Procédures sévères

1200 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sous anesthésie, la trachée est dégagée pour injecter de la bléomycine qui déclenche sur trois semaines une inflammation puis une fibrose pulmonaire pouvant provoquer une détresse respiratoire, avant enregistrement de la respiration puis mise à mort pour prélever les poumons, dans le développement préclinique de médicaments. Le porteur reconnaît que le modèle n'a jamais été réalisé dans ces conditions au laboratoire et qu'aucun calcul de puissance n'est possible, tout en revendiquant 8 à 10 animaux par groupe. Il présente ce modèle comme "nécessaire" à la mise sur le marché de nouveaux traitements et retient le cobaye pour la sensibilité de ses voies aériennes.

Objectifs

L’inflammation pulmonaire est une réponse biologique complexe du tissu pulmonaire à divers stimuli néfastes : pathogènes, cellules endommagées, substances irritantes, etc. L’inflammation est un mécanisme immunitaire protecteur impliquant les cellules immunitaires, les vaisseaux sanguins et différents messagers cellulaires. Depuis ces dernières décennies, on assiste à une augmentation significative des maladies inflammatoires du poumon, telles que l’asthme ou la broncho-pneumopathie chronique obstructive , maladie chronique d'origine respiratoire atteignant les bronches. L’inflammation peut être aiguë, c’est-à-dire temporaire, ou devenir chronique et donc persister un long moment. Le plus souvent, cette inflammation chronique va évoluer vers une fibrose du tissu pulmonaire qui modifiera la fonction pulmonaire. Les tests décrits dans ce projet ciblent l’inflammation et la fibrose du système respiratoire dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments à lutter contre certaines infections pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce modèle d'inflammation/fibrose pulmonaire est nécessaire à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines pathologies Ce modèle d'inflammation/fibrose pulmonaire est nécessaire à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines pathologies pulmonaires. Les traitements ont pour objectif de réduire les symptômes et d’améliorer la tolérance à l’effort des patients. Le traitement antifibrosant par pirfénidone ou nintédanib ralentit l’aggravation de la maladie, mais n’entraîne pratiquement pas d’amélioration des symptômes (toux persistante par exemple). Dans ce contexte, il est nécessaire de poursuive la recherche de nouveaux traitements efficaces et sans effets secondaires majeurs.

Procédures

Lors de l'injection de bléomycine, une phase de chirurgie en condition d'asepsie est nécessaire. Les animaux sont anesthésiés et leur trachée est dégagée pour injection du réactif. L'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil et un antisedan est administré pour accélérer le réveil. La durée de l'intervention de l'anesthésie à l'injection de l'antisédan est de 45 minutes maximum. L’inflammation et la fibrose pulmonaire se développe progressivement sur une période de 21 jours (durée maximale de l’expérience). En fin d’étude (généralement le dernier jour, jour 21), les animaux sont placés dans des chambres de pléthysmographie pour l’enregistrement des paramètres respiratoires (stabilisation, puis enregistrement sur une période de 3-4 heures). Pendant l’étude, des prélèvements sanguins (veine saphène) intermédiaires sous anesthésie peuvent être réalisés (maximum 2, pour un volume inférieur à 15% de la volémie de l’animal). Enfin, un prélèvement sanguin ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie est réalisé juste avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédures, il est attendu une réaction inflammatoire principalement localisée au niveau pulmonaire. Quand on cherche à moduler la réponse inflammatoire à l'aide d'agents pharmacologiques, il est possible d'établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. L'inflammation est liée aux effets de substances administrées par voie intra-trachéale dont les effets sont bien caractérisés. Dans le cas de l'inflammation pulmonaire, les paramètres respiratoires peuvent être altérés et induire une détresse respiratoire. Dans la mesure du possible, les études sont réalisées sur des animaux hébergés en groupe (sauf lors de la mesure des paramètres respiratoires, mais sur une période de 4h maximum).

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour recueil du liquide bronchoalvéolaire et des poumons (pas de réveil).

Remplacement

En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro ont pu être réalisés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement positif. Ce modèle est actuellement en développement, masi nos données historiques obtenues dans des modèles similaires indiquent qu'il est nécessaire d'inclure 8-10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) pour atteindre une sensibilité correcte. Néanmoins, ce modèle n'ayant jamais été réalisé dans les conditions décrites au sein du laboratoire, aucune analyse de puissance ne peut être réalisée. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétique d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré- ou post-opératoires complets.

Choix des espèces

Le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique. Le cobaye reste utilisé dans plusieurs domaines de recherche (électrophysiologie cardiaque, immunologie, fonction respiratoire,...). Le cobaye est ainsi un bon modèle d'asthme ou inflammation pulmonaire, car contrairement à la souris et au rat, ses voies aériennes sont sensibles à l'histamine et il démontre une réaction allergique précoce et tardive comme c'est le cas chez l'humain. C'est également l'espèce classiquement utilisée pour l'évaluation des symptômes de toux. Principalement des cobayes sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.

110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une greffe de glioblastome dans le cerveau, une fenêtre crânienne, des injections puis une perfusion intracardiaque, et peut développer selon le porteur une perte de poids, une prostration, une ataxie et des difficultés à respirer irréversibles au fil de la croissance tumorale. Les souris sont isolées une par cage de la chirurgie jusqu'à la mise à mort, 21 ou 28 jours plus tard, le porteur reconnaissant que cet isolement est "vivement déconseillé" tout en le jugeant nécessaire pour préserver le montage crânien. Il conclut qu'aucune méthode ne peut se substituer à l'animal pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans cette tumeur cérébrale.

Objectifs

Dans une étude préliminaire nous avons déterminé quelles cellules immunitaires sont recrutées au site tumoral après traitement au mimétique de SMAC (données non publiées). Dans ce projet nous voulons désormais déterminer leur rôle fonctionnel à savoir si ces cellules sont pro- ou anti-tumorales

Bénéfices attendus

Le GBM est une tumeur cérébrale dont le pronostic est sombre. Il n’existe aucun traitement curatif et la survie médiane des patients est d’un an avec un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Déterminer le rôle bénéfique ou néfaste des moDCs et microglie activée dans la progression tumorale et dans la réponse au traitement permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) greffe intra-cérébrale (110 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ); 2) pose d’une fenêtre crânienne à la fin de la greffe tumorale pour le suivi par imagerie (110 animaux); 3) injection i.p. pour l'anesthésie des animaux avant les greffes intra-cérébrales et les perfusions intracardiaques (110 animaux, quelques secondes d'intervention); 4) Injections sous-cutanées d'analgésiques lors des greffes intra-cérébrales et la perfusion intracardiaque (110 animaux, quelques secondes d'intervention); 5) injection retro-orbitale pour le traitement au véhicule ou à la GDC- 0152 (110animaux, quelques minutes d'intervention sous anesthésie) ; 6) Perfusions intracardiaques (110 animaux, 10 minutes d'intervention).

Impact sur les animaux

La greffe cellulaire intracérébrales sera exécutée sous anesthésie et les souris recevrons une analgésie après intervention chirurgicale pour limiter toute souffrance, donc la chirurgie ne devrait pas induire la souffrance de l’animale. L’implantation de la fenêtre crânienne est aussi généralement bien tolérée. La perte de poids est le paramètre principal qui reflète la progression tumorale et peut être associée à une diminution de l’activité motrice. Les déficits moteurs, caractérisés par une forte diminution ou manque de déplacement ainsi qu’une prostration, ataxie et difficultés à respirer peuvent être rencontrés pendant les derniers jours d’observation à cause du développement tumoral et sont irréversibles. Nous veillerons à contrôler l’apparition de ces symptômes. Ces signes cliniques ainsi qu’un score de souffrance supérieur ou égal à 10 (voir grille de scores en annexe), ou la perte de la fenêtre crânienne, seront considérés comme points limites.

Devenir

Procédure 1: les animaux seront euthanasiés après 21 jours ( n= 55) ou 28 jours (n=55) après greffe tumorale.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine. Notre choix d’utiliser les souris pour récupérer les cellules tumorales et immunitaires et effectuer des essais sur membrane chorioallantoïque de poulet s’inscrit toutefois dans une démarche de réduction et remplacement.

Réduction

Conformément aux exigences de réduction du nombre d’animaux, le nombre d'animaux prévus dans chaque groupe sera basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement et les cages changées et nettoyées toutes les semaines. Les souris seront hébergées à raison de 5 animaux par cage jusqu’à la chirurgie et de 1 par cage après chirurgie et pose d’une fenêtre crânienne. Bien que l’isolement des animaux soit vivement déconseillé, ce protocole nécessite néanmoins de mettre 1 animal par cage après chirurgie. Les animaux doivent être 1 par cage afin de préserver leur chirurgie et leur « chapeau » nécessaire à l’analyse par microscopie. Les expériences précédentes effectuées dans le laboratoire ont montré que plusieurs animaux dans une même cage s’enlèvent mutuellement le « chapeau » et peuvent ainsi se blesser ou blesser l’animal concerné. Par ailleurs, si le chapeau est enlevé les risques d’infection sont augmentés. Les souris restent isolées du jour de leur implantation jusqu’à leur sacrifice, c’est-à-dire 21 ou 28 jours selon les groupes. La durée de l’expérimentation est donc relativement courte. Les souris seront en présence d’un enrichissement (« nestlets », nid végétal, igloos en polycarbonate). Après 7 jours d'acclimatation, les animaux seront anesthésiés avant la chirurgie et en postopératoire une analgésie est prévue jusqu’à que l’animal ne manifeste plus de signe de souffrance. L'évaluation de la douleur sera effectuée en fonction de la perte de poids des animaux, de changement dans leur comportement, ou de l'apparition de signes cliniques de souffrance. En cas de souffrance de l’animal une analgésie sera administrée jusqu'à ce que l'animal ne manifeste plus ces signes.

Choix des espèces

Ce projet consiste à caractériser la réponse immunitaire à la suite d’au traitement au mimétique de Smac et ne permet donc pas d'autre alternative. Les souris C57BL6 seront utilisées lorsque le système immunitaire sera mature c’est-à-dire à partir de 7 semaines.

Génotypées par une biopsie d'un doigt, puis soumises à des mesures de force de préhension et à un entraînement à l'exercice, des souris, dont des mutantes pour le gène Tigd4, sont ensuite anesthésiées pour mesurer la force contractile de leurs muscles par huit stimulations d'une demi-seconde. Au total, 640 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, et le porteur annonce des effets indésirables chez les mutantes "en raison de leur faible musculature". Il décrit les mesures de force et l'entraînement comme des procédures durant lesquelles "les souris ne souffrent pas", sans préciser la nature ni la durée de cet entraînement, et prévoit pourtant une paralysie possible des pattes arrière et une échelle de douleur qui monte jusqu'à "douleur intense". Encore sous anesthésie après la mesure de force, toutes sont tuées pour prélever leurs muscles.

Objectifs

Le rôle principal des cellules musculaires squelettiques est de se contracter générant une force énorme. Si cette force n'est pas correctement amortie, les cellules musculaires se rompent et la fonction musculaire échoue. Les cellules musculaires gèrent ce problème en dissipant la force vers les tendons qui sont situés à ses deux extrémités. Elles forment une jonction spécialisée avec le tendon, appelée jonction myotendineuse (JMT). La JMT est donc le principal site de blessure lorsque nous faisons de l'exercice. Cependant, nous savons très peu de choses sur la façon dont elle est régulée et sur les gènes qui sont importants à sa fonction. Habituellement, les cellules du corps humain ont un noyau par cellule. En revanche, les cellules musculaires squelettiques possèdent des centaines de noyaux à l'intérieur d'une seule cellule. Il est important de noter qu'un sous-ensemble de ces nombreux noyaux remplit des fonctions spécialisées, par exemple celles de la JMT. Notre équipe a récemment identifié un gène non étudié, appelé Tigd4, qui est fortement exprimé uniquement dans les noyaux musculaires de cette jonction, mais pas dans les autres noyaux musculaires éloignés de la JMT. Cette découverte fait de Tigd4 un gène candidat intéressant à étudier plus précisément. Pour ce faire, un service de notre institut génère des souris génétiquement modifiées portant une mutation dans le gène Tigd4. Notre équipe étudiera le résultat de la mutation de Tigd4 dans la JMT et la fonction musculaire.

Bénéfices attendus

Notre étude établira que Tigd4 est un régulateur important de la JMT, qui est avec les cellules musculaires essentielle au bon fonctionnement des muscles. Par conséquent, ce projet aura de nombreux avantages dans les domaines de la biologie musculaire, de la biologie de l'exercice physique, et des maladies qui provoquent des défaillances au niveau de la JMT.

Procédures

1. Prélèvement de biopsie digitale pour l’identification et le génotypage : Il s'agit d’une procédure très rapide qui prend moins d'une minute par animal. Les souris seront remises dans leur cage après l'expérience où elles seront surveillées pendant leur rétablissement. 2. Mesure de la force de préhension et entraînement à l’exercice : Il s'agit de procédures non invasives durant lesquelles les souris ne souffrent pas. Les souris retourneront ensuite dans leur cage d'origine. 3. Mesure de la force contractile in situ : Cette procédure est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation. Après la procédure, les souris encore sous anesthésie seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

Les animaux mutants devraient avoir des effets indésirables en raison de leur faible musculature. La mesure de la force contractile in situ sera réalisée sous anesthésie et sous antalgiques.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux après leur mise à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Les souris sont nécessaires pour ces expériences dans le but de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des cellules musculaires. Les modifications génétiques qui ne sont possibles que chez la souris nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées et donc la physiopathologie. Ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro.

Réduction

Nous prenons plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Mesure 1 : De multiples essais fonctionnels seront réalisés chez la même souris. Mesure 2 : Les animaux utilisés pour vérifier la viabilité des mutants seront utilisés pour les expériences histologiques et fonctionnelles, ce qui réduira également le nombre d'animaux utilisés. Mesure 3 : La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris minimum nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes.

Raffinement

Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. La mesure de la force contractile in situ sera effectuée sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter puis les animaux seront sacrifiés avant leur réveil pour le prélèvement des tissus musculaires.

Choix des espèces

Pour caractériser la physiologie du muscle, nous devons réaliser des expériences in vivo chez la souris car les modifications génétiques sont mieux établies dans ce modèle. Le projet est basé sur nos récents travaux chez la souris qui ont permis de découvrir un gène fortement et spécifiquement exprimé dans la JMT. Par conséquent, la souris est le modèle le plus approprié pour ce projet. Le moment où la mutation de ce gène montrera une altération observable est une question ouverte à ce jour et nous ne pouvons pas le prédire précisément à ce stade.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par voie intraveineuse avec la levure Candida albicans pour reproduire une candidose invasive, suivies par température rectale pendant vingt et un jours, une partie recevant des antifongiques ou un produit d'immunothérapie. Le porteur indique qu'une proportion des souris ne survivra pas, mortes de l'infection ou tuées quand leur état se dégrade, et qu'une hypothermie déclenche la mise à mort. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise une infection fongique systémique et ses réponses immunitaires.

Objectifs

Chaque année, environ 250000 personnes dans le monde sont atteintes de candidémie (forme la plus courante des candidoses invasives) et 50000 en meurent en raison de sa détection tardive, du nombre limité d'antifongiques utilisables et de l'accroissement de l'apparition de souches résistantes. Candida albicans est une levure commensale de la peau et des muqueuses. Elle utilise donc notre organisme à son avantage sans que nous y trouvions un quelconque bénéfice ou inconvénient. Ce commensalisme repose sur un équilibre entre levure/microbiote et défenses immunitaires de l'hôte. En cas de rupture de l'équilibre, la levure colonise de manière excessive l'organisme hôte. Les causes sont: -utilisation à long terme/de façon répétée d'antibiotiques à large spectre -rupture de la barrière cutanée/gastro-intestinale (chimiothérapie/chrirurgie gastro-intestinale/perforation/utilisation de cathéter veineux). Ces ruptures provoquent une colonisation de l'intestin permettant le passage des levures dans le sang (candidémie) et la dissémination dans les organes (candidose disséminée). Candida fait parti des 10 causes les plus fréquentes de candidémies, et leur taux de mortalité est de 42% à 30 jours, résultant d'un diagnostic souvent tardif du pathogène impliqué. Le traitement est basé sur 3 classes d'antifongiques. La résistance naturelle des souches de Candida est à prendre en compte lors du traitement des candidoses invasives ainsi que le problème du développement des résistances acquises qui est de plus en plus présent depuis les 20 dernières années. Il est donc urgent de trouver des thérapies alternatives à ces antifongiques et/ou d'en limiter la consommation afin de réduire l'émergence de nouvelle résistace. Ce projet vise à mettre au point 2 modèles murins de candidose invasive traitée ou non aux antifongiques comme outils permettant de tester différents produits d'immunothérapie dans le but de lutter contre la résistance aux antimicrobiens classiques. Le premier modèle est utilisé dans l'optique de combiner un produit d'immunothérapie au traitement antifongique afin d'en réduire sa consommation/durée. Le second vise à tester un produit d'immunothérapie seul afin d'être une alternative au traitement antifongique. Dans notre programme, différents produits seront donc testés pour vérifier leur capacité à éliminer/contrôler l'infection, et comprendre les mécanismes mis en jeu suite à leur administration en présence et en absence d'antifongiques.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements contre la candidose invasive basée sur la stimulation du système immunitaire des patients, afin de venir en support ou en remplacement des antifongiques, dont l’utilisation excessive permet l’émergence de souche résistante(s)/multi-résistante(s). Les bénéfices attendus à court terme doivent permettre : -de mettre en place les modèles animaux pertinents pour tester un premier produit d’immunothérapie, -d’améliorer la survie des animaux atteints de candidose invasive avec ou sans antifongiques, -l’avancement des connaissances scientifiques sur un produit d'immunothérapie injecté par voir intraveineuse dans un modèle de candidose invasive avec ou sans antifongiques, -d’utiliser un tel produit d’immunothérapie, comme traitement aussi bien dans les candidoses invasives sensibles ou comme alternative aux antifongiques. Les bénéfices attendus à long terme doivent permettre : -de tester différents produits d’immunothérapie dans l’indication de la candidose invasive sensible, -de présenter des données robustes aux autorités réglementaires afin de soutenir le développement clinique d’un ou plusieurs produits d’immunothérapie pour espérer obtenir ensuite une autorisation de mise sur le marché pour soigner les patients atteints de candidose invasive seul ou en association avec des antifongiques -de se substituer aux antifongiques ou d’en diminuer leur consommation dans les soins intensifs.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -infection à Candida albicans par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 100% des animaux -Administration des antifongiques par injection intrapéritonéale pour 50% des animaux (2 fois maximum/souris et 1 min/animaux) -Injection d'un tampon par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 8% des animaux -Injection d’un produit d’immunothérapie, parmi les 3 produits à visée thérapeutique à tester, par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 49% des animaux) -Suivi quotidien des animaux: prise de température interne pa voie rectale (30 secondes/souris) pendant 21 jours maximum pour 100% des animaux -Prélèvement de sang sous anesthésie locale (30 secondes/souirs) pour 100% des animaux

Impact sur les animaux

Les souris vont être inoculées par voie intraveineuse par Candida albicans à différentes doses afin de mimer la pathologie humaine, après anesthésie locale et générale gazeuse. La candidose invasive étant une infection mortelle chez l’homme dans 42% des cas, Il est donc attendu qu’une proportion de nos animaux ne survive pas, soit directement de leur infection, soit par mise à mort en raison de leur état général dégradé. Il est probable que la proportion d’animaux ne survivant pas, soit plus importante dans la première procédure que dans les deux suivantes, le but de ces dernières étant de trouver un équilibre entre mortalité et survie afin de pouvoir répondre aux questions posées. On peut s’attendre à ce que l'état général des animaux se dégrade, avec par exemple une perte/baisse de leur mobilité, une perte de poids et à une élévation ou une diminution de la température interne chez ces animaux, suite au développement de la candidose invasive, pendant 2-3 jours. Une partie des animaux va recevoir un traitement antifongique par injection intrapéritonéale, engendrant une légère douleur au point d’injection au moment de celle-ci. Puis certains animaux recevront une injection d’un produit d’immunothérapie parmi les 3 produits à tester, par voie intraveineuse après anesthésie locale et générale gazeuse. L’injection de ces produits n’a causé aucun dommage chez la souris naïve, mais dans le contexte de candidose invasive traitée ou non aux antifongiques, une augmentation de la température corporelle interne est potentiellement envisageable dans les 24h suivant l’injection. Un prélèvement de sang sera réalisé après anesthésie locale au moment de leur mise à mort. La douleur relative au prélèvement devrait être réduite par l’anesthésie locale et ne pas durer plus de 5 minutes, entre le moment du prélèvement et celui de la mise à mort de l’animal. Il est peu probable mais néanmoins envisageable que l'on puisse observer une apparition de lésion ou une infection bactérienne suite à l'injection ou au prélèvement sanguin.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort car pour chaque procédure un certain nombre d'organes sont prélevés, ce qui nécessite la mort de l'animal, afin de caractériser ceux touchés par l'infection et ceux qui ont été impactés par le traitement d'immunothérapie. Cela permettra de déterminer les organes dans lesquels la réponse immunitaire sera étudiée plus précisément dans la suite du programme.

Remplacement

Les objectifs de ce projet sont la mise en place deux modèles de candidose invasive traitée avec ou sans antifongiques afin d’évaluer la capacité de traitement d’immunothérapie à améliorer l’état général de ces animaux, dans le but à plus long terme d’en étudier les conséquences immunologiques sur un organisme vivant, entier. Afin de répondre à ces objectifs, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser une infection fongique systémique, ni les réponses immunitaires mises en jeu lors de ces infections avec ou sans traitement antifongiques et/ou d’immunothérapie.

Réduction

Tout au long du projet, nous essaierons de réduire le nombre d’animaux sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le nombre de souris par groupe a été déterminé à la suite d’une étude préliminaire, qui a permis d’estimer la variabilité du modèle et d’atteindre une différence statistique entre les 2 groupes quand le produit augmente significativement la survie de 30%. Le nombre de souris pour répondre à la question posée étant trop important pour être maniulé en une seule fois, un premier lot de 10 souris par groupes sera utilisé. Si ce nombre ne suffit pas pour répondre significativement à la question, un autre lot de 10 souris par groupe sera réalisé jusqu'à atteindre les 30 souris théoriquement suffisantes pour y répondre avec une différsence statistique entre les groupes. Toutefois, si un problème technique devait intervenir sur un ou plusieurs groupes des ces 3 séries et qui empêcherait d'obtenir une différence significative entre certains groupes (ce qui rendrait la conclusion incertaine), ces groupes seraient répétés en procédant de la même manière qu'au-dessus. De cette façon, dès que le nombre d'animaux est suffisant pour répondre à la question posée avec une différence significative entre les groupes, l'expérience s'arrête. Le nombre de souris restant, prévu pour répondre à la question mais n'étant pas encore commandé ne sera donc pas utilisé. De plus, si nous n’arrivons pas à trouver les conditions d’injections du produit d’immunothérapie pour qu’il augmente la survie des animaux de 20% minimum,le projet sera arrêté. Les résultats obtenus seront utiles pour la suite du programme. En effet, un certain nombre d'organes seront prélevés post mortem afin de caractériser ceux touchés par l’infection et ceux qui ont été impactés par le traitement d’immunothérapie et donc déterminer les organes dans lesquels la réponse immunitaire sera étudiée dans la suite du programme. Enfin, s’il est impossible d’obtenir les résultats souhaités dans l’un des deux modèles de candidose invasive, il sera alors abandonné dans les procédures restant à réaliser.

Raffinement

Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie générale gazeuse après application d’un anesthésique local. Les prélèvements sanguins se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. La mort des animaux intervient minimum 3 jours après l’infection par Candida albicans. Les animaux seront donc suivis une fois par jour pendant les 2 premiers jours post-infection. Pendant la durée présumée durant laquelle la mortalité est attendue, entre J3-8, les animaux seront suivis matin et soir. Enfin, une fois passé cette période critique et en fonction de l’état général des animaux observé, la fréquence de suivi sera adaptée jusqu’à la fin de la procédure. En période critique, J3-8, le suivi du matin, consistera en une surveillance de l’état général des animaux (poils, posture, mobilité…), leur poids, leur température prise par voie rectale, ainsi que le site d’injection de Candida albicans et des produits d’immunothérapie. Le suivi du soir consistera en une évaluation visuelle de l’état des animaux. En période non critique (J0-2 et J9-21), le suivi du matin, consistera en une surveillance de l’état général des animaux (poils, posture, mobilité…), ainsi que le site d’injection de Candida albicans et des produits d’immunothérapie. Le suivi du soir consistera en une évaluation visuelle de l’état des animaux. Tout animal dont le comportement est anormal, sera sorti de la cage et sera traité comme le matin en période critique, afin de déterminer si son état requiert ou non une mise à mort anticipée. Pour éviter toute douleur inutile aux animaux, du paracétamol sera donné dans l'eau de boisson à tous les animaux pendant une durée maximale de 6 jours de J2-8, période attendue de la mortalité des animaux. Ce traitement pourra être renouvelé si besoin après une pause thérapeutique de 3-4 jours. En cas de lésion, les yeux seront nettoyés au sérum physiologique. Si une infection bactérienne et/ou dégradation de l'oeil sont observées, l'animal sera mis à mort. En cas d'hypothermie d'un animal, il sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle animal établi et reconnu pour réaliser de premières étudies de preuve de concept mettant en jeu un système immunitaire complet. En effet, le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant initié une étude préliminaire dans cette espèce qui a donné des résultats encourageants, il nous semble pertinent de poursuivre les investigations dans le même modèle. Les produits d’immunothérapies qui sont développés dans ce programme ont pour visée d'être utilisés chez l’homme. Ils cibleront des patients adultes. Nous cherchons à faire une preuve de concept de l'efficacité des produits d'immunothérapie dans des animaux ayant un système immunitaire fonctionnel. Pour cela, nous utiliserons des souris d’au moins sept semaines pour ces études précliniques.

Pour optimiser des vaccins à ARNm contre des antigènes tumoraux et choisir leur voie d'administration, 828 souris C57BL/6J vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont vaccinées dans la veine de la queue ou par le nez sous anesthésie, ou dans le muscle sans anesthésie, et une partie est rendue porteuse de tumeurs de la joue, par injection, ou du poumon, par un moyen que le RNT ne décrit pas. Ces souris peuvent perdre du poids, s'isoler, avoir du mal à respirer ou présenter une tumeur de la joue nécrosée et ulcérée, et leur mise à mort anticipée dépend de points limites que le porteur ne détaille pas. En fin d'expérience, sous anesthésie, les souris subissent une prise de sang, un lavage broncho-alvéolaire et une perfusion intracardiaque, pour des vaccins dont le porteur écrit qu'ils "pourront à terme être utilisés chez l'homme".

Objectifs

Le cancer demeure la principale cause de mortalité au monde malgré de réels progrès dans les traitements médicaux. Actuellement les traitements les plus prometteurs reposent sur l’immunothérapie, qui consiste à stimuler et/ou réactiver le système immunitaire afin d’induire des réponses anti-tumorales efficaces et spécifiques. Une des stratégies d’immunothérapie consiste à vacciner avec des antigènes tumoraux. L’efficacité de ces vaccins anti-cancer peut être optimisée en travaillant sur leur composition afin de diminuer la dose injectée et sur la voie d’immunisation la plus adéquate. En effet, la majorité des vaccins est administré par voie systémique (sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique). Mais dans le cas de cancers localisés dans les muqueuses comme le cancer du poumon ou de la sphère ORL, des travaux ont montré que la vaccination par voie muqueuse (ex :intranasale) est plus efficace pour d’induire localement une réponse immune plus importante. Dernièrement, le succès des vaccins ARNm dans la lutte contre la Covid-19, a suscité un nouvel engouement pour ce type de vaccin. Et une des premières applications cliniques des vaccins ARNm a été pour traiter le cancer. L’objectif de ce projet est d’optimiser des vaccins à ARNm contre des antigènes tumoraux et d’évaluer leur efficacité chez la souris. Pour cela, les souris seront vaccinées avec différentes formulations de vaccins ARNm et différentes voies d’immunisation et nous analyserons la réponse immune. La meilleure formulation sera ensuite testée chez des souris porteuses de tumeurs du poumon ou de localisées dans la sphère ORL afin de voir si le vaccin peut inhiber la croissance tumorale. Ce projet permettra de développer de nouvelles thérapies innovantes pour traiter le cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer et de valider un nouvel outil thérapeutique dans le traitement contre le cancer basé sur la technologie innovante des vaccin ARNm avec une optimisation de : - la formulation de l’’encapsulation de l’ARNm - la voie d’immunisation - la vectorisation de l’antigène Ces vaccins pourront être administré en association avec des traitements actuellement utilisés en clinique ( ex : les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires négatifs comme anti-PD-1) pour en maximiser les effets. Ces vaccins pourront à terme être utilisés chez l’homme pour le traitement des tumeurs localisés dans les voies muqueuses (cancer du poumon, de la sphère ORL).

Procédures

Injection par voie intraveineuse sur animaux sous anesthésie gazeuse : 2 injections à 2 semaines d’intervalle ou 3 injections à 1 semaine d’intervalle; durée totale environ 5 min. Injection par voie intramusculaire sur animaux vigiles : 2 injections à 2 ou 1 semaines d’intervalle; durée totale du geste 1-2 min. Injection par voie intranasale sur animaux sous anesthésie générale : 2 injections à 2 ou 1 semaines d’intervalle; durée totale environ 30 min. Injection de cellules tumorales dans la joue sur animaux sous anesthésie générale : 1 injection; durée totale environ 30 min. Injection par voir intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours);durée totale du geste 1-2 min. Sur animaux sous anesthésie générale : Prélèvement de sang ( 500μl), Lavage broncho alvéolaire (5x 1ml), perfusion intracardiaque;durée totale environ 30 min.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections par voie intraveineuse, intramusculaire et intrapéritonéale ne sont pas connus pour engendrer des nuisances ou douleurs. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 3 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids pu présenter des signes évocateurs de souffrances tels que des troubles du comportement (immobilité, isolement...) et de l’aspect physique (dos vouté, apparence du poil...). Pour les tumeurs du poumon les souris peuvent présenter des difficultés à respirer ( bien que dans la littérature ces signes sont généralement décrit à partir de 4 semaines). Pour les tumeurs de la joue, une nécrose, ulcération de la tumeur peuvent apparaitre.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes pour l'étude des réponses immunes

Remplacement

Le microenvironnement tumoral est complexe, de même que les réponses immunitaires impliquées dans la réponse immune antitumorale. L’efficacité d’un vaccin ne peut être évalué que dans des organismes entiers et les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement tumoral. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme.

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été déterminées selon des données déjà publiées (cinétique de vaccination, doses, nombre de cellules tumorales à injecter). Nous avons pu déterminer un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel pour garantir une analyse statistique fiable. Des groupes de 10 animaux pour tester l’efficacité des vaccins, et pour le groupe vacciné avec notre vaccin de référence le nombre est réduit à 6. Pour les souris porteuses de tumeurs des groupes de 12 sont nécessaires puisqu’il existe une certaine hétérogénéité de la croissance tumorale. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les injections intranasales et les injections de tumeurs dans la joue sont réalisées sous anesthésie générale pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillées jusqu’à leur réveil. Les injections par voie intraveineuse, via la veine de la queue, sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse placés sur tapis chauffant. Les injections par voie intramusculaire et intrapéritonéales ne sont pas connus pour engendrer de douleurs particulières et sont réalisées sur animaux vigiles après désinfection à l’éthanol 70% de la surface d’injection. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations déjà utilisés en clinique ou pré-clinique. Les animaux sont élevés en cages enrichies, et regroupés en groupes sociaux afin d’éviter leur isolement ( 5 souris maximum/cage). Les animaux seront acclimatés au minimum 1 semaine avant le début de toute expérimentation. Pour les animaux le nécessitant, la prise alimentaire et l’hydratation seront facilités avec un enrichissement dans la cage de croquettes humidifiées et de gelée hydratante. La croissance tumorale est mesurée 2fois/semaine à l'aide d'un pied à coulisse par les expérimentateurs. Une évaluation quotidienne de l’état général de l’animal basée sur des points limites sont établis. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie, en cas de comportement anormal le responsable du projet est alors averti. L’observation de point limite induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris C57bl/6J. Ce modèle est parfaitement maitrisé dans l’équipe qui dispose de nombreux outils (lignées tumorales syngéniques, vaccins) Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 8 semaines. Cela permet d’avoir un système immunitaire entièrement développé et à cet âge les souris tolèrent bien une anesthésie générale.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par des bactéries multi-résistantes puis reçoivent un anticorps monoclonal par voie intrapéritonéale, avant mise à mort trois à cinq jours plus tard pour prélever rate, foie et poumons. Le porteur indique que l'infection peut provoquer fièvre, difficultés respiratoires et perte de poils, des points limites permettant une mise à mort précoce. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour évaluer le traitement en présence d'un système immunitaire complet et du microbiote.

Objectifs

En 2017, l’OMS a publié une liste des agents pathogènes prioritaires et les a classés en 3 catégories : critique, élevée et moyenne. Dans le groupe le plus critique se trouvent les bactéries multi et pan-résistantes (MDR ou PDR) aux antibiotiques qui sont un problème mondial et qui représentent une menace en particulier dans le milieu hospitalier. Dans ce groupe, on retrouve Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter et de nombreuses Enterobacteriaceae telle que E. coli ou encore Klebsiella qui ont acquis une résistance aux carbapénèmes et aux céphalosporines qui à l’heure actuelle constituent les meilleurs traitements contre ce type de bactéries. Pour remédier à ce problème, l’élaboration de nouveaux traitements est essentielle ce qui à court terme veut dire la synthèse de nouveaux antibiotiques. Or toujours d’après l’OMS, en 2020 seulement 2 candidats parmi 32 ont pour cibles ces bactéries multi-résistantes. C’est pour cela qu’il est crucial d’orienter les recherches vers d’autres molécules tels que les anticorps antimicrobiens. Les anticorps sont des molécules naturellement produites lors d’une infection et constituent une des voies de défense face à un pathogène ; mais on peut également les synthétiser. Il a par exemple été montré dans des études préliminaires la présence d’un polysaccharide de surface chez certaines de ces bactéries multi-résistantes telles que E. coli ou encore S. aureus. Cet antigène pourrait s’avèrer être une piste assez intéressante dans le développement de nouveaux traitements. De précédents travaux utilisant la vaccination passive (anticorps monoclonaux) ou active (vaccination classique) ciblant cet antigène ont permis de montrer l’efficacité de ce dernier en induisant spécifiquement la mort des bactéries présentant à leur surface ce sucre mais également en protégeant des souris contre ces bactéries. Notre projet de recherche s’inscrit donc dans la continuité de ces données préliminaires et vise à développer de nouvelles méthodes de traitement contre les bactéries multi-résistantes.

Bénéfices attendus

Ces travaux couplés à une étude in vitro nous permettront de déterminer précisément l’action favorable liée à l’utilisation de thérapeutiques innovantes comme les anticorps monoclonaux, en présence ou en absence d’une antibiothérapie lors d’une infection par des bactéries, y compris multi-résistantes. Ces nouvelles thérapeutiques visent non seulement à lutter efficacement contre les infections causées par les bactéries multi-résistantes mais aussi à réduire la pression de séléction induite par les antibiotiques, ce qui permettra de diminuer l’émergence et la dissémination de la résistance aux antibiotiques.

Procédures

Infection bactérienne et administration de l’anticorps monoclonal par voie intra-péritonéale. Les animaux provenant de la procédure 1 seront sacrifiés au maximum 5 jours après le début de l'infection puis la rate et le foie seront prélevés. Concernant les animaux de la procédure 2, la mise à mort sera effectuée 3 jours au maximum après l'infection et à la fin de la procédure les poumons seront prélevés.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer des infections à des bactéries pathogènes y compris multi-résitante aux antibiotiques. Ces infections peuvent provoquer une augmentation de la température corporelle, des difficultés respiratoires ou encore une perte des poils. Dans le cadre d’un traitement aproprié on s’attend à voir ces effets regresser dans le temps. En revanche pour les conditions ou le traitement sera inaproprié ces effets vont s’aggraver mais la mise en place de points limites spécifiques vont permettre d'euthanasier les souris de façon précoce.

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Des études in vitro préliminaires ont permis d’établir les doses optimales d’anticorps à utiliser. Cependant l’emploi du modèle animal nous est indipensable afin d’étudier son effacité en présence ou en absence d’un système immunitaire complexe, l’impact du microbiote ou une antibiothérapie couplée à l’utilisation d’anticorps monoclonal. De plus, s’agissant du développement d’une nouvelle stratégie curative l’expérience sur l’animal est justifiée avant l’application sur l’homme.

Réduction

Nous utiliserons une lignée consanguine dont le fonds génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Nous limiterons notre projet à l’étude de quatre souches bactériennes. Nous utiliserons pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative. Par nos expériences passées, il est estimé qu’un groupe de 8 animaux est suffisant pour obtenir une étude statistique.

Raffinement

Pour réduire le stress et l’angoisse des souris, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton). L’objet de notre étude est de trouver un traitement efficace lors d’infection par des bactéries multi-résistantes. Pour limiter au maximum la douleur et la souffrance associée au sepsis sévère et notamment lors de la fin de vie, nous avons choisi d'euthanasier les animaux bien avant la mort induite par l’infection.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée et reconnue comme modèle d’infection systémique à E. coli et d’autres bactéries. Cette approche expérimentale permettra d'étudier non seulement le moyen optimal de déployer les anticorps monoclonaux (ou autres thérapies innovantes) en même temps que les thérapies par antibiotiques standard. Elle permettra également de tester l'efficacité de ces nouvelles thérapies, en particulier lorsqu'elles sont administrées après le début de l'infection tout en évaluant l’impact du microbiote ou du rôle du système immunitaire. Afin de réduire au maximum la variabilité de nos résultats nous n’utiliserons que des animaux adultes du même âge (6 à 8 semaines).