sepsis par la technique de CLP (« Cecal Ligature and Puncture » ou ligature et ponction du caecum) peut engendrer une douleur, une souffrance et une angoisse des animaux liées à la chirurgie. De plus, le développement d’une immunodépression induite par un traitement chimique mais également l’infection abdominale peuvent engendrer un affaiblissement de l'animal.

Devenir

Afin d'évaluer les conséquences de l'infection induite sur les animaux immunodéprimés, l'accès aux organes d'intérêts ainsi qu'aux fluides biologiques est indispensable, nous ne pouvons donc pas garder les animaux en vie.

Remplacement

L'évaluation de l'impact du sepsis chez la souris immunodéprimée nécessite l’accès aux organes d’intérêt afin d’évaluer les conséquences de cette infection sur l’organisme dans sa totalité. En effet, ceci n’est absolument pas reproductible in vitro car l’induction d’un sepsis engendre une des modifications cellulaires dans différents organes tels que la rate, les poumons mais également le sang périphérique.

Réduction

Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Notre précédent projet, ayant eu pour objectif de caractériser les dysfonctions immunitaires suite à un sepsis induit par la technique de CLP, nous a permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le laboratoire possède déjà une expertise à la fois sur le développement d'infections abdominales et sur le développement de modèle murin d’immunodépression, ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux pour la mise en place de cette étude.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. L'utilisation d’analgésiques permettra d’éviter toute souffrance aux animaux. De plus, l’évaluation régulière du score de grimace des animaux et le suivi de leur poids et de leur comportement permettra d’avoir un contrôle continu sur leur état de santé.

Choix des espèces

Ce modèle murin permettra de développer une immunodépression induite, retrouvée fréquemment chez l’Homme, suivi d'une dysfonction immunitaire induite par un sepsis. Ce modèle nous permettra ainsi de caractériser cette dysfonction immunitaire. Le développement d'une immunodépression suivi d’une infection n'est pas reproductible in vitro car il touche le système immunitaire dans son ensemble. De plus, le modèle murin d’immunodépression induite par traitement chimique est un modèle animal connu et bien caractérisé et le développement d'infections abdominales a récemment été développé et caractérisé au sein de notre laboratoire. La très grande majorité des travaux scientifiques réalisés utilise des souris de 7-9 semaines.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est provoquée par inhalation de bléomycine, avec injections quotidiennes et gavages, puis elles sont tuées pour prélèvement des poumons. Le porteur indique que cette induction, qu'il juge non substituable, tue 10 à 15 % des souris et provoque une perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement ne caractérise la fibrose, l'espoir d'un transfert en clinique restant une perspective.

Objectifs

Notre protéine d'intérêt, qui appartient à la grande famille des récepteurs-canal, est un immunomodulateur. Cette protéine participe à l’épaississement du tissu pulmonaire (ou fibrose) qui se traduit par de grande difficulté respiratoire allant jusqu’au décès des patients atteints de fibrose pulmonaire. Il existe une petite molécule chimique qui active cette protéine et nous savons que cette molécule favorise la mise en place de réponse immunitaire anti tumorale. Plusieurs indications de la littérature suggèrent que l’activation de cette protéine permettrait aussi d’activer les voies de signalisation associées à la diminution de la fibrose pulmonaire. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester si cette molécule permet de diminuer la fibrose pulmonaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle et le mécanisme d’action de notre protéine d’intérêt dans la progression des fibroses pulmonaires. Ce projet permettra aussi d’identifier de possible nouvelles cibles thérapeutiques, et ou des combinaisons thérapeutiques, qui pourraient être transférer en médecine humaine.

Procédures

Pour l’ensemble des procédures, les souris seront soumises à l'inhalation d’une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cet acte dure moins d’une minute et est réalisée sous anesthésie pour diminuer le stress de l'animal. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront soumises à des injections quotidiennes de molécules. Ces injections durent moins de 10 secondes. En tout, il y aura 14 injections. Pour les injections multiples, la seconde injection sera décalée d'au moins 3 heures et sur un site distant du premier. Cette injection dure moins de 10 secondes. Pour les souris recevant des molécules par gavage oral. Ce gavage sera réalisé 5 jours sur 7, pendant 14 jours.

Impact sur les animaux

Dans l'ensemble des procédures la fibrose est induite par une injection intranasale de Bléomycine. Par expérience, cette procédure, non substituable, induit une perte de 10 à 15% des animaux alors que la littérature décrit une mortalité de 30%. Au cours de l'induction de la fibrose les animaux perdent du poids (entre 10 et 15% de leur poids initial) dans les 5 premiers jours. La perte est progressive et le retour à la normal est visible entre le 8 et le 10ème jour. Nous savons par expérience que les injections quotidiennes en intra péritonéale de notre molécule ainsi que les injections d'anticorps déplétant, bloquant ou autres molécules chimiques n'induisent pas d'effets indésirables visibles sur les animaux en expérimentation. Le gavage induit un stress aux animaux, mais nous savons par expérience que ce stress est bien supporté sur notre modèle animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour pouvoir prélever le poumon et réaliser les expériences nécessaires au projet

Remplacement

A ce jour il n'existe pas de méthode de remplacement (co culture de cellules ou modèles invertébrés) qui permettent de caractériser chez les mammifères les interactions cellulaires et moléculaires mises en jeu dans les pathologies telle que la fibrose pulmonaire.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, nous avons réalisé une étude statistique prévisionnelle qui nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Dès que les résultats seront scientifiquement exploitables nous arrêterons les expériences et nous opterons au sein de chacune des procédures pour une stratégie go-no-go où les expériences seront arrêtées dès que nous aurons caractérisé sans ambiguïté l'intermédiaire cellulaire et moléculaire.

Raffinement

Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vigiles. Pour limiter au maximum la souffrance des souris tout comportement suspect de l'animal sera référencé dans la fiche journalière de suivi par les zootechniciens en charge du suivi des animaux. Cette fiche de suivi indique des points limites adaptés à notre expérience, un arbre décisionnel et les critères d’arrêt de souffrance des animaux en expérimentation.

Choix des espèces

Le modèle murin de fibrose pulmonaire que nous souhaitons utiliser permettra d’analyser l’effet de molécules chimiques activatrices de la protéine d'intérêt et de caractériser par la suite leur mode d’action. L’instillation d'agent irritant chez la souris mime l’état pathologiques des patients atteints de fibrose pulmonaire. Ainsi grâce à ce projet, nous pourrons tester l’hypothèse qu’activer notre protéine d’intérêt est une nouvelle stratégie thérapeutique efficace pour diminuer la fibrose pulmonaire. Nous espérons qu’à plus long terme nos molécules pourront être testées en clinique humaine. Les souris mâles seront mises en expérimentation à un âge de 8 semaines. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature et les souris développent une inflammation et une fibrose pulmonaire après l’exposition à l'agent irritant.

1 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur pulmonaire leur est greffée par ouverture d'un espace intercostal, un geste que le porteur décrit lui-même comme sévèrement douloureux, avec irradiation et traitements répétés. L'établissement, prestataire de services précliniques, propose ces modèles à des clients pour tester des composés avant l'humain. Il affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Second cancer le plus souvent diagnostiqué (2.21 millions de cas recensés en 2020), le cancer du poumon est à ce jour le plus meurtrier (1.8 million de décès en 2020). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de cancer de poumon orthotopique monocentrique chez les rongeurs (rats ou souris), le plus prédictif possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des composés thérapeutiques dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques, à établir une réelle évaluation de l’efficacité de cette molécule destinée à traiter les tissus cancéreux localisés chez l’homme. Une fois le modèle établi, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Cependant, pour certaines applications thérapeutiques, de nouveaux modèles précliniques les plus prédictifs possibles doivent être établis afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. L’animal, représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur pulmonaire dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Ils seront identifiés par implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage, sous anesthésie (moins de 1 minute). Les animaux seront irradiés après un court transport (durée totale moins de 30 minutes, les animaux restant dans leur cage de stabulation). La greffe tumorale sera une procédure chirurgicale d’une trentaine de minutes environ et sera réalisée sous anesthésie et analgésie pré- et post-opératoire. L’acte douloureux de la chirurgie (ouverture intercostale) durera moins d’une minute. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie intramusculaire (IM) ou intradermique (ID) sous anesthésie et analgesie (1 minute). Les animaux vigiles et sous contention pourront recevoir des traitements par voies intra-péritonéale (IP), intra-veineuse (IV), sous-cutanée (SC), intra-nasale (IN), intra-trachéale (IT) ou orale (1 minute) Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure.

Impact sur les animaux

Pour ces modèles la greffe (injection de suspension de cellules ou greffe de fragments) de la tumeur est réalisée dans un lobe pulmonaire (modèle orthotopique). La douleur liée à cet acte est sévère en particulier du fait de l’ouverture d’un espace intercostal. L’évolution du volume tumoral pourra entrainer des troubles respiratoires généralement modérés tels qu’un essoufflement des animaux et une modification de la posture, ainsi qu’une perte de poids et une diminution de motricité en particulier. Ces effets seront évalués plus en détail lors de la première étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 10% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement (avant randomisation) afin de plus facilement constituer des groupes homogènes au moment de la randomisation. Si de la mortalité est constatée au moment de la chirurgie de greffe lors de la première étude, le nombre d’animaux excédentaires pourra augmenter du pourcentage de décès à la chirurgie. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

La greffe sera réalisée sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique opiacé et d’un alpha2 agoniste. En fin puis durant 2 jours suivant la chirurgie, un anti inflammatoire non stéroidien sera administré. 4h, 8h, et 24h après la chirurgie, les animaux recevront un analgésique opiacé. La chirurgie sera réalisée stérilement, avec maintien de la température corporelle, et surveillance post-opératoire jusqu’au réveil puis toutes les 2h sur 6h au total. Les actes douloureux (thoracotomie en cas d’exsanguination terminale par section d’un vaisseau thoracique, flush des organes au PBS en intracardiaque) seront réalisés sous anesthésie profonde avec Kétamine/Xylazine et analgésie 30min avant l’acte (Buprénorphine). Les injections IM/ID sont réalisées avec analgésie (opiacés) préalable. Les autres administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer spécifiquement l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Une sgrille de scoring est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Au début, le scoring avec pesée est réalisé 3 fois par semaine minimum, puis tous les jours dès que certains animaux présentent des signes cliniques, y compris des pertes de poids (voir procédure). Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages dès une perte de poids >5% observée sur certains animaux. Les scores cliniques les plus élevés et l’accumulation de scores intermédiaires constitueront un point limite (voir plus loin). Une perte de poids élevée ou prolongée constituera un point limite. Dans le cas de modèles cachectiques, le point limite de perte de poids sera adapté et de la nourriture enrichie sera apportée dès l’induction. En cas de toxicité sur l’animal, afin de limiter la souffrance des animaux une procédure sous forme d’un arbre décisionnel sera suivi par l’équipe projet. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasives permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Toutefois, il pourrait arriver que les animaux soient reçus à partir de l’âge de 5 semaines, mais les procédures ne débuteront pas avant 7 semaines d’âge.

1 675 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des femelles gestantes puis leurs petits sont gavés quotidiennement d'alcool sous régime gras pour reproduire une hépatite alcoolique aiguë, avec transplantation de microbiote fécal. Le porteur indique que le protocole peut entraîner une perte de poids importante et qu'aucun antalgique ne peut être administré, en raison de son effet sur le microbiote. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que la modélisation animale est indispensable.

Objectifs

L’Hépatite Alcoolique Aigüe sévère (HAA) est l’une des formes les plus graves de maladie du foie liée à la consommation chronique et excessive d’alcool. La mortalité attribuable à l’HAA est de 40 à 45% à 6 mois. La corticothérapie, seul traitement recommandé, améliore la survie à court terme. Cependant elle peut s’accompagner de complications infectieuses avec 25,6% des patients atteints d’HAA présentant une infection qui les rend inéligibles au traitement et se trouvent sans alternative thérapeutique. L’identification précoce des non-répondeurs aux corticoïdes est un enjeu thérapeutique pour éviter un traitement inutile et risquer une infection. De plus, dans le cas de résistance à la corticothérapie (30% des cas) la mortalité s’élève à plus de 75%. Récemment, le rôle du microbiote intestinal (MI) a été mis en lumière. En effet, le MI d’un patient ayant une HAA est différent de celui d’un patient sans HAA. De surcroit, le transfert du MI d’un patient avec une HAA sur un modèle de souris germ-free (dépourvue de microbiote) peut induire une inflammation hépatique. La transmission d’inflammation est réversible par une nouvelle transplantation d’un MI provenant d’un humain n’ayant pas développé de HAA, suggérant un concept de traitement de l’HAA par la Transplantation de Matière Fécale (TMF). Utiliser un modèle préclinique d’HAA chez des souris conventionnelles afin d’identifier les mécanismes immunomodulateurs de la TMF et comprendre les mécanismes physiopathologiques de réponse ou de résistance à la corticothérapie est crucial. Le rôle d’une TMF seule comme traitement d’une HAA ne peut être investigué en clinique pour des raisons éthiques car les patients ne peuvent pas ne pas recevoir les corticoïdes (traitement de référence). Ce modèle préclinique pourra être le modèle de référence pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements pour soigner l’HAA.

Bénéfices attendus

Le modèle préclinique développé pourrait, à court terme, être le modèle de référence pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements pour soigner l'HAA. La TMF seule comme traitement d’une HAA ne peut être investiguée en clinique pour des raisons éthiques. La démonstration de son efficacité dans ce modèle préclinique pourrait, à plus long terme, faire progresser les connaissances sur le bénéfice de la TMF dans le traitement de l’HAA et ainsi encourager de nouveaux essais cliniques. De plus, le traitement par TMF proposé dans ce travail se présente sous forme de gélules orales auto-administrées, cela ouvre de nombreuses perspectives d'utilisation pour de nombreuses pathologies démontrant une dysbiose. La démontration de l’efficactié de la TMF ouvre des perspectives thérapeutiques cruciales pour des patients se trouvant en impasse thérapeutique et où il n’existe pas d’alternatives thérapeutiques.

Procédures

Sur animaux vigiles: -Différents prélèvements non invasifs (urinaires, féces) sont réalisés hebdomadairement pendant toute la durée du protocole. -Au maximum 3 injections et des gavages quotidiens par animal seront réalisés.

Impact sur les animaux

La manipulation des mères gestantes peut induire un stress important. Les antibiotiques n'induisent pas de nuisance chez les souris gestantes. La répétition de gavages et d'injection peut induire un stress et une douleur modérée, notamment sur les femelles gestantes pour lesquelles le stress pourrait être plus important. Les prélèvement invasifs et non invasifs pourraient provoquer un léger stress chez les souris. Les précédentes études sur la procédure d'induction de l'HAA a montré qu'il pouvait induire une perte de poids importante.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour réaliser différentes analyses biologiques et histologiques.

Remplacement

Il n’existe aucun modèle dans la littérature de modèlisation cellulaire de l’HAA. De plus, pour vérifier l’efficacité du traitement, la modèlisation animale est une étape indispensable. Dans ce projet, le modèle préclinique permet de tester l’efficacité d'un nouveau traitement qui ne peut être investigué en clinique pour des raisons éthiques.

Réduction

Une expérience préliminaire sera réalisée pour définir le meilleur modèle de la HAA pour notre étude. L’utilisation du modèle développé permettrait de réduire le nombre de gavages et de manipulations dans l’établissement du microbiote intestinal d’intérêt. Le nombre de souris par groupe a été évalué via une étude statistique. Nous comparerons les traitements au sein de chaque groupe à l'aide de tests statistiques adéquates. Nous procéderons à 5 répétitions du protocole retenu (5 donneurs différents pour chaque groupe) mais une évaluation de la significativité sera effectuée à 3 répétitions pour réduire le nombre de souris. A la suite de l’expérience préliminaire. Au total 150 femelles gestantes et 750 femelles et 750 mâles seront nécessaires au développement du modèle d'HAA.

Raffinement

Les animaux seront mis avec présence d’enrichissement (litière foisonnante, roue d’activité motrice) et un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et/ou coton), et maintien des animaux en groupes de 6 afin d’éviter le stress de l’isolement. Dès leur arrivée à l’animalerie et jusqu’à leur mort, nos animaux seront surveillés de manière régulière, pesés 2 fois par semaine. Durant ce protocole, les animaux seront surveillés au moins une fois par jour pour s’assurer de leur bonne santé. Si une détérioration de l’état des animaux est observée, une grille de notation sera réalisée pour s’assurer que celle-ci ne dépasse pas les points limites. En cas de souffrance l’expérimentateur habilité appliquera les soins appropriés, soit une réhydratation par injection de solution glucosée à 5%, ou l’euthanasie de l’animal si nécessaire. il sera impossible de lui administrer des antalgiques en raison de leur impact sur le MI. Chaque mère sera mise dans une cage seule, avec présence d’enrichissement (litière foisonnante, roue d’activité motrice) et un accès ad libitum à l’eau et la nourriture.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de référence dans l’étude de la maladie alcoolique du foie. Des femelles gestantes au dernier tiers de gestation puis les femelles allaitantes seront gavées avec le microbiote d'intérêt afin de mimer la transmission du microbiote de la mère au nouveau-né. Après le sevrage, les souris sevrées sont séparées en fonction de leur sexe et seront nourries, dès qu’ils atteindront le poids de 19g pour les femelles et 20g pour les mâles, de manière chronique avec un régime gras contenant de l'alcool et des gavages quotidiens d'alcool. Après induction de l'HAA , les souris recevront le traitement. Il faut noter, comme le précise les études antérieures que ce protocole peut induire une perte de poids importante, seules des souris de poids supérieurs à 19-20g recevront le régime gras contenant de l'alcool .

6 macaques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant deux chirurgies cérébrales de trois à cinq heures et environ douze mois de séances quotidiennes d'enregistrement de ses neurones, cinq jours par semaine, avant d'être tué pour l'analyse de son cerveau. L'équipe leur injecte chaque jour dans le muscle une neurotoxine, le MPTP, pendant six mois au plus, pour provoquer des symptômes parkinsoniens permanents (raideur musculaire, tremblements, posture anormale), avec des difficultés à s'alimenter et à bouger qui peuvent entraîner perte de poids et escarres. S'y ajoutent des injections de particules virales dans le cerveau, des électrodes de stimulation électrique, une injection quotidienne d'une substance que le porteur dit "inerte" mais destinée à "manipuler l'activité des neurones", et un entraînement pour se laisser attraper par un collier au bout d'une canne et rester assis jusqu'à une heure dans une "chaise de travail". Le porteur décrit une "pénurie de singes" en Europe et dans le monde, et annonce que le choix entre macaque cynomolgus et macaque rhésus "dépendra des possibilités d'approvisionnement".

Objectifs

Dans la maladie de Parkinson, le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires s’accompagnent d’activités oscillatoires anormales dans un réseau de structures localisées sous le cortex cérébral, aussi appelé les ganglions de la base. Néanmoins, le lien entre ces activités oscillatoires pathologiques et les troubles moteurs caractéristiques de la maladie de Parkinson reste flou malgré des décennies de recherche. D'une part, la concomitance entre la réduction/abolition de ces activités oscillatoires suite à des traitements pharmacologiques et/ou à des procédures chirurgicales et l'amélioration clinique des troubles moteurs suggère un lien de causalité entre ces oscillations neuronales et la planification, le contrôle et la coordination des mouvements. D'autre part, il a été démontré que le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires peuvent apparaître avant l'émergence des activités oscillatoires dans les ganglions de la base. De plus, les caractéristiques de ces oscillations neuronales peuvent varier en fonction des différentes structures qui composent le réseau des ganglions de la base. Notre plan de recherche est structuré en trois objectifs complémentaires. Le projet vise à (i) caractériser comment ces activités oscillatoires se produisent et comment elles se propagent dans les différentes structures des ganglions de la base chez des singes parkinsoniens effectuant des mouvements de bras volontaires en direction d’une cible; (ii) identifier le lien entre les caractéristiques de ces oscillations neuronales dans différentes structures du réseau des ganglions de la base et les mouvements normaux/anormaux; (iii) développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant une inversion rapide et robuste des changements neuronaux et comportementaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour la maladie de Parkinson qui diffèrent significativement des thérapies actuellement disponibles et qui ne peuvent être développées sans une profonde compréhension mécanistique et quantitative de la façon dont le cerveau remplit ses fonctions ainsi que des mécanismes qui sous-tendent ses dysfonctionnements. Ce projet permettra de comprendre les mécanismes de génération et de propagation des activités oscillatoires anormales observées dans les ganglions de la base chez des singes après induction d’un syndrome parkinsonien et révèlera le lien avec les symptômes moteurs parkinsoniens. Ce projet sera donc extrêmement intéressant pour les personnes souhaitant développer de protocoles thérapeutiques originaux visant à restaurer le fonctionnement normal du cerveau. A terme, ce projet aidera à soulager les troubles moteurs des patients souffrant de la maladie de Parkinson tout en minimisant l'apparition d'effets secondaires et donc participera à améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Chacun des animaux sera soumis à deux chirurgies d'une durée de 3à 5h chacune. La première chirurgie permettra l'injections de particules virales inactivées dans le cerveau visant à modifier les caractéristiques des neurones, et l'implantation d'électrodes d'enregistrements pour recueillir l'activité de ces neurones. La seconde chirurgie permettra l'implantation d'électrodes permettant de délivrer différentes intensités de courant électrique dans le cerveau pour restaurer son fonctionnement normal. Chaque animal subira également une injection intramusculaire quotidienne d'une substance chimique inerte et sans danger pour l'animal visant à manipuler l'activité des neurones dont les caractéristiques ont été modifiées préalablement (une injection par jour, 5 jours par semaines durant 3 à 6 mois environ). L'induction du syndrome parkinsonien chez les animaux se fera grâce à des injections quotidiennes intramusculaires (une injection par jour pendant n jours) d'une neurotoxine (appelé MPTP) qui provoque des symptômes permanents de la maladie de Parkinson. Le nombre de jours d'injection et le dosage de cette neurotoxine dépendra de la progression du syndrome (mais n'excédera pas plus de 6 mois). Enfin, chaque animal participera à une séance quotidienne d'enregistrements électrophysiologiques de l'activité neuronale (une séance par jour, 5 jours par semaine durant 12 mois environ).

Impact sur les animaux

La phase précoce de conditionnement et de l'entrainement (c'est-à-dire la capture de l'animal dans la volière à l'aide d'un colier, l'entrainement de l'animal dans la tâche comportemental) peut stresser les animaux. De plus, des douleurs et infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales . Enfin, l'induction du syndrome parkinsonien provoquera l'apparition de symptômes moteurs (c'est-à-dire des difficultés à effectuer des mouvements, une rigidité musculaire, une posture anormale et des tremblements au repos). Par ailleurs, selon la sévérité de ces symptômes parkinsoniens, les animaux pourront présenter des difficultés à s'alimenter et à bouger pouvant donc entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres.

Devenir

Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale et l'aspect du cerveau après l’induction du syndrome parkinsonien. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.

Remplacement

Notre projet a pour but de caractériser les dysfonctionnements qui se produisent dans le cerveau après induction d'un syndrome parkinsonien et de déterminer les conséquences sur le comportement afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce type de projet ne peut donc pas être effectué via des approches in silico, in vitro ou ex vivo et l'approche in vivo est indispensable. De plus, les singes ont un cerveau et des comportements semblables à l'homme ce qui permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation de rongeurs ou d’autres espèces de vertébrés n'est donc pas appropriée et nous sommes obligés d'utiliser des primates non-humains.

Réduction

Notre objectif est de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour la recherche. Nous y parvenons en planifiant soigneusement et en maximisant les données obtenues chez chaque animal. Ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera par deux le nombre total d’animaux utilisé pour ce projet. Le nombre d'animaux a été choisi en fonction des pratiques standards qui combinent l'étude de l'activité neuronale et l'étude du comportement chez les primates non-humains. Enfin, notre stratégie de libre accès aux données sera essentielle non seulement pour les avancées scientifiques, mais aussi pour des raisons éthiques. En effet, il n'est pas nécessaire de réaliser davantage d'expériences sur les animaux si les données sont déjà disponibles quelque part dans le monde.

Raffinement

En début de protocole et durant 3 mois, l’expérimentateur habituera les animaux à sa présence (15-30min par jour, 5 jours par semaine). L’expérimentateur apprendra à l’animal à se laisser attraper par son collier à l’aide d’une canne et à rester calmement assis dans une chaise de travail (5 jours par semaine). Le temps passé en chaise augmentera progressivement jusqu’à atteindre une heure. Pendant la durée totale des expériences, les animaux seront maintenus ensemble afin d'éviter l'isolement social et les comportements dépressifs. Ils bénéficieront également d'un environnement enrichi (par exemple, jouets, musique). Les chirurgies seront réalisées dans un bloc opératoire dédié, de façon stérile et sous anesthésie profonde. Une couverture antalgique en pré- et post-opératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Enfin, pour limiter la douleur que peuvent engendrer les incisions cutanées, nous administrons un anesthésique local avant incision. Pour le contrôle de la température, avant l’induction de l’anesthésie, une sonde sera insérée dans le rectum des animaux. De plus, durant la totalité de la chirurgie, les animaux seront placés sous une couverture (électrique) chauffante qui est régulée en fonction de la température corporelle. Suite aux chirurgies, les animaux seront quotidiennement observés durant 5 à 7 jours post-chirurgie par le personnel de l'animalerie sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition etc. Une attention toute particulière sera porté aux risques d'infections, d'abcès, d'œdèmes et d'inflammation. Enfin, durant l'induction du syndrome parkinsonien, les animaux seront également quotidiennement observés pour évaluer la sévérité de la maladie et induire un syndrome parkinsonien stable et modéré. Si les symptômes s'accentuent (c'est-à-dire difficultés à s'alimenter et à bouger, pouvant entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres), l'animal sera immédiatement sorti du protocole et séparé des autres animaux, de façon à sécuriser son hébergement et éviter qu’il se blesse. De plus, des précautions particulières seront prises telles que l'utilisation de matelas moelleux/alèses et de fréquents changements de position pour éviter les chocs et le développement d'escarres.

Choix des espèces

Contrairement à d'autres espèces de vertébrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation du cerveau semblable à celle de l'homme. De plus, le macaque possède un répertoire de comportements plus large et plus proche de celui de l'homme ce qui nous permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation du primate non-humain permettra donc de plus facilement transposer nos résultats à l’homme et reste donc indispensable dans le cadre de cette étude. De plus, les animaux utilisés pour ce projet seront âgés d’au moins 36-48 mois. A cet âge, on peut considérer que le développement du système nerveux central à atteint sa maturité. Ce paramètre est important à respecter puisqu’il nous permettra de comparer plus aisément les résultats obtenus chez ces animaux avec les caractéristiques observés chez l’homme à l’âge adulte. Notons que dans le contexte (européen et mondial) actuel de pénurie de singes pour la recherche scientifique, le choix du singe cynomolgus ou du singe rhésus dans ce projet dépendra des possibilités d'approvisionnement. Quoiqu'il en soit, nous n'attendons pas de différences majeures entre ces deux espèces.