Procédures sévères

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur pose chirurgicalement une pompe diffusant de la bléomycine pour induire une sclérodermie, puis on administre les composés à tester par des voies variées et on prélève 7,5 % de leur sang chaque semaine, avant la mise à mort. Le porteur revendique un modèle répondant à un "besoin important de santé" et affirme qu'aucune approche in vitro ne peut remplacer l'animal. La souffrance déclarée reste au niveau sévère, ce qui soumet le projet à une évaluation rétrospective.

Objectifs

La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie orpheline atteignant le tissu conjonctif. Son origine n’est pas connue mais son apparition et sa progression impliquent très certainement des facteurs environnementaux sur un fond génétique de susceptibilité. La physiopathologie est dominée par des lésions microvasculaires responsables de lésions endothéliales couplées à la production de nombreux médiateurs pro-inflammatoires favorisant un remodelage vasculaire. Un processus d’auto-immunité serait également impliqué supportant l’entretien, la progression et le maintien de la pathologie. Ces différents éléments soutiennent l’apparition de lésions fibrotiques liées à l’accumulation de dépôt multi-viscéral de matrice extracellulaire résultat d’une rupture de l’équilibre synthèse/dégradation de ces composés matriciels. La SSc est responsable d’une réduction significative de la survie, en particulier dans les formes diffuses au cours desquelles les atteintes viscérales sont fréquentes. Une meilleure compréhension de la physiopathologie de cette maladie permet de proposer des approches thérapeutiques afin d’optimiser la prise en charge des patients. Ce projet s’inscrit donc dans une étude préclinique visant à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients atteints de sclérodermie systémique. Ce travail permettra également de comparer les candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, le Tofacitinib. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagées afin de couvrir au mieux les potentiels effets recherchés sur la sévérité et la progression de cette maladie dans le modèle murin utilisé.

Bénéfices attendus

Le modèle animal de sclérodermie systémique (SSc) utilisé dans cette étude est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de la maladie afin de répondre à un besoin important de santé.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie préalable pour la pose d'une pompe Alzet par le fournisseur. La pompe Alzet est nécessaire au délivrement de la bléomycine en sous-cutanée afin d'induire la sclérodermie du modèle. Selon la demande de notre partenaire, la molécule à tester pourra être administrée dans l’eau de boisson, dans l’alimentation, par gavage, inhalation, injections intra péritonéale (à l'aide d'une aiguille 25-27G), intravasculaire (à l'aide d'une aiguille 29-30G), sous-cutanée (à l'aide d'une aiguille 25-27G), intradermique (à l'aide d'une aiguille 30G) intramusculaire (à l'aide d'une aiguille 29-30G). La fréquence/durée de l'administration est variable en fonction de la demande de nos partenaires, tout en respectant les caractères de l'éthique animale. Un volume maximum de sang de 7,5% du volume total sera collecté 1 fois par semaine. Un prélèvement en point final de sang, et d'autres organes/fluides auront lieu après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo afin d'évaluer l'efficacité des composés testés.

Impact sur les animaux

Les effets directs et indirects de la procédure chirurgicale de pose de la pompe Alzet par les fournisseurs des animaux sont décrit au sein de leur autorisation de projet (Voir numéro indiqué en 4.2). Ils regroupent la récupération post-opératoire (douleur et stress) dû à l’anesthésie et à la procédure chirurgicale. Cette chirurgie peut également induire une possible perte de poids, une mise en tension de la peau et un possible risque de nécrose en cas de tension trop importante, la création d’un espace vide en sous cutané, une gêne mécanique et une gêne dans les déplacements (troubles légers de l’équilibre dus à la présence d’un poids sur un côté). C'est pourquoi les animaux seront surveillés quotidiennement post-induction de la maladie et pendant toute la durée de l'étude. L'aspect général et le poids des souris seront évalués post-induction sous la forme d’un score prédictif de la douleur. Ce projet étant classé à un stade sévère, il fera l'objet d'une évaluation rétrospective.

Devenir

A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.

Remplacement

Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Aucune étude pilote ne sera effectuée de part la robustesse du modèle utilisé (description et publications). Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante (test non-paramétriques de Mann-Whitney et Kruskal Wallis) pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Le nombre de 10 animaux par condition test correspond à la quantité minimale nécessaire pour cet objectif.

Raffinement

Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Le projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée dans le bon déroulé de l'expérience et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective. Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs ayant connaissance du modèle (signes cliniques attendus) afin d'apporter les meilleurs soins aux animaux. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la sclérodermie systémique sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Dans ce projet, les expériences in vivo sont donc indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance de composés mais également leur efficacité sur la maladie. La souris est largement décrite pour être une espèce de choix dans ce modèle compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. La majorité des expériences sera réalisée chez la souris C57Bl/6J. Cependant, la souche peut différer en fonction des souhaits des sponsors. Les souris utilisées auront entre 7 et 12 semaines afin d'avoir des sujets adultes avec un système immunitaire mature.

190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection intracérébrale d'un agent inflammatoire, puis des prélèvements sanguins et musculaires et une mesure des propriétés contractiles du muscle, dans un modèle de cachexie associée au cancer. Le porteur annonce peu d'effets attendus hormis une légère perte de poids musculaire, tout en classant l'ensemble en gravité sévère. Il affirme qu'un système in vitro ne reproduirait pas la complexité de ce processus multi-tissus et que seul un modèle murin le permet.

Objectifs

Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peuvent être observées dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. La cachexie associée au cancer s'accompagne d'une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien), d'une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez la souris.

Bénéfices attendus

En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope.

Procédures

Pour déterminer le temps de prélèvement tissulaire optimal et des concentrations d'IL1ß et d'activine A optimales, des animaux seront soumis aux interventions suivantes: injection intra-cérébrale centrale, prélèvements sanguins, prélèvements des tissus musculaires (durée totale d'environ 60 minutes: 45 min pour l'injection de l'agent inflammatoire dans le système nerveux central et 15 min pour les prélèvements tissulaires). Pour déterminer les effets de l'inflammation centrale sur la force musculaire et la réponse transcriptionnelle musculaire, des animaux seront soumis aux interventions suivantes: injection intra-cérébrale centrale, mesure des propriétés contractiles du muscle tibialis antérieur, prélèvements des tissus musculaires (durée totale d'environ 90 minutes: 45 min pour l'injection de l'agent inflammatoire dans le système nerveux central, 30 min pour la mesure des propriétés contractiles du muscles et 15 min pour les prélèvements tissulaires).

Impact sur les animaux

La gestion du stress est un point essentiel à la bonne réalisation de cette expérimentation puisque celui-ci active directement l'axe corticotrope et donc la production de glucocorticoïdes. Même si aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu avant la procédure d'injection de l'agent inflammatoire dans la région centrale d'intérêt, nous mettrons tout en place afin de réduire au maximum le stress éventuel que pourraient subir les animaux. Pour cela, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) à compter de la date de réception dans l'animalerie (12 semaines). La mesure de force et les prélèvements tissulaires seront réalisés entre 12H00 et 72H00 après l'injection centrale de l'agent inflammatoire. Nous serons donc particulièrement vigilants pendant cette période à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 12H00 après l'injection, puis toutes les 12H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort de façon éthique au terme de chaque procédure.

Remplacement

Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.

Réduction

Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base d'un critère d'évaluation principal (concentration de corticostérone circulante). Cette stratégie statistique nous permet de déterminer au mieux le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de nos analyses. En fonction des plans expérimentaux, les effets biologiques seront déterminés par comparaison de 2 moyennes ou par comparaisons de plusieurs moyennes entre elles.

Raffinement

Le bien être animal est une préocupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (dômes et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Toutefois et afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) dès leur réception à l'âge de 12 semaines. Les prélèvements tissulaires seront réalisés entre 12H00 et 72H00 après l'injection centrale de l'agent inflammatoire. Même si aucune complication particulière n'est attendue, l'agent inflammatoire pourra être à l'origine d'une légère perte de poids et de masse musculaire (2 à 5%). Nous serons donc particulièrement vigilants pendant cette période à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 12H00 post-injection, puis toutes les 12H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.

Choix des espèces

La quasi-totalité des données dans le domaine de la cachexie associée au cancer a été obtenue chez la souris. Par ailleurs, l'ensemble des techniques nécessaires à la réalisation de ce projet a été développé chez la souris. En travaillant chez la souris, nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des données publiées dans le domaine et nous éviterons toute étape de mise au point préalable qu'aurait nécéssité l'utilisation d'un autre modèle animal. Les souris seront utilisés à l'âge de 15 semaines. Cela correspond à un stade de cachexie dans le modèle murin Apc. La mutation du gène Apc (adenomatous polyposis coli) provoque chez la souris une polypose rectocolique qui est associée à l'activation de l'axe corticotrope et au développement de la cachexie.

20 brebis adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes mises à mort à différents temps du projet pour prélever le greffon. Chacune subit une opération cardiaque d'environ quatre heures sous circulation extracorporelle, pour recevoir une valve et un patch produits par des cellules humaines, puis des échographies sous anesthésie et des mesures de pression par cathéter, avec des risques de troubles du rythme, d'hémorragie, d'infection et de calcification de la valve. Les quatre premières brebis opérées sont suivies une semaine, pour vérifier la faisabilité d'une reconstruction que le porteur qualifie de "très complexe", avant l'implantation des seize autres, suivies 8 à 16 semaines, en vue de traiter un jour la tétralogie de Fallot, une malformation cardiaque du nouveau-né. Pour justifier le choix du mouton, le porteur écarte les souris et les rats, "trop petits", et les primates, "trop chers et/ou éthiquement difficiles d'accès".

Objectifs

La tétralogie de Fallot est une malformation cardiaque très fréquente chez les nouveau-nés. Elle peut être corrigée grâce à une réparation chirurgicale qui consiste à fermer la communication interventriculaire et à élargir la voie de sortie pulmonaire du ventricule droit. Cette approche engendre obligatoirement une fuite valvulaire pulmonaire qui doit être réparée. Des patchs synthétiques ou biologiques provenant d’animaux et traités chimiquement ont pu être utilisés pour limiter cette fuite. Néanmoins, ils se sont révélés inefficaces à court et moyen termes et peuvent être associés à des complications postopératoires sévères. Un biomatériau complètement biologique sans traitement chimique produit par des cellules humaines et pouvant potentiellement grandir avec le patient a été développé par notre équipe. Afin d'envisager une application en clinique, il est nécessaire d’évaluer, à court terme et moyen terme, la réponse immunitaire de l'implantation du biomatériau dans l'organisme entier. Ceci ne peut être réalisé qu'en utilisant un modèle animal ayant une physiologie et une anatomie proche de l'Homme. Une implantation dans un modèle de gros animal est donc indispensable pour évaluer la réponse immunitaire et le remodelage in vivo à long terme des produits d’ingénierie tissulaire. Un total de 20 ovins sera inclus dans le projet. Ainsi, l’objectif général de ce travail est d’étudier l’efficacité et la réaction immunitaire innée et adaptative à court terme de biomatériau développé au laboratoire (valve et patch trans-annulaire biologique) dans un contexte de greffe pour une correction chirurgicale de la tétralogie de Fallot.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'une part de valider l’efficacité à court/moyen terme de notre valve, sur le phénomène de régurgitation pulmonaire (phénomène qui se produit lorsque la valvule pulmonaire ne se referme pas correctement : le ventricule droit pousse le sang dans l'artère pulmonaire vers les poumons, où il peut être oxygéné mais lorsque la valvule pulmonaire ne se referme pas complètement, du sang peut refluer des poumons au cœur) qui peut avoir des conséquences dramatiques sur le patient et d'autre part de mettre en évidence la faible réponse immunitaire à court terme de l’hôte suite à l’implantation de notre tissu. Ces résultats permettront d’envisager la réalisation d’une étude à plus long terme (jusqu’à 1 an) pour évaluer le remodelage et l’intégration du greffon avec le tissu de l’hôte. Dans l'objectif, à terme de pouvoir proposer le biomatériau dans la prise en charge de la tétralogie de Fallot chez l'Homme.

Procédures

Au cours de la procédure, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale qui est réalisée sous anesthésie générale avec la mise en place d’une circulation extracorporelle. Une correction chirurgicale sera réalisée au niveau de la voie de sortie pulmonaire. Cette intervention durera environ 4 heures par animal. L'opération est réalisée selon le protocole mis en place pour une opération chez l'Homme. Bien que le procédé d’implantation soit maîtrisé par le chirurgien, la reconstruction chirurgicale qui sera réalisée est très complexe. Ainsi, un groupe « test » composé de 4 animaux seront implanté et suivi pour 1 semaine. Les animaux des groupes expérimentaux seront suivis dans le temps (pour une durée de 8 à 16 semaines en fonction du lot). Ses animaux seront suivis par échographie sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux. Ce suivi permet une surveillance très efficace, en parallèle du suivi quotidien des animaux par le personnel de l'animalerie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels se situent principalement lors de la réalisation de la procédure chirurgicale. Les effets indésirables lors de l'opération peuvent être : troubles du rythme cardiaque et hémorragie. La pose des cathéters pour la mesure des pressions ventriculaire et artériel est mini-invasive et les effets indésirables associés sont les mêmes que l’opération : trouble du rythme cardiaque et hémorragie. Les suivis par échographie ou par IRM, réalisés sous anesthésie générale, sont non-invasifs et indolores pour l'animal. Les effets indésirables post-opératoires peuvent être : infection du site opératoire, occlusion du drain empêchant le bon drainage thoracique, hémorragie, calcification de la valve. Un suivi particulier lors de premiers jours sera fait par le personnel afin d'identifier tous les effets indésirables éventuels. Lors de la phase de suivi et d'hébergement, suite à la cicatrisation du site opératoire, il ne devrait pas y avoir de complication supplémentaire. En outre, le première groupe « test » à court terme (1 semaine) nous permettra d’identifier les effets indésirables et de nous assurer de la faisabilité, la reproductibilité et l’efficacité de notre correction chirurgicale avant d’implanter un plus grand nombre d’animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à différents temps du projet afin de pouvoir réaliser les analyses permettant de répondre à l'objectif scientifique de l'étude . La réponse immunitaire ainsi que le remodelage des greffes par les cellules de l’hôte seront étudiés par des analyses histologiques. Cette étape nécessitant le prélèvement du matériau préalablement implanté, la mise à mort de celui-ci est inévitable.

Remplacement

Bien qu’un modèle de valve humaine puisse être largement étudié in vitro, son étude in vivo reste limitée aux modèles animaux immunodéficients ou immunosupprimés trop petits (souris ou rats), trop chers et/ou éthiquement difficiles d’accès (primates). Il n’est pas donc possible de remplacer l’utilisation d’animaux. En effet, l’objectif du projet est d’évaluer la réponse immunitaire et l’intégration du biomatériau dans l’organisme entier afin d’envisager à terme une utilisation chez les patients.

Réduction

Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. Vingt brebis seront incluses dans le projet selon différentes modalités d'étude considérant qu’un animal possède une seule valve pulmonaire et que par conséquent une condition sera implantée par animal.

Raffinement

Le raffinement sera pris en compte tout au long du projet. Le projet est mis en place dans des locaux agréés, avec du personnel dédié et expérimenté. De l’enrichissement est mis en place pour répondre au besoin des animaux (pierre à sel, foin, hébergement en groupe sociaux…). Un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie est mis en place et le bien- être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié. Si nécessaire des actions adaptées pourront être mises en oeuvre sous l'avis vétérinaire.

Choix des espèces

Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité du biomatériau étudié. Le modèle ovin a été choisi, car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine cardiovasculaire. De plus, d’après nos études menées, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets cellulaires qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes. À ce stade, les brebis possèdent un système immunitaire et un système cardiovasculaire matures.

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections hebdomadaires de busulfan et d'inhibiteurs du protéasome, des anticancéreux, sont suivis par échocardiographie sous anesthésie, puis subissent un cathétérisme cardiaque terminal avant prélèvement du cœur et des poumons, pour étudier une hypertension artérielle pulmonaire d'origine médicamenteuse. Le porteur décrit des effets fonctionnels faibles et une "dyspnée légère" tout en classant les procédures en gravité sévère. Il qualifie le modèle chez le rat d'"incontournable" et le recours aux animaux d'"indispensable", tout en menant des expériences parallèles sur cellules humaines.

Objectifs

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie mortelle affectant l’arbre vasculaire pulmonaire. L’HTAP peut se développer sans cause connue (HTAP idiopathique) ou peut être secondaire à des médicaments ou des toxiques (HTAP iatrogène). La liste des médicaments ou toxiques est constamment mise à jour et classifie les substances comme définitivement ou possiblement associées à de l’HTAP. Parmi ces substances le busulfan en tant qu’agent alkylant est classé comme potentiellement associés à l’HTAP et les inhibiteurs du protéasome (IP), le bortezomib et le carfilzomib n’ont pas été étudiés. Notre équipe a récemment identifié un signal fort provenant de ces molécules (travaux en cours de publication). Elles sont utilisées pour des pathologies hématologiques, notamment le myélome, et dans les conditionnements pré greffe de moelle. Les mécanismes entraînant le développement de l’HTAP après exposition à ces médicaments n’ont pas été étudiés. Les meilleurs modèles existant d’HTAP sont des modèles développés chez le rat, et miment parfaitement les caractéristiques hémodynamiques et morphologiques principales de la maladie humaine. C’est pourquoi créer des modèles d’HTAP iatrogène chez le rat est incontournable pour étudier l’effet de ces drogues sur le système cardiopulmonaire des malades. Il est en effet crucial de vérifier que ces drogues n’ont pas d’effets indésirables notamment sur le cœur et les poumons de ces animaux, qui sont très impactés par l’HTAP. Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des antalgiques. La pratique répétée d’échocardiographie nous permettra d’étudier la fonction cardiovasculaire de manière non invasive et de limiter le nombre d’animaux. L’utilisation simultanée des inhibiteurs du protéasome associée au busulfan nous permet d’une part de reproduire de manière fidèle les traitements reçus par les patients mais aussi de limiter le nombre d’animaux. Après traitement, un cathétérisme cardiaque et l'euthanasie seront réalisés sous anesthésie générale, suivi du prélèvement des tissus . Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Le nombre total de rats utilisés sera de 168 sur l’ensemble de l’étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal.

Bénéfices attendus

L’HTAP est une cause de handicap, d’insuffisance cardiaque et de mort. Au vu de l’absence d’identification des mécanismes expliquant le développement de l’HTAP chez les patients exposés à ces médicaments, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une échocardiographie hebdomadaire, sous anesthésie générale et 1 à 2 injections sous cutanées hebdomadaires sous anesthésie générale. Le projet soumis prévoit de sacrifier les animaux au bout de 6 semaines. Cependant, les échocardiographies hebdomadaires permettront de suivre l’évolution des paramètres cardiovasculaires des animaux et d’adapter si nécessaire la durée du protocole (diminution ou augmentation du nombre de semaines de suivi). A la fin du protocole les animaux seront soumis à un cathétérisme cardiaque droit, sous anesthésie générale. L'échocardiographie se fera de paire avec la 2ème injection le cas échéant, cette manipulation durera 10 minutes. Les injections se faisant en intrapéritonéale dureront moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Induction d'une toxicité vasculaire pulmonaire n'entrainant pas ou peu de retentissement fonctionnel. Possible dyspnée légère.

Devenir

Après réalisation du cathétérisme les organes d'intérêt que sont le coeur et les poumons vont être prélevés, leurs études sont indispensables à la compréhension des mécanismes sous-jacents au développement de l'HTAP.

Remplacement

L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire après exposition médicamenteuse. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction ventriculaire droite, la réactivité vasculaire, l'histologie pulmonaire dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une HTAP puis d'une insuffisance cardiaque droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe. Cependant, autant que faire se peut, les expériences se feront parallèlement sur cellules vasculaires pulmonaires humaines afin de limiter au maximum le recours aux animaux. Ces cellules primaires sont générées dans notre hopital, référent en ile de france de la transplantation pulmonaire des patients souffrant d'HTAP.

Réduction

La surveillance échocardiographique hebdomadaire permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés au travers d’études longitudinales où chaque animal devient son propre contrôle. Afin de réduire encore le nombre d'animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme permettant d'évaluer leur fonction cardiaque et les tissus prélevés seront partagés. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Les calculs de puissance ont été faits en amont de la manipulation pour réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude et les tests statistiques ad hoc seront utilisés pour analyser les résultats et identifier les différences attendues le cas échéant.

Raffinement

Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des antalgiques. Certaines expériences pourront être réalisées sur tissus pulmonaires solés. A la fin des expérimentations, les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages d'animaux. Ceux-ci seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. Les échographies de suivi prévues dans la procédure permettent de suivre le stade de l’insuffisance cardiaque qui peut survenir dans l'HTAP et de décider de l'euthanasie des rats avec une fonction cardiaque altérée.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire pulmonaire et des caractéristiques hémodynamiques semblables à celle de l'homme. Notre équipe travaille en routine avec des modèles murins d'hypertension artérielle pulmonaire, nous avons donc l'expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Nous allons travailler avec des rats de souches Wistar. Les animaux utilisés sont de jeunes rats (6 à 8 semaines, 100 g), l'induction de l'HTAP est connue pour être plus sévère à cet âge où le système vasculaire pulmonaire est en croissance.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque rat est irradié à la mâchoire, subit une extraction de molaire puis une exérèse d'os mandibulaire, plusieurs scanners et l'implantation d'une pompe à antalgiques, ce qui provoque des douleurs et des difficultés à s'alimenter et à ronger, ses incisives étant recoupées à chaque anesthésie. Le projet teste un biomatériau composite destiné à réparer l'os après une ostéoradionécrose de la mâchoire. Le porteur affirme qu'"il n'est pas possible de se passer d'animaux" avant un éventuel essai chez l'humain.

Objectifs

Evaluer l'efficacité d'un biomatériau composite innovant sur la formation osseuse dans le cadre du traitement d'ostéoradionécrose mandibulaire.

Bénéfices attendus

Première preuve in vivo de l'efficacité de ce biomatériau composite innovant dans le traitement de l'ostéoradionécrose. Perfectionnement du modèle animal d'ostéradionécrose chez le rongeur.

Procédures

Les interventions suivantes seront effectuées : - irradiation (sous anesthésie générale, durée estimée inférieure à 60 min) - implantation de mini-pompe pour diffusion d'antalgiques (au cours de chaque anesthésie générale, durée estimée inférieure à 30 min) - chirurgie d'extraction de molaire (sous anesthésie générale, avec prélèvement sanguin, durée estimée inférieure à 30 min) - chirurgie d'exérèse d'os mandibulaire pathologique (sous anesthésie générale, avec prélèvement sanguin, durée estimée inférieure à 30 min) - scanners à J28, M2, M3, M4, M5 (sous anesthésie générale, durée estimée inférieure à 15 min) - prélèvement sanguin et mise à mort (sous anesthésie générale, durée estimée inférieure à 10 min)

Impact sur les animaux

Douleurs, difficultés à l'alimentation, difficulté au rongeage.

Devenir

Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse, présence d'ostéoradionécrose).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature.

Raffinement

Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (pompes à morphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès ad libidum à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée à la règlementation à savoir un compartiment minimal de 800cm² par animal. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Les incisives seront recoupées lors de chaque anesthésie générale pour compenser le fait que le rongeage sera potentiellement douloureux. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car une analyse de la régénération osseuse au microscope est nécessaire (autopsie).

Choix des espèces

Rats Lewis (LEW/OrlR) mâles de 400 grammes sexuellement matures pour plus de robustesse et pour faciliter la chirurgie (mandibule plus grande). Modèle animal d'ostéoradionécrose mandibulaire (irradiation et extraction de molaire) déjà utilisé par l'équipe porteuse du projet pour tester l'efficacité d'un autre biomatériau. Modèle animal fiable et robuste pour cette pathologie (déjà publié dans la littérature).

2 000 souris et 2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections intradermiques de collagène pour déclencher une polyarthrite, avec gonflements articulaires, difficultés locomotrices et perte de poids pouvant atteindre 15 %. Le projet teste des molécules candidates présélectionnées in vitro contre la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "nécessaire" car les modèles cellulaires ne reproduiraient pas tous les processus in vivo de l'atteinte articulaire.

Objectifs

L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique ou prophylactique de composés chimiques ou biologiques dans un modèle d’arthrite rhumatoïde. Cette maladie des articulations évolue par poussées inflammatoires de durée et d’intensité variables pour gagner progressivement de nouvelles articulations. Elle provoque des gonflements et des douleurs notamment au niveau des mains, des poignets, des genoux et des petites articulations des pieds. Avec le temps, les épaules, les coudes, la nuque, les mâchoires, les hanches et les chevilles peuvent être touchés. Dans 20 à 30% des cas, l’inflammation provoque la dégradation progressive du cartilage et de l’os des articulations touchées, et entraîne leur déformation. En l’absence de traitement et sous ses formes les plus graves, la maladie peut être responsable de handicaps au bout d’une dizaine d’années. Il existe à l’heure actuelle des traitements permettant de contrôler l’inflammation et l’évolution de la maladie sur le long terme (Méthotrexate, Léflunomide, Hydroxychloroquine, Azathioprine, Sulfalazine, anti-TNF, anti-IL-6). Ces médicaments présentent des effets secondaires sérieux comme la réduction des défenses immunitaires contre certaines infections. De plus, 30% des patients ne répondent pas aux traitements, et les malades rechutent rapidement dès l’interruption du traitement. Afin de caractériser de nouveaux candidats médicaments, un modèle animal de polyarthrite rhumatoïde est nécessaire pour recréer les phases d’inflammation et de destruction du cartilage et de l’os, car les modèles cellulaires in vitro ne récapitulent pas tous les processus mis en place in vivo lors de l’atteinte de l’articulation, avec l’implication de différents types cellulaires au cours du temps. Ce projet visera à évaluer de nouveaux composés chimiques ou biologiques. Ceux-ci seront pré-sélectionnés in vitro sur des critères d’efficacité, et in vivo sur des paramètres pharmacocinétiques, afin de limiter le nombre de produits à tester dans le modèle animal de la pathologie. Ils seront testés en mode préventif pour mesurer leur capacité à empêcher l’apparition des symptômes, ou en mode thérapeutique pour déterminer leur efficacité sur la progression de la maladie et l’atteinte osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’arthrite rhumatoïde. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques ou prophylactiques pour cette maladie.

Procédures

Eventuels traitements préventifs à partir du Jour -3 avant induction, ou thérapeutique dès l’apparition des signes cliniques, avec le composé biologique ou chimique à tester sous différentes voies d’administration (IP – ID – SC – PO – IM) – IM et ID sous anesthésie gazeuse avec buprénorphine (anesthésie environ 1h, traitements au maximum 3 fois par jour). Jour 0 : Injection sous cutanée de Buprénorphine à 0.1 mg/kg pour les souris, 0.05mg/kg pour les rats (acte de 5 minutes) Anesthésie Isoflurane et tonte et désinfection de la zone d’injection à la base de la queue Administration intradermale du collagène de type II (protéine préparée en adjuvant complet de Freund) (anesthésie environ 1 heure). Jour 18 : Anesthésie Isoflurane et tonte et désinfection de la zone d’injection à la base de la queue Administration intradermale très lente du collagène de type II (protéine préparée en adjuvant incomplet de Freund) (anesthésie environ 1 heure). Pesée des animaux : tous les 2/3 jours puis tous les jours dès l’induction (prend environ 5 minutes par animal). Scoring clinique tous les jours après induction. Mesure de l’épaisseur des pattes au minimum 2 fois par semaine, au maximum 1 fois par jour (prend environ 10 minutes). Analyses : Une scanographie optionnelle sous anesthésie Isoflurane pour visualiser l’atteinte des articulations au niveau des pattes. Celle-ci impliquera un transport des animaux sur un second site (anesthésie environ 2h) Prélèvements sanguins et urinaires optionnels durant l’étude si besoin de mesurer le taux de produit circulant ou autres biomarqueurs (sous anesthésie, environ 1h, maximum 1 prélèvement par jour, dans le respect des volumes de prélèvement recommandés). Fin d’étude Anesthésie des animaux sous Isoflurane (1h maximum) Prélèvement éventuel de sang par voie intracardiaque ou jugulaire (pour dosage de composé et autres paramètres sanguins/plasmatiques) Euthanasie des animaux Prélèvement des pattes (et tout autre tissu si besoin) pour analyse histologique et scanographie ex vivo

Impact sur les animaux

Dans ce modèle d’arthrite rhumatoïde, nous nous attendons à observer des signes d’inflammation (rougeur, gonflement) au niveau de certaines articulations des animaux, en particulier les tarses. Nous nous attendons aussi à des pertes de poids du fait de l’inflammation, pouvant atteindre 15%. Par ailleurs, les animaux pourraient présenter des difficultés locomotrices. Des stratégies de limitation de ces nuisances seront mises en place : nourriture et eau gélifiées au fond de la cage, pesées quotidiennes, réhydratation sous cutanée si nécessaire (en cas de perte de poids de plus de 10%), scoring de douleur quotidien des animaux et administration d’un traitement antalgique si nécessaire, points limites adaptés au modèle (voir détails plus bas).

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes, de membres et de grands volumes de sang.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Chez la souris et le rat, dans ce modèle, un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (score d’inflammation des tarses). Ce nombre pourra monter jusqu’à 12 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (analyse histologique ou imagerie, dosages cytokiniques).

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine avant induction de la maladie et une fois par jour à partir de l’induction de la maladie. • Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés en sous-cutané avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. • Entre 15 et 20% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, deux fois par jour. Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront systématiquement placés au fond de la cage à partir de l’induction. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Une grille de scoring de douleur et d’état général est mise en place pour évaluer la nécessité d’administrer un traitement antalgique et l’atteinte des points limites. Cette grille et les points limites sont listés dans la procédure. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation. Si les signes persistent, une décision de suivi ou d’euthanasie devra être prise. Le fait de ne pas sacrifier l’animal qui a atteint le point limite doit être argumenté et justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction d’arthrite rhumatoïde et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. Un enrichissement supplémentaire de nidification sera ajouté pour améliorer le confort des animaux.

Choix des espèces

La souris mâle DBA/1J et le rat Lewis ou Wistar femelle seront privilégiés pour le modèle d’arthrite rhumatoïde car le modèle est bien décrit et documenté dans la littérature avec ces souches et sexes en particulier. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum).

600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, des séances de radiothérapie et des IRM répétées sous anesthésie, et peut développer selon le porteur des troubles neurologiques terminaux, convulsions, perte d'appétit et troubles du mouvement liés à la tumeur, avec un suivi de survie pouvant atteindre six mois pour certains. Les animaux sont mis à mort au point limite, notamment à une perte de 20 % du poids, pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que seule l'étude sur organisme vivant reflète les interactions entre tissu sain et tumeur et retient souris et rats pour la reproductibilité des modèles tumoraux.

Objectifs

Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 14 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. Notre projet s’inscrit dans ce contexte en utilisant une source de rayons X très particulière et encore expérimentale, de basse énergie mais de haut flux, permettant (i) de sélectionner au mieux les énergies étudiées (ii) de faire un microfractionnement spatial de la dose. Ces deux spécificités ne sont pas techniquement possibles sur les sources classiques hospitalières à l’heure actuelle. Le potentiel de cette technique a été étudié depuis une vingtaine d’années déjà, selon différentes approches : simulation Monte Carlo, dosimétrie expérimentale, irradiation de cellules en culture. Ces approches bien qu’indispensables restent très limitées car elles ne prennent pas en compte la complexité du tissu tumoral, se développant de façon autonome, possédant sa propre vascularisation etc. L’objectif de notre projet vise à tester les modalités d’imagerie (diagnostique) et les modalités d’irradiation (géométrie, balistique, dose) sur des tumeurs proches des tumeurs humaines grâce à l’utilisation de modèles précliniques de rongeurs porteurs de tumeurs (souris et rats). Ce projet portant sur la physiologie tumorale, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'acquérir un ensemble de données précliniques de haute qualité sur des animaux porteurs de tumeurs cérébrales pour des protocoles de radiothérapie. Les études réalisées pendant les 5 ans du projet permettront d’élargir nos connaissances sur les réponses biologiques du tissu tumoral et du tissu sain exposés aux radiations, d’évaluer le rôle du microenvironnement tumoral par rapport à l’efficacité du traitement, d’analyser les effets des rayonnements sur la vascularisation tumorale et saine, sur le comportement des animaux, etc. L'objectif est également de pouvoir proposer un schéma d'irradiation optimal (nombre d'incidences, dose, géométrie) avec une préservation efficace des tissus sains pour un transfert réaliste vers un essai clinique.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : implantation de cellules tumorales par chirurgie stéréotaxique intracérébrale sous anesthésie générale et locale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; 2 types de radiothérapies sous anesthésie générale, sur 500 animaux (250 rats, 250 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; imagerie par resonnance magnetique sous anesthésie générale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), 3 à 4 fois par animal, pendant environ 1 heure

Impact sur les animaux

Le changement d'environnement et le transport des animaux de l'animalerie jusqu'au lieu d'irradiation représente du stress et de l'angoisse. La procédure de radiothérapie n'induit pas de douleur mais du stress et de l'angoisse. L'inoculation tumorale répresente une douleur locale et du stress. Il peut y avoir l’apparition de troubles neurologiques dus à l'effet de masse induit par la tumeur en phase terminale, c'est-à-dire à partir de 2 semaines après l'implantation (troubles du mouvement, perte d'appétit, convulsions). Cependant, nous nous attendons à la prévention de ces symptômes grâce à la réduction du volume tumoral après la radiothérapie. Dans des rares cas la radiothérapie elle-même peut induire une léthargie, une perte d'appétit ou des convulsions. Une alopécie et, plus rarement, une dermatite radio-induite transitoire peuvent apparaitre dans le champ d'irradiation environ 2 semaines après l'exposition. La procédure d’imagerie implique du stress pour les animaux et l’injection de l’agent de contraste induit une douleur locale.

Devenir

A la fin de cette procédure, tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de cerveaux.

Remplacement

La thérapie anticancéreuse a pour but d’éradiquer la tumeur ou de ralentir sa croissance tout en préservant au maximum les tissus sains avoisinants. La seule alternative aux études animales est l’étude in vitro (cellules). Cependant, il est impossible d'étudier la réponse tumorale et les effets secondaires sur la fonction cérébrale, l'irradiation de la peau et des os du crâne avec des expériences in vitro. En effet, l’appréciation de l’efficacité d’une technique de thérapie anticancéreuse nécessite le passage par un organisme vivant, reflétant la complexité des interactions entre le tissu sain et le tissu tumoral, la présence d’une vascularisation tumorale et d’un système immunitaire, le microenvironnement tumoral et l’index thérapeutique. Les modèles de tumeurs les plus reproductibles et à croissance rapide ont été développés chez les rongeurs. L’un des outils permettant de mesurer l’efficacité thérapeutique est l’établissement de courbes de suivi long terme permettant de calculer des moyennes et médiane de survie. Parallèlement, certains animaux sont sacrifiés à temps fixes pour la réalisation d’études visant à obtenir une ‘image’ de la tumeur ou de l’organe à un moment donné afin d’appréhender les interactions rayonnement-matière spécifiques de la technique.

Réduction

Pour le calcul du nombre d'animaux, il faut prendre en considération la variabilité intra- et inter-tumorale pour une population de rongeurs implantés suivant un même protocole. La réduction du nombre d’animaux porte en fait sur une implantation commune des animaux contrôles (animaux portant une tumeur mais ne subissant pas de thérapie) pour plusieurs expériences lorsque la programmation des expériences d’irradiation le permet. Tous les groupes seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés et reconnus pour chaque étude. Nos précédentes expériences montrent qu’un nombre d’animaux de 7-8 animaux suffit à obtenir des résultats robustes. Nous prévoyons donc des groupes d’animaux n=10 du aux problèmes éventuels rencontrés durant les différentes étapes de l’expérience. Ce calcul mène à utiliser 60 animaux par expérience, 2 expériences par an, sur 5 ans, 600 animaux au total.

Raffinement

Les animaux arrivent à l’animalerie une semaine avant l’implantation tumorale pour acclimatation et seront hébergés en groupes. Si possible, ils sont hébergés dans des grandes cages. Nous utiliserons la procédure d’enrichissement définie par le SBEA et l’animalerie. Nous allons réduire le stress du transport par une manipulation prudente, la mise à disposition d'hydrogel et un transport d'animaux groupés en cage filtrée. Afin de réduire le stress et la douleur des procédures chirurgicales, de l’imagerie et de la radiothérapie, ces procédures sont réalisées sous anesthésie soit (i) par inhalation (ii) soit par induction gazeuse suivie d’une injection intrapéritonéale d’un mélange d'anesthésiques/antalgiques et d’une injection sous-cutanée d'un anesthésique local au-dessus du site d’implantation des cellules tumorales. Une injection postopératoire d'antalgique sera administrée lors de l’implantation tumorale. Les animaux sont observés quotidiennement par le responsable du projet après chaque procédure et seront hébergés en cage isolée dès que les premiers signes cliniques apparaissent (perte d'appétit, perte de poids, prostration, convulsions). Les animaux disposent alors de nourriture humide à l’assiette et/ou d’un aliment riche en nutriment (« boost »). L'administration d'antalgiques sera considérée pour soulager la douleur (décision prise par le responsable du projet). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés (examen clinique (EC) 2 fois par jour après chaque procédure et en cas de symptômes cliniques, EC quotidien pendant les 3 premières semaines post irradiation en cas de bonne santé générale, ensuite EC un jour sur 2 ou 3 en cas de bonne santé générale jusqu'à la mis à mort). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux sont mis à mort quand les points limites, definis dans la grille de symptômes, sont atteints. Ceux ci comprennent l'apparition de symptômes cliniques (troubles neurologiques, prostration, anorexie, manque de toilettage) et une perte de poids de 20% de leur poids maximal.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur de plus petits nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez la souris et le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante des irradiations comparables à nos expériences. Les souris sont favorisée d'un point de vue économique, elles sont adaptées à notre installation et peuvent être manipulées et hébergées facilement. Les rats sont importants dans notre cas, car du fait de leur taille plus importante, les irradiations et la dosimétrie sont plus faciles à mettre en oeuvre de façon fiable et reproductible. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons sont bien adaptées pour étudier les effets de la radiothérapie sur le microenvironnement tumoral. Nous validerons nos protocoles d'irradiations (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) chez 2 espèces d'animaux et plusieurs modèles tumoraux différents, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Les animaux sont utilisés entre 4 à 12 semaines après la naissance (4 à 8 semaines pour les souris, 8 à 12 semaines pour les rats), ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés mais néanmoins disponibles en plus grande série chez les éleveurs agréés. Les modèles tumoraux ont été développés dans les animaux à cet âge quand le cerveau est encore en cours de développement, ce qui nous mène à choisir le même stade de développement pour rester reproductible dans nos résultats. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficile à gérer en animalerie. Enfin, les courbes de suivi long terme durent environ 6 mois (pour certains animaux seulement), justifiant aussi l’utilisation de cette tranche d’âge.