Procédures sévères

1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Elles subissent trois modèles d'accident vasculaire cérébral ischémique puis un suivi par IRM, pour tester un agent de contraste censé diagnostiquer et traiter les microcaillots. Le porteur indique que ces modèles peuvent provoquer des douleurs postopératoires, des déficits moteurs et cognitifs et une perte de poids, les souris perdant plus de 20 % de leur poids ou dépassant un score de douleur défini étant alors tuées. Il répète que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

L’enjeu de ce projet est d’améliorer la prise en charge des microthrombi (petits caillots sanguins) résiduels dans les accidents vasculaires cérébraux (AVC) de type ischémique. Pour cela, nous avons développé un nouvel agent de contraste (PHySIOMICS). Ce dernier, peut être combiné à différentes molécules et semble doté de propriétés anti-inflammatoires. Ainsi, dans un premier temps, nous combinerons cet agent de contraste à des molécules favorisant la thrombolyse des thrombi (par exemple l’activateur tissulaire du plasminogène). Ensuite, nous évaluerons l’effet des PHySIOMICS sur la réponse inflammatoire associée dans le parenchyme cérébral. Nous développerons ainsi un outil théranostique qui vectorisera un traitement thérapeutique spécifiquement au niveau des microthrombi tout en assurant leur diagnostic. L’IRM moléculaire permettra de suivre l’apport thérapeutique des PHySIOMICS couplés ou non sur le traitement des microthrombi chez la souris.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic et le traitement des AVC chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un potentiel traitement ischémique et inflammatoire ainsi que la caractérisation de l'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 modèles d'AVC ischémique différents, le modèle thrombine d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 1); le modèle chlorure de fer (application d'une compresse imbibée de chlorure de fer sur l'artère cérébrale moyenne permettant la formation d'un caillot) d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 2); le modèle sténoses en tandem : c'est à dire la formation de plaques d'athérome au niveau de l'artère carotide commune puis les faire migrer au niveau du parenchyme pour une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 3) et 1 modèle de neuro-inflammation d'une durée moyenne de 20 minutes (cf procédure 4). Tous les animaux auront un suivi à l'IRM d'une durée moyenne de 45 minutes à J0 (après avoir induit un AVC ischémique (procédure 1 à 3) ou une neuroinflammation (procédure 4)) et un second suivi allant de 6h à 7 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : *Pour le modèle thrombine (cf procédure 1): - perte de poids - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Pour le modèle chlorure de fer (cf procédure 2): - perte de poids - douleurs post opératoires - stress – déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle de sténose en tandem (cf procédure 3): - diabète – douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle de neuroinflammation (cf procédure 4) : - diabète - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le suivi à l'IRM : -stress. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observations des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).

Devenir

Les animaux issus des procédures d'AVC ishcémique et de neuroinflammation seront mis à mort par perfusion intra-cardiaque afin de prélever les organes.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine grave touchant une part importante de la population. De plus, les méthodes in vitro de ce projet aident à la réduction du nombre d’animaux. La technique des microfluidiques nous permettra l’étude de la fixation des PHySIOMICS couplés au TPA et/ou la NAC aux caillots et de visualiser leur dégradation. Ainsi l’efficacité de ce couplage sera déjà évaluée et validée avant d’avoir recours aux animaux limitant ainsi leurs nombres.

Réduction

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquations avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur le modèle.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permet de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée par rapport au poids initial et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel utilisé dans cette procédure expérimentale est neuf (pour les consommables, comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyé et désinfecté pour les réutilisables (pinces métalliques).

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'inflammation cérébrale. Le stade de développement des animaux est de 8 semaines pour les souris des procédures 1; 2 et 4 pour un poids compris entre 35 et 40g. Ce choix a été fait fait suivant les données de la litérrature employant les mêmes modèles expérimentaux. Enfin, pour la procédure 3, le modèle d'AVC ischémique sténose en tandem sera réalisé sur des souris de 12 semaines car il est nécessaire d'induire un régime de "high-fat diet" pendant 6 semaines (après sevrage qui est à 6 seamines) afin d'obtenir des animaux diabétiques.

336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde pour prélever leurs tissus cardiaques. Chacune est intubée, a le thorax ouvert et subit trente minutes de ligature d'une artère coronaire pour provoquer un infarctus, puis passe environ 24 heures isolée sur un tapis chauffant. Le porteur compte 25 % de mortalité liée à l'infarctus et forme ses groupes en conséquence, 15 souris pour en garder 12, afin d'étudier le rôle de la protéine BIN1 dans le maintien des tubules T des cellules du cœur et l'effet de BIN1 ou d'immunosuppresseurs administrés. Pour justifier l'espèce, il écrit que "La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme".

Objectifs

L’objectif de notre projet est d'éclaircir les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la formation de tubules T des cardiomyocytes dans l’infarctus myocardique. En particulier, nous cherchons à déterminer si BIN1 et le transport vésiculaire ont un effet protecteur sur le maintien des tubules T et la contractilité cardiaque. Nous utiliserons un modèle d'ischémie-reperfusion myocardique chez la souris nous permettant d'étudier l’organisation des tubules T, les taux de BIN1 et de ses partenaires, ainsi que l'effet de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs (dexaméthasone, DEX, et rapamycine, RAP) sur la taille de l'infarctus.

Bénéfices attendus

L’infarctus du myocarde (IM) aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Lors d’un IM, l’occlusion d’une artère coronaire irrigant le cœur prive les cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes) d’oxygène, entrainant une dégradation de ces cellules et une diminution de leur contractilité. En particulier, les invaginations transversales membranaires ou tubules T des cardiomyocytes, essentielles à la contraction au niveau cellulaire, sont altérées. Cependant, ces mécanismes sont pour le moment encore mal compris. En étudiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du réseau de tubules T cardiaques, notre projet permettra de mieux comprendre comment les tubules T sont générés et dégradés, et de déterminer les acteurs clés de ces processus. Il sera ainsi possible de contrecarrer la dégradation des tubules T et de restaurer la contractilité cardiaque en régulant la concentration des acteurs clés. Pendant la durée de ce projet, nous espérons pouvoir identifier les conditions permettant la maintenance des tubules T des cardiomyocytes dans un modèle murin d’ischémie-reperfusion, ainsi qu’une amélioration de la contractilité cardiaque. L’étude de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs nous mettrons également sur la voie de futur traitements possibles chez les patients pour maintenir la contractilité cardiaque dans les zones les plus affectées après un IM.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'ischémie/reperfusion myocardique (ligature coronaire). La durée totale de l'intervention chirurgicale est de 60 min, dont 15 min entre l'intubation oro-trachéale et l'accès au coeur, 30 min de ligature coronaire, et 15 min pour la fermeture du thorax. Un prélèvement sanguin terminal de 150 µl sera également effectué au moment du sacrifice des animaux (procédure 1).

Impact sur les animaux

Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Les nuisances ou effets indésirables suite à l'anesthésie et la chirurgie sont l'hypotension, le refroidissement et la perte de poids. Avant utilisation, une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur, dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids en groupe social au sein de l’animalerie en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu par des jouets (cabanes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Avant procédure, une surveillance quotidienne des animaux (observation de l’état général) sera réalisée par le personnel de l’animalerie soignant les animaux, et leur poids sera suivi de façon hebdomadaire par le personnel réalisant les procédures chirurgicales. Après la chirurgie, les animaux seront gardés sous surveillance dans une cage sur tapis chauffant avec enrichissement, eau et nourriture gélifiée en plus de l’alimentation habituelle. Cette surveillance, où l’animal est isolé, dure approximativement 24h, puis les animaux retrouvent leur hébergement en groupe social avec enrichissement, en conservant autant que possible les groupes formés afin de maintenir la stabilité hiérarchique établie. Pendant tout le protocole expérimental, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel ayant réalisé la procédure chirurgicale grâce à la grille de score des points limites (fiche d’observation, voir annexe) qui est mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. En cas de souffrance de l’animal selon le score obtenu à l’aide de la grille d’évaluation, une nouvelle injection d’antalgique (buprénorphine 0.1mg/Kg) sera réalisée. Au cours de la procédure, la décision de garder les souris en vie sera prise par le responsable du projet en concertation avec le vétérinaire référent et la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde (kétamine/xylazine) pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.

Remplacement

Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette etude, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative ni de modélisation possible de l'ischémie-reperfusion myocardique

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 animaux + 25% de mortalité liée à l'infarctus, soir 15 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux les effets de l'ischémie reperfusion myocardique sur , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux a inclure. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience.

Raffinement

Nous raffineros cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage d’animalier minimum 2 fois/jour). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique (cocktail kétamine 100mg/Kg /Xylazine 10mg/Kg i.p.) avant la chirurgie et d’analgésique (Buprénorphine 0.05mg/Kg) aux doses appropriées avant la chirurgie, une deuxième injection de Buprénorphine (0.05mg/Kg) est réalisée 6h après le réveil puis une troisième injection 14h après la seconde injection.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. 3 mois (jeunes adultes) pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie liée au vieillissement.

22 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures pour provoquer un trouble du rythme et implanter un pacemaker, puis une greffe de cellules cardiaques issues de cellules souches humaines, avant un mois de surveillance. Le porteur indique que les tirs de radiofréquence ou un dysfonctionnement du pacemaker peuvent tuer l'animal en cours de procédure. Il reconnaît que les organoïdes permettent des études in vitro mais conclut que ce système ne sera jamais aussi représentatif que le modèle porcin.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde. Elles se manifestent par un dysfonctionnement du cœur au niveau circulatoire mais aussi au niveau électrique. Notre projet porte sur le dysfonctionnement du noeud sino-atrial (NSA - ensemble de cellules dans l'oreillette droite) qui est le principal stimulateur cardiaque qui contrôle la fréquence cardiaque tout au long de la vie. Son mauvais fonctionnement en raison d'une maladie congénitale ou du vieillissement, entraîne un ralentissement de la fréquence cardiaque et une circulation sanguine inefficace, ce qui nécessite un traitement par l'implantation d'un stimulateur cardiaque électronique. Or ces équipements présentent plusieurs inconvénients, notamment un risque d'infection, une durée de vie de batterie limitée et l'incapacité de s'adapter aux changements de taille du cœur chez les patients. Notre laboratoire a développé ces dernières années une technique capable de générer des cellules cardiaques contractiles in vitro (appelées hiPSC-CMs), dérivées de cellules de patients, et qui pourraient offrir une thérapie alternative de stimulateur biologique dans laquelle le NSA défaillant serait remplacé par greffe cellulaire. Dans ce contexte, nous souhaitons étudier l’impact d'une telle greffe chez un modèle porcin souffrant de troubles du rythme cardiaque.

Bénéfices attendus

Le dysfonctionnement du NSA est fréquent et considéré comme facteur de risque cardio-vasculaire. Il engendre des frais d’hospitalisation majeurs pouvant être réduits par une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques liés au traitement (ici un pacemaker biologique). Si la greffe de cellules souches permettait la reprise de l’activité cardiaque, cela offrirait une opportunité exceptionnelle d'étudier le développement et la fonction d'un pacemaker cardiaque humain, de modéliser des maladies qui affectent cette sous-population de cellules cardiaques et de concevoir la médecine régénératrice pour les patients souffrant d'insuffisance cardiaque.

Procédures

Au cours de cette procédure, les animaux subiront une chirurgie de deux heures maximum pour induire un trouble cardiaque et implanter un pacemaker. Une semaine après la pose du pacemaker, ils bénéficieront d'une greffe de cardiomyocytes et seront surveillés quotidiennement pendant un mois. A la fin de la procédure, ils seront mis à mort et des tissus seront prélevés pour analyse.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l'animal sont plus liées au modèle lui même qu'à la présence d'une douleur pour laquelle les procédures de prise en charge sont bien maîtrisées (injection d'un morphinique au cours de l'intervention, administration post-opératoire d'anti-douleurs et anti-inflammatoires). En effet, la création de ce modèle pourrait entraîner la mort de l'animal à plusieurs moments : soit en cours d'intervention à cause des tirs de radiofréquence avant la pose du pacemaker, cette situation n'est pas anticipable et sera dépendante des individus ; soit pendant la phase de surveillance des animaux, ce qui pourrait être lié à un dysfonctionnement du pacemaker. Un rejet de greffe est envisageable mais au vu de la petite quantité et du lieu d'injection des cellules, nous nous attendons à une réaction inflammatoire locale sans effet sur l'état général de l'animal. Au cours des phases de surveillance, et au delà des soins apportés pour une bonne cicatrisation suite à l'opération, la surveillance des animaux sera très rigoureuse, notamment par l'évaluation quotidienne du comportement de l'animal et de son état de conscience évalué par une grille de score.

Devenir

Tous les animaux seront mis en mort en fin de procédure pour réaliser des prélèvements tissulaires.

Remplacement

Le but de l'étude sera d'approcher au maximum du modèle humain en déterminant les conditions de greffe d’un pacemaker biologique issus d'organoïde de hiPSC-CMs, permettant à l'avenir de remplacer les pacemakers électroniques. Bien que les organoïdes représentent une avancée significative pour la recherche en permettant de réaliser des études in vitro pour comprendre la toxicité et l’action d’une molécule pharmacologique, ou pour mieux comprendre la complexité du vivant, ce système ne pourra jamais être aussi complet et représentatif que le modèle animal. C'est pourquoi, malgré notre volonté permanente de respecter les 3Rs, nous avons choisi de poursuivre nos recherches sur le modèle porcin. Sa taille, son anatomie et les exigences requises pour la réalisation du protocole en font le modèle expérimental le plus pertinent pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum, défini sur les données d'une étude précédente, ainsi que sur une évaluation statistique permettant de calculer le nombre nécessaire pour obtenir une différence significative entre plusieurs groupes. La reprise de l’activité cardiaque suite à une ablation du nœud auriculo-ventriculaire sera étudiée dans le temps par un test satistique.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, les gestes interventionnels (ablation par radiofréquence, implantation du pacemaker, greffe, exploration terminale) seront toujours réalisés sous anesthésie générale associée à la gestion de la douleur per-opératoire et post-opératoire par l'administration d'anti-inflammatoires. La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille. De même la mise à mort sera réalisée en fin de procédure alors que les animaux sont anesthésiés. Pendant la phase post-opératoire immédiate, une grille d'évaluation sera utilisée pour s'assurer du bon réveil de l'animal. Pendant la période de surveillance, notre vigilance sera accrue. Une grille de score sera utilisée pour évaluer l'état clinique des animaux, portant sur des critères d'absence d'infection ou d'hématome, sur des points généraux de comportement et des signes d'inconfort ou de douleur, et sur l'état de conscience de l'animal en lien direct avec le modèle. Cette grille aidera à la prise de décision en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

L'objectif de l'étude est d’évaluer la réponse à une thérapeutique (greffe de pacemaker biologique issu de cellules souches) sur un modèle le plus proche possible de l’humain. Le modèle porcin, de par sa taille et les exigences requises pour la réalisation du protocole, est le modèle expérimental le plus pertinent pour cette étude. Ce modèle de porc anesthésié, intubé et ventilé devrait permettre d'obtenir des résultats histologiques cardiaques, après euthanasie, extrapolables au patient de cardiologie ou de médecine de ville. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois environ, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 30 et 35 kg) et pour des raisons de coût d'autre part.

990 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent dans l'articulation de la cheville une ou deux injections de cristaux d'urate ou de carraghénine pour déclencher une crise de goutte, puis le composé à tester, la douleur étant mesurée par le test de von Frey, pour évaluer de nouveaux candidats médicaments d'un partenaire industriel. Le porteur indique que l'arthrite induite peut provoquer une inflammation locale douloureuse, un défaut de toilettage et une baisse de la prise alimentaire. Il affirme que la culture cellulaire ne peut pas explorer ces mécanismes et que la preuve d'efficacité exige un "organisme entier", et revendique le rat comme le plus petit animal permettant une injection articulaire fiable.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer un modèle d’arthrite chez le rat afin de tester de futurs candidats médicaments dans la prise en charge de cette pathologie. Dans cette étude, nous évaluerons la pharmacocinétique d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation aiguë de l'articulation de la cheville. Ce travail cherche à améliorer le traitement des arthrites, en particulier de la crise de goutte, une maladie inflammatoire touchant les articulations. Les crises, souvent très douloureuses, se caractérisent par un échauffement et un gonflement de l'articulation et peuvent durer plusieurs jours. La complexité de ces maladies, dont la composante est multicellulaire, nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme entier comme l’animal. Cette étude se fosalise sur le développement de nouvelles formes d’administration d’un principe actif en utilisant des techniques de délivrance locale prolongée du médicament. Nous utiliserons un modèle d’inflammation goutteuse induite par des cristaux d’urate (Monosodium Urate MSU) ou de la carraghénine chez le rat. Un seul inducteur de l'inflammation (MSU ou carraghénine) sera utilisé par étude mais ces 2 agents inflammatoires pourront être testés lors d'études indépendantes. La pharmacocinétique du traitement administré sera déterminée de manière locale (niveau articulaire) mais également de manière systémique (sang). La douleur sera évaluée grâce au test de von Frey. L’utilisation du rat est tout indiquée dans cette étude, et se fera en accord avec la règle des 3R. Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort des rats seront mis en place dans chaque expérience et tous les animaux seront pesés et leur comportement surveillé afin de veiller à leur bien-être. Ce projet de recherche nécessitera l'utilisation de 99 rats par étude (15 rats pour l’étude pilote et 84 rats pour l’étude principale). A raison de deux études par an, nous utiliserons 990 rats pour la durée totale du projet. Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole étant classées à un grade sévère, elles feront l'objet d'une évaluation rétrospective.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'évaluer de nouveaux candidats médicament dans le processus inflammatoire de l'arthrite afin d'améliorer la prise en charge des patients et de les traiter de manière durable.

Procédures

Les animaux recevront une ou deux (selon la demande du partenaire industriel) injections intra-articulaire dans l'articulation de la cheville pour induire l'arthrite et une injection intra-articulaire avec le composé à tester. Les injections intra-articulaires durent 30 secondes et se font sous anesthésie isoflurane. Pour évaluer la douleur, les animaux seront soumis à un test qui consiste à appliquer de manière successive des filaments au niveau de la patte de l’animal. Les animaux sont acclimatés au set-up durant 30 minutes suivi par le test de Von Frey pendant 15 minutes. Enfin, sur animal euthanasié, un prélèvement en point final de sang sera effectué au niveau caudal. Un lavage intra-articulaire, et un prélèvement d'organes auront lieu après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo. L'ensemble de ces prélèvement se feront dans les 5 minutes suivant la mise à mort de l'animal.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables induits par un modèle d'arthrite chez le rat sont le développement d'une réaction inflammatoire au niveau local, une douleur locale pouvant entraîner un manque de toilette (poils ébouriffés), un comportement altéré (vivacité réduite) et une diminution de la prise alimentaire si l'animal a des difficultés à se redresser sur ses pattes. C'est pourquoi les rats seront surveillés quotidiennement post-induction pendant toute la durée de l'étude. L'aspect général et le poids des rats seront évalués post-induction sous la forme d’un score prédictif de la douleur. Des granulés seront déposés dans la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux.

Devenir

A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet et la pharmacocinétique du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.

Remplacement

Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire permettra de valider le modèle d’arthrite induite. L’étude principale ne sera conduite seulement si les résultats de cette étude pilote confirment la robustesse du modèle permettant ainsi de réduire le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux. Le nombre de rats nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Le nombre de 8 animaux par condition test correspond à la quantité minimale nécessaire pour cet objectif.

Raffinement

Les rats seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 3 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (tunnel, buchette) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal. Des granulés seront déposés dans la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux. Enfin, l'ensemble des injections intra-articulaires se feront sous anesthésie isoflurane 3%.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis et ceux à deux reprises dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines afin d'avoir des sujets adultes avec un système immunitaire mature pour se conformer à l’objectif de l’étude visant à appliquer ces futurs composés sur une population adulte.

511 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent l'ARN d'un entérovirus par voie intraveineuse ou intrapéritonéale pour induire une myocardite, avant le prélèvement terminal de leurs organes. Le porteur classe ces procédures en sévère car l'infection peut faire perdre 20 % de leur poids aux souris, seuil déclenchant leur mise à mort immédiate par dislocation cervicale. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne peut se substituer à l'animal, l'inflammation n'étant décrite selon lui que chez les mammifères.

Objectifs

La myocardite virale est une maladie inflammatoire du cœur. L’incidence de cette maladie est d’environ 1,5 million de cas par an dans le monde. Elle résulte principalement d’une infection des tissus cardiaques par des virus communs comme les Entérovirus et elle est considérée comme une des causes majeures de mort subite cardiaque chez l’enfant et l’adulte jeune. Actuellement les mécanismes qui régulent le développement de la myocardite virale aiguë et sévère restent inconnus et limitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'objectif principal de ce projet est d’étudier l’impact de ces virus dans un modèle animal (chez la souris) sur la réponse immunitaire et le développement de la maladie.

Bénéfices attendus

Bien que des progrès remarquables aient été réalisés au cours des dernières années au niveau des outils de diagnostic de la myocardite, la prise en charge clinique de cette pathologie reste difficile avec des traitements symptomatiques de l’insuffisance cardiaque et ou des troubles du rythme. Notre projet qui vise à court terme d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la sévérité de la myocardite virale et sa progression en myocardite chronique. Ainsi, les résultats attendus auront un bénéfice pour la santé humaine. Aussi, l’étape 2 du projet permettra de poser à long terme les bases de futures thérapeutiques visant à activer d’une manière adéquate la réponse immunitaire chez les patients présentant une myocardite aigue induite par les Enterovirus.

Procédures

L'administration de l'ARN viral, du virus ou du traitement, se fera une fois par voie intraveineuse ou intrapéritonéale. A un temps définit, les organes de souris seront prélevés pour les analyses virologiques, histologiques et immunologiques. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ni de procédures chirurgicales seront appliqués sur les animaux des procédures.

Impact sur les animaux

Les premiers signes d'infection par le virus chez la souris sont la perte de poids (20% du poids initiale de la souris), ce qui justifié la classe sévère des procédures, et une diminution d'activité. Le stress et l'inconfort lié à la contention et aux injections intraveineuses ou intrapéritonéales.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever les organes cibles afin effectuer les analyses virologiques, biochimiques et histologiques

Remplacement

La myocardite est une maladie inflammatoire du muscle cardiaque. Le phénomène de l’inflammation est décrit uniquement chez les mammifères. Nous ne pouvons donc pas utiliser de modèle invertébré pour répondre à notre objectif. La complexité du système à étudier et son impossibilité de le reproduire in vitro, en tenant compte de tous les phénomènes biologiques de l’organisme, fait qu’il n’y a aucune méthode alternative pour substituer à l’utilisation des animaux

Réduction

Nous avons le souci permanent de réduire le nombre de souris sacrifiées dans nos projets, pour cela nous utiliserons des études statistiques afin de justifier la pertinence de nos résultats tout en utilisant le moins de souris possible. Tenant compte de nos résultats ultérieurs et l’expérience des membres du projet, nous utilisons des logiciels pour calculer/estimer le nombre minimal d’animaux à utiliser dans chaque groupe.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et l'angoisse des animaux, nous mettrons en œuvre des mesures enrichissement des cages notamment avec du coton, aucun hébergement individuel n’est prévu, et les expériences seront menées par le même expérimentateur du début jusqu’à la fin. Au cours de l'infection, les animaux seront pesés et observés pour leur comportement dans les cages tous les jours, y compris les week-ends et les jours fériés. Par la tenue d’une grille d’évaluation de l’état de santé de chaque souris, tout animal montrant une perte de poids de 20% de son poids initial ou à l’apparition d’un signe de souffrance (diminution d'activité, chute, dos vouté, pelage hérissé, détresse respiratoire) sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Conformément aux données de la littérature la souris est l’animal le plus utilisé dans les études de recherche sur les maladies cardiovasculaire. Plusieurs données sur les infections virales (existence des souches de virus adaptées à la souris) et inflammation ont été établie par nous-même et d’autres laboratoires en utilisant la souris comme modèle d’étude. L’existence sur le marché d’un grand nombre d’anticorps dirigés contre les marqueurs de l’inflammation spécifique murin, facilitera notre étude afin de progresser, plus rapidement, dans nos recherches. Nous travaillons avec des souris adultes (5-6 semaines, poids ~17-20g)

1 151 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un anévrysme intracrânien est provoqué par injection d'une molécule dans le cerveau et pose d'un dispositif augmentant la pression artérielle, jusqu'à la rupture et l'hémorragie cérébrale. Le porteur indique une mortalité attendue lors de la chirurgie et des symptômes neurologiques déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucun dispositif ne reproduit tous les paramètres de la maladie et qu'il est "nécessaire" de provoquer chez l'animal une pathologie proche de celle des humains.

Objectifs

Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. Dix anévrysmes sur 100 000 évolueront jusqu'à leur rupture, entrainant des saignements dans le cerveau, ce qui conduit le plus souvent à la mort du patient. De plus en plus d’études suggèrent que l’évolution de l’anévrysme jusqu’à sa rupture n’est pas systématique et qu’elle ferait appel à des mécanismes particuliers. Pourtant, le seul traitement aujourd'hui consiste à retirer l'anévrysme, rompu ou non, lors d'une chirurgie très risquée. Un traitement moins dangereux pourrait être mis au point si les mécanismes impliqués dans la rupture de l'anévrysme étaient identifiés. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'anévrysme intracrânien évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, qui ont un rôle connu dans la coagulation sanguine, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques menant ou non à une rupture. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leurs mécanismes de réponses lors des stades tardifs de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 15 jours chez la souris des anévrysmes rompus. Nous allons l'appliquer à des souris n'ayant pas certaines protéines nécessaires au fonctionnement des plaquettes et étudier si leur absence à un effet positif sur la maladie. Une fois les protéines plaquettaires impliquées dans la maladie identifiées, nous utiliserons des médicaments déjà utilisés chez l'Homme ainsi que des molécules antiplaquettaires en développement.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre dans un premier temps d’identifier des molécules plaquettaires impliquées dans l’évolution de l’anévrysme vers sa rupture. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant l'évolution de l'anévrysme jusqu'à sa rupture chez la souris, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgicale compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.

Procédures

Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrismes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgical : un prélèvement sanguins est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (10 minutes au total). Une procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance). L'évolution du comportement plaquettaire durant l'évolution de la pathologie sera suivie par analyse sanguine. Pour analyser ce sang, 2 prélèvements sanguins supplémentaire seront réalisés sur souris anesthésiées. (un prélèvement sanguin = 1 minute)

Impact sur les animaux

Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie d'injection de molécule dans le cerveau (J0). Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée, 24h); perte de poids postopératoire (modérée, 24h); Stress de contention pendant la mesure de pression artérielle (9 sessions de 15 min). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme :Perte de poids (2g en 24h); Apparition de symptômes neurologiques, hémorragie.

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée ou à la fin de la procédure s'ils n'atteignent pas les points limites défini dans ce projet avant. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.

Remplacement

La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie due au passage de la micropipette dans un vaisseau survienne. Ceci s’exprime par une l’apparition de symptôme neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours et des points limites précoces ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile à l'animal. Du coton est mis à leur dispositon dans leur cage afin qu'ils puissent nidifier.

Choix des espèces

La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Homme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absente, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine.

Chacun des 6 macaques à longue queue subit une chirurgie de huit heures pour implanter un dispositif de refroidissement localisé de l'hippocampe, deux ventriculographies de trois heures, deux IRM et un scanner, puis 36 séances d'enregistrement de six heures, assis dans une chaise de contention à laquelle il est entraîné pendant au moins un mois. Ces primates sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à la fin, au terme d'une procédure sans réveil, pour analyser les lésions produites dans leur cerveau par le dispositif et le refroidissement. Le but est de mettre au point des algorithmes qui prédisent les crises d'épilepsie et déclenchent le refroidissement, en vue d'un implant humain qui pourrait fonctionner sur batterie. Le résumé ne décrit pas comment les crises sont provoquées : seule la liste des effets mentionne des crises "persistantes légères" 1 à 2 heures "après séance pénicilline", et la liste des séances d'enregistrement parle d'"injection" sans dire laquelle.

Objectifs

L’épilepsie, qui touche 1% de la population, constitue un problème de santé majeur. En dépit de nombreuses avancées thérapeutiques, seules 30% des épilepsies pharmaco-résistantes (celles qui ne répondent pas aux médicaments) sont opérables et cette option n’est envisageable que si le foyer épileptique se situe dans une zone accessible du cerveau Dans les autres cas, une autre approche thérapeutique alternative est l’arrêt des crises d’épilepsie par refroidissement du foyer épileptique. Ce phénomène, connu depuis les années 1930, a été validé chez le rongeur et testé chez le primate à l’aide de dispositifs de refroidissement appliqués à la surface du cerveau. Le présent projet a pour objectif d’appliquer cette technique de refroidissement uniquement au moment qui précède l’arrivée d’une crise épileptique sur un modèle de primate. La technique de refroidissement a l’avantage d’être réversible et d’être une procédure peu invasive, mais elle doit encore être affinée en vue d’une application thérapeutique chez l’homme. A ce jour, aucune étude n'a mis en évidence la possibilité d’utiliser la prédiction des crises d’épilepsie comme déclencheur du traitement en boucle fermée de l’épilepsie pharmaco-résistante. L’objectif scientifique de cette étude est donc de développer les algorithmes de prévision des crises épileptiques pour une administration en boucle fermée du refroidissement localisée. Ces algorithmes seront capables de détecter le risque d’émergence d’une crise d’épilepsie et de l’inhiber en activant un refroidissement localisé de la zone épileptogène.

Bénéfices attendus

A ce jour aucune étude n’a présenté une évidence incontestable que la prédiction où les pronostics des crises épileptiques est possible au-delà de l’occurrence par chance. Les pronostics générés vont produire des périodes de haute ou base probabilité d’occurrence des crises. Nous souhaitons tester l’efficacité des algorithmes via le refroidissement pendant ces périodes de haute probabilité des crises et non pas pendant les périodes de crises réels. L’hypothèse est que les effets du traitement vont être supérieurs s’ils sont appliqués en dehors des crises épileptiques convulsives déjà établies. Les bénéfices directs seront la réduction de la puissance nécessaire pour refroidir et le dosage de la quantité du froid à livrer. Avec une réduction de la quantité d’énergie nécessaire pour produire le froid, le système pourrait finalement être compatible avec une batterie implantable type « pacemaker ». Les rendements actuelles en utilisant une approche continue, ne permettent pas avoir une batterie implante à long terme. L’utilisation du refroidissement représente aussi un avantage considérable sur les systèmes actuels parce que son effet est plus important et rapide que la stimulation électrique. Les algorithmes vont être adaptés pour mieux répondre aux taches des pronostics des crises épileptiques. Ils vont être comparés à l’état de l’art et seront peu gourmands en consommation électrique. Ces algorithmes vont être évalués en utilisant un modèle de primates non humains épileptiques avec la possibilité d’optimiser les algorithmes dans le temps. Le refroidissement du foyer épileptogène est une manière efficace d’arrêter les crises, comme nous sommes en train de le démontrer dans nos études en cours. Ces modèles précliniques permettront de tester facilement l’efficacité des algorithmes pour prédire l’occurrence des crises et l’effet thérapeutique du refroidissement pendant les périodes de haut risque de crises. Les bénéfices attendus sont le développement des algorithmes de prévision des crises utilisables sur des systèmes en boucle fermée et aussi de valider l’hypothèse du départ sur la nécessité de diminuer le refroidissement pour aboutir à l’arrêt des crises.

Procédures

Imagerie par IRM : 2 d’une heure chacune Imagerie par CT scan : 1 d’une heure Ventriculographie : 2 de 3 heures Chirurgie implantation : Implantation de dispositif, durée 8 heures Prélèvements sanguins : pré et post-opératoire soit 2 des prélèvements additionnels seront réalisés si complication infectieuse Séances d’enregistrement par condition :12 injection sans refroidissement, 12 injection refroidissement intermittent « aléatoire », 12 refroidissement en boucle ferme soit 36 au total chacun durant 6 heures.

Impact sur les animaux

• Perte de poids post-opératoire : 7 jours • Douleur transitoire post opératoire : 1 jour • Stress pendant séance d’habituation : jusqu’à l’habituation • Position anormale (dos voûté) : post opératoire immédiat post anesthésie générale • Vocalisation anormale pendant la séance d’enregistrement : jusqu’à l’habituation • Signes neurologiques: parésie post opératoire transitoire : 5-7 jour post opératoire • Crises épileptiques persistantes légères (mâchonnements, salivation, mouvements répétitives de tête) : 1-2 heures après séance pénicilline

Devenir

A la fin des expérimentations et à la suite d’une procédure sans réveil, nous allons euthanasier les animaux et prélever leur cerveau pour analyser le degré de lésion produit par le dispositif refroidissant et le refroidissement en vue d’un passage à un dispositif implantable chez l’homme.

Remplacement

Le remplacement des modèles animaux en générale et des modèles primates en particulier n’est pas possible pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in vitro comme les tranches de tissus cérébrale ne permettent pas de tester un implant préclinique complet qui a pour vocation de préfigurer le futur implant humain. Dans le projet, une partie des éléments de l’implant et certaines expérimentations ont pu être menées in vitro, notamment les tests de biocompatibilité permettant d’éviter l’utilisation d’animaux. Les primates non humains (PNH) sont les modèles idéaux pour tester les dispositifs cliniques pour l’épilepsie pour la similitude existante entre la structure du cerveau humain et celle du PNH. De plus, la génération des états épileptiques et des crises sont similaires aux phénomènes observés chez le patient épileptique

Réduction

Un nombre maximal de 6 primates non humain est estimé dans ce projet pour obtenir des résultats statistiquement fiables et exploitables du fait notamment de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal sera son propre contrôle. L’analyse statistique sera effectuée par des tests non paramétriques appariés, afin de mesurer la différence des moyennes avant et après traitement sans présomption initiale d’une distribution normale de la population (précédés par des tests de normalité). Toutefois dans le respect de la règle de « réduction » des 3R, le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’au 50% si les résultats obtenus sur les premiers animaux ne sont pas concluants ce qui provoquera l’arrêt des expérimentations ou bien si l’effet est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié des animaux. Tous les efforts seront faits par les expérimentateurs pour réduire le nombre d’animaux mis en expérimentation tout en permettant d’atteindre l’objective scientifique.

Raffinement

L’état clinique des animaux sera régulièrement observé. Dès que l’animal manifestera l’une de ces réactions négatives spécifiques leur surveillance sera renforcée : perte de poids, douleur post opératoire, position anormale, vocalisation anormale, signes neurologiques, crises épileptiques persistantes. La surveillance renforcée consistera à trois observations par jour et pourra s’étendre à un accompagnement continu. Pendant cette mise en observation, le protocole de recherche sera interrompu et un protocole de soins sera mis en place. Le vétérinaire de l’installation sera alerté sans délai afin de décider de la mise en œuvre des traitements médicaux appropriés : 1. Traitement antidouleur dès les premiers signes de douleur 2. Traitement Antiépileptique si nécessaire 3. Anesthésie général pour tout soin, procédure chirurgicale, prise du sang ou imagerie. 4. Soins de la plaie chirurgicale post opératoire et suivi : Si signes d’infection présentes, les soins locaux seront augmentés en fréquence at une thérapeutique antibiotique sera mise en place 5. Entrainement a la chaise de contention pédant au moins 1 mois. L’animal doit rester calmement assis sur la contention pour la durée de la séance. 6. Les primates qui ne reproduiront pas les crises attendues, seront sortis de l’étude par anticipation. Les animaux isolés gardent un contact tactile, visuel et olfactif avec leurs congénéres ; l'enrichissement environnemental est augmenté (plus de jouets, friandises, ....) et les contacts avec les expérimentateurs accrus.

Choix des espèces

L’utilisation de primates non humains (PNH) dans l’étape finale d’évaluation préclinique est nécessaire avant un usage clinique chez l’Homme pour valider la sécurité et l’efficacité du dispositif. En effet, les PNH ont un cerveau semblable à l’Homme aussi bien sur le plan anatomique que fonctionnel (structure cellulaire, communication et connectivité neuronales, capacités cognitives etc…). En effet, un modèle alternatif ex vivo permettant d’obtenir toutes les données biologiques n’existe pas. De plus les PNH peuvent reproduire des crises d’épilepsie pharmaco résistantes similaires aux crises hippocampiques chez le patient. Notre protocole expérimental vise à arrêter les crises en utilisant des moyens implantables, comme dans un futur système clinique. Règlementairement, Le modèle animal peut être à l’origine d’essais expérimentaux nécessaires avant une expérimentation humaine. Les PNH servent donc, bien souvent, de tremplin avant une application chez l’homme. Les dispositifs médicaux implantables font l’objet de procédures d’évaluation rigoureuse avant de recevoir une autorisation de mise sur le marché. Depuis les années 80, dans tous les pays du Monde, sous la pression des politiques et de la société, une procédure, la « nouvelle approche », s’est progressivement imposée, qui codifie très précisément les différentes étapes de l’évaluation, in vitro, chez l’animal et en clinique pour permettre la mise sur le marché. Chacune de ces étapes, chacun des tests requis connaît des limites, mais au final, le système apparaît efficace, le nombre d’accidents étant particulièrement réduit, eu égard au nombre d’utilisation des dispositifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux d’un âge supérieur à 40 mois et un poids de +/- 7-10 kg, afin de pouvoir faciliter la manipulation et l’entrainement comportemental des sujets adultes.