Procédures sévères
Etude de l’impact de deux protéines dans le développement des maladies rénales inflammatoires et rôle des anticorps de ces maladies.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
452 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 312 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer des protéines humaines, elles reçoivent des injections d'anticorps et de traitements, des prélèvements d'urine et des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever les reins. Le porteur qualifie l'impact de "modéré" et la maladie rénale de "très légère", ce qui contraste avec les 312 animaux classés en gravité sévère. Il affirme que les conditions de la circulation sanguine ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Objectifs
L’inflammation chronique induite lors des maladies rénales détruit les vaisseaux qui filtrent le sang et affecte les fonctions rénales. De nouveaux médicaments doivent être trouvés car les traitements actuels sont associés à une forte mortalité. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre l'évolution des maladies inflammatoires rénales pour développer de nouveaux médicaments à l'aide de modèles animaux. Ceux-ci nous permettront d’étudier les cellules et les molécules qui favorisent le développement de l'inflammation dans ces maladies rénales. Notre modèle reproduit une maladie rénale humaine, qui est fatale si elle n'est pas traitée. Nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris exprimant des protéines humaines qui seraient importantes au cours des maladies rénales humaines. Une lignées de souris exprime les récepteurs humains aux anticorps, ce qui en fait un modèle unique pour étudier le rôle des anticorps dans la maladie rénale. La seconde lignée expriment la protéinase 3 (PR3) humaine, une protéine qui pourrait favoriser l'inflammation lors de la maladie rénale. Ces deux protéines humaines semblent impliquées dans le développement de la maladie rénale chez l'Homme, cependant, à ce jour ceci n'a pas été démontré. Notre étude permettra de mieux comprendre le rôle de ces deux protéines dans le développement des maladies rénales inflammatoires humaines.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples: 1- mieux comprendre le role de deux protéines humaines dans le développement de maladies inflammatoires rénales chez l'homme. 2- cibler les conséquences de l'activité de ces protéines au cours de la maladie pour améliorer la santé des patients. 3- Proposer de nouvelles pistes pour le développement de médicaments plus spécifiques ayant moins d'effets secondaires.
Procédures
Nous effectuerons des prélèvements d'urines à l'aide d'un dispositif de collecte (pendant la nuit) permettant de ne pas changer les animaux d'environnement (adaptation à la cage), et les animaux recevront une injection de liquide contenant les anticorps dans une veine (5 minutes); cette injection se fera au niveau de la queue sur animal vigile. 3 injections dans l'abdomen seront effectuées par semaine, pendant 2 semaines (3 x 2 minutes) pour les traitements pharmacologiques. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront effectués à intervalles réguliers pendant 2 semaines (5 min par prélèvement). Les prélèvements seront effectués sous l'oeil ou au niveau de la mandibule. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de chaque procédure afin d'étudier les organes d'intérêts avec différentes techniques.
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental est censé avoir un effet modéré sur le bien-être de l'animal. Cette maladie rénale est très légère, l'animal va uriner des protéines qui devraient être retenu par le rein. Afin d'étudier la maladie, les animaux seront placés dans un dispositif qui permet de collecter les urines pendant la nuit, donc les animaux seront contraints mais grâce au système que nous avons développé, ils ne seront pas isolés socialement. Les cycles d'anesthésie et de prélèvements sanguins pourraient fatiguer les animaux. L'inflammation chronique entraine une légère perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à différents temps et les reins seront prélevés afin d’étudier l’évolution de la maladie rénale et l’effet des différents traitements.
Remplacement
Les pièces opératoires (biopsies rénales) chez l’homme sont limitées en nombre et en nature (petite quantité de tissu, une seule biopsie/patient). De plus, l'étude des cellules, de la fonction des protéines humaines d'intérêt sur l’inflammation et les fonctions rénales nécessite la présence des conditions mécaniques et fluidiques caractéristiques de la circulation. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro. C'est pourquoi notre étude nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux au strict minimum, tout en garantissant l'obtention de résultats fiables, une étude statistique a permis de déterminer que 10-12 animaux/groupe seraient nécessaires pour obtenir une différence statistiquement significative entre 2 groupes.
Raffinement
La prise en charge d’une éventuelle douleur s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi clinique de 5 jours par semaine avec la mise en place de points limités évalués à l’aide d’une grille de score. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour, jusqu'à ce que les signes de douleur disparraissent. Si les signes de douleurs persistent au-delà de 48 heures, les animaux seront euthanasiés. Une phase de préparation aux collectes d'urine d'une semaine sera effectuée préalablement aux expérimentations afin de réduire le stress des animaux. Nous avons développé un système de collecte d'urine qui permet de garder les animaux dans leur environemment social. Afin de réduire le stress, les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie. Afin de prévenir la douleur, les prélèvements sanguins seront effectués en alternant les sites de prélèvement.
Choix des espèces
Le modèle murin de maladie rénale inflammatoire que nous utiliserons est préférable aux modèles utilisant d'autres animaux dans le cas de ce projet car : -Ce modèle est déjà en place dans notre laboratoire -Les souches génétiquement modifiées que nous souhaitons utiliser sont murines. -Les outils pour étudier ce modèle murin sont très développés. -Ce modèle a servi de support d’étude pour l’exploration des mécanismes inflammatoires impliqués dans le développement de maladies inflammatoires chroniques. Les souris (mâles et femelles) utilisées auront 10-12 semaines : âge adulte, développement des organes arrivé à terme.
Evaluation de l’efficacité anti-tumorale de petites molécules ciblant une protéine de survie des cellules cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
1 178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses dans le flanc, les mamelles ou le sang, puis une injection quotidienne de molécules dans l'abdomen cinq jours par semaine pendant trois à six semaines, avec prélèvements sanguins réguliers. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une paralysie des membres et une perte de poids, et que les injections répétées causent une douleur au site. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour étudier l'effet des traitements sur un organisme entier.
Objectifs
Les cellules cancéreuses endurent de nombreux stress et dommages qui menacent leur survie. Pour résister à la mort cellulaire, elles inhibent les mécanismes de mort, augmentent l'action des facteurs de survie ou effectuent ces deux actions simultanément. Une des protéines de survie récemment identifiées est exprimée très fortement dans la plupart des cellules cancéreuses, leur conférant une résistance aux agents anticancéreux. Cette protéine pourrait donc constituer une cible thérapeutique intéressante. Nous avons développé et optimisé une série de petites molécules capables d’empêcher l’action protectrice de cette protéine in vitro. Il est maintenant nécessaire de poursuivre l’évaluation de ces petites molécules en tant qu’agents thérapeutiques à l’aide de modèles animaux de différents cancers (cancer du sang, de la peau, du sein, du poumon notamment).
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre l’évaluation de petites molécules ayant un potentiel thérapeutique dans le traitement des cancers. En raison de la stratégie originale mise en place pour développer ces molécules et sur leur mode d’action, les bénéfices de ce projet à long terme seraient de proposer une alternative thérapeutique efficace et mieux tolérée par les patients les plus fragiles car ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, nous vérifierons que les petites molécules ayant un potentiel thérapeutique n’ont pas d’effet toxique. Pour cela nous injecterons la petite molécule dans l’abdomen de la souris femelle une seule fois ou une fois par jour pendant 5 jours (injection d’une durée de 10 secondes réalisée sur souris éveillée) et les souris seront surveillées pendant 2 semaines avant d’être euthanasiées. Puis nous vérifierons que la durée de vie dans l’organisme est suffisant pour exercer leurs actions. Pour cela, les petites molécules seront injectées dans la veine de la queue (souris éveillée, durée de l’injection 30 secondes). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps (entre 10 min et 3h après l'injection des petites molécules; soit 5 prélèvements au niveau de la veine de la joue, sur souris éveillée, d’une durée de 10 secondes). Le potentiel thérapeutique de ces petites molécules sera évalué sur différents modèles de cancer. Pour cela, nous mettrons dans un premier temps en place ces modèles en injectant les cellules cancéreuses soit par voie intra-veineuse (dans la veine de la queue de souris éveillée, d’une durée de 30 secondes) soit sous la peau au niveau du flanc (injection sur souris anesthésiée, d’une durée d’une minute), soit dans les mamelles (injection sur souris anesthésiée, d’une durée d’une minute). Quel que soit le modèle utilisé, le protocole thérapeutique consistera à injecter les petites molécules dans l’abdomen des souris éveillées 5 jours par semaine pendant 3 à 6 semaines. Le suivi impliquera des prélèvements de sang hebdomadaire sur toute la durée du protocole (sur souris éveillée, d’une durée de 10 secondes) et de la mesure de la tumeur lorsque celle-ci est apparente (mesure au pied à coulisse sur souris éveillée, d’une durée de 30 secondes).
Impact sur les animaux
L’injection des petites molécules thérapeutiques dans l'abdomen peut entrainer une douleur au site d’injection en particulier lorsque celle-ci sera répétée dans le temps (1 fois par jour, 5 jours/semaine, pendant 3 à 6 semaines). Comme tous les médicaments qui doivent entrainer la mort de certaines cellules, ils sont susceptibles d’avoir des effets indésirables pour le bien-être (perte de poids, diarrhée). La mise en place des différents modèles de cancer implique des injections. Dans le cas des injections sous la peau au niveau du flanc ou des mamelles, nous pourrons observer dans le temps un inconfort lié à la croissance de la tumeur (gène dans la locomotion des souris). L’injection dans le sang des cellules tumorales pourra également conduire à une douleur de l’animal au cours du temps (développement de la pathologie) avec apparition d’une paralysie des membres inférieurs notamment et/ou perte de poids. Les prélèvements sanguins pourront générer un stress transitoire de l’animal lié à sa manipulation.
Devenir
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure afin d’analyser de manière la plus exhaustive possible l’effet thérapeutiques des petites molécules (prélèvement du sang, des organes et des tissus cancéreux).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Une fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère pour laquelle de nombreux modèles de cancer sont déjà bien caractérisés. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes car les modèles de cancers sont bien établis dans ces conditions.
Equilibre excitation – inhibition et épilepsie dans le circuit hippocampique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie cérébrale avec injection intracérébrale et implantation d'électrodes, puis le déclenchement de crises d'épilepsie par un agent convulsivant, avant une mise à mort par perfusion transcardiaque. Le porteur décrit des crises pouvant atteindre le stade 5 de l'échelle de Racine, convulsion généralisée entraînant l'euthanasie de l'animal. Il justifie les bénéfices par un "intérêt sociétal considérable" et affirme que l'étude des circuits neuronaux ne peut se faire que sur l'animal.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle d'un type neuronal spécifique (interneurones médiateurs de l'inhibition périsomatique), dans le contrôle inhibiteur du circuit hippocampique dans les conditions physiologiques et dans l'épilepsie. L'efficacité de cette inhibition dépend directement de la concentration intracellulaire en ions chlorures. Plusieurs travaux in vitro suggèrent qu'un épisode aigu de crise pourrait affecter à plus ou moins long terme les systèmes d'homéostasie des ions chlorures dans les neurones hippocampiques, ce qui pourrait causer un déficit d'inhibition favorisant l'épileptogenèse. De plus, le diurétique bumétanide, qui module aussi l'homéostasie des ions chlorures dans les neurones in vitro, a été proposé comme approche thérapeutique potentielle. Grace à des méthodes d'électrophysiologie et d'optogénétique chez la souris, nous allons tester directement ces hypothèses in vivo.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies (en particulier l'épilepsie), ce qui représente un intérêt sociétal considérable.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs et implantation de miniatures pour enregistrement chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure de déclenchement de crises d'épilepsie par injection intracérébrale d'agent convulsivant, d'une durée de 2 à 5h, procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre, d'une durée d'1 à 6h (cycle comportemental complet, incluant une période de sommeil jusqu'au réveil), ou en mode tête-fixée, par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 2 à 4 semaines), procédure d'enregistrement sur l'animal anesthésié, d'une durée de 3 à 6h, et enfin anesthésie terminale (perfusion transcardiaque), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables suivants sont attendus : - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - l'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien être animal - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
Les fonctions des réseaux neuronaux sont assurées par leurs caractéristiques intrinsèques (connectivité précise entre multiples types neuronaux) autant qu'extrinsèques (interactions avec les autres régions cérébrales), ce qui impose le recours à des techniques invasives d'exploration. L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur l'animal.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques (moyenne et variance) par conséquent inconnus. D'après la littérature du domaine, un scénario plausible pour les variables que nous caractérisons est d'être en mesure de détecter une différence de 25% entre 2 échantillons de petite taille issus de distributions suivant une loi Normale dont l'écart type est d'environ 20% de la moyenne. l faut ainsi un échantillon de 10 animaux pour détecter avec une certitude de 95% (risque α de type I) et une puissance de 0.8 (risque β de type II) une différence de 25% entre 2 moyennes dont les distributions suivent une loi Normale (µ, σ=0.2µ). Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50%, est donc de 20 par lot expérimental. Toutefois, les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.
Raffinement
Les dommages en termes de souffrance animale sont minimisés par les conditions d'élevage (cages collectives et enrichies de carré de coton jusqu'à la chirurgie et autant que possible après), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie), le suivi régulier (quotidien dans les periodes péri-opératoires et après le déclenchement des crises) des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité). Les animaux sont étroitement surveillés lors de l'induction de l'épisode épileptique aigu, et des points limites spécifiques ont été définis selon l'échelle de Racine. Si l'animal atteint le stade 5 d’intensité des crises (convulsion motrice généralisée), l'animal est immédiatement anesthésié (inhalation d'isoflurane) et un anti-convulsivant est administré (Diazepam, 5mg/kg, 0.5ml/kg, IP). Si le stade 5 persiste au réveil de l'animal, il est mis à mort sans délai par dislocation cervicale sous anesthésie isoflurane. L'état de récupération dans les jours qui suivent l'état de crise est étroitement surveillé (alimentation, récupération comportementale). Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet. Le phénotype n'est pas dommageable pendant la période de latence (absence de crise) qui suit l'état épileptique aigu et qui dure 2 à 6 semaines selon les individus. Les enregistrements les plus tardifs sont réalisés dès l'apparition des crises spontanées (stade chronique), dont l'expression est vérifiée chaque jour, afin de minimiser la durée du phénotype épileptique subi par l'animal. Enfin, des points limites spécifiques à chaque procédure sont décrits pour chaque étape du projet.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser la pathologie cérébrale concernée par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-chirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.
Evaluation de l’impact d’une série de composés en développement sur la cachexie
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales induisant une cachexie, fonte musculaire et perte de poids progressives, puis un gavage biquotidien pendant quinze jours, pour tester sept composés d'une société cliente. Le porteur limite le développement de la tumeur à vingt et un jours, seuil au-delà duquel les souris sont mises à mort, et renvoie au conditionnel une éventuelle mise sur le marché. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode de substitution" permettant d'étudier l'efficacité réelle d'un composé sur la cachexie.
Objectifs
Le projet faisant l’objet de la présente demande d’autorisation vise à étudier les effets de 7 composés en développement chez un modèle de cachexie induite par des cellules LLC (Lewis Lung Carcinoma). Cette étude est commanditée par une société cliente de notre entreprise, dans le cadre de la recherche de l’efficacité de leurs composés dans ce domaine d’application.
Bénéfices attendus
Si la présente étude pemet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la cachexie, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ils constitueraient ainsi les tout premiers traitements autorisés pour la prise en charge de la cachexie.
Procédures
Ce projet comporte 4 types d'interventions différents: Inoculation de cellules LLC : Durée de 5 minute environ. Test de force (2 tests : pattes avant et 4 pattes) : Durée 30sec/session (3sessions/test ; répété 2 fois au cours du projet). Mesures de composition corporelle : Durée de 1-2 minutes (répétée 3 fois au cours du projet). Administrations sous-cutanées et orales : Durée 10 secondes environ; adiministrations biquotidiennes pendant 15 jours.
Impact sur les animaux
Le modèle employé dans le présent projet est un modèle de cachexie résultant du développement d'une tumeur sous-cutanée induite par l'inoculation de cellules Lewis Lung Carcinoma (LLC). Le développement tumoral induit un état de cachexie progressif s'accompagnant d'une réduction de masse maigre et d'une perte de poids corporel. Pour des raisons éthiques (tumeur ne devant dépasser 3000m3), le modèle est limité à 21 jours post inoculation des cellules LLC après lesquels les animaux seront euthanasiés. D'autre part, les mesures de pesée et de tumeurs peuvent constituer une nuisance par la manipulation. Les traitements, par injections sous-cutanées et per os par sondes de gavage, engendrent également une nuisance sur les animaux. La mesure de compositon corporelle et le test de force constitue une légère nuisance sur l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histologiques sur les muscles des pattes arrières, le coeur, le diaphragme, le tissu adipeux sous-cutané, le foie et certaines portions du tube digestif qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur l’état de cachexie. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe contrôle du modèle (heated-treated LLC/ Vehicule) a été réduit à 8 animaux (contre 12 pour les groupes cachectiques) du fait d'une moindre variabilité des paramètres mesurés, ces souris ne développant pas de tumeur. Les analyses statistiques seront réalisées par des tests ANOVA suivis de tests Post-hoc de Bonferroni. Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 80% et une erreur alpha à 0,05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, poids corporel cumulé, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, volume tumoral, densité tumorale, poids de la tumeur, poids corporel sans tumeur, composition corporelle (masse grasse, masse maigre, masse fluidique ; animal, carcasse avec/sans tumeur, tumeur seule), test de force par grip test (2 et 4 pattes), poids des muscles (gastrocnemius, soleus, long extenseur des orteils, plantaris, tibialis, vastus lateralis, diaphragme, cœur).
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Il s'agit d'un modèle de cachexie chez la souris induit par une inoculation de cellules LLC. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cage individuelle et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout de dômes en carton, de briquettes en bois et de matériel de nidification. Afin de réduire toute douleur au cours des procédures expérimentales, l'inoculation des cellules LLC sera réalisée sous anesthésie et les mesures de composition corporelle seront réalisées chez l'animal vigile (indolore ; durée de la mesure : 2 minutes). Les administrations sous-cutanées seront réalisées par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique, et deux sites d'administration seront utilisés (alternance d'un jour à l'autre). Les administrations orales seront pratiquées à l'aide de canules de gavage à usage unique pourvues d'embout en silicone. Enfin, compte-tenu du développement d’une tumeur et d’un état de cachexie progressif chez les animaux, le développement de cette dernière sera limité à 21 jours post inoculation et un suivi journalier particulièrement étroit des animaux à l'aide d'une grille de score de souffrance permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Au-delà des points limites, la souffrance de l'animal est évaluée pour une gestion contrôlée de la douleur. A partir d’un certain seuil, un analgésique sera administré et une intervention du vétérinaire référant pourra être programmée.
Choix des espèces
Le modèle souris C57BL/6 J est très bien documenté dans la littérature en tant que modèle de cachexie induit par une inoculation de cellules LLC. Le choix du modèle souris C57BL/6J a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés seront de jeunes souris adultes (5 semaines à réception ; 7 semaines au début du traitement). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte présentant un état cachectique lié au cancer.
Utilisation de nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPIONs) pour la prise en charge personnalisée des glioblastomes
- Recherche appliquée
- Cancers
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale de type glioblastome leur est implantée, puis elles reçoivent des nanoparticules d'oxyde de fer par voie intraveineuse et des séances d'imagerie IRM ou SPECT sous anesthésie, pour évaluer un outil de diagnostic et de traitement personnalisé. Le porteur indique que les tumeurs intracérébrales peuvent provoquer une perte de poids et des troubles du comportement, les animaux étant mis à mort dès l'apparition de signes graves. Il qualifie le développement de nouvelles stratégies d'"indispensable" et affirme qu'aucune alternative ne permet de vérifier l'accumulation des composés dans la tumeur.
Objectifs
Le glioblastome est la tumeur cérébrale de plus haut grade et la plus fréquente. On dénombre environ 250 000 nouveaux cas par an dans le monde. Les glioblastomes sont extrêmement létaux et la médiane de survie est estimée à environ 14-15 mois. Le traitement classique, qui n’a que peu évolué depuis 2005, est constitué d’une chirurgie puis d’une radiothérapie et enfin d’une chimiothérapie aux nombreux effets secondaires systémiques. Au sein de ces tumeurs cérébrales, on trouve une accumulation de cellules immunitaires, qui pourraient avoir un rôle dans le mauvais pronostic des glioblastomes. Dans ce contexte, les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIONs) ont été largement étudiées et s’avèrent très prometteuses dans la prise en charge personnalisée des glioblastomes. Les SPIONs sont biocompatibles et biodégradables et possèdent des propriétés intrinsèques (constituées d’oxyde de fer) permettant de les visualiser en imagerie par résonance magnétique (IRM) et de les chauffer par hyperthermie magnétique (pour réaliser un traitement localisé). De plus, la surface des SPIONs peut être facilement modifiée afin d’introduire des motifs chimiques permettant 1/ de modifier leur comportement dans l’organisme (en limitant leur élimination ou les dirigeant vers une cible spécifique), 2/ de les visualiser en imagerie (nucléaire ou fluorescente), et/ou 3/ d’y ajouter un molécule de traitement (chimiothérapie, radiothérapie). Ainsi, au travers du présent projet, l’objectif est de développer des SPIONs ciblant les glioblastomes pour améliorer le diagnostic et le traitement des patients tout en limitant les effets indésirables systémiques pour un cancer au fort besoin médical non-satisfait.
Bénéfices attendus
Le traitement standard du glioblastome en clinique n’a pas évolué depuis 2005 et pourtant cette pathologie présente une incidence de 3/100 000 habitants et la médiane de survie des patients est d’environ 14 mois. Il est donc indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Depuis une dizaine d'années, le développement des nanoparticules magnétiques permet de réduire les effets secondaires des chimiothérapies, de réduire les résistances des cellules cancéreuses et d’améliorer, d’accélérer le diagnostic des glioblastomes. Les nanoparticules d'oxyde de fer sont biocompatibles et leur fonctionnalisation leur permet d'être stables et de diminuer son absorption hépatique. Les résultats obtenus permettront de proposer un outil permettant le diagnostic et le traitement des glioblastomes et donc un nouveau protocole de prise en charge des patients.
Procédures
Les animaux subiront les actes suivants : * Injection de SPIONs par voie intraveineuse (injection unique sous anesthésie isoflurane, 15 minutes maximum par animal). Les doses employées sont des doses traces n’entrainant aucun effet biologique. * Imageries IRM ou SPECT sous anesthésie isoflurane (animaux placés dans un lit chauffant) d’une durée maximale de 45 minutes (à raison de 2 imageries par semaine pendant 3 semaines ou 4 imageries répétées sur 24h).
Impact sur les animaux
Le développement de modèles animaux avec des tumeurs intracérébrales est susceptible d’induire chez les animaux des signes cliniques tels qu’une perte de poids, un comportement atypique ou des signes de mal être qui seront très étroitement suivis tout au long des procédures du projet afin de mettre à mort les animaux dès l’apparition de ces signes cliniques indésirables. Si un signe apparait, le suivi sera accentué et des mesures proactives seront prises (nourriture gélifiée, réhydratation). En cas de signes graves ou légers prolongés sur 24h, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : - Euthanasiés selon le planning de l’étude - Euthanasiés si points limites atteints
Remplacement
Les molécules d’intérêt seront d’abord étudiées in vitro et in vivo sur souris saines pour réduire le nombre d’animaux pathologiques nécessaires à nos travaux. Il n’existe pas, à l’heure actuelle, d’alternative au modèle animal permettant de valider que des composés administrés par voie intraveineuse vont effectivement s’accumuler au niveau tumoral. Seule l’utilisation d’animaux présentant un système physiologique complet se rapprochant de l’organisme humain permettra donc de répondre à nos objectifs.
Réduction
En comparaison avec une étude « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux d’autant. Le programme d’étude établi en plusieurs étapes pourra être arrêté à tout moment et limiter ainsi toute utilisation non nécessaire d’animaux.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur (injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs évaluée régulièrement. Les données seront intégrées à l’aide d’une grille d’évaluation (Annexe 1) et l’animal pris en charge. De plus notre projet contient une première partie pour évaluer la croissance des tumeurs intracérébrales par imagerie IRM et pour mieux appréhender les signes cliniques éventuels. Cette première partie, ainsi que des données issues d’études préalables, nous permettra de définir les points limites les plus précoces afin de limiter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les murins de type souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie moléculaire eux-mêmes très proches des appareillages humains (PET/IRM), facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Souris de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.
Effets anti-inflammatoires des bactéries lactiques et suivi de micro-organismes dans l’intestin par imagerie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Une partie reçoit par voie orale des bactéries lactiques suivies par imagerie, d'autres subissent une colite induite provoquant perte de poids et diarrhée, pour évaluer des effets anti-inflammatoires sur l'intestin. Le porteur indique que le suivi par imagerie de bactéries luminescentes vise à réduire le nombre d'animaux habituellement tués à différents temps. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire le dialogue entre le système immunitaire, la muqueuse intestinale et le microbiote d'un mammifère.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans une thématique générale d’évaluation de multiples interventions susceptibles de moduler l’homéostasie générale des muqueuses et les réponses immunes locales et systémiques, en conditions basales et divers contextes d'inflammations intestinales chez la souris. L’étude permettra de renseigner sur l’efficacité de traitements préventifs ou thérapeutiques ainsi que la compréhension des mécanismes associés aux protections mises en évidences, en particulier en modifiant transitoirement ou durablement la structure du microbiote intestinal et/ou l’immunité de l’individu. Il s’agit d’un projet intégré combinant des procédures distinctes, rassemblées ici, ayant pour la plupart déjà fait l’objet d’autorisations antérieures, en vue d’un renouvellement.
Bénéfices attendus
Pour l'étude de la persistance et la localisation des bactéries dans l'intestin: jusqu'à maintenant, les études nécessitent de sacrifier un grand nombre d’animaux à différents temps et les tissus sont excisés pour énumérer les bactéries. De plus, les techniques invasives utilisées sont susceptibles de modifier la flore et l’influence du contexte de l’animal vivant. Le suivi des bactéries bioluminescentes/fluorescentes par imagerie permettra de rationaliser ces études, de diminuer le nombre d’animaux et de suivre de façon non-invasive le devenir des bactéries dans le tractus intestinal (temps de survie, état des cellules, quantification des bactéries dans un compartiment particulier, influence de la matrice utilisée incluant les bactéries, influence d’une co-application de différentes souches de bactéries lactiques…). De plus, le développement de bactéries lactiques bioluminescentes et fluorescentes permettra d’étudier les interactions moléculaires qui existent entre les bactéries et l’hôte. Pour les modèles de colites expérimentales, les bénéfices attendus sont: 1) Elucidation des mécanismes anti-inflammatoires médiés par les probiotiques dans un contexte physiopathologique mimant les maladies inflammatoires chronique de l'intestin (pas de méthodes substitutives à ce jour). 2) Efficacité préventive et thérapeutique: sélection de souches et étude préalable avant l’investigation d’un probiotique chez l’homme.
Procédures
Dans les procédures 1 et 2, aucune intervention induisant le stress ne sera faite. Des prélevements de selles seront réalisés ponctuellement en fonction des expérimentations (prélevement des selles quotidiennement et une seule fois par jour (4-5 selles individuelles/souris) pendant 12 jours) . Pour les procédures 3 et 4, des prélèvements de selles seront réalisés (prélevement des selles quotidiennement 1x par jour pendant 7 jours maximum) et un prélèvement de sang sera réalisé avant la mise à mort des animaux. Les prelevements de tissus variés seront réalisés sur animaux euthanasiés.
Impact sur les animaux
L'administration orale des bactéries et l'étude de la persistance des bactéries chez les souris saines n'induiront pas d'effets indésirables. Les expériences de colite induiront aux souris des pertes de poids et une apparition de diarrhée en fin d'expérimentation.
Devenir
Les animaux des procédures 1, 2, 3 et 4 seront euthanasiés.
Remplacement
Il n’est pas possible de reproduire la physiologie intégrée et complexe du dialogue entre le système immunitaire, la muqueuse intestinale et le microbiote digestif de mammifère.
Réduction
Les microorganismes (bactéries lactiques ou levures) qui seront étudiés in vivo seront tout d’abord étudiés et sélectionnés in vitro en fonction de leurs propriétés immuno-modulatrices. Les souches présentant les meilleurs profils anti-inflammatoires seront alors évaluées in vivo. Ces propriétés protectrices des micro-organismes nonpathogènes ne peuvent être étudiées que sur un organisme vivant (mammifère). Afin de réduire le nombre d'animaux avec une puissance statistique sufficante, des lots de 8-10 souris seront utilisés. Ce nombre est justifié sur la base d'expériences préliminaires et publiées dans la litérature et la puissance des tests statistiques intégrant la dispersion des valeurs individuelles (Mann-Withney).Ces évaluations précliniques n’interviennent toutefois qu’après détermination préalable des effets in vitro (effets anti-inflammatoires, effets prébiotiques, chélation des métaux lourds), afin de limiter au mieux le nombre d’animaux (Réduire).
Raffinement
Les procédures sont définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant la souffrance animale. Les animaux sont manipulés individuellement et à l’isolement afin d’éviter tout stress aux animaux non manipulés. Après l’induction de la colite, les animaux sont observés quotidiennement et pesés a minima tous les 2 jours. Si une perte de poids est supérieure à 10 % du poids corporel initial, une surveillance quotidienne voire 2 fois par jour a lieue. De la même façon, tout signe éventuel de détresse (prostration, vocalisation, tremblement, …) fera l’objet d’une attention particulière. Si une perte de poids supérieure à 20 % survenait, ou un signe évident de souffrance, il serait immédiatement procédé à une euthanasie des animaux concernés.
Choix des espèces
La souris représente le modèle le plus accessible et le plus pertinent pour modéliser la physiologie digestive des muqueuses chez l'homme. Cet organisme intègre également des composantes physiologiques, métaboliques et immunitaires pertinentes pour faire des conclusions transversales chez l'homme.
Traitement de modèles PDX d’ostéosarcome par de nouveaux médicaments capables de cibler TREM2 (potentiels marqueurs de mauvais pronostics)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des fragments de tumeurs osseuses de patients leur sont greffés, puis elles reçoivent des injections répétées trois à quatre fois par semaine pendant trois à dix semaines, pour tester des molécules ciblant la protéine TREM2 dans l'ostéosarcome. Sur les atteintes, le porteur se limite à mentionner "les effets dus à l'implantation de tumeurs" sans les détailler, alors que la gravité déclarée est sévère et que les organes sont prélevés après la mise à mort. Il qualifie les modèles de tumeurs de patients d'"indispensables" et le modèle immunocompétent d'"essentiel", aucune approche cellulaire ne reproduisant selon lui le microenvironnement de la tumeur.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’activité d'une voie impliquée au niveau du microenvironnement immunitaire, in vivo de base et après modulation par des molécules qui ciblent cette voie, seul et en combinaison avec des molécules actuellement utilisées dans le traitement des patients. L'objectif est de mieux comprendre les mécanismes liés au marqueur étudié dans ce projet et des voies modulées par celui-ci, en vue d’établir les liens entre la résistance aux traitements et les mauvais pronostics. Nous évaluerons la sensibilité in vivo de molécules modulant cette voie sur des modèles in vivo d’ostéosarcome. Nous étudierons les mécanismes d’action de ces molécules et évaluerons leur application thérapeutique à un groupe d’ostéosarcomes de plus mauvais pronostic, dès la prise en charge initiale. L’analyse des tumeurs primaires implantées de patients, l’estimation du développement par imagerie ainsi que le suivi du développement des métastases éventuelles, viendront compléter notre étude d’efficacité. Enfin, des analyses des tumeurs et métastases développées seront réalisées. Cela permettra d’explorer l’activité de nouveaux médicaments dans le but d’améliorer la survie des patients et permettra l'application d'un traitement plus adapté au pronostic du patient dès le début de son parcours de soins.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera les éléments précliniques permettant de comprendre et d’identifier un marqueur de mauvais pronostic et ainsi définir de nouvelles cibles thérapeutiques. Le traitement défini pourra être utilisé dans des essais cliniques sur l’ostéosarcome pour améliorer la survie des patients avec mauvais pronostic.
Procédures
Une procédure chirurgicale unique sera réalisée, avec une durée maximale de 5-10min par souris. Injections intrapéritonéales alternées entre 3 à 4 fois par semaine pendant 3 à 10 semaines. Prélèvement de sang unique, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont ceux dus à l'implantation de tumeurs.
Devenir
Dans la procédure 1 tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever la tumeur à utiliser dans la procédure 2. Dans la procédure 2 et 3 tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever la tumeur et des organes (poumons, rate, fois) pour étudier au mieux la réponse anti-tumorale mise en place après traitement thérapeutique.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement (qu'elle soit placée en sous-cutanée ou dans une localisation proche de son site original osseux en paratibial) ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, osseux…), l’utilisation des modèles PDX reste indispensable. De même, la réponse du système immunitaire au processus tumoral est complexe et multicellulaire, il est difficile de le reproduire in vitro, le modèle syngénique est essentiel et complémentaire des modèles immunodéficients utilisés pour les PDX Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l’activité de TREM2 et son lien avec les mécanismes oncogéniques et métastatiques des cancers à mauvais pronostics mais également explorer et valider l'efficacité de nouvelles thérapies capables de cibler TREM2.
Réduction
Peu de modèles d’ostéosarcome sont décrits. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les doses seront calibrées par rapport à la littérature et sur nos résultats obtenus in vitro. Dans cette étude nous voudrions comparer chacun des groupes expérimentaux avec uniquement le groupe control, résultant en un total de 7 comparaisons, ce qui limitera le nombre d'animaux utilisé. Nous réaliserons une analyse de variance. Dix modèles d'ostéosarcome de patients, représentant l'hétérogénéité de la maladie seront utilisés et chaque modèle sera traité avec les molécules anti-TREM2 administrées seules et en combinaison avec des molécules utilisées dans le traitement de la maladie. Afin de réduire le nombre d'animaux implantés, nous avons choisi de réaliser un suivi du développement tumoral longitudinal par imagerie. Dans notre étude, l’imagerie (scan r-x) sera fait en une analyse qualitative, de façon à confirmer la présence/croissance tumorale et le développement des métastases.
Raffinement
Les souris sont greffées et imagées sous anesthésie générale. Les souris reçoivent des médicaments anti-douleur. Les animaux sont surveillés chaque jour après la chirurgie afin de détecter toute modification. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de détecter précocement un développement de la tumeur. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux sont stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement adapté à l'espèce sera systématiquement ajouté dans les cages. Un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des animaux âgés de 4 semaines (juste sevrés) à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement.
STIMULATION CARDIAQUE DANS LES BLOCS AURICULOVENTRICULAIRES IMMUNS : EVALUATION DE FAISABILITE VIA UN STIMULATEUR CARDIAQUE SANS SONDE CHEZ LE LAPIN
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
15 lapins vont être utilisés dans un modèle de bloc cardiaque du fœtus, dix opérés sous anesthésie et tués sans réveil, cinq maintenus en vie trois mois puis tués. Chaque animal subit l'implantation d'un stimulateur cardiaque sans sonde autour du cœur et une ablation du nœud auriculoventriculaire pour ralentir son cœur, une chirurgie d'environ trente minutes. Le porteur choisit le lapin car son gabarit de 500 à 800 grammes est comparable à celui d'un fœtus humain entre seize et vingt-quatre semaines. Il affirme que le remplacement n'est pas possible et que l'étude doit se faire sur des animaux vivants.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer la faisabilité d’implantation d’un pacemaker sans sonde en épicardique (autour du coeur) chez des animaux de gabarit comparable à un fœtus humain (lapin). En effet, les troubles de la conduction chez le fœtus, responsables d’un ralentissement important de la fréquence cardiaque, sont le plus souvent provoqués par la présence d’anticorps chez la mère, qui provoquent une atteinte des voies électriques chez le fœtus. Les blocs auriculoventriculaires complets (BAVc) fœtaux se développent le plus souvent entre 16 et 24 semaines d’aménorrhées (SA), touchent environ 1/10 000 nouveaux nés vivants, et la morbi-mortalité reste très importante avec près de 20% des fœtus qui décèdent. Il n'existe aucune option thérapeutique à l'heure actuelle. En l’absence de thérapeutique efficace chez ces patients, le développement d’un système de stimulation pour les fœtus atteints de BAVc est essentiel pour permettre d’accélérer leur fréquence cardiaque afin de poursuivre le développement normal jusqu’au terme de la grossesse. Des nouveaux systèmes de stimulation ont été développés, notamment des pacemakers miniaturisés sans sonde. Compte tenu le gabarit très limité des fœtus à ces termes (500 gr – 800 gr), l’implantation d’un pacemaker relié à une sonde épicardique est complexe. Si ces pacemakers sans sonde sont habituellement implantés à l’intérieur du cœur (endovasculaire), ces pacemakers de nouvelle génération pourraient être implantés en épicardique avec un boitier en position abdominale chez le fœtus.
Bénéfices attendus
Il n’existe, à l’heure actuelle, aucune thérapeutique efficace chez les fœtus en bloc auriculoventriculaire complet congénital avec mauvaise tolérance (ralentissement extrème du coeur ne permettant pas au foetus de se développer normalement avec risque de mort foetale). La seule option est l’extraction par césarienne si le terme de la grossesse le permet, avec les complications connues de la grande prématurité. Si différentes stratégies de stimulation in utero ont été essayées, sans succès chez l’homme, il apparait que le système de stimulation doit être implanté entièrement dans le fœtus, en raison du déplacement des sondes de stimulation lié aux mouvements du fœtus quand le boitier du stimulateur est externe ou dans le ventre maternel. Le développement d’une technique de stimulation adaptée est essentiel pour permettre d’accélérer la fréquence cardiaque des fœtus afin de poursuivre le développement normal jusqu’au terme de la grossesse. Cela est d’autant plus importants que le taux de mortalité reste très important mais aussi car le risque de récidive pour un futur enfant chez la même mère est aussi considérable (supérieur à 20%). Cette étude sera la première à évaluer la faisabilité d’implantation d’un stimulateur sans sonde en position épicardique (autour du coeur avec boitier en position abdominale) chez des animaux de gabarit comparable aux fœtus humains. Si les résultats sont positifs, cette étude sera complétée par une étude chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie avec implantation d'un stimulateur sans sonde par voie épicardique (autour du coeur avec stimulateur en position abdominale). Dans le même temps, une ablation du noeud auriculoventriculaire sera réalisée pour ralentir le coeur du lapin (création d'un bloc auriculoventriculaire pour ralentir le coeur du lapin afin d'évaluer de façon appropriée si le stimulateur contrôle bien la fréquence cardiaque du lapin). La durée de l'intervention est évaluée à 30 minutes.
Impact sur les animaux
Chirurgie pour implantation d'un stimulateur épicardique (autour du coeur). Chez les 5 lapins non mis à mort à la fin de la chirurgie: cicatrice liée à l'implantation, potentielles douleurs post opératoires, suivi avec electrocardiogramme, échographie cardiaque, radiographie thoracique.
Devenir
Une 1ère procédure sans réveil impliquera 10 lapins. Cette 1ère étape s'arretera après 4 succès d'implantation dont au moins les 2 dernières implantations successives avec succès. Si ces critères sont réunis avant les 10 lapins, la 2ème procédure sera mise en place sans réaliser la 1ère procédure chez les autres lapins. Pour la 2ème procédure, 5 lapins seront implantés d'un stimulateur cardiaque sans sonde (idem procédure n°1) avec réveil pour suivi du fonctionnement du stimulateur cardiaque au long cours pendant 3 mois afin d'évaluer le fonctionnement optimal du stimulateur cardiaque à distance au cours de la croissance puis seront mis à mort.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’évaluer la faisabilité d’implantation de stimulateurs cardiaques sans sonde en épicardique chez des animaux de gabarit comparable aux fœtus humains et le fonctionnement optimal de ces stimulateurs cardiaques, ce projet doit être réalisé sur des animaux vivants. Le remplacement n'est donc pas possible.
Réduction
Le nombre d’animaux (n=15 dont 5 avec un suivi chronique pendant 3 mois) a été discuté de façon collégiale avec les cardiologues pédiatriques, les rythmologues, et les chirurgiens cardiaques, pour être réduit au maximum mais permettre cependant de démontrer la fiabilité de l’approche et d’optimiser la technique d’implantation avant les premières implantations chez des fœtus humains. En l'absence de groupe contrôle pour mettre en évidence une différence, une puissance statistique ou nombre de sujets necessaires n'est pas applicable.
Raffinement
Les contraintes subies par les animaux seront minimisées pour que leur bien-être soit préservé au mieux. Les animaux seront pris en charge par les vétérinaires du centre avant l'intervention et dans le cadre du suivi pour les animaux non mis à mort après l'implantation. Les lapins sont hebergés dans des cages Techbiplast (portoirs de 3 cages), 1 lapin par cage avec abrevement au biberon et nourriture en granulé en permanence. Nous avons ajouté de l'enrichissement avec du foin et des jouets (bâton de bois et balle). Les lapins sont visités tous les jours week-end compris avec 2 changes par semaine. Lors de l'intervention, le protocole suivant sera appliqué: Les animaux sont maintenus à jeûn 24 heures avant l’intervention chirurgicale (24 heures pour l’alimentation solide, 8 à 12 heures pour l’eau). Un examen clinique pré-anesthésique est réalisé : couleur des muqueuses, temps remplissage capillaire, auscultation cardiaque et pulmonaire, fréquences cardiaque et respiratoire, température, tympanisme gastrique. Anesthésie: Un cathéter veineux est mis en place dans l’oreille. Injection en intra musculaire Zoletil 100 : 8 mg/kg ; Rompun 5 mg/kg : Une perfusion d’entretien de soluté de Ringer Lactate est mise en place (10-20 ml/kg/heure). Toute perte sanguine sera corrigée par un apport supplémentaire de soluté de Ringer lactate représentant trois fois le volume des pertes sanguines enregistré. Gouttes de lubrifiant oculaire administrées aux lapins pendant la chirurgie. Monitoring de l’anesthésie: les paramètres de surveillance anesthésiques seront évalués toutes les cinq minutes : - Couleur des muqueuses et temps de recoloration capillaire. - Tonus musculaire mandibulaire. - Positionnement du globe oculaire. Myosis/mydriase. Réflexe palpébral. - Fréquences cardiaque et respiratoire. - Oxymétrie de pouls. - Température. Analgésie: l’analgésie est obtenue par injection, lors de l’induction, de chlorhydrate de morphine (0.05 à 0.5 mg/kg par voie intra-musculaire ; morphine Lavoisier, France) renouveler toutes les 4 à 6 heures. Ce traitement analgésique pourra être poursuivi, après évaluation de la douleur de l’animal et examen clinique, pendant les 48 à 72 heures post-opératoires. Une injection de Ketofen 10 % (2 mg/kg par voie intramusculaire ; Ceva, France) est réalisée sur l’animal extubé et en décubitus sternal. Ce traitement anti-inflammatoire sera poursuivi sur une période de 3 à 5 jours (2 mg/kg/24 heures).
Choix des espèces
Le lapin a été choisi car le gabarit des petits lapins (entre 500 gr et 800 gr) est comparable avec le gabarit des foetus humains aux termes de grossesse (entre 16 et 24 semaines d’aménorrhées) ou la survenue de BAV pourrait indiquer la mise en place d'un stimulateur cardiaque. D'autres espèces avec des gabarits compatibles (comme le cobaye) n'ont pas été retenues devant l'absence d'agrément de notre centre pour ces espèces. Par ailleurs, pour les animaux non mis à mort après l'implantation, la croissance des lapins permettra d'évaluer la fiabilité du stimulateur cardiaque au décours de la croissance de l'animal, permettant d'étudier si le système de stimulation restera fiable chez le foetus humain au cours de la grossesse.
Etudes des propriétés biologiques du SARS-CoV-2 et de ses variants, et évaluation de traitements thérapeutiques et prophylactiques.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
2010 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, puis reçoivent des molécules antivirales ou des vaccins, pour évaluer les propriétés des variants et tester des traitements. Le porteur décrit une pathologie pulmonaire avec perte de poids et indique que les variants pourraient provoquer des formes plus graves. Il affirme que le recours au modèle animal est obligatoire après une évaluation in vitro, tous les animaux survivants étant tués en laboratoire de haute sécurité.
Objectifs
L’émergence récente de variants du SARS-CoV-2 contraint la communauté scientifique à suivre l’évolution naturelle du virus quasiment au jour le jour. Il est donc indispensable de pouvoir évaluer les propriétés biologiques in vivo de ces virus, le plus rapidement et le plus efficacement possible. Presque deux ans après l’émergence de ce virus, le développement de thérapeutiques antivirales (antiviraux, anticorps, vaccins) reste d’un intérêt majeur. Encore une fois, cet objectif est renforcé par l’émergence de variants d’intérêts. Ce projet propose donc: -D’évaluer les propriétés biologiques du SARS-CoV-2 et de ses variants -De tester des thérapeutiques antivirales (antiviraux, anticorps, vaccins) contre ce virus et ses variants.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer les propriétés biologiques des variants du SARS-CoV-2 et de poursuivre les travaux de la communauté scientifique sur le développement de thérapeutiques, après validation in vitro, qui pourront ensuite potentiellement être utilisées chez l’Homme. Cette étape est indispensable à tout développement pharmaceutique.
Procédures
Les animaux, anesthésiés au préalable, seront infectés par le SARS-CoV-2 par voix intranasale. Cette intervention dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + infection) et ne s'effectue qu'une seule fois. L'administration de molécules antivirales ou de vaccins s'effectuera par voie intranasale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire ou par gavage sur les animaux anesthésiés. Le traitement s’effectuera au maximum deux fois par jour, durant le temps de l’expérimentation. L’administration des vaccins s’effectuera selon deux schémas : une dose ou deux doses à 10-25 jours d’intervalle. Cette intervention dure en moyenne 3 minutes (anesthésie + traitement). Un seul prélèvement sera effectué sur animal vivant: le lavage nasal. Il sera réalisé une seule fois par jour, au maximum deux jours consécutivement et dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + lavage nasal).
Impact sur les animaux
Le SARS-CoV-2 entraine une pathologie pulmonaire non mortelle et spontanéemment résolutive chez le hamster. Le principal symptôme observé est une perte de poids survenant généralement entre le 4ème et le 7ème jour post-infection. Néanmoins, l'étude de l'infection par des variants du SARS-CoV-2 pourrait conduire à des formes cliniques/symptomatologiques différentes de celles déjà observées. Par conséquent, les animaux seront surveillés cliniquement et pesés quotidiennement durant la période d’expérimentation, afin de détecter précocément cette perte de poids et/ou tout autres symptômes (notamment pulmonaire).
Devenir
Les manipulations s'effectuant avec un virus infectieux et ayant lieu dans un laboratoire NSB3, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L’étude de l’efficacité d’une molécule antivirale, d’un anticorps ou d’un candidat vaccin sur un virus et ses variants passe obligatoirement par l’utilisation d’un modèle animal, après une évaluation in vitro poussée.
Réduction
D’une part, concernant l’évaluation des propriétés biologiques des virus et la recherche de thérapeutiques antivirales (antiviraux, anticorps), nous avons déterminé l’effectif nécessaire de 6 hamsters par lot. D’autre part, nous avons déterminé l’effectif nécessaire de 8, 12 et 9 hamsters par lot concernant les études vaccinales, de fitness réplicatif et de pharmacocinétique, respectivement. Ces effectifs ont été calculés pour une puissance de 80% pour un risque alpha de 5% et de 95% pour un risque beta. Nous nous sommes également basés sur les écart types obtenus dans la littérature et sur nos précédents projets APAFIS.
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les animaux seront anesthésiés (isofluorane) avant toute inoculation de virus et administration de thérapeutiques. D’autre part, un traitement analgésique (buprénorphine) sera administré chez les hamsters présentant des signes d’infection trop sévères (évalués grâce à une grille de score). Par ailleurs des points limites adaptés ont été choisis afin de détecter précocement ce type d’atteinte. Les animaux seront maintenus en cage et ne seront soumis à aucune privation de nourriture ou d’eau. Ils seront surveillés cliniquement et pesés quotidiennement durant la période d’expérimentation.
Choix des espèces
Mesocricetus auratus est le modèle de référence pour le virus du SARS-CoV-2. Animaux âgés de 3 à 9 semaines. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études pré-cliniques sur le SAR-CoV-2.
Réponses physiologiques et comportementales de la sardine face à une baisse en oméga-3 dans l’alimentation et une hausse de température des océans chez la sardine Sardina pilchardus.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Pêchées en mer, puis maintenues dans des conditions qui simulent une baisse des oméga-3 dans leur nourriture et une eau plus chaude, 360 sardines subissent chacune douze biométries et deux biopsies musculaires sous anesthésie, chaque acte étant précédé de 24 heures de jeûne. Après une mesure de leur respiration en bassin, 180 d'entre elles passent 24 heures dans un bassin test où un stimulus qui imite un prédateur déclenche leur fuite, puis subissent une prise de sang, et les 360 poissons sont déclarés à un niveau de souffrance sévère, que le porteur attribue au cumul des actes. Ces 180 sardines sont tuées pour prélever leur foie, leurs muscles, leur cerveau, leurs yeux et leurs otolithes, dans un projet qui veut prévoir l'effet du changement climatique sur la croissance et la qualité des stocks. Les 180 autres sont gardées en vie dans un bassin commun pour observer une éventuelle ponte, et le RNT ne dit pas ce qu'elles deviennent ensuite.
Objectifs
L'étude vise à comprendre comment les fonctions physiologiques et comportementales d’une espèce de petit poisson pélagique, la sardine Sardina pilchardus, s’ajustent face aux conditions environnementales. En particulier, l’objectif est d’étudier comment sont impactées les performances physiologiques de cette espèce de fort intérêt écologique et halieutique en termes de croissance, taux métaboliques, et comportement anti-prédateur, face à un scénario futur couplant une baisse en oméga-3 dans l’alimentation et une hausse de température des océans.
Bénéfices attendus
Les données physiologiques et comportementales obtenues permettront de mieux comprendre les réponses physiologiques et comportementales de la sardine, espèce dont la physiologie est mal connue, dans un contexte de changement climatique. Aussi, les données obtenues au niveau de l’individu seront utilisées par la suite dans notre projet pour modéliser les réponses au niveau de la population. Ceci permettra à terme de mieux comprendre la répartition des stocks, mais aussi la qualité des stocks en termes d’oméga 3, dans un contexte de changement climatique.
Procédures
- Tout au long du conditionnement, nous suivrons le taux de croissance individuel à travers des biométries bimensuelles. Chaque poisson (n=360) subira donc 12 biométries d’environ 2 minutes chacune. - Tout au long du conditionnement, nous suivrons également la composition en acides gras individuellement sur les 360 individus par (1) une première biopsie réalisée au T0 du conditionnement sur le flanc gauche, au-dessus de la ligne latérale, (2) une seconde biopsie musculaire réalisée 2 mois après le début du conditionnement, cette fois sur le flanc droit, au-dessus de la ligne latérale. Chaque poisson (n=360) subira donc 2 biopsies, qui dure chacune environ 5 minutes. - Entre 4 et 6 mois après le début du conditionnement, les performances physiologiques et comportementales des individus seront évaluées: • A l’issue de 4 mois de conditionnement, les taux métaboliques des 360 individus, c’est à dire la quantité d’oxygène consommée par unité de poids et de temps, seront mesurés par respirométrie 4 fois par bassin, sur 24h (durée totale estimée pour tester les 12 bassins : environ 2 semaines). • A l’issue de 5 mois de conditionnement, les performances de fuite seront mesurées sur 180 individus, à raison de 5 individus à la fois, par analyse vidéo sur 24h, (durée totale estimée pour tester les 180 individus : environ 1 mois). La réponse de fuite mesurée en tant que telle ne dure que quelques secondes, mais les animaux seront gardés 24h en tout dans le bassin test. • Un prélèvement sanguin, durant environ 3 minutes, sera effectué à la suite des mesures de réponses de fuite, c’est-à-dire environ 6 mois après le début du conditionnement, sur ces mêmes 180 individus. - Des mises à jeun de 24h seront effectuées avant chaque biométrie, biopsie, mesure de respirométrie et mesure de réponse de fuite
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent : (1) la biométrie qui nécessite une anesthésie puis une contention des animaux, et qui peut alors générer un stress léger durant environ 3 minutes par poisson, (2) les biopsies qui nécessitent une anesthésie, une contention, et une cicatrisation, et qui peuvent alors générer une douleur et un stress modéré pendant environ 5 minutes, (3) la respirométrie (mesure des taux métaboliques) peut générer un stress léger si le niveau d’oxygénation du bac descend en dessous du seuil de 75% d’oxygène, considéré comme la limite de la normoxie. Ce stress n’excèdera pas 15 minutes, qui est la durée durant laquelle la pompe permettant le renouvellement d’eau reste fermée pour permettre la mesure de consommation en oxygène des individus, (4) la réponse de fuite peut générer un stress modéré durant environ 5 minutes, lié au fait que nous stimulons les individus avec un stimulus expérimental mimant un prédateur, et cherchons à générer une réponse de fuite, (5) le prélèvement sanguin lié à l’anesthésie et à la contention peut générer un stress modéré et une douleur pendant environ 3 minutes, (6) le cumul des actes sur un même individu peut générer un stress sévère d’une dizaine de minutes, notamment du fait que les prises de sang seront effectuées juste après la mesure de réponse de fuite.
Devenir
A l’issue de la procédure, 180 animaux ayant subi le test de de fuite seront mis à mort pour prélever leurs différents tissus nécessaires à l'analyse des acides gras, à la mesure de l'expression de gènes (foie, muscle, cerveaux, yeux), ainsi qu'à la détermination de l’âge (otolithes). Les 180 autres seront gardés en vie et replacés dans un bassin commun pour voir si une ponte naturelle a lieu, puisque la période correspondra à une période de ponte en milieu naturel, et que des pontes spontanées ont déjà été obervées dans d'autres laboratoires à cette période.
Remplacement
Cette étude vise à caractériser les réponses physiologiques et comportementales de la sardine (croissance, synthèse des acides gras, taux métaboliques, évitement des prédateurs) face aux changements environnementaux. Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser le résultat d’interactions complexes entre différents tissus et fonctions, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. En effet, les processus étudiés s’appliquent à l’organisme vivant, dans son intégrité et toute sa complexité.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte-tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. L’estimation a été faite à partir de données de variabilités (notamment de croissance, de données d’expression de gènes, et de mesures d’acides gras) obtenues dans des expériences préalables sur d’autres espèces moins grégaires (prise en compte de la puissance des tests statistiques). Pour permettre d’utiliser un minimum d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les mesures de respirométrie et de réponses de fuite. Pour tester l’effet du conditionnement sur les variables étudiées, nous utiliserons des tests de comparaison de moyennes du type ANOVA à un facteur et ANOVA à mesures répétées.
Raffinement
Les mesures de raffinement tiennent compte des contraintes zootechniques et notamment de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles. Lors des marquages, des biométries, des biopsies, et prises de sang, les poissons à jeun seront sédatés légèrement par injection directement dans leur bac d’origine d'un anesthésiant pour limiter leur stress et faciliter la pêche. Ils seront ensuite délicatement pêchés à l’aide d’un bécher opaque, pour limiter la manipulation des animaux et la perte des écailles (les sardines étant particulièrement sensibles aux manipulations), puis transvasés dans un seau d'anesthésiant. Ce bain d’anesthésiant contiendra également une solution à base d’aloé vera qui permet de former une petite pellicule sur la peau des poissons limitant ainsi la perte des écailles et les lésions dues à la manipulation. Afin de favoriser une récupération rapide de la biopsie, une incision superficielle de 5 mm de la peau au-dessus de la ligne latérale après asepsie permettra au punch à biopsie d’atteindre le muscle sans enlever de peau. A la suite de la biopsie, un antiseptique puis une goutte de colle chirurgicale recommandée par notre vétérinaire référent seront appliquées sur la zone incisée. Pour la mesure des taux métaboliques par respirométrie, l’ensemble du montage expérimental sera placé derrière un rideau, et le système mis en place directement dans les bassins permettra d’éviter aux individus le stress d’un transport, et de ressentir les modifications de changements cycliques du régime d’écoulement. Le niveau d’oxygénation du bassin sera contrôlé en permanence et ne descendra pas en dessous de 75% de saturation en oxygène, considéré comme la limite de la normoxie. Les animaux seront en surveillance permanente. Ils seront retirés de la procédure dès que le point limite sera atteint (les points limites sont décrits dans l’item prévu à cet effet). Pour le test de fuite, qui génère un stress qui est très souvent rencontré en milieu naturel, chaque individu ne sera testé qu'une seule fois. Le poisson sera complètement isolé de l’environnement extérieur, et son comportement sera observé en permanence par vidéo.
Choix des espèces
Le projet se focalise sur la sardine (Sardina pilchardus), petit poisson pélagique d'intérêt écologique et économique. L'étude vise à comprendre comment les fonctions physiologiques et comportementales de cette espèce de petit pélagique s’ajustent face aux conditions environnementales. Il est donc indispensable d'expérimenter sur cette espèce. Stade adulte de première année (20 g et 14 cm environ). Il s’agit du stade qui permet le meilleur taux de survie après la pêche en milieu naturel. Grâce à leurs sonars, les pêcheurs sont capables, avant même de jeter le filet à l’eau d’avoir une idée de la taille des individus du banc et donc de savoir s’ils correspondent à ceux que l’on cherche. Aussi, la période de juin nous assure de trouver des individus d’un an environ. L’âge exact des individus ne pourra toutefois être confirmé qu’après sacrifice et prélèvement des otolithes, à l’issue de l’expérience.
Dialogue réciproque entre l’intestin et l’os
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 842 en gravité sévère. Une partie reçoit une injection de lymphocytes T et une autre du DSS dans l'eau de boisson pour induire une colite avec perte de poids, afin d'étudier le lien entre inflammation intestinale et perte osseuse. Le porteur indique tuer les souris dès un score de gravité de 9 ou une perte de poids de 20 pour cent. Il affirme qu'aucune lignée cellulaire ne peut remplacer la souris, présentée comme "indispensable".
Objectifs
Les lymphocytes innés et adaptatifs sont des acteurs majeurs des maladies inflammatoires chroniques. Ces maladies sont très fréquemment associées à une perte osseuse qui peut devenir extrêmement invalidante, même lorsque le site de l’inflammation n’est pas l’os, comme par exemple dans le cas des maladies inflammatoires de l’intestin (MICI ou maladie de Crohn) dans lesquelles entre 50 et 70% des patients développent des complications osseuses. Les cellules lymphoïdes innées (ILCs) représentent une population hétérogène de lymphocytes dépourvus de récepteurs spécifiques à l'antigène et répondent uniquement aux changements du microenvironnement tissulaires. Les ILCs sont les homologues innés des lymphocytes T et des acteurs essentiels dans l’induction et le maintien de l’inflammation intestinale. Cependant le lien entre les ILCs et la perte osseuse reste inconnu. Nos résultats préliminaires montrent une accumulation des ILCs, en particulier les ILCs de type 3 dans les organes lymphoides y compris la moelle osseuse et en association avec la perte osseuse. L’objectif de ce travail est d’identifier le rôle des ILCs dans la différenciation et l’augmentation des ostéoclastes reponsable de la perte osseuse. Les résultats découlant de cette étude permettront de mieux comprendre le rôle des ILCs dans le développement de la perte osseuse au cours de l’inflammation, et potentiellement d'envisager de nouvelles approches thérapeutiques via une modulation des ILCs.
Bénéfices attendus
Notre objectif est de mieux caractériser le dialogue réciproque entre l’intestin et l’os et en particulier l’implication des cellules lymphoides innées (ILCs) et l’effet de la modulation des ostéoclastes sur leur génération. Nos résultats apporteront des informations importantes sur le plan fondamental car ce travail n’a jamais été réalisé. Sur le plan translationnel, cette étude nous permettra de cibler des molécules d‘intérêt dont nous pourrons, par la suite, moduler l‘expression pour vérifier si elles sont impliquées dans le lien entre inflammation de l’intestin et perte osseuse. Les cibles identifiées dans l‘étude pourront donc être envisagées comme cibles thérapeutiques potentielles chez ces patients.
Procédures
200 souris seront injectées une seule fois au jour 0 par les lymphocytes T naifs et suivies pendant 7 semaines et 696 souris seront traitées par le DSS 3% dans l'eau de boisson pendant 3 jours afin d'induire une colite.
Impact sur les animaux
L’injection des lymphocytes T naifs ou le traitement par le DSS gènèrent une colite avec une perte de poids.
Devenir
Toutes les souris seront euthanaisées.
Remplacement
Il n‘existe pas de lignée cellulaire de lymphocytes innés (ILCs) ou d‘ostéoclastes inflammatoires qui nous permettrait de nous dispenser de l‘utilisation d‘animaux. La souris reste donc la seule source de cellules primaires que nous utilisons dans toutes nos expérimentations. De plus, nous avons besoin de valider certains de nos résultats in vivo, comme par exemple le recrutement de cellules inflammatoires dans la moelle osseuse, ou l'analyse du phénotype des ILCs et des ostéoclastes in vivo, ainsi que l'influence du microenvironnement normal ou inflammatoire sur ces types cellulaires. Ce type de microenvironnement ne peut pas être reproduit in vitro du fait de sa complexité. L‘utilisation de souris est donc indispensable
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé en se basant sur nos études et expériences antérieures et d’un test à priori (G*power). Le nombre d’animaux par groupe a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de type Anova) avec le nombre de souris minimum par groupe et on utilisera 3 groupes par expérience comme indiqué dans la section 4 : procédures expérimentales. De plus, un même animal servira pour isoler différents type cellulaires (ILCs, précurseurs et ostéoclastes) dont nous aurons besoin et l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.
Raffinement
Toutes les experiences et manipulations des animaux seront effectuées afin de respecter le bien être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Nous traiterons de façon préventive les souris avec colite par des analgésiques avec faible incidence anti-inflammatoires comme le paracetamol. Les animaux seront suivis selon la grille de score présentée ci-dessus 3.3.2.4 et pesés tous les jours pour les souris traitées par le DSS et 2 fois par semaine pour les souris injectées par les cellules T. Dès que les souris atteignent un score de 9 sur la grille de score ou qu'elles présentent une perte de 20% par rapport à leur poids au jour 0, elles seront immédiatement euthanasiées par dislocation cervicale
Choix des espèces
Nos résultats précédents ainsi que la majorité des données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons ont été obtenus chez la souris. Il existe déjà des modèles de souris transgéniques dont l'utilisation permettra de répondre à certaines de nos questions. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des animaux au stade adulte, entre 8 et 12 semaines. A ce stade le système immunitaire des souris est mature et auquel nous avons déjà travaillé dans nos études précédentes
1.2. Titre du projet Modulation pharmacologique de la ferroptose (stratégies anti-ferroptotiques et pro-ferroptotiques) avec analyse comportementale, radiologique et histologique dans des modèles d’étude de la maladie de Parkinson (MP)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 320
6840 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 3920 en gravité sévère. Les souris sont intoxiquées par la neurotoxine MPTP et les rats par la 6-OHDA pour reproduire une maladie de Parkinson, puis traités par divers agents et soumis à des analyses comportementales non précisées et d'imagerie avant une mise à mort par ponction cardiaque. Le porteur indique que l'anesthésie peut provoquer détresse respiratoire, hypothermie et mort soudaine. Il présente le développement de traitements neuroprotecteurs comme un "besoin" majeur et ces modèles chimiques et transgéniques comme le moyen de prouver l'implication de la ferroptose.
Objectifs
Les maladies Neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la sclérose latérale amyotrophique (ou maladie de Charcot), sont définies par une perte anormale des neurones. L’un des plus grands besoins actuellement en santé dans le monde est le développement de traitements de neuroprotection c’est à dire susceptible d’éviter la perte de ces neurones et donc la progression de ces maladies. Il n’existe actuellement aucun traitement neuroprotecteur dans la maladie de Parkinson. Le présent projet vise à tester des modèles de perte des neurones induits soit par des toxiques soit par des manipulations génétiques dans lesquels nous déterminerons les marqueurs radiologiques et d'imagerie de la perte des neurones et nous testerons des traitements de neuroprotection afin de valider leurs intérêts pour les tester dans des essais thérapeutiques humains.
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer la prédominance de la ferroptose dans ces conditions pathologiques de toxiques environnementaux et de transgénèse tout en validant des nouvelles stratégies thérapeutiques en comparant leur performance et en associant des biomarqueurs théragnostiques translationnels à la fois radiologiques et biologiques.
Procédures
3840 souris C57BL6J seront intoxiquées par une neurotoxine (le MPTP) mimant la maladie de parkinson ainsi que 80 souris ACSL4/CreDAT. Cette intoxication a lieu une seule fois par voie intrapéritonéale. L'ensemble des animaux C57BL6J intoxiqués seront ensuite traités par les différents agents thérapeutiques selon 3 modes d'administration (IP, IN, ICV). 320 rats WISTAR seront intoxiqués par une neurotoxine (la 6 OHDA) mimant la maladie de parkinson par voie intracérébroventriculaire. Cette chirurgie a lieu une seule fois. L'ensemble de ces animaux seront ensuite traités par les différents agents thérapeutiques selon le meilleur mode d'administration déterminédans le modèle de souris MPTP. 200 souris seront intoxiquées avec une autre neurotoxine (le RSL3) mimant la maladie de parkinson par voie intracérébroventriculaire en dose unique, par voie intranasale ou intrapéritonéale en dose unique ou en doses répétées n'excédant pas 3 administrations / semaines. 80 souris ACSL4/CreDat1 subiront une chirurgie dans le but d'administrer les PFF. Cette intervention sera réalisée qu'une seule fois. 1920 souris GPX4/CreDAT1 seront traitées soit par voie intrapéritonéale, intracérébroventriculaire ou intranasale par les différents agents thérapeutiques ainsi que 320 souris Thy1-asyn. L'ensemble de ces animaux seront évalués sur le plan comportementale et d'imagerie du vivant avant leur mise à mort avec prélévement sanguin intracardiaque. Les administrations en IP et en IN dureront 5 minutes / animal, les injections ICV n'excéderont pas les 30 minutes. Les analyses comportementales dureront de 30 minutes à 1 heures et les analyses en imagerie du vivant n'excéderont jamais 2h30.
Impact sur les animaux
L'induction des neurotoxines chez nos animaux et des différents agents thérapeutiques peuvent entraîner des signes de gênes ou d'inconfort. Au moindre comportement inhabituel de nos animaux, nous procéderons à une surveillance plus stricte et en cas d'atteintes des points limites, nous procéderons à la mise à mort de nos animaux. Lors des actes de chirurgie et d'analyse en imagerie, l'induction de l'anesthésie peut provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie pouvant conduire à la mort soudaine de nos animaux. Pour réduire au maximum le nombre de décès chez nos animaux lors de ces différentes approches, nous veillerons sur leur état général tout au long de ces procédures en contrôlant leur température corporelle et en les maintenant à une température optimale grâce à une couverture chauffante. En cas d'atteinte des points limites, les animaux seront mis à mort.
Devenir
L'ensemble de ces animaux seront évalués sur le plan comportementale et d'imagerie du vivant avant leur mise à mort avec prélévement sanguin intracardiaque. Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés au cours de ce protocole, nous avons intégré dans la mesure du possible, les animaux a toutes les procédures mises en oeuvre dans ce projet.
Remplacement
Les différentes molécules inhibitrices de ferroptose, encapsulées ou non dans les nanocapsules, seront testées et leur mode d’action étudiés sur les cultures cellulaires disponibles au laboratoire avant d’être utilisés chez l’animal
Réduction
Nous veillerons à réaliser les études comportementales, d'imagerie et histologiques sur les mêmes animaux quand cela est possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisés
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront optimisées avec le maintien d'un cycle jour/nuit (12h/12h), d'une température comprise entre 20°C et 24°C ainsi qu'une hygrométrie comprises entre 40 et 70%. Un suivi quotidien des animaux sera effectué pour surveiller l’apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises.
Choix des espèces
L’utilisation du MPTP (en IP) chez la souris ou de la 6OHDA (en intracérébrale) chez le rat permettent d’induire des symptômes avec une atteinte sélective des neurones dopaminergiques reproductible. Ces modèles induits de la MP dont nous maitrisons au laboratoire seront comparés avec les modèles transgéniques GPX4 floxed, ACSL4 floxed, CreDAT qui permettront de prouver l’importance de la ferroptose dans la MP et leur degré de réversibilité sous traitement. Les souris C57BL/6 utilisés dans le cadre des modèles MPTP sont âgées de 12 semaines, 20 semaines et de 52 semaines. Les rats WISTAR auront un poids compris entre 180 et 200g soit âgés d’environ 4 semaines. Les souris Thy1-asyn sont âgées de 8 mois au début de l’expérimentation et suivies jusque 14 mois. Les souris ACSL4/Cre DAT1 et GPX4/Cre DAT1 seront utilisés dès l’âge de 8 semaines Nous analyserons le phénotype des animaux en termes de comportement général et de viabilité, d’histologie (neurodégénérescence et synucleinopathie, imagerie IRM et Pet scan Cu ATSM. L’objectif est de démontrer une neuroprotection dopaminergique. L’induction par tamoxiphene sera réalisée dès les premiers mois de vie.