Procédures sévères
CREATION DE MODELES PATHOLOGIQUES CHEZ LE RONGEUR EN VUE DE MIMER DES AFFECTONS CLINIQUES.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Rats : 4000
2500 souris et 4000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, mis à mort ou cédés à des équipes scientifiques. Ils subissent une chirurgie unique pour créer des modèles de diabète, d'insuffisance hépatique, d'arthrose, d'infarctus du myocarde ou de vagotomie, avec des prélèvements sanguins et une récupération post-opératoire de 48 à 72 heures. Le porteur revendique la production et la mise à disposition de ces modèles pathologiques pour la recherche, en assumant le recours à des animaux "surnuméraires". Il affirme qu'il est "impossible de modéliser une maladie dans sa globalité" par des outils informatiques ou cellulaires.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles pathologiques sur les espèces rat et souris dans le but d’étudier les pathologies associées. Les différents modèles pathologiques sont la création par des procédures de chirurgie de modèle de diabète, d’insuffisance hépatique, d’arthrose, d’infarctus du myocarde et de vagotomie.
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles pathologiques permet l’amélioration des connaissances et de la compréhension de la physiopathologie des affections cliniques associées pour la médecine humaine comme vétérinaire dans différents domaines : facteurs de risques, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, recherche fondamentale, prévention …
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique de quelques minutes à une heure sous anesthésie générale ou injection unique d’un produit sur animal vigile. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dus aux contentions, aux procédures chirurgicales et lors de la période de récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Mise à mort ou envoi chez les scientifiques pour tous les animaux.
Remplacement
L’apparition et l’évolution d’une maladie est un phénomène complexe, faisant intervenir beaucoup de types de cellules et d’organes au sein d’un même corps. De plus, le nombre de ces types de cellules et d’organes ainsi que leur façon de communiquer entre eux ou de réagir ne sont pas semblables selon le stade de la maladie. Cette complexité et le côté dynamique d’une maladie fait qu’il est impossible de modéliser une maladie dans sa globalité par des outils informatiques ou cellulaires par exemple et demande de faire appel à des modèles pathologiques sur des espèces animales telles que le rat et la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Le contrôle de la douleur est réalisé avant la chirurgie et lors du post-opératoire ou en cas de besoin par une administration d’analgésique. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectué dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentés ou non pouvant être disposés directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Le choix de l’âge ou du poids des animaux est défini par les scientifiques en fonction de leurs études et des poids et/ou âges minimum pour lesquels les modèles pathologiques peuvent être développés soit : Dès la naissance pour les rats concernant le modèle diabétique. A partir de 25g pour les souris et 125g chez le rat pour le modèle infarctus du myocarde et ligature du canal cholédoque. Dès 125g pour le modèle d’arthrose chez le rat. Dès 175g pour le modèle de vagotomie chez le rat.
Impact des oméga-3 alimentaires dans la relation microglie-neurone et les altérations cognitives induites par le vieillissement.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des tests comportementaux dont un test de peur conditionnée par chocs électriques, sous différents régimes alimentaires, pour étudier l'effet des oméga-3 sur le vieillissement cognitif. Le porteur indique que les souris sont mises à mort pour prélever les structures cérébrales, et que les régimes n'affectent pas le bien-être des animaux non-humains. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des comportements ne peut se faire que sur des animaux vivants et vigiles.
Objectifs
Le vieillissement s’accompagne d’une inflammation chronique à bas bruit, c’est-à-dire qu’elle est silencieuse, le mécanisme inflammatoire se situe alors sous le seuil de la douleur et cause des dégâts dans l’organisme sans qu’il y ait de foyer inflammatoire précis. Cette inflammation est associée à des modifications du système immunitaire cérébral, des altérations des fonctions neuronales et des déficits cognitifs de degré variable. Les fonctions cérébrales impliquent notamment la communication entre les neurones et les cellules microgliales, les principales cellules du système immunitaire cérébral. Cette communication repose entre autres sur des vésicules extracellulaires, les exosomes, complexes protéiques impliqués dans la communication neurones-cellules gliales, qui participent à la fois aux fonctions physiologiques et aux réponses neuroinflammatoires, c’est-à-dire à l’inflammation dans le cerveau. L’alimentation à laquelle nous sommes exposés tout au long de la vie est clé dans le bon fonctionnement cérébral et le vieillissement cognitif. Ainsi, certains nutriments comme les acides gras polyinsaturés n-3 (AGPI n-3) ou oméga 3, ont un rôle bénéfique sur les fonctions cognitives. Cependant, leurs mécanismes d’action pour prévenir ou atténuer le déclin cognitif restent à ce jour méconnus. Ce projet consiste à identifier les biomarqueurs cérébraux du risque de déclin cognitif accéléré et de déterminer des combinaisons de nutriments pour maintenir les fonctions cognitives avec l’âge. Dans ce contexte, le projet de recherche que nous souhaitons développer a pour objectif d’identifier des biomarqueurs mécanistiques cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles personnalisées ciblant la neuroinflammation pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Pour ce faire, nous allons allier dans cette étude nutrition, neuroinflammation, microglies et analyse des exosomes.
Bénéfices attendus
Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche comportementale et électrophysiologique dans le cadre de troubles cognitifs liés à l’âge, afin de mettre en avant la relation microglies-neurones via les exosomes.
Procédures
Tests comportementaux à 3 mois ou à 18 mois (3 tests par animal) – quelques minutes par test.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des chocs électriques de faible intensité pour le test de peur conditionnée. Les autres tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées notamment durant les tests sur le stress, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les régimes équilibré, carencé ou supplémenté en Oméga 3 n’impactent en rien le bien-être de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur la physiologie neuronale et microgliale chez la souris pendant le développement. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
L’objectif général du projet vise d’identifier des biomarqueurs mécanistiques cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles personnalisées ciblant la neuroinflammation pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Pour ce faire, nous utilisons des modèles souris. Une partie de nos hypothèses ont été formulées sur la base de données obtenues in vitro. Cependant dans la cadre d’une étude faisant le lien entre la nutrition et le cerveau, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Les animaux reçoivent un régime alimentaire (équilibré, carencé ou enrichi en AGPI n-3) durant toute la durée de leur développement périnatal (gestation et allaitement) ou à l’âge adulte ou en fin de vie. Nous nous intéressons à l'effet de cet apport nutritionnel sur les aspects cognitifs à l’âge adulte (3 mois) ou en fin de vie (18 mois). La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et vieillissement, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6.
Développement d’un biomatériau pour la prévention des fistules salivaires en chirurgie cervico-faciale_changement d’EU
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
38 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Trois subissent une irradiation cervicale et trente-cinq une laryngectomie totale avec ablation du larynx, pour tester un biomatériau censé prévenir les fistules salivaires après chirurgie du cancer. Le porteur décrit des atteintes lourdes possibles, hématome, infection, fistule, douleurs à l'alimentation et troubles du comportement liés à l'impossibilité d'émettre un son, les animaux étant gardés vivants le temps de la cicatrisation avant mise à mort pour analyse. Il affirme qu'il n'est "pas possible de se passer d'animaux" et qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne convient.
Objectifs
Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant (DM) sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux, 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design de biomatériaux à base d’alginate. L'objectif du projet présenté ici est l’évaluation in vivo du DM avec 3 tâches : 1) mise au point d’un modèle de mini-porc irradié (n=3); 2) mise au point d’un modèle de mini-porc laryngectomisé (n=5); 3) évaluation de l’efficacité du DM sur des porcs laryngectomisés avec ou sans irradiation (n=30). Afin de répondre à ces objectifs le nombre total d’animaux utilisés sera donc de 38.
Bénéfices attendus
Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire après laryngectomie totale chez l'homme, qui est une complication fréquente et potentiellement fatale. Cette complication est associée à une morbidité et des dépenses de santé importantes. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution de la morbidité et de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.
Procédures
Irradiation cervicale (classe modérée) chez 3 porcs : une dose de 10 grays centrée sur le cou, en une séance, sous anesthésie générale, précédée d'un scanner de centrage. Laryngectomie totale (classe sévère) chez 35 porcs : chirurgie sous anesthésie générale avec exérèse du larynx et fermeture du pharynx.
Impact sur les animaux
Irradiation cervicale : risque de mucite radique causant des douleurs à l'alimentation, dermite radique causant des lésions cutanées douloureuses, oedème laryngé causant un légèr frein respiratoire. Laryngectomie totale : risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), fistule salivaire (pharyngostome), douleurs à l'alimentation, troubles comportementaux dus au handicap vocal (impossibilité d'émettre un son), mauvaise tolérance de la canule, décanulation accidentelle potentiellement léthale.
Devenir
Nécessité de garder les animaux en vie le temps de la cicatrisation muqueuse et la résorption du biomatériau suite à la chirurgie. Mise à mort nécessaire pour l'analyse de la cicatrisation (présence ou non de fistule salivaire) et de la biocompatibilité/biointégration du biomatériau le cas échéant.
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Aucun modèle animal répondant à notre cahier des charges n'a été publié à ce jour, ce qui justifie la réalisation de notre projet. Aucune alternative in silico, in vitro ou ex vivo ne peut reproduire les conditions physiopathologiques nécessaires : processus cicatrisation en présence potentielle mais non systématique de salive, tissus irradiés etc.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée*. Dans la procédure 2 nous devrons adapter les canules de trachéotomie, l’alimentation etc. Si tout se passe bien et que nous pouvons garder les animaux en vie 1 mois nos réduirons le nombre d’animaux de la procédure 3 non irradiés et sans biomatériaux. *Le principal critère d'évaluation est le taux d'animaux sans fistule. En utilisant un plan A'Hern (alpha=10%, 1-beta=80%) et (p0=45% ; p1=70%), 20 animaux doivent être inclus dans le bras expérimental à savoir biomatériau. Les règles de décision sont : insuffisamment efficace < 12 succès/20 < suffisamment efficace. Comme le bras de contrôle n'est là que pour estimer un taux de réussite, 10 animaux seront inclus dans le bras de contrôle. Par conséquent, 30 animaux doivent être inclus dans cette étude de la procédure 3.
Raffinement
Les méthodes d’analyses utilisées, les plus avancées, permettent d’obtenir une précision dans les mesures conduisant à réduire la variabilité expérimentale et donc le nombre d’animaux utilisés. Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe. La responsabilisation du manipulateur et le respect de l’animal nous conduisent à prendre en charge la prévention de la souffrance, notamment par l’application stricte de points-limites préalablement définis. En cas de signes externes de souffrance (cachexie, prostration, fièvre) persistant pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort pour raisons humanitaires.
Choix des espèces
Animaux mâtures sexuellement pour limiter la régénération des tissus, plus intense chez chez les animaux en croissance (juvéniles). L'âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois. Des modèles porcs irradiés au niveau thoracique ou de la mâchoire ont été décrits dans la littérature, il n’existe pas de modèle décrit au niveau cervical. Pour les tests in vivo de ce projet, la validation d'un modèle de mini-porc irradié au niveau du cou est nécessaire. Un modèle de laryngectomie totale (LT) chez le porc a déjà été décrit pour la recherche sur la transplantation laryngée, mais les animaux ont été gardés en vie peu de temps et l’objectif n’était pas le contrôle des fistules salivaires. Afin de valider et de se familiariser avec la procédure, une LT avec gastrostomie sera réalisée sur 5 animaux.
Role de Foxk1 dans la lutte anti-tumorale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par injection intradermique et intraveineuse, puis des lymphocytes T modifiés, pour étudier le rôle de la protéine Foxk1 dans la réponse anti-tumorale. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité, et que les animaux dont les atteintes persistent au-delà de huit jours sont mis à mort. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative" à l'expérimentation animale et que le recours à la souris est "crucial".
Objectifs
Les réponses immunitaires efficaces contre les cellules malignes et les pathogènes sont le résultat de processus cellulaires complexes et hautement coordonnés. Au cours des dernières décennies, d'importants efforts de recherche ont montré que des cellules immunitaires appelées cellules T jouent un rôle central dans le développement de ces processus. Le développement de drogues qui ciblent les cellules T est apparu comme un mode d'action efficace pour renforcer l'activation des lymphocytes T contre les cellules cancéreuses. Les thérapies basées sur des modifications génétiques qui ciblent les cellules T constituent une deuxième approche fructueuse et offrent un moyen unique d'armer les lymphocytes T pour éliminer certaines tumeurs. Cependant, malgré le succès remarquable de l'immunothérapie du cancer, tous les patients ne répondent pas à ces nouveaux traitements et certains développent des signes cliniques liés à des effets secondaires nocifs. L'activation des lymphocytes T est intimement liée aux activités métaboliques qui dictent l'ampleur de la réponse immunitaire. À cet égard, le ciblage des composants moléculaires impliqués dans l'aptitude métabolique des cellules T est très prometteur pour améliorer les fonctions anticancéreuses de ces cellules. Un de ces composants moléculaires appelé Foxk1 a été identifié comme étant un acteur clé du métabolisme des cellules T et constitue en ce sens une cible intéressante pour moduler les fonctions effectrices des cellules T contre les cellules cancéreuses. Le projet vise donc à caractériser le rôle de Foxk1 dans les cellules T, et à réguler ses fonctions dans le contexte des réponses anti-tumorales.
Bénéfices attendus
Un défi important dans la recherche biomédicale actuelle et son application pharmaceutique en immuno-oncologie est d'identifier les mécanismes moléculaires qui peuvent être ciblés pour reprogrammer les cellules T, et modifier leurs fonctions et leur devenir, afin de mieux contrôler les réponses anticancéreuses. Dans ce contexte, la reprogrammation du métabolisme des cellules T apparaît comme une voie alternative et prometteuse pour moduler les réponses des cellules T. Ainsi, le projet présenté ici explore cette possibilité en se concentrant sur Foxk1 qui constitue un candidat prometteur pour contrôler le métabolisme des cellules T et qui pourrait donc faire l'objet d'une intervention pharmaceutique visant à augmenter ou à diminuer les fonctions des cellules T. Par ailleurs et au-delà du facteur de transcription Foxk1, ce projet constitue une preuve de principe pour cibler les effecteurs impliqués dans les programmes métaboliques, offrant de nouvelles opportunités thérapeutiques pour reprogrammer les cellules T dans les réponses anticancéreuses.
Procédures
Les animaux impliqués dans cette recherche seront greffées avec des cellules tumorales (par injection intradermique et injection intraveineuse). Des cellules T modifiées seront subséquemment injectées par voie intraveineuse afin de déterminer leur effet sur dans la réponse anti-tumorale. Chacune de ces 3 types de procédures se déroule sur plusieurs minutes.
Impact sur les animaux
Du fait des protocoles envisagés, plusieurs nuisances sont attendues sur les animaux. 1. les animaux seront soumis à des anesthésies avec possiblement une conséquence de déshydratation. 2. l’injection et la croissance tumorale pourra conduire à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d'analyser les tailles de tumeurs, les infiltrats cellulaires aux seins de ces tumeurs et des ganglions drainant. De manière générale, le suivie de la réponse immunitaire et en particulier des lymphocytes T, objet de l'étude, nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser les processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte tumoral. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est cruciale.
Réduction
Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale N ( μ = 15, σ = 3). Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature traitant du suivi de la croissance tumorale, nous savons que des groupes de maximum 5 animaux (suivi immuno) et 10 animaux (croissance tumorale), analysés avec le test two-tailed student’s test with welch’s correction nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en duplicat pour être publiables. La validité statistique des résultats (différence significative entre les groupes) sera évaluée par les tests statistiques suivants : two-tailed student’s test with welch’s correction ANOVA et/ou Mann Whitney.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation de cellules tumorales, injection intraveineuse). Nous allons implanter des cellules tumorales par injection sous cutanée puis traiter les animaux pour réduire le développement tumoral. Nous porterons une attention particulière à la taille de la tumeur et au poids de l’animal mais aussi à leur posture et leur comportement en groupe. Les animaux seront observés 1 à 2 fois par semaine post injection des cellules tumorales et un tableau listant les points limites suivants sera utilisé. Si les points limites persistent au-delà de 8 jours, l’animal sera euthanasié. Pour toute expérience nécessitant une manipulation de l’animal, ceux-ci seront anesthésiés avec les méthodes autorisées. Le suivi des points limites sera réalisé par les expérimentateurs impliqués dans le projet (Chercheur, post doc, ingénieur, étudiant en thèse).
Choix des espèces
Il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin de mimer le plus fidèlement la pathologie cancéreuse humaine et d'étudier en détail l’infiltrat immunitaire associé au développement tumoral et le comparer à l’infiltrat immunitaire présent lors du rejet tumoral. Dans le laboratoire, nous avons choisi de travailler sur la souris comme modèle animal car nous pouvons facilement les manipuler génétiquement et aussi nous pouvons reproduire au mieux la complexité biologique du système immunitaire dans le développement tumoral.
Etude de l’efficacité in vivo d’un candidat vaccin contre le SARS-CoV2 – Challenges vaccinaux
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
52 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, puis pesés chaque jour et soumis à des lavages nasaux, pour tester un candidat vaccin à ARN messager. Le porteur indique que l'infection provoque une pathologie pulmonaire et une perte de poids, et que tous les animaux survivants sont mis à mort en fin de procédure du fait du confinement en laboratoire NSB3. Sur le remplacement, il affirme à plusieurs reprises que le recours aux animaux est "indispensable" pour évaluer l'efficacité du vaccin sur un système immunitaire complet.
Objectifs
Ce projet propose d’évaluer l’efficacité d’un vaccin contre le SARS-CoV-2 chez le modèle hamster. Ce vaccin ARN ‘générique’ de type Moderna est produit dans le cadre d'un transfert de biotechnologie des vaccins à ARN messager vers les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFM) pour répondre plus équitablement à la COVID-19 et aux futures pandémies.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de vérifier l'efficacité d'un vaccin 'ARN' générique produit par le Centre de Transfert de la Technologie des vaccins à ARN messager afin de réduire les inégalités dans l’accès aux vaccins contre la COVID-19 dans les pays à revenus faible et intermédiaire.
Procédures
Les animaux, anesthésiés au préalable, seront infectés par le SARS-CoV-2 par voix intranasale. Cette intervention dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + infection) et ne s'effectue qu'une seule fois. Les animaux sont également pesés tous les jours (1 minute). Un seul prélèvement sera effectué sur animal vivant: le lavage nasal. Il sera réalisé une seule fois par jour, au maximum deux jours consécutivement et dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + lavage nasal).
Impact sur les animaux
Le SARS-CoV-2 entraine une pathologie pulmonaire non mortelle et spontanémment résolutive chez le hamster. Le principal symptôme observé est une perte de poids survenant généralement entre le 4ème et le 7ème jour post-infection. Par conséquent, les animaux seront surveillés cliniquement et pesés quotidiennement durant la période d’expérimentation, afin de détecter précocément cette perte de poids et/ou tout autres symptômes (notamment pulmonaire).
Devenir
Les manipulations s'effectuant avec un virus infectieux et ayant lieu dans un laboratoire NSB3, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le développement d’un vaccin passe par plusieurs étapes indispensables. La première est sa construction : l’objectif est de présenter des éléments caractéristiques du microbe ciblé au système immunitaire. La seconde correspond aux essais précliniques, qui est le cadre dans lequel s'inscrit notre projet. C’est une étape indispensable pour sélectionner les meilleurs candidats et éviter d’administrer à des humains des vaccins inefficaces ou qui seraient trop inflammatoires. L’utilisation d’animaux est indispensable car elle permet d’évaluer l’efficacité du candidat vaccin en condition réelle, mettant en jeu le système immunitaire complet d’un être vivant. Enfin, la dernière consiste à réaliser des essais cliniques chez l’Homme.
Réduction
Les effectifs ont été calculés grâce au logiciel G*Power, pour une puissance de 80%, un risque alpha de 5%. Au sein de la littérature, ainsi qu’au cours de nos expériences précédentes, nous avons observé et obtenu un écart type de 0.5log (en quantité d’ARN de virus) chez les animaux non immunisés. L’objectif étant de démontrer une différence significative, si elle existe, de 1log (en quantité d’ARN de virus) entre les animaux immunisés et ceux non immunisés, un « effect size » de 2 a donc été utilisé pour le calcul. (Effect size = Δ/écart-type)
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront anesthésiés (isoflurane) avant toute infection (Induction au sein d’une boite : Isoflurane 5%, 2L/min). D’autre part, un traitement analgésique (buprénorphine) sera administré chez les hamsters présentant une atteinte de l’état général (évalués grâce à une grille de score). Par ailleurs, des points limites adaptés, entrainant la mise à mort de l’animal, ont été choisis. Après une période d’acclimatation de 6 jours, les animaux (4 par cage) seront hébergés en cage enrichie par un « aspen brick » et des « paper shaving », et ne seront soumis à aucune privation de nourriture ou d’eau. Ils seront surveillés cliniquement et pesés régulièrement durant la période d’expérimentation.
Choix des espèces
Mesocricetus auratus est le modèle de référence pour le virus du SARS-CoV-2 puisque la souche originelle de SARS-CoV-2 est capable d’infecter naturellement les hamsters syriens dorés. Les animaux seront âgés de 3 à 10 semaines. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études précliniques sur le SARS-CoV-2.
Évaluation d’une thérapie peptidique chez le rat R-DMDdel52, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
174 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par injection létale, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils développent une perte de masse musculaire, une faiblesse croissante et une atteinte cardiorespiratoire, jusqu'à une mise à mort dite compassionnelle entre six et treize mois, et reçoivent jusqu'à plusieurs dizaines d'injections d'une protéine testée. Le porteur décrit un comportement de "freezing" et une surveillance rapprochée, et affirme n'attendre aucune toxicité du traitement. Il retient le rat plutôt que la souris car son modèle "mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle".
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare causée par des mutations dans le gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante. Le déficit en dystrophine induit une perte progressive de force dans les muscles, menant à la perte de l'ambulation à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles de la ventilation et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, l'utilisation des glucocorticoïdes, traitement de référence largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte d'ambulation et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. Depuis 5 ans, on assiste à une accélération de propositions d'autorisation de mise sur le marché (composés pharmacologiques, vecteurs de thérapie génique) et on dénombre une cinquantaine d'essais cliniques en cours (clinicaltrials.gov). Sur le plan mécanistique, l'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les cellules des muscles squelettiques induit d'abord une dysfonction, puis une fragilité et enfin une rupture des membranes cellulaires lors des cycles de contraction/relâchement de ces muscles. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique, l'accumulation de matière fibreuse et une formation de vaisseaux sanguins inappropriée. Cette combinaison empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle. Dans ce contexte, notre objectif scientifique est de proposer une alternative aux traitements existants incluant les glucocorticoïdes en apportant la preuve de principe préclinique de l'efficacité d'une thérapie innovante. En se basant sur une étude précédente réalisée chez la souris, l'hypothèse est qu'une forme non oxydable d'une protéine X serait capable de ralentir la progression de la DMD, en luttant contre l'inflammation et le stress oxydatif impliqués dans la pathologie. L’efficacité de la protéine X sera testée sur les rats DMD seule ou en association avec un traitement aux glucocorticoides.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec la protéine X sur le modèle original et pertinent du rat DMD récemment développé. La protéine X est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Cette protéine X permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles dystrophiques. Plus particulièrement, la protéine X devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques robustes produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénération musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du cœur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de l’ambulation et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires.
Procédures
Les animaux reçoivent la protéine X par une injection hebdomadaire par voie intrapéritonéale et pour certains lots une injection sous-cutanée ou les deux. Cela correspond à un nombre d'injections compris entre 9 et 18 (9 semaines de traitement, essai préclinique à court terme) et 22-48-69-138 (22 semaines, 48 semaines ou 69 semaines - essai préclinique à long terme). Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital, 1 fois en procédure 2 ou 4 fois en 17 mois selon les procédures. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus une analgésie. L'évaluation fonctionnelle privilégie les méthodes non invasives. La mesure de force nécessite une anesthésie injectable, réalisée 1 fois avant la mise à mort pour les animaux des deux procédures d'essai clinique à court et long terme. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme, principal acteur de la ventilation de repos, est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvement chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques sont bien connus ce qui permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. L'essai préclinique à court terme de ce projet inclue des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables. L'essai préclinique à long terme de ce projet inclue des animaux au-delà de 6 mois. Nous porterons une attention particulière à ces animaux avec une surveillance quotidienne et une prise de poids hebdomadaire jusqu’à l’âge de 6 mois puis tous les deux-trois jours. En ce qui concerne le traitement, Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection de la protéine X. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité.
Devenir
À l'issue des trois procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer à l'échelle microscopique l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés (muscles des membres, diaphragme, cœur). Bien que non attendue, il est également essentiel de prélever les organes sentinels d'une éventuelle toxicité (reins, foie, rate, poumons) et de les soumettre à une expertise anatomopathologique. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par une injection létale de pentobarbital.
Remplacement
Des études antérieures ont montré qu'une version modifiée de la protéine X favorise la régénération sans exacerber l'inflammation en induisant l'expansion des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages, favorisant ainsi la guérison des tissus. De manière très intéressante, un criblage cellulaire de plus de 5 000 médicaments cliniques et composés médicamenteux a mis en évidence que plus de 50 % des composés qui inhibent les activités pro-inflammatoires de la proténe X étaient des glucocorticoïdes. Ces résultats soulignent l'importance de cibler des isoformes redox spécifiques de cette protéine aussi bien dans des conditions physiologiques que pathologiques. Sur ces bases mécanistiques très robustes, ce projet vise à trouver la réponse à une question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelations constante à savoir quels sont les effets bénéfiques sur l'éventail de mécanismes pathogènes ouvert par le processus dystrophique peut-on attendre d'un traitement précoce, court ou long, sur un modèle animal de dystrophie musculaire de Duchenne.
Réduction
Les expériences déjà menées sur les rats DMD traités avec différents candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique) ont montré que traiter 5-7 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Le problème majeur avec cette lignée est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique (essentiellement), les données de 5-7 animaux arrivés au terme de la procédure puissent être traitées. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6-8 animaux selon le genotype sauvage ou DMD et ce grace à des analayses à l'aide d'un t test non paramétrique de Mann-Whitney entre deux groupes ou un ANOVA entre plusieurs groupes. L'effet âge étant évalué par un test de Friedman par mesures répétées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. La température des locaux est maintenue dans la fenêtre 22 ± 2 °C. Pour le bien-être des rats, ils sont stabulés dans des cages XL ayant une surface de 2080 cm2 et une hauteur de 23 cm sur une moitié de la surface, soit 5 cm de plus que la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début (3-4 semaines, animaux de 100g puis ce nombre est progressivement réduit jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g (animaux sauvages au-delà de 5 mois, les rats DMD non traités n'atteignent jamais cette masse corporelle). L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Nous prêterons attention aux points suivants: - perte de mobilité par atrophie des muscles des pattes, - prostration due à une anomalie cognitive ou à la douleur, - lordose excessive liée à l'atrophie des muscles dorsaux comme chez les patients, - arrêt du toilettage entrainant la dégradation du pelage, - vocalise anormale (hors contention) ou grimaces faciales, la cause de la douleur est recherchée et des antalgiques pourront être prescrits, notamment sur les animaux DMD en fin de vie, nous pourrons utiliser un anti-inflammatoire ou un opioïde après consultation du vétérinaire référent. La survenue de l'un des points ci-dessus associé à une perte de poids sur une semaine dépassant 20% du poids maximal atteint par l’animal et non compensée par la mise à disposition de nourriture humide et d’hydrogel en fond de cage (difficulté à ronger les croquettes sèches, dysphagie possible liée à la dégradation des muscles masticateurs), entrainera la mise à mort compassionnelle de l'animal concerné.
Choix des espèces
Le rat, une espèce de mammifère phylogénétiquement proche de l'homme, constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris myopathe, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin de la myopathie de Duchenne. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle sur le chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).
Creation d’un modèle murin des affections neurosensorielles et étude d’une thérapie
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une neuropathie humaine, elles développent des déficits auditifs et visuels, et subissent des mesures de l'audition et de la vision sous anesthésie générale avec pose d'électrodes sous-cutanées et cornéennes, puis un traitement par gavage. Le porteur indique que la privation sensorielle perturbe leurs interactions avec l'environnement et génère du stress. Il teste une molécule censée restaurer la régulation du fer, présentée comme préalable à un essai clinique chez les patients.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’efficacité d’un traitement médicamenteux dans la récupération ou la stabilisation des fonctions auditives et optiques dans un modèle animal présentant ces atteintes neurosensorielles causées par des mutations du gène étudié. Il s’agit d’un gène découvert chez l’Homme dans un contexte de neuropathie auditive et optique débutant à l’adolescence et s’aggravant rapidement pour entrainer une cécité quasi-complète ainsi qu’un déficit auditif profond. La protéine qui est codée par ce gène présente un rôle important dans la synthèse de protéines régulant le fer intracellulaire (protéines à centre fer-soufre). Les études cellulaires ont montré que les mutations du gène entrainent une surcharge de fer dans la cellule. Les défauts de synthèse des acteurs de la régulation du fer, dont les protéines fer-soufre, sont à l’origine de cela. Il a été démontré dans ces cellules que la molécule A permet de restaurer la régulation du fer lorsque ces acteurs manquent. Or, nous ne savons pas si cela peut se traduire par la restauration des fonctions auditives et/ou optiques chez les patients. L’étude du modèle murin permettra donc, d’une part de comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la mutation du gène, en étudiant d'une part, les modifications des structures de l'oreille interne et de la rétine, et d'autre part, l’efficacité de la molécule A dans la récupération des fonctions sensorielles.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de comprendre les mécanismes in situ des atteintes neurosensorielles (auditive et oculaire) chez les patients portant une mutation. Nous serons capables d’étudier l’évolution de ces atteintes neurosensorielles chez la souris qui présente un développement plus rapide que l’Homme, cela nous permettra d’avoir une idée du pronostic. Nous analyserons la morphologie des cellules ciliées et du nerf auditif, ainsi que les éléments permettant la neurotransmission au niveau de la synapse. De même, une étude parallèle des cellules de la rétine, ainsi que du nerf optique, sera effectuée de la même manière. Ces éléments permettront de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces atteintes. Le traitement des souris par la molécule A permettra d’avoir des éléments de réponses pour juger de son efficacité dans la préservation ou la récupération des fonctions auditives et optiques.L’efficacité chez la souris permettra de mettre en place un protocole de traitement des patients durant un essai clinique.
Procédures
Nous étudierons cette lignée à différentes étapes de son développement en mesurant les fonctions auditive et oculaire. La fonction auditive sera évaluée par la mesure des potentiels évoqués auditifs ainsi que des otoémissions acoustiques provoquées via le recueil des produits de distorsions. Ces mesures dureront environ 30 à 45mn. La fonction oculaire sera étudiée par l’électrorétinogramme (environ 15mn) Les enregistrements des fonctions oculaires et auditives seront réalisés après anesthésie générale (injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine 100mg/Kg, et xylazine 10mg/Kg) Le traitement sera administré sous forme liquide par gavage oral une fois par jour chez des souris vigiles qui seront surveillées dans les minutes qui suivent afin de s'assurer de l'absence de fausse route.
Impact sur les animaux
Les souris étudiées seront atteintes de déficit auditifs et visuels, ces atteintes entraineront une perturbation leurs interactions avec l’environnement du fait de la privation sensorielle, ainsi que des modifications de leurs comportements liées au stress que cela va entrainer. Les explorations fonctionnelles auditives et optiques nécessiteront une anesthésie générale des souris par ketamine et xylazine afin de limiter au maximum la douleur liée à la mise en place d’électrode sous-cutanée permettant de recueillir les potentiels évoqués auditifs durant les stimulations auditives. Durant cette même anesthésie générale, l’implantation d’une électrode de recueil cornéenne associée à des stimulations lumineuses permettront de réaliser l’electrorétinogramme.
Devenir
Toutes les souris utilisées pour cette étude seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin d'obtenir les prélèvements histologiques pour analyser post mortem
Remplacement
L'utilisation de cellules en culture (fibroblastes) permettra d’effectuer les premières analyses fonctionnelles pour caractériser l'impact des mutations et pour évaluer l'efficacité de la molécule A in vitro dans les fibroblastes de patients. Dans un deuxième temps, dans le cadre de développement thérapeutique, il sera indispensable d’utiliser un modèle animal afin de tester l'efficacité de la molécule in vivo, avant que son utilisation ne soit envisagée chez l’homme.
Réduction
Afin de Réduire le nombre d'animaux utilisés, la procédure d'enregistrement de l'électrorétinogramme et des potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions seront standardisée sur les deux yeux et sur les deux oreilles respectivement. De plus, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les études fonctionnelles (électrorétinogramme,des potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions) et les analyses histologiques.Les explorations fonctionnelles serons réalisées à chaque stade de développements chez 10 souris dans chaque groupe (mutantes et témoins) avant la mise à mort de celles-ci. Le nombre de 10 animaux par condition par groupe sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Les enregistrements de la fonction visuelle par électrorétinogramme ainsi que la fonctionne auditive par potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions seront réalisés sous anesthésie générale pour éviter toute souffrance et éviter que les animaux bougent. Les procédures mises en place pour réaliser le projet sont peu traumatiques, de courte durée, elles peuvent néanmoins engendrer du stress. Les animaux seront surveillés quotidiennement, des antalgiques seront administrés en cas de douleur et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Le globe oculaire et l'oreille de la souris présentent des structures similaires à celles de l’humain et représentent donc des modèles adaptés pour les études physiopathologiques. De plus, les neuropathies optiques et auditives sont des pathologies pour lesquelles il est difficile de récupérer du matériel biologique adapté chez l’humain (énucléation ou pétrectomie inenvisageables), et donc de réaliser une étude scientifique fondamentale précise du tissu d'intérêt. Enfin, pour tester l’efficacité d'une molécule in vivo dans le cadre d'un développement thérapeutique, il est indispensable d’utiliser un modèle animal. Le modèle murin présente également l'avantage d'une reproduction relativement rapide compte tenu de la durée d’ovulation et de gestation de la souris. Pour toutes ces raisons, nous avons considéré le modèle murin comme étant le plus adapté pour l’étude de ces affections neurosensorielles.
Identification et sélection de candidats précliniques anti tumoraux
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 2250
26 850 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Une tumeur leur est greffée sous la peau, dans la mamelle, la plèvre, le rein ou le foie, avec pour des milliers d'entre eux une chirurgie du foie ou la pose d'un cathéter, puis des administrations de composés une à deux fois par jour pendant six à huit semaines. Le porteur évoque une possible nécrose locale et des points limites déclenchant la mise à mort. Il présente ce criblage de candidats-médicaments comme reposant sur des modèles "indispensables", et la mise à mort finale comme elle-même "indispensable" aux prélèvements.
Objectifs
Le cancer est l’une des causes majeures de mortalité dans le monde, à l’origine de 10 millions de décès en 2020, avec 19 millions de nouveaux cas cette même année. D’après les projections, le nombre de nouveaux cas de cancer dans le monde devrait atteindre 29,5 millions pour l'année 2040. Aussi, le nombre de décès dans le monde devrait lui atteindre 16,4 millions pour l'année 2040. Les expérimentations décrites dans ce projet ont pour objectif d’identifier et d’évaluer des molécules entrainant la régression ou le ralentissement de l’évolution de tumeurs cancéreuses sur des modèles animaux et qui permettront à terme de mettre à disposition aux patients des traitements pour soigner le cancer.
Bénéfices attendus
Un cancer est dû à une accumulation de mutations génétiques et/ou d’altérations épigénétiques au niveau de gènes jouant un rôle crucial dans le maintien de l’intégrité cellulaire. Ces phénomènes oncologiques conduisent les cellules à acquérir des capacités de prolifération accrue, de résistance à la mort cellulaire programmée, d’invasion des tissus et de formation de métastases. Le cancer n’est pas une maladie unique, mais un ensemble de maladies et représente la deuxième cause de mortalité dans le monde. Les modèles animaux utilisés dans ce projet vont nous permettre de mieux comprendre certaines voies de signalisation cellulaire impliquées dans la croissance tumorale et de sélectionner des nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de certains cancers.
Procédures
Les gestes techniques réalisés sur animaux se pratiquent sur rats et souris, vigiles ou anesthésiés. -Sur animaux vigiles : • Identification individuelle (punch à l’oreille, anneaux au feutre à la queue, tatouage à la patte). Tous les animaux sont concernés. • Administration de composés par voies orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse. Tous les animaux sont concernés. Les administrations par voies orale, péritonéale et sous-cutanée peuvent être réalisées une à deux fois par jour, pendant 6 à 8 semaines. Les administrations par voie intraveineuse peuvent être réalisées une à deux fois par semaine, pendant 6-8 semaines. • Mesure du volume tumoral réalisé une à deux fois par semaine pendant 8 semaines au maximum sur un animal maintenu en contention. Cet acte concerne 6000 souris et 1000 rats. -Sur animaux anesthésiés: • Administration par voie sous-cutanée des cellules à greffer. Acte réalisé une fois. Cet acte concerne 4000 souris et 1000 rats. • Administration en intramammaire des cellules à greffer. Acte réalisé une fois. Cet acte concerne 2000 souris. • Administration en intrapleurale des cellules à greffer. Acte réalisé une fois. Cet acte concerne 2300 souris. • Administration en intrapleurale de composés à tester. Acte pouvant être réalisé plusieurs fois par semaine. • Prélèvements sanguins intermédiaires au maximum une fois par semaine par animal ou terminaux. Ils sont réalisés en respectant les recommandations en termes de volumes et temps de récupération. Tous les animaux de ce projet sont concernés. • Mises à mort par une méthode règlementaire ou une méthode validée par un comité d’éthique. Tous les animaux de ce projet sont concernés. • Chirurgie avec pose de cathéter à la veine jugulaire (acte unique). Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Cet acte concerne 350 rats de ce projet. • Chirurgie avec résection partielle du foie (acte unique). Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Cet acte concerne 5000 souris de ce projet. • Chirurgie avec administration de cellules tumorales dans la capsule rénale (acte unique). Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Cet acte concerne 2000 souris de ce projet. • Chirurgie avec administration de cellules tumorales dans le foie sain (acte unique). Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Cet acte concerne 2000 souris de ce projet.
Impact sur les animaux
En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entraîner des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour nos recherches. Dans le cadre des procédures de pharmacocinétiques, les composés sélectionnés sont d’abord testés en administration unique. Les procédures suivantes permettent d’établir les meilleures modalités d’administration aux animaux en termes de dose, durée et fréquence. Ces procédures sont autant de précautions pour écarter les composés qui provoqueraient des effets indésirables. Dans certains modèles de greffes, il est possible d’observer une nécrose locale qui est prise en charge dans le cadre du suivi des animaux et des soins associés. Certaines procédures nécessitent la réalisation d’une chirurgie avec ouverture de la paroi abdominale. Elles n’engendrent pas d’effets indésirables autres que ceux liés aux modèles eux-mêmes et sont réalisées sous anesthésie et en recourant à des analgésiques. L’ensemble des procédures décrites dans ce projet utilisent des gestes techniques bien caractérisés s’appuyant sur des publications scientifiques. Elles sont réalisées par des personnes expérimentées dont le maintien des compétences est suivi précisément. Malgré cet ensemble de précautions préliminaires, la survenue de signes cliniques ne peut être totalement écartée. Dans ces cas, le traitement est suspendu ou adapté, des points limites sont définis pour chaque procédure afin de mettre en place des actions correctives pour préserver le bien-être des animaux.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue des procédures est indispensable afin de pouvoir prélever le sang et les organes et réaliser les analyses permettant de répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Le processus de sélection des composés est réalisé sur des tests cellulaires et acellulaires permettant d’évaluer l’efficacité des composés et de comprendre leur mécanisme d’action. Pour évaluer l’activité des composés in vivo, il est indispensable de recourir ensuite à l’utilisation de modèles animaux intégrant au mieux la physiopathologie humaine (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammation…). Tous les modèles utilisés sont bien décrits dans la littérature scientifique et ont été validés avec des composés qui ont montré leur efficacité chez l’homme dans des études cliniques. Ces modèles vivo sont indispensables pour prendre en compte la complexité de la carcinogénèse humaine.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in-vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront testées sur les animaux. Ce système permet de réduire considérablement le nombre de molécules testées chez l’animal et donc le nombre d’animaux utilisés. Pour les procédures de pharmacocinétique, en règle générale, 9 à 15 animaux par composés testés sont inclus en étude et permettent de réaliser des mesures cinétiques suffisamment complètes. Pour les procédures de pharmacologie, seuls les modèles animaux, bien décrits et validés par la communauté scientifique sont réalisés. En règle générale, 8 à 12 animaux sont utilisés par groupe (1 groupe par composé à tester incluant le véhicule du composé). Une analyse de variance à 1 ou 2 facteur(s) suivie d’un test de Dunnett ou de Bonferronni comparant le véhicule avec le composé à tester permet de mesurer si l’effet du composé est significatif. Les études peuvent être répétées une deuxième fois pour évaluer la reproductibilité de l’effet observé avec un composé.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. Ils sont observés tous les jours et un examen clinique détaillé est réalisé au minimum deux fois par semaine. Les conditions de chaque procédure expérimentale sont étudiées individuellement par la Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) qui émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. De même, les soins péri-opératoires sont discutés et encadrés par la SBEA avec le conseil du vétérinaire référent. Les animaux immunodéficients sont hébergés et manipulés dans des conditions permettant de respecter leur statut sanitaire particulier, ainsi ils n’expriment pas de phénotype dommageable. Les animaux affaiblis sont maintenus dans des conditions aménagées facilitant l’accès à l’alimentation et à l’eau de boisson (par exemple ajout d’aliment gélifiée).
Choix des espèces
En pharmacocinétique, la souris et le rat sont les espèces standards dans les premières phases de recherche et développement de nouveaux candidats médicaments. Le rat est choisi pour les molécules les plus intéressantes, afin de commencer la comparaison pharmacocinétique inter espèce, ainsi que de préparer les études de toxicologie futures. En pharmacologie, la souris est l’espèce recommandée et largement utilisée pour les premières étapes de la recherche contre le cancer. Elle permet de réduire les quantités de composés nécessaires à l’évaluation de leur efficacité. Le rat est choisi en seconde intention pour tester les molécules les plus prometteuses et pouvant montrer un profil pharmacocinétique différent comparé à la souris. L’immunodéficience permet de pouvoir greffer des lignées cellulaires humaines et créer des tumeurs se rapprochant de celles observées chez l’homme. Les études pharmacocinétique, de tolérance et d’hépatectomie partielle sont réalisées sur des animaux d’âge adulte qui permettent une bonne évaluation de l’exposition et tolérance des composés. Les études de greffes sont réalisées avec des animaux juvéniles (3 à 8 semaines). Cet âge permet de greffer les cellules sur des animaux dont l’immunité est la moins développée possible et ainsi de favoriser la prise tumorale.
Étude des fonctions de modifications du squelette cellulaire et leur implication dans les pathologies
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
5 209 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs organes, dans des procédures relevant de la gravité sévère ou menées sous anesthésie sans réveil. Une partie ne subit qu'un suivi de son état clinique, d'autres une ouverture du thorax sous anesthésie profonde sans reprise de conscience, pour étudier la régulation du squelette des cellules. Le porteur signale qu'une souche présente une ataxie et que l'état des nouvelles lignées créées reste inconnu à l'avance. Il justifie l'usage de la souris par l'étude de ces mécanismes au niveau de l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du squelette cellulaire (cytosquelette): d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Le cytosquelette étant impliqué dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies. A terme, ce projet permettra de développer les moyens de dépistage et de nouvelles thérapies ciblant les maladies reliées à la dérégulation du cytosquelette. Le cytosquelette est présent dans toutes les cellules, ou il exerce des rôles très divers : il donne aux cellules leur forme, participe au mouvement des cellules et au transport intracellulaire, rend possible la division cellulaire et le déplacement de spermatozoïdes lors de la fécondation. Le cytosquelette interagit avec de nombreuses protéines qui contrôlent ses fonctions. Une des hypothèses suggère que le choix des éléments utilisés pour construire le squelette cellulaire et les modification de ces éléments constituent un code, qui définit ses propriétés et influence les interactions avec les autres protéines spécifiant ainsi ses fonctions. Le présent projet est une continuation d’un projet précèdent, qui a permis de démontrer le rôle essentiel de la régulation du cytosquelette dans la survie des neurones et dans la fertilité. Nous proposons maintenant d’étendre notre analyse à d’autres modèles murins de ce code de cytosquelette.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de maladies telles que les neurodégénérescence, cancer ou infertilité. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette et de développer les moyens de dépistage et les traitements des pathologies liées à sa dérégulation.
Procédures
Les animaux sont soumis à une analyse phénotypique (analyse de l’état clinique des animaux) pendant leur vie mais ne subiront aucune intervention. A différents âges, les animaux seront anesthésiés et ensuite mis à mort pour fixation de leurs organes.
Impact sur les animaux
Une des souches murines utilisée dans ce projet a été décrite comme ataxique, c'est à dire qui présente des problèmes de coordination de mouvements. Pour les nouveaux modèles qui seront générés dans le cadre de cette étude, la condition des animaux n’est pas connue à l’avance. Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s'arrêteront en fin de chirurgie (procédure sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses de leurs organes
Remplacement
Après les premières étapes d'analyse des enzymes, impliquant la culture cellulaire (expression d’enzymes dans les lignées cellulaires et observation de leurs activités), le projet a pour but maintenant de comprendre la fonction de ces enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris.
Réduction
Les animaux générés lors de ce projet seront utilisés à la fois pour l’analyse phénotypique et pour l'analyse de leurs organes, permettant de réduire le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs. Les croisements seront optimisés pour produire les animaux d'intérêt. Les animaux contrôles proviendront des mêmes portées que les animaux d’intérêt.
Raffinement
Les animaux seront surveillés deux fois par semaine minimum. Tout signe de mal-être, tel que la perte de poids, blessure, mauvaises relations sociales sera détecté et l‘animal sera soigné et soit isolé, soit mis à mort. Les soins peuvent inclure l’application d’une crème désinfectante (blessure) ou d’un complément nutritif (perte de poids). Une grille de score est mise en place pour le suivi clinique des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges : nouveau-né, 1 mois (animal jeune), 4 mois (animal adulte), 12 mois (animal âgé) et 18 et 24 mois (animaux très âgés). En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme. De plus, certains mutants devront être analysés très âgés, vu que l’on veut observer la dégénérescence liée à l’âge chez ces animaux. Les analyses de certaines lignées (à phénotype non-dommageable uniquement) nécessiteront la génération d’embryons au stade embryonnaire E14.5 ou E17.5 (soit 14,5 jours-post fécondation ou 17,5 jours post-fécondation) E14.5 ou E17.5. En effet à partir d’embryons de ces âges (en jour post-fécondation) il est possible de cultiver les cellules primaires nécessaires pour l’étude de mécanismes cellulaires impliqués.
Effets cardiovasculaires précoces des toxines urémiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit deux chirurgies à sept jours d'intervalle pour provoquer une insuffisance rénale, avant l'administration de toxines urémiques et un suivi par échographie et IRM sous anesthésie jusqu'à une mise à mort échelonnée. Le porteur indique une douleur après les chirurgies, une perte de poids et des troubles du comportement dans les semaines suivantes. Il affirme que l'analyse des atteintes cardiovasculaires ne peut se faire in silico et juge le modèle souris "indispensable".
Objectifs
L'objectif de ce travail est d'étudier les effets vasculaire et cardiaque spécifiques de deux toxines urémiques: l’Indoxyl sulfate (IS) et le Para-cresyl sulfate (PCS).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de démontrer que les dysfonctions cardiaque et vasculaire observées au cours de l'insuffisance rénale aiguë (IRA) sont en partie secondaires à l'accumulation des toxines urémiques IS et PCS. Ce projet nous permettra d'en montrer le lien direct indépendamment de l'IRA en elle-même en utilisant des groupes de souris sans insuffisance rénale avec exposition par voie orale à l'IS ou au PCS. Les résultats de ce projet pourraient nous permettre également d'envisager des études thérapeutiques visant les toxines urémiques directement ou leurs mécanismes d'action.
Procédures
Les animaux du groupe IR (insuffisants rénaux ou groupe témoin positif) seront soumis à une procédure chirurgicale destinée à réduire le fonctionnement rénal. Les souris subiront 2 chirurgies à 7 jours d'intervalle afin de créer une insuffisance rénale. Les autres groupes (groupes sham ou groupe sans insuffisance rénale) seront soumis à des opérations blanches. Les animaux seront ensuite traités selon les groupes par KCl, IS ou PCS et suivis par imageries non invasives (échographies et IRM réalisées sous anesthésie), jusqu'à l'euthanasie qui surviendra dans chaque groupe à 3 temps (J7, J15 et J45). La procédure d'échographie durera 30 minutes et l'IRM 1 heure. Les prélèvements sanguin et tissulaires seront réalisés à l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux directement liés aux chirurgies et aux imageries de suivi. Les risques liés aux chirurgies et aux imageries de suivi concerneront tous les groupes de l'étude cardiovasculaire. Ils seront représentés essentiellement par la douleur aux décours des actes de chirurgies puis dans les semaines suivantes par un retentissement sur le bien-être (perte de poids, troubles comportementaux etc.).
Devenir
L'étude sera divisée en deux parties (étude préliminaire puis étude cardiovasculaire). Au terme des deux procédure (étude préliminaire et étude cardiovasculaire), les souris seront euthanasiées. Pour l'étude préliminaire, elles seront euthanasiées à J7 et J15 pour évaluer une cinétique de concentration d'IS et de PCS afin de définir la dose adéquate à administrer aux souris dans l'étude cardiovasculaire. Pour l'étude cardiovasculaire, les souris seront euthanasiées à 3 temps différents (10 souris à chaque temps par groupe) J7, J15 et J45 afin de réaliser une cinétique d'étude des atteintes structurelles cardiovasculaires (par mesure de marqueurs vasculaires et cardiaques dans le plasma et au niveau tissulaire).
Remplacement
L’analyse précise des conséquences cardiovasculaires de l’IR sur le plan tissulaire et fonctionnel ne peut être réalisée par des études in silico et l’utilisation de modèles animaux reste à l’heure actuelle indispensable. Notre choix s’est porté sur un modèle de souris car c’est le modèle le plus utilisé, le plus accessible et reconnu par l’ensemble de la communauté scientifique.
Réduction
En vue de réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude préliminaire sera effectuée avec un effectif d’animaux réduit (7 groupes de 10 souris par groupe soit 70 souris) pour établir la dose adéquate d’IS et de PCS à administrer aux souris dans la suite de l’étude. L'étude cardiovasculaire sera réalisée sur un total de 120 souris avec 4 groupes de 30 souris par groupe. Dans l'étude cardiovasculaire de nombreux paramètres tissulaires et fonctionnels seront réalisés sur les mêmes animaux. Afin de pouvoir mettre en évidence une différence significative entre les groupes en tenant compte de la variabilité des mesures et de la mortalité, 10 animaux par groupe et par temps seront nécessaires pour les analyses tissulaires et biochimiques.
Raffinement
Dans le cadre d’un raffinement, on placera des nids végétaux, litières adaptées à la nidification et un fond sonore musical afin de favoriser le bien-être des animaux qui seront hébergés à plusieurs par cage. Des points limites seront établis et adaptés aux procédures mises en place et toutes les précautions d’usage seront mises en œuvre en terme d’anesthésie et d'analgésie afin de limiter la douleur des animaux au décours des chirurgies et lors des d’imageries. Afin de réduire la douleur lors des chirurgies (blanches ou IR), celles-ci seront effectuées sous anesthésie. Les chirurgies seront réalisées après avoir vérifié que le niveau d’anesthésie et d'analgésie est adéquat en appliquant une pression sur une des pattes de l’animal. De l’anesthésique sera réadministré en cas de réaction de l’animal. La douleur postopératoire sera systématiquement évaluée et traitée par une injection sous-cutanée d'analgésique. Tous les animaux seront suivis en postopératoire immédiat quotidiennement et jusqu’à la fin du protocole selon un score permettant de caractériser l’état de bien-être des animaux. Ainsi, la plus grande attention sera portée afin d'éviter la survenue de douleur et de stress chez les animaux tout au long du protocole.
Choix des espèces
Notre modèle murin d’IR a été validé par plusieurs publications aussi bien par notre équipe que par d’autres. Il s'agit d'un modèle d'IR stable (le niveau d'urée restant relativement stable avec le temps) qui peut devenir chronique si on laisse l'IR persister pendant plus d'un mois (chez l'homme c'est 3 mois). Avant un mois d'évolution chez la souris, l'IR est encore considérée comme aigue, permettant l’étude des stades précoces. Le modèle murin d’IR par électrocautérisation/néphrectomie est très largement utilisé depuis plusieurs années dans la communauté scientifique et accepté par les Comités d’Ethique en Matière d’Expérimentale Animale. De plus, l’étude présentée ici vise à apporter des données physiopathologiques complémentaires à ce modèle. Conformément aux publications précédentes de notre laboratoire employant le modèle d’IR, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines. Les souris arriveront à l’animalerie âgées de 6 semaines et nécessiteront 2 semaines d’acclimatation.
IronTWIK
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
De l'embryon de 15 jours à la souris de 60 jours, les petits de femelles gestantes nourries avec plus ou moins de fer sont tués à cinq stades de leur développement pour prélever leur cerveau, leur duodénum, des neurones de la moelle épinière, leurs nerfs sciatiques et de la peau du dos. 400 souris, issues de lignées qui expriment différentes formes du canal potassique TWIK1 ou en sont dépourvues, vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Pour ce niveau sévère, le porteur affirme que le projet ne comporte, hors le régime appauvri en fer, "aucune procédure pouvant nuire au bon développement" des souris, tout en envisageant un déficit nerveux chez les souriceaux d'une lignée plus sensible. Il annonce trois lignées dans ses objectifs et quatre dans son calcul d'effectifs. Il exclut toute réutilisation ou adoption, en écrivant devoir envisager que les effets du régime "puissent se développer plus tard".
Objectifs
L'objectif principal de ce projet IronTWIK1 est de montrer que le canal ionique TWIK1 joue un rôle central dans la maturation des fibres nerveuses et que cette fonction est liée au métabolisme du fer par les neurones concernés. Pour cela, nous souhaitons soumettre les femelles gestantes de 3 lignées de souris exprimant ou non des formes différentes du canal TWIK1 (absent, sélectif pour le potassium, non-sélectif pour le potassium) à deux régimes alimentaires se distinguant par des teneurs en fer différentes ; un dit « haut Fer » et un dit « bas Fer ». Nous sacrifierons les souriceaux à différents stades de leur développement pour analyser les niveaux de maturation des fibres nerveuses concernées ainsi que le développement du système nerveux de la peau.
Bénéfices attendus
Le canal TWIK1 participe avec les autres membres de la famille des canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) au maintien du potentiel de repos des cellules excitables et à la protection neuronale. Les neurones liés au toucher et qui constituent les afférences principales des mécanorécepteurs de la peau et des poils sont caractérisés par la présence d’une couche de myéline. Bien qu'on ne s'explique toujours pas le rôle qu'il puisse y jouer, le canal TWIK1 apparait comme le mieux exprimé de sa famille dans ce type de fibres nerveuses. Or, ce canal potassique partage avec les protéines essentielles à la maturation et la myélinisation de ces même fibres nerveuses une localisation subcellulaire et une dépendance au pH qui laisse supposer qu'il pourrait en contrôler l’activité et la maturation. Une telle mise en évidence permettrait d’envisager un contrôle pharmacologique de cette maturation par le contrôle de l’activité ou de la sélectivité de ce canal potassique. Si cette hypothèse était avérée, ce projet, ouvrirait une porte encore jamais utilisée pour comprendre les mécanismes de la maturation des fibres nerveuses ni dans le traitement des maladies neurodégénératives par la pharmacologie liée à ces canaux ioniques.
Procédures
Tous prélèvement prévus dans ce projet sera effectué sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
Outre l’exposition des mères gestantes à un régime appauvri en fer, ce projet ne propose aucune procédure pouvant nuire au bon développement et au bien-être des animaux. Il est possible toutefois qu’une des trois lignées étudiées soit plus sensible que les autres à cette diminution du taux de fer dans la nourriture et que cette sensibilité différente se manifeste par un déficit nerveux altérant le développement normal des souriceaux. Le cas échéant, nous procéderons à l’application des règles établies pour les points critiques qui peuvent aller jusqu’à l'arrêt de la procédure et l'euthanasie des animaux.
Devenir
Nous ne savons pas à l'heure actuelle les effets que peut avoir un régime appauvri en Fer sur les souris génétiquement modifiées pour le canal TWIK1. Même si ces effets ne sont pas visibles en fin de procédure, nous devons envisager que ceux-ci puissent se développer plus tard c'est pourquoi nous ne pouvons pas choisir l'option de réutiliser, replacer ou adopter les animaux.
Remplacement
Le remplacement des souris, par l’utilisation de cultures cellulaires par exemple, a déjà largement été employé dans l’étude de ce canal. L’observation de TWIK1 a débuté par son clonage en 1996. En 2012, les mécanismes de changement de sélectivité lors d'une exposition à des pH acides ont été étudiés dans les ovocytes de Xénopes. Le canal TWIK1 est un canal fonctionnel pour lequel il est à présent indispensable d’étudier le mode de fonctionnement in vivo et son rôle physiologique. L’implication de TWIK1 dans la maturation des fibres nerveuses liées au toucher et à la proprioception nécessite l’utilisation d’un modèle animal car pour le moment, aucun système in vitro ne permet de reproduire l’ensemble des mécanismes physiologiques d’un organisme entier. De par ses similarités avec la physiologie humaine, et parce ce que nous possédons trois modèles murin génétiquement modifié pour TWIK1, la souris constitue le meilleur modèle pour adresser cette question. De plus, la caractérisation de cette maturation doit tenir compte du développement de l'animal et doit donc se faire sur un animal entier.
Réduction
Les 4 lignées de souris concernées par ce projet sont déjà disponibles dans le laboratoire où elles font l’objet d’une étude sur le rôle du canal TWIK1 dans la perception de la douleur et dont les procédures ont été validées par les instances ministèrielles. Ici, nous utiliserons indifféremment les animaux mâles et femelles. Une large recherche bibliographique nous a permis d’optimiser le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir une réponse statistiquement significative. La maturation du système nerveux périphérique s’évalue d’une part par la mise en place des fibres spécialisées et d’autre part par la mesure de l’épaisseur de la gaine de myéline des fibres myélinisées. Cette dernière mesure, comparée à l’épaisseur de la fibre nerveuse sans la myéline, constitue un paramètre appelé rapport-g (ou g-ratio). Celui-ci constitue dans ce projet notre variable d’intérêt. Une consultation de la littérature traitant de ce sujet nous a permis, par un calcul de puissance statistique de déterminer la taille d’effectif la plus juste en tenant compte des conditions expérimentales (2 régimes différents, 2 sexes, 4 génotypes). Le calcul effectué dans ces conditions renvoie des effectifs de 6 souris par groupe. Sur tout animal qui entrera dans l’étude nous prélèverons le cerveau, le duodénum, certains neurones de la moelle épinière, les nerfs sciatiques et une section de peau correspondant à la partie haute du dos.
Raffinement
Nous savons que les 3 lignées de souris TWIK1 sont parfaitement viables, qu’elles se reproduisent normalement et que leurs descendances ne présentent aucun signe de mauvais développement. Néanmoins, il n’est pas exclu qu’en présence d’un régime appauvri en Fer la qualité du lait des mères soit modifiée et qu’en fonction de leur génotype, les souriceaux présentent des troubles visibles du développement. Les animaux seront donc observés de façon bihebdomadaire afin de rechercher des signes cliniques indicateurs des différentes conséquences d’un tel régime sur l’organisme. Une feuille d’observation, incluant une grille de score, a été établie qui permettra également d’identifier précocement tout signe de stress ou de douleur. Cette grille de score contient des points limites précis. La mort n’étant pas un point limite acceptable, nous sortirons les souris de l’étude lorsqu’un des points limites sera atteint.
Choix des espèces
L'étude que nous souhaitons mener vise à déterminer l'impact d'un canal TWIK1 excitateur ou inhibiteur sur des structures cérébrales complexes (Cerveau, duodenum, nerfs sciatique et peau velue...). En outre, les analyses de tissus que nous souhaitons réaliser doivent être faites à différents stades du développement. Elles ne peuvent donc pas être faites in vitro au niveau cellulaire car elles requièrent l'intégralité de l'animal. L'espèce animale utilisée sera la souris (Mus Musculus) car c'est le modèle le plus classiquement utilisé pour les manipulations génétiques. De plus, ce modèle présente de fortes similitudes avec l'humain pour les fonctions étudiées. En outre, des souris transgéniques issues du fond génétique des C57Bl6-J exprimant des formes différentes du canal TWIK1, sont déjà disponibles dans notre institut. Celles-ci sont parfaitement viables et ne montrent aucun signe délétère de leur développement. Ce projet concerne 4 lignées. Chaque lignée sera soumise à deux régimes : un dit à « haut Fer » et un dit à « bas fer ». Pour chacune nous prélèverons les embryons au stade E15 (15 jours après la fécondation), les nouveau-nés à P1 puis à P15, à P30 et à P60 (respectivement 1 puis 15 puis 30 puis 60 jours après la naissance). Dans certains neurones de la moelle épinière (DRG), la mesure des niveaux d’expression des gènes codant les marqueurs spécifiques des différents types de fibres sensitives montre que dès le stade E13 (13ème jour après la fécondation), les neurones qui nous intéressent sont déjà différenciés. En choisissant le stade embryonnaire E15 (15 jours après la fécondation), nous pourrons facilement cibler les neurones où le canal TWIK1 est le mieux exprimé. Le stade P1 (1 jour après la naissance) nous permettra de visualiser le niveau d’innervation et la maturation des fibres nerveuses au moment de la naissance. Nous proposons les stades P15 et P30 (respectivement 15 et 30 jours après la naissance) car une étude montre qu’en absence des transporteurs du Fer, la myélinisation des fibres nerveuses est altérée à ces deux stades P15 et P30 puis est compensée pour revenir à un niveau normal. Lors de nos observations de la croissance des souris TWIK1-KO, nous avons observé une alopécie transitoire entre la 3ème et la 8ème semaine après la naissance. En choisissant P60 (60 jours après la naissance), nous sous assurons d’être au-delà de cette 8ème semaine et de pouvoir observer ces éventuels phénomènes de compensation.
Impaired organ repair after sepsis: role of tissue resident macrophages and recruited monocytes (ORISMO)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature-ponction du caecum destinée à provoquer une infection généralisée, une ablation partielle de rein et une injection de tamoxifène, pour étudier la réparation du rein après un sepsis. Le porteur indique une perte de poids de 10 à 15 % et une baisse d'activité de plusieurs jours, et annonce un traitement de la douleur au site opératoire. Les objectifs cliniques, de nouvelles thérapeutiques pour les patients survivant à une infection grave, sont formulés au conditionnel, tandis qu'il affirme que seul le modèle animal approche la complexité du sepsis humain.
Objectifs
Evaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale après une infection grave
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.
Procédures
les animaux seront soumis à 3 procédures: - injection intra-péritonéale de tamoxifen (durée 2minutes) - Procédure chirurgicale de ligature ponction caecale (durée 10minutes)- procédure chirurgicale de nephrectomie, clampage du pédicule vasculaire rénal (durée 35minutes)
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales peuvent s'accompagnées de douleur au niveau du site opératoire, celle-ci sera systématiquement recherchée et un traitement antalgique sera administré à tous les specimen, possiblement réitéré à plusieurs reprise en cas de persistence de signes d'inconfort. La perte de poids est une complication attendue de l'infection, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporelle, et regresse en quelque jours après la guérison. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle (composante du comportement maladie) et n'excède pas 5-7 jours au dela des différentes procédures
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Le sepsis est une maladie complexe et multi-systémique qui associe une intense activation immunitaire, une défaillance circulatoire, des altérations endothéliales à divers degrés. A ce jour, seule l'utilisation de modèles animaux permet d'approcher la complexité du sepsis chez l'homme. Le modèle de ligature ponction caecale que nous utiliserons est largement étudié et le plus utilisé dans la littérature.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, les animaux seront leurs propres contrôles pour un suivi au cours du temps (analyse rein droit puis rein gauche), ceci afin de réduire leur nombre. Le nombre d'animaux par groupe à été déterminé par calcul de puissance necessaire à mettre en évidence une différence significative entre les groupes avec le minimum de specimens.
Raffinement
Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien être des animaux lors des procédures expérimentales les mesures suivantes seront prises: surveillance acccrue toute les 12h dans les 48h suivants la procédure. Administration systématique d'antalgique chez tous les specimen après chirurgie et réadministration à H24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire mise à mort dans les cas extrèmes (au moyen d'un scoring clinique, qui liste les points limites à partir desquels les antalgiques ou de mise à mort sont prises). Surveillance accrue 2 fois/jours pendant les 3 premiers jours après chirurgie.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Souris mâles jeunes adultes de 4-8 semaines environ Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme