Procédures sévères

600 souris Nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Sous anesthésie, une plaie cutanée est créée puis recouverte d'un substitut de peau issu de cellules souches embryonnaires humaines, et chaque souris est ensuite isolée en cage individuelle de deux semaines à six mois pour éviter l'arrachage du greffon. Le porteur reconnaît que cet isolement prolongé est une source de stress par privation de contacts sociaux. Il décrit un objectif de production, sécuriser le lancement de lots cliniques de substituts cutanés, les souris étant tuées à quatre échéances pour analyser les greffes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés développés selon différentes méthodes de fabrication, en utilisant des banques de cellules dérivées de cellules souches embryonnaires humaines cultivées sur une matrice biologique, amplifiées et différenciées. Trois milieux de culture différents sont utilisés, qualifiés dans des tests in vitro de reconstruction épidermique, pour produire ces produits de thérapie innovante dans de nouveaux dispositifs médicaux afin d’obtenir des substituts cutanés de plus grande taille que dans des plaques de culture commerciale et en évaluant la stabilité des unités thérapeutiques produites au cours du temps, selon les normes concernant les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain et les lignes directrices de l’Agence Européenne du Médicament pour les médicaments à base de cellules souches. Un maximum de 30 substituts cutanés ainsi préparés selon différentes conditions expérimentales et sélectionnés sur la base d’essais préalables in vitro de stabilité et de fonctionnalité, seront greffés chez la souris Nude pour éviter un rejet. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions de fabrication optimales pour la production des lots de transfert de substituts cutanés et de sécuriser le lancement d’une production de lots cliniques dédiés à la production des unités thérapeutiques qui iront chez le patient.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes où donneur et receveur sont la même personne, sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limitée de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes où donneur et receveur sont de même espèce ou d'espèces différentes peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau mais avec de forts risques de rejet, douleurs, infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés biosynthétiques sont aujourd’hui disponibles, constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de protéines et facteurs de croissance nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité, et des substituts cutanés à partir de cellules souches embryonnaires humaines sont produits par ingénierie tissulaire. Ils sont envisagés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions de fabrication optimales pour la production des lots de transfert de substituts cutanés et de sécuriser le lancement d’une production de lots cliniques dédiés à la production des unités thérapeutiques qui iront chez le patient.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour la réalisation des greffes de substituts cutanés. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau sera effectué avant la réalisation de la greffe de substitut cutané à cet emplacement. Un traitement analgésique des souris Nude greffées sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes cutanées seront protégées et elles seront observées régulièrement tout au long de l’expérimentation. Un suivi quotidien des souris greffées sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané. La durée de cet hébergement en cage individuelle sera variable, de 2 semaines à 6 mois pour la durée la plus longue.

Impact sur les animaux

L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation. Le processus cicatriciel est en effet long, passant par différentes phases, inflammation, néovascularisation, épithélialisation et surtout remodelage. La peau néoformée à partir d’un substitut cutané est une peau très fragile jusqu’à la finalisation du remodelage qui peut nécessiter plusieurs semaines voire plusieurs mois pour être finalisé. Cet hébergement en cage individuelle des souris peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris de voire au moins une de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.

Devenir

Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de substitut cutané et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 600 souris Nude greffées seront mises à mort à 4 temps différents après réalisation de la greffe cutanée, 2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois après, avec 5 souris par temps de prélèvement, afin de réaliser un ensemble d'analyses sur les prélèvements cutanés qui seront effectués.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de vaisseaux sanguins, régénération de la surface cutanée…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes et selon les recommandations internationales en vigueur. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée avec l'utilisation d'analgésique. Les animaux seront ensuite observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation. Une grille de score sera mise en place avec l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel conduisant si nécessaire à la mise à mort des animaux dans des conditions éthiques afin d'arrêter toute souffrance. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme, et la souris Nude est une souris avec un système immunitaire très rudimentaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger telle que des substituts cutanés préparés à partir de cellules embryonnaires humaines. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Huntington, elles développent de quatre à douze mois une perte de poids et des défauts moteurs et cognitifs, après une injection stéréotaxique dans le cerveau (striatum) sous anesthésie de 70 minutes. À douze mois, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien puis de sang précède la mise à mort et les analyses post-mortem. Le porteur teste des doses d'un vecteur de thérapie génique en vue d'un futur essai clinique et affirme que le recours aux modèles animaux est "essentiel", faute de culture cellulaire reproduisant l'architecture du cerveau.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Le but principal est de tester l’efficacité du gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, dans le cadre du futur essai clinique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de tester l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un virus adéno-associés (AAV) exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin plus progressif pour la MH, en injectant un lot qui sera utilisé pour les recherches préclinique et clinique car à même d’être utilisé chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Ce modèle reproduit assez fidèlement l’évolution de la maladie par rapport à ce qui se passe chez l’homme.

Procédures

A partir de 4 mois d’age, les animaux développeront un phénotype dommageable jusqu’à 12 mois soit 10 mois. Ces souris reproduisent de maniere très progressive et fidèle, les atteintes pathologiques de la maladie d’Huntington, c’est-à-dire un perte de poids, des défauts moteurs et cognitifs. Les animaux seront soumis à 2 mois d’age à une injection stéréotaxique sous anésthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'adminstration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux seront soumis a tests comportementaux des 5 mois d’age. A 12 mois d’age, un prélèvement de liquide cephalo-rachdien suivi de sang sera effectue avant euthanasies pour l’analyse post mortem des tissus.

Impact sur les animaux

Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mecanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé, 5 à 7% du poids total de l’animal.

Devenir

Lors de l’élevage de la lignée dommageable, les animaux d’intérêt produits seront maintenus en vie et 3 semaines à 6 mois après les injections (délivrance du gene thérapeutique) suivi de l’analyse comportemtal jusqu’à l’euthanasie. Des prélèvements et analyses sont nécessaires en post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, le modèle de souris pour la maladie de Huntingtonles souris Huntington sont bien caractérisées. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (198) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.

Raffinement

Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique , et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6 h après l’acte chirurgical une injection d’analgesique est realisee pour éviter tout inconfrot de l’anima. 24 h après une deuxième injection d’analgesique est realisee. 4h/5h après cette injection les anaimaux seront observes par l’experimentateur et il sera verifie qu’aucun signe de douleur est detecte. Si besoin, une injection d’analgesique est realisee pour evoter tout inconfort e l’animal. Le protocole d’analgesie post-operatoire a été decide avec l’accord veterinaire clinicien.

Choix des espèces

L’objectif de cette étude est d'évaluer l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un AAV exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui sera utilisé par la suite chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Nous commencerons donc par valider son expression , qui a été produit avec un nouveau procédé de fabrication/qualité, dans des souris saines avant son utilisation future chez un modèle murin de la MH. Les souris qui seront utilisées sont des souris agée de 4 mois, dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnées d'injection dans le cerveau.

3 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 3 120 individus étant classés en sévère. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques pour implanter virus et cellules de glioblastome, une résection tumorale, des cycles d'injections de témozolomide et de tamoxifène, ainsi que deux irradiations et des prélèvements sanguins réguliers. Le porteur indique que la tumeur cérébrale, la chirurgie et les traitements peuvent provoquer douleurs, perte de poids, désorientation et déséquilibre, la mise à mort intervenant à l'atteinte d'un point limite. Il reconnaît disposer de co-cultures et d'organoïdes mais les juge "simplistes" et affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" pour le microenvironnement tumoral.

Objectifs

Le glioblastome (GB) est la tumeur cérébrale la plus commune et agressive chez l’adulte. Les patients atteints de GB subissent généralement une résection chirurgicale pour éliminer autant que possible la tumeur cérébrale. Après la chirurgie, dans le but d’éliminer les cellules cancéreuses restantes, une radiothérapie et une chimiothérapie sont administrées aux patients. Malheureusement, ce traitement standard actuel n'empêche pas la tumeur de récidiver. Même après élimination de la majorité de la masse tumorale, quelques cellules restantes se multiplient et se régénèrent dans une autre partie du cerveau où la chirurgie n'est plus possible. Le métabolisme cellulaire, qui permet de fournir de l’énergie aux cellules, a un impact significatif dans la progression du cancer, ainsi que dans la résistance thérapeutique des tumeurs. Cibler le métabolisme représente donc une stratégie pour éliminer les cellules cancéreuses. Notre objectif est de comprendre les échanges métaboliques entre les cellules du GB et les cellules du micro-environnement. En utilisant des modèles animaux dont certains types cellulaires (neurones, cellules immunitaires) sont dépourvus de gènes impliqués dans le métabolisme, nous étudierons l’impact du métabolisme des cellules du micro-environnement dans la croissance et l’invasion tumorale. Nous appliquerons également le protocole standard utilisé pour les patients atteints de GB (résection, rayonnements ionisants et chimiothérapie) pour évaluer le bénéfice de combiner le traitement actuel avec l’inhibition du métabolisme dans le micro-environnement tumoral.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra i) de mieux comprendre le rôle du métabolisme dans le micro-environnement tumoral et son impact sur la progression tumorale et l’invasion ; ii) de caractériser les échanges métaboliques entre les cellules du glioblastome et leur micro-environnement ; iii) d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, notre étude pourra offrir la possibilité de mettre en place, couplée au traitement actuel standard utilisé pour traiter le glioblastome, de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant le métabolisme des cellules tumorales, mais également celui des cellules du micro-environnement, afin de freiner la progression tumorale et l’invasion des tumeurs de glioblastome dans des zones où la chirurgie n’est plus possible, et par conséquent d’améliorer la survie des patients.

Procédures

- Les animaux seront soumis à des chirurgies stéréotaxiques pour implanter des virus. Les chirurgies stéréotaxiques sont des procédures qui durent environ 25 minutes et seront réalisées une fois. - Les animaux seront soumis à des chirurgies stéréotaxiques pour implanter des cellules de glioblastome. Les chirurgies stéréotaxiques sont des procédures qui durent environ 25 minutes et seront réalisées une fois. - Les animaux seront soumis à une résection tumorale. Cette chirurgie dure 30 minutes et sera réalisé une fois. - Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales de Témozolomide chaque jour pendant 5 jours, après 2 jours de repos un nouveau cycle de 5 jours de traitement sera réalisé. Les cycles de traitement seront répétés sur une durée de 28 jours. L'injection dure moins d'1 minute par souris. - Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales de Tamoxifène chaque jour pendant 5 jours. L'injection dure moins d'1 minute par souris. - Les souris seront soumises à des rayonnements ionisants 2 fois à 4 jours d'intervalle. Cela dure 5 minutes par souris. - Les souris seront soumises à des prises de sang chaque 15 jours. Cela dure 5 minutes par souris.

Impact sur les animaux

L'irradiation et le Témozolomide peuvent induire des symptômes ressemblant à l'anxiété, des troubles de la mémoire spatiale et d'apprentissage chez la souris. Une perte de poids peut être observé après irradiations. Une perte de la pigmentation peut également être observé après l’irradiation, les poils des souris C57BL/6 peuvent devenir gris après l’irradiation. Une irritation au point d’injection peut être observé après le traitement de TMZ par IP. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgie à l’issue des stéréotaxies (injection des cellules de glioblastome, résection tumorale et injection des virus). Le développement de tumeurs cérébrales, l’injection du virus ainsi que la résection peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, déséquilibre).

Devenir

Suite à la génération des mignées de souris KO, les animaux seront utilisés pour l'implantation de cellules de glioblastome pour analyser leur survie et la tumorigenèse. Tous les animaux seront mis à mort dès l'atteinte d'un point limite.

Remplacement

Nous avons isolé des cellules de glioblastome de type souche à partir de tumeurs de différents patients. Nous avons obtenu des données robustes en utilisant ces modèles in vitro pour supporter l’hypothèse que le lactate a un rôle clé dans la prolifération et l’invasion des cellules de glioblastome. Nous souhaitons maintenant connaître son rôle dans le micro environnement. Nous avons établi des cultures de neurones corticaux de souris et nous les avons mises en co-culture avec des cellules de glioblastome isolées de patients, pour étudier le rôle des neurones dans la prolifération et l’invasion des cellules de glioblastome. Ce modèle de co-culture nous a permis de voir que les neurones favorisaient la prolifération cellulaire et l’invasion des cellules de glioblastome. Cependant, ce modèle est très simpliste et ne reflète pas la complexité du cerveau et de son micro environnement. Bien que des modèles d’organoïdes soient développés, ces modèles ne sont également pas parfaits. En effet, les composants immunitaires dans les cultures organoïdes qui ne peuvent être maintenus que pendant une courte période. Le manque de cellules endothéliales et de système vasculaire tumoral est également un problème majeur qui limite l'utilité des organoïdes des tumeurs cérébrales, car le système microvasculaire est un composant majeur de l'environnement tumoral, ce qui peut affecter la croissance des cellules tumorales et l'effet immunitaire antitumoral. Il est donc nécessaire que nous passions maintenant à un modèle in vivo, pour étudier le rôle du lactate dans le micro environnement tumoral du glioblastome.

Réduction

Une manip pilote avec un petit groupe d'animaux est tout d'abord réalisé pour définir les meilleures conditions d’implantation (coordonnées stéréotaxiques) pour l’injection des virus. Nous avons mis en place des stratégies pour réduire le nombre de souris en utilisant le même groupe de souris pour obtenir plusieurs résultats. Par exemple, l'imagerie bioluminescente est une méthode non invasive qui nous permet suivre la progression de la tumeur dans le temps tandis que les mêmes souris peuvent être maintenues pour générer les courbes de survie ou bien pour les analyses immunohistochimiques. Le même groupe de souris sera utilisé pour évaluer la survie et pour les prélèvements sanguins pour analyser les métabolites présents dans le sang.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages collectives, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d’un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre d’explorer, de jouer et de ronger. Ces cages offrent aux animaux un espace important pour se redresser. Les chirugies (implantation des cellules, virus et résection) se déroulent sur animaux anesthésiés. Les animaux sont placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Des analgésiques sont donnés avant la chirurgie. L'incision de la peau de la tête se fait suite à une anesthésie locale. Les animaux ont du gel ophtalmique avant la chirurgie afin de réduire la sécheresse oculaire. Une injection de saline est réalisée pour éviter une déshydratation de l’animal. En cas de perte de poids par rapport au poids initial, du nursing sera mis place. Postopération (résection), un analgésique est administré 2 fois par jours pendant les 72h suivant l’opération. Du geldiet est déposé dans le fond de la cage pour prévenir de la perte de poids. Pour le suivi de la croissance tumorale, les souris seront anesthésiées pour mesurer la bioluminescence. Du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux pour éviter un dessèchement de la cornée. Les souris sont réchauffées grâce à une plaque chauffante à 37°C placée dans l’imageur. Lors de la session d’IR, du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux pour éviter un dessèchement de la cornée. Une injection de saline est réalisée en sous-cutané pour éviter une déshydratation de l’animal. Du geldiet est mis dans le fond de la cage pour palier au possible perte de poids suite aux IR. Une irritation au point d’injection peut être observé après les injections IP (TMZ, Tamoxifène) répétées. Les souris sont massées au niveau du point d’injection. Suite à la prise de sang, une injection de saline est réalisée. Les animaux sont surveillés quotidiennement pour détecter l’apparition d’éventuels effets secondaires. Des points limites sont définis.

Choix des espèces

Des souris immuno compétentes recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine murine. Ce modèle nous permet d’étudier le rôle du micro-environnement dans le développement tumoral. Des souris immunodéprimées recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine humaine. Ces souris permettent d'implanter des cellules humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. Le laboratoire a une grande expérience d'implantation de cellules de glioblastome dans ces modèles et nous avons l'habitude du développement du glioblastome dans ces souris. Les tumeurs se développent de manière très reproductible dans ces modèles, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences. De plus, ces modèles sont idéaux d'un point de vue préclinique, car nous reproduisons grâce aux cellules de type souche des caractéristiques complexes observées chez les patients humains. Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines pour les injections de cellules tumorales pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés. Les KO seront induits 2 semaines avant l'implantation des cellules de glioblastome, nous utiliserons donc des souris de 5 à 7 semaines pour l'injection de tamoxifène. Les KO Mct2 dans les neurones seront induits 2 semaines avant l'implantation des cellules de glioblastome, nous utiliserons des souris de 5 à 7 semaines pour l'implantation des virus. Le délai de 2 semaines entre ces 2 procédures (injection de tamoxifène ou de virus) et l'implantation des cellules de glioblastome, a été choisi pour permettre de laisser le temps au KO de se faire dans les cellules, et aux souris de récupérer de ces procédures avant la chirurgie.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 170 individus étant classés en sévère. Elles reçoivent une irradiation sublétale aux rayons X, une greffe de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis des traitements par acide rétinoïque et épidrogues, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que la leucémie et les traitements peuvent entraîner perte de poids et dégradation de l'état, et fixe un point limite à 20 % de cellules leucémiques circulantes. Il reconnaît avoir déjà montré in vitro l'effet de l'association testée, mais affirme que le microenvironnement médullaire rend le modèle murin "nécessaire".

Objectifs

Une proportion rare de leucémies aiguës promyélocytaires (APL) présente un réarrangement chromosomique entraînant la juxtaposition des gènes RARA (récepteur de l’acide rétinoïque alpha) et PLZF (Promyelocytic leukaemia zinc finger protein), avec production d’une oncoprotéine hybride à l’origine du développement de la maladie. Dans ce cas particulier de fusion PLZF-RARA, le traitement conventionnel par l’acide rétinoïque (ATRA, qui permet une rémission dans les autres types d’APL) se heurte à une résistance des cellules leucémiques et une rechute chez les patients. Nos travaux précédents ont mis en évidence dans une lignée de leucémie myéloïde aiguë une nouvelle interaction au mécanisme original entre PLZF et EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2), un facteur responsable de la réduction d'activité de nombreux gènes. Or, l'implication d'EZH2 dans le développement d'hémopathies malignes a été mise en évidence dans de nombreuses études et EZH2 est une cible thérapeutique pour laquelle des inhibiteurs sont actuellement en développement. Nous souhaiterions donc nous intéresser au rôle de cette interaction entre PLZF et EZH2 dans l'initiation et le développement de l'APL exprimant la fusion PLZF-RARA. Nous avons obtenu des résultats préliminaires in vitro encourageants, montrant que l'inhibition d'EZH2 était associée à une moindre capacité de prolifération dans une lignée cellulaire exprimant PLZF-RARA. Nous souhaitons donc tester maintenant l’effet d'inhibiteurs d'EZH2 (épidrogues) sur le développement tumoral d'APL PLZF-RARA traitées à l'acide rétinoïque (ATRA, traitement conventionnel des APL), afin de déterminer si l'association d'une épidrogue au traitement conventionnel permet de contourner la résistance et de réduire la progression tumorale.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet qu'il révèle de nouvelles pistes pour déterminer si l'association de différentes épidrogues au traitement classique par l'acide rétinoïque permet de contourner les résistances et de réduire la progression tumorale des APL.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation sub-léthale réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 2 minutes. La greffe de cellules leucémiques qui s'ensuit par injection intraveineuse est réalisée sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles l'injection des cellules, effectuée en quelques secondes, est réalisée. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par des injections intrapéritonéales nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation sub-léthale et une greffe de cellules leucémiques par injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par injections intrapéritonéales. Le développement de la maladie et les traitements étant susceptibles d’entraîner une perte de poids et une dégradation de leur état, les animaux seront soumis à une observation quotidienne et à des évaluations à l'aide de la grille de score, permettant de prévenir les effets délétères et gérer la douleur. Nous serons vigilants sur l’altération du bon fonctionnement des cellules sanguines de l'animal qui pourrait survenir du fait du développement de la leucémie, et notamment une possible baisse de l’hématocrite. C'est pourquoi nous réaliserons un suivi précoce et prédictif grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire de notre laboratoire, en quantifiant la proportion de cellules leucémiques dans le sang. Cette mesure nous permet, grâce à notre expérience de ce modèle, de fixer un point limite de 20% de cellules leucémiques circulantes afin de rester en-deçà de l'apparition d'une formule sanguine anormale.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures, afin de prélever les moelles qui seront regreffées et utilisées pour réaliser les analyses moléculaires et cellulaires.

Remplacement

Le but du projet est de mieux comprendre les processus de régulation de l’hématopoïèse pathologique, l'hématopoîèse étant définie comme le processus de production de toutes les cellules sanguines dans la moelle osseuse. Cette régulation implique des mécanismes intrinsèques aux cellules, mais aussi une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux de la moelle osseuse (facteurs extrinsèques). Ces deux types de mécanismes sont entièrement imbriqués du fait d’un dialogue permanent entre les cellules hématopoïétiques et leur microenvironnement. Il est donc nécessaire de replacer la cellule dans son contexte et d’avoir recours aux modèles murins. Cependant, nous avons pu récemment utiliser des modèles in vitro pour montrer les effets bénéfiques de l’association d'une épidrogue avec l’acide rétinoïque sur les cellules leucémiques. Nous souhaitons donc tester l'hypothèse d'un bénéfice de cette association in vivo, aux doses recommandées dans la littérature.

Réduction

Bien que le recours aux modèles murins soit rendu nécessaire par l’existence reconnue de mécanismes de régulation des cellules hématopoïétiques par le microenvironnement, nous limiterons au maximum le nombre d'animaux. Pour cela, nous nous baserons sur les résultats obtenus in vitro afin d'optimiser les combinaisons de drogues à tester et nous utiliserons les techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre projet nécessitera 200 souris NSG, permettant d'évaluer l'action potentiellement bénéfique d'une association d'épidrogues au traitement conventionnel par l'ATRA. Le nombre d’animaux a été optimisé grâce à notre expérience du modèle : nous avons ajusté le nombre d'animaux au minimum requis pour l'obtention du nombre de cellules suffisantes pour réaliser les analyses moléculaires, et permettant également d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.

Raffinement

Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment la détermination de la quantité de cellules leucémiques dans le sang par des mesures en cytométrie d'un rapporteur permettant de distinguer l'origine des cellules (celllules leucémiques PLZF-RARA ou cellules sanguines des souris NSG). Les prélèvements sont réalisés sous anesthésie gazeuse par du personnel compétent. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage.

Choix des espèces

L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, notamment pathologique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, agées de 7 à 10 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures, et qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe des cellules leucémiques.

528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 480 individus étant classés en sévère. Elles subissent un conditionnement par deux chocs électriques aux pattes censé induire une mémoire de type post-traumatique, complété par des injections intrapéritonéales, avant analyse du cerveau. Le porteur décrit un modèle comportemental de mémoire traumatique développé par l'équipe, sans détailler les autres tests employés au-delà de ce conditionnement. Il affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la mémorisation et qu'une espèce "suffisamment proche" de l'humain est requise pour extrapoler les résultats.

Objectifs

Si les caractéristiques cliniques de l’état de stress post-traumatique (ESPT) sont bien décrites, les bases neurobiologiques de cette pathologie sont encore méconnues. L’un des trait cardinaux de cette pathologie, se développant à la suite d’un stress intense, est une altération de la mémoire associant à la fois une amnésie et une hypermnésie. Cette mémoire est définie comme maladaptative, en opposition à une mémoire émotionnelle normale qui est considérée comme adaptative. Le but de ce projet est de définir en quoi ces deux types de mémoire diffèrent. Pour ce faire, nous étudierons le réseau cérébral recruté dans ces deux types de mémoires à la fois lors de l’encodage de l’événement et lors de son rappel.

Bénéfices attendus

En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.

Procédures

Les animaux sont soumis à des procédures comportementales entainant un stress chez l'animal permettant de mimer une mémoire de type post-traumatique ainsi qu'à des injections intra-péritonéales.

Impact sur les animaux

Une telle investigation implique l’utilisation d’un modèle permettant de distinguer et de comparer après un épisode de stress le développement d’une forme de mémoire émotionnelle normale et d’une mémoire de type traumatique. Le modèle de mémoire traumatique développé au sein de l’équipe permet précisément une telle comparaison. Ce modèle de conditionnement implique des effets stressants chez les animaux liés l'application de deux chocs élèctriques légers au niveau des pattes. Cette nuisance entraine une classe de sévérité sévère.

Devenir

Toutes les souris des procédures 1 et 2 seront mises à mort après les procédures comportementales afin d'analyser l'activité du cerveau.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.

Réduction

Concernant la réduction, l’effectif de 528 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux.

Raffinement

Concernant le raffinement, les souris seront hébergées dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit, en cage collective, sauf dans la semaine qui précède l'étude comportementale où elles seront placées en cage individuelle . Dans toutes les cages l'environnement sera enrichi ( bio-tunel et carrés de cellulose) . Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine et pesées 1 fois par semaine par un personnel qualifié . Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être (perte de poids, poils hérissés, prostration…), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h.

Choix des espèces

La souris adulte (8 à 12 semaines): -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris adulte : pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet d'accéder au niveau cellulaire grace à des procédures histologiques simples et d'immunohistochimie

15 105 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Elles reçoivent des greffes de tumeurs humaines, parfois sur l'organe d'origine, ainsi que des ovariectomies, castrations ou injections intracardiaques, pour entretenir une banque de tumeurs et tester des anticancéreux. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer gêne respiratoire, occlusion intestinale, ascite ou exophtalmie selon la localisation, et reconnaît n'avoir mis en œuvre aucun test statistique. Il qualifie le modèle vivant intégré d'"indispensable" faute d'alternative pour ces cancers.

Objectifs

Les xénogreffes résultent de la greffe chez la souris de fragments tumoraux de patients obtenus suite à un prélèvement chirurgical»). Ces xénogreffes sont actuellement considérés comme le modèle tumoral le plus proche des tumeurs des patients et permettent la réalisation d’études biologiques et pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ainsi elles constituent un outil essentiel pour étudier la biologie des cancers humains et pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou posologies de médicaments. Elles permettent également dans certains essais cliniques, une aide à la prescription pour le clinicien quand il a été possible de montrer l’efficacité d’une molécule sur la xénogreffe issue de la tumeur du patient. Ce caractère prédictif dépend toutefois de la possibilité de sélectionner les xénogreffes appropriées et donc d’avoir pu constituer des ensembles représentatifs de la diversité des tumeurs de patients. Cela nécessite le développement d’un grand nombre de modèles tumoraux différents pour une même pathologie. De même, certaines études biologiques nécessitent d’une quantité importante de matériel tumoral, à l’état frais, et ne seraient pas réalisables sans le passage en xénogreffe. Une banque de PDX maintenue sur souris constitue donc une source importante de matériel tumoral à l’état frais, sans les limitations des prélèvements issus des patients. Notre laboratoire a déjà développé un nombre important de modèles de différents types tumoraux (sein, poumon, côlon, mélanome, rétinoblastome, ovaire, lymphomes,…), notre objectif est donc de : - Maintenir les modèles pertinents existants comme source de matériel tumoral nécessaire pour les études biologiques et pharmacologiques - Obtenir de nouveaux modèles (tumeurs ou sous-types tumoraux) pour lesquels il existe un besoin et un rationnel scientifique ou clinique - Développer des modèles de métastases - Développer des modèles résistants pour comprendre les phénomènes de résistance aux traitements et les moyens de les contourner

Bénéfices attendus

Les xénogreffes issues des tumeurs patientes constituent un modèle préclinique cliniquement pertinent, dont les applications sont nombreuses, en recherche fondamentale et translationnelle. En recherche fondamentale, elles permettent d’étudier la biologie des cancers humains sans les limitations associées aux prélèvements issus des patients (matériel en quantité insuffisante, difficultés logistiques ou d’accès aux prélèvements, etc.), car elles constituent une source de matériel tumoral humain illimité, pouvant être conditionnée de façon différente selon les applications (à l’état frais, congelé, fixé, dissocié en single cell, etc.). Pour la recherche pharmacologique, le développement exponentiel de thérapies ciblées et individualisées dans le cancer ces dernières années a rendu nécessaire la mise au point de modèles précliniques représentatifs de la diversité et la complexité de la pathologie cancéreuse observée chez les patients. Les xénogreffes d’origine humaine constituent aujourd’hui l’outil d’analyse pharmacologique le plus proche de la clinique. Ces nouveaux modèles permettent de sélectionner les meilleurs composés anti-tumoraux : optimisation des modalités thérapeutiques, prédiction des effets du médicament, évaluation de l’effet sur la croissance locale et la dissémination métastatique, identification de marqueurs de réponse ou de résistance au traitement Par ailleurs, l'évaluation préclinique est une étape importante et obligatoire dans le développement d'un médicament avant son utilisation clinique. Ces expériences pharmacologiques sont possibles grâce au maintien des tumeurs sur souris, comme source de matériel tumoral.

Procédures

La greffe de matériel tumoral sera faite dans la majorité des cas en sous cutané. Des souris supplémentaires sont greffées au niveau de leur site d’origine ou bien autre site qui par l’absence de système immunitaire permet d’améliorer la prise tumorale Ces greffes seront réalisées1 fois / animal et sous anesthésie ; durée d’anesthésie chimique

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau ou du péritoine. L’utilisation d’anesthésique et d’analgésique permet de prendre en charge ces douleurs. Lors des anesthésies, une baisse de température corporelle est observée chez la souris ; pour éviter la baisse de température, les animaux sont placés sous lampe chauffante et tapis chauffant. Les injections de cellules ou l’administration de molécules par voie orale ou par injection ne provoquent pas de douleurs chez les animaux au-delà de l’injection elle-même Par ailleurs, la croissance des tumeurs surtout quand elles sont greffées au niveau de leur site d’origine pourraient provoquer une perte de poids et aussi une gêne pour se déplacer juste après la greffe. L’alimentation gélifiée ajouté dans la cage et la réhydratation aident à diminuer l’inconfort des animaux. Les gênes causées par le développement des tumeurs orthotopiques ou bien apparition des métastases peuvent être : - gêne respiratoire par le développement des tumeurs au niveau des poumons - Diarrhée, perte de poids plus de 72h ou occlusion intestinale pour les tumeurs de colon, - apparition d’ascite pour les tumeurs de l’ovaire - difficulté à se déplacer pour les greffes au niveau de l’os et au niveau de la glande mammaire - exophtalmie pour les tumeurs de l’œil - Difficultés de déplacement ou boitillement avec ou sans déformation du genou pour les tumeurs intra-osseuses

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour des prélèvements post-mortem

Remplacement

l'utilisation des animaux se justifie par le fait que la tumeur interagit avec son environnement pour se développer qu'elle soit placée en sous- cutanée ou dans une localisation proche de son site originel (vascularisation, stroma…). Un modèle vivant intégré est donc indispensable pour étudier les interactions entre la tumeur et ses organes cibles mais également avec l’organisme dans sa totalité. Ces modèles vont nous permettre d'étudier le développement de la maladie en essayant de mimer et comprendre leur mécanisme oncogénique dans des modèles orthotopiques. Par ailleurs, nous pourrons également explorer et valider l'efficacité de nouvelles thérapies dans des modèles sous-cutanés rares voire inexistants pour certains types de cancers ou des modèles orthotopiques particuliers, le plus proche de clinique. Il n'e'xiste donc pas de méthode alternative capable de répondre à la question scientifique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son strict minimum, notamment grâce au calcul du taux de prise du modèle établi qui permet de ne greffer que le nombre d’animaux nécessaires au maintien de la xénogreffe. Par ailleurs, nous recherchons continuellement à améliorer nos techniques de congélation/décongélation des tumeurs pour éviter de garder des animaux greffés en continue pour le maintien de modèles non utilisés. A noter que pour l’apprentissage des nouveaux gestes expérimentaux, le personnel sera formé d’abord sur les animaux euthanasiés et une fois le geste maîtrisé, leur formation est complétée sur les souris en vie. Pour cette étape, afin de réduire le nombre d’animaux et après l’avis favorable du vétérinaire, nous utiliserons les animaux greffés par ailleurs et dont les tumeurs n’ont pas poussé. Aucun test statistique n’a été mis en œuvre

Raffinement

Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : utilisation d’anesthésique et d’analgésiques systématique lors des chirurgies, addition d’alimentation hydraté en post-opératoire, hydratation supplémentaire de l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie ; Les animaux seront surveillés le jour de la chirurgie pour les greffes en SC et interscapulaires (90% des greffes) et pendant 24h pour les ovariectomies, les castrations, les greffes autres que les SC et interscapulaires. sous-capsule rénales et l’ injection des cellules en intracardiaque. Par la suite, les animaux sont surveillés 1 fois par semaine par le personnel dédié. Par ailleurs, sauf exception, les greffes sont programmées et réalisées au plus tard le jeudi matin. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.

Choix des espèces

Choix de l’espèce « Souris » c’est le modèle in vivo d’un mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique Choix de la lignée murine : nécessité d’un déficit immunitaire pour éviter le rejet de la xénogreffe d’origine humaine par la souris. Différentes souches sont utilisées en fonction des types et sous-types tumoraux pour favoriser la prise et la croissance des modèles de xénogreffes La greffe a lieu entre 5 à 11 semaines pour que les souris aient fini leur croissance mais suffisamment tôt pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience peut diminuer avec l’âge. Les animaux à cet âge supportent également mieux l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.

27 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Une arthrite leur est déclenchée par des injections de collagène, d'anticorps ou d'une cytokine, certaines souris génétiquement modifiées développant la maladie en continu, puis des composés leur sont administrés jusqu'à deux fois par jour pendant six semaines, pour évaluer des candidats médicaments contre la polyarthrite rhumatoïde et l'arthrite psoriasique. Le porteur indique un gonflement et une inflammation douloureuse des articulations. Il qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un effectif qui atteint 27 400 animaux non-humains.

Objectifs

Les maladies inflammatoires articulaires peuvent divisées en en deux catégories, la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’arthrite psoriasique (AP). - La PR est une maladie auto-immune plurifactorielles qui survient vers 45 ans avec une prévalence de 0.5-0.8% de la population générale. - L’AP est une forme d’arthrite inflammatoire qui survient ordinairement chez des personnes atteintes d’un psoriasis. De 10 à 30 % des personnes atteintes de psoriasis seront atteintes d’AP. Cette pathologie touche autant les hommes que les femmes et se manifeste généralement entre 20 et 50 ans. Il n’existe aucun moyen de guérir l’AP, mais grâce à un diagnostic précoce et à un traitement approprié, il est possible de maîtriser la maladie et de prévenir les lésions articulaires graves. Ces deux maladies inflammatoires articulaires se caractérisent par une atteinte et une dégradation osseuse de l’articulation conduisant à un enraidissement douloureux puis à une incapacité du patient à mobiliser l’articulation affectée. De nombreux patients ne répondent pas aux traitements actuels qui reposent sur les antiinflammatoires non-stéroïdiens, les corticoïdes et les immunosuppresseurs, des anticorps. Des traitements plus performants sont nécessaires. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de maladie inflammatoire articulaire.. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules utilisées chez les animaux ont préalablement été testées et validées in vitro.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et d’arthrite psoriasique.

Procédures

Des méthodes différentes peuvent être utilisées pour déclencher les signes cliniques : soit deux injections intra-dermiques de collagène dans la queue et / ou la surexpression d’une cytokine pro-inflammatoire par une unique administration intraveineuse, soit l’administration de cocktail d’anticorps (unique) soit d’albumine (2 administrations). Dans une des procédures, nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées présentant un phénotype dommageable (en déclenchant spontanément la maladie) mais contrôlable tant qu’elles ont maintenues sous traitement par l’infliximab. Dans deux des procédures, l’érosion osseuse sera évaluée une fois au cours de l’étude à l’aide d’une radiographie rayon X. Les composés seront administrés au maximum 2 fois par jour pendant de 1 à 6 semaines maximum en fonction de la procédure. Un prélèvement sanguin sera également effectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés (une seule fois par étude) ou pour doser la quantité de cytokine pro-inflammatoire (une seule fois par étude, dans 2 procédures). Au moment de la mise à mort, une ponction intra-cardiaque pourra être réalisée. Les scores cliniques seront évalués quotidiennement à partir de l’initiation des traitements par les composés (au maximum pendant 6 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques de la la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’arthrite psoriasique (AP) qui se caractérisent par un gonflement et une inflammation des articulations du poignet et des doigts. En fonction de la procedure appliquée, les animaux pourront être suivis pendant 1 à 6 semaines maximum.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptée à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi, par exemple,avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analgesie sera prévu. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou à la mise à mort anticipée de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature