Procédures sévères

5040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le protocole repose sur le modèle resident-intruder, où des souris territoriales attaquent des congénères introduites dans leur cage, jusqu'à quatre confrontations par animal, avec administration de composés puis prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien. Le porteur reconnaît que la souche est agressive et que des attaques entre animaux sont à prévoir, pour tester des molécules censées réduire l'agressivité liée à des maladies comme Alzheimer. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution in vitro ou in silico pour évaluer un comportement agressif.

Objectifs

L’agressivité est un instinct biologique de l’homme et de l’animal, sous-tendue par l’instinct de survie pour soi-même ou pour ses proches ou encore par l’instinct de reproduction. En ce sens, elle représente une manifestation normale et même nécessaire, car elle représente l’énergie qui permet à l’individu de développer une personnalité capable de s’affirmer et de se défendre par rapport aux autres. Par contre lorsque l'agressivité n'est plus canalisée ou maîtrisée, elle devient pathologique. Elle constitue un symptôme qui apparait dans différentes pathologies cérébrales (comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson). Le but de ce projet est de démontrer la capacité de différents produits à réduire l'agressivité territoriale chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter l'agressivité chez l'homme, symptôme pouvant survenir dans certaines pathologies comme la maladie d'Alzheimer (environ 32 millions de personnes atteintes dans le monde et 9.9 millions de nouveaux cas en 2015) ou la maladie de Parkinson (environ 10 millions de personnes atteintes dans le monde). Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.

Procédures

Une partie des animaux sera isolée (résident) afin de leur permettre de développer leur sentiment de propriété territoriale pendant toutes la durée de l'expérience et subira jusqu'à 4 tests (mise en présence avec un animal "intrus"), et l'autre partie des animaux sera introduite dans la cage du « résident » et pourra subir des manifestations agressives de la part du résident (au maximum 3 confrontations par animal). Les animaux résidents recevront de 1 à 7 administrations avec les composés à tester. Sur ces mêmes animaux, un à deux prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l'expérience ainsi qu'un prélèvement de liquide céphalo rachidien sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l’objet d’échange avec le responsable bien être pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiper au mieux de potentiels signes cliniques. La souche de souris utilisée étant agressive, des attaques entre congénères sont à prévoir. L’impact négatif pour l’animal sera réduit au maximum en isolant si besoin les animaux les plus agressifs. L'administration et le prélèvement de sang sont effectués par un personnel entrainé et la douleur associée est réduite à son minimum et sera l'équivalent d'une piqure. Concernant le prélèvement de liquide céphalo rachidien, celui ci est effectué sous anesthésie sans réveil, et sera considéré sans douleur associée.

Devenir

Euthanasie des animaux à la fin des expériences étant donné la gravité de la procédure et/ou sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal et/ou sacrifice des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le comportement agressif, ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 12 / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux conditions expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales la plus pertinente et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur l'agressivité car elle présente un comportement de territorialité et a une tendance naturelle à développer un comportement agressif vis-àvis d'un intrus qui entre sur son territoire. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie pour l'implantation de métastases hépatiques, puis des injections, des séances d'imagerie et une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que les effets indésirables attendus tiennent à la croissance des tumeurs et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour tenir compte de la physiologie de l'organisme complet. Le projet vise à valider chez la souris un système de régulation d'un gène par la nutrition avant un éventuel transfert à l'humain.

Objectifs

ll est nécessaire de valider notre système de régulation génique par la nutrition dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Nous avons choisi le modèle des métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC), pour son intérêt médical, sa faisabilité et son transfert rapide en médecine humaine. En effet, le foie est le site privilégié des métastases du cancer colorectal puisqu'il concerne 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans. Par ailleurs, notre voie de régulation est très réactive dans le foie. Nous avons ainsi choisi d’utiliser ce système de régulation génique dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons maintenant valider notre approche de régulation génique par la nutrition dans un modèle animal pour le traitement d’une pathologie de façon à pouvoir rapidement transférer cette technologie à l’homme. Nous avons choisi d’utiliser ce système de régulation génique par la nutrition dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour implanter les métastases hépatiques (Procédure 1, 30 min par souris). Cette procédure inclut également une injection en sous-cutané d'un analgésique sur animal vigile (10 à 15 min avant la chirurgie). Un agent de contraste sera injectée en intra-péritonéal sur animal vigile avant anesthésie gazeuse pour évaluation de l'expression génique par imagerie optique 2 fois par semaine (Procédure 2, 15 min par souris). L'expression génique sera induite par une injection d'un plasmide porteur du gène d'intéret dans la veine de la queue au début de l'expérimentation, sur animal vigile (Procédure 3, 10 min par souris). Un anticorps sera injecté en intra-péritonéal sur animal vigile une fois par semaine (Procédure 5, 1 min par souris). Du sang sera prélevé chez ces souris, 2 fois au cours de l'expérimentation esur animal vigile (Procédure 6, 2 min par souris) et à la fin de l'expérimentation par ponction intra-cardiaque sous anesthésie gazeuse (Procédure 7, 2min par souris).

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n'est attendu concernant les procédures d'injection d'agents de contrastes ou de plasmides ou d'anticorps dans ce modèle. Les effets indérisables potentiels attendus sont liés à la croissance des métastases tumorales. Le suivi quotidien des animaux permettra de réagir rapidement en cas de signe d'inconfort et/ou de souffrance pour l'animal.

Devenir

Les animaux seront réutilisés pour les procédures 1 à 6. A l'issue de la procédure 7 les animaux seront anesthésiés par anesthésie gazeuse à l'isoflurane puis sacrifiés par ponction cardiaque.

Remplacement

De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro ont permis de tester l'efficacité de notre stratégie. Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris. Pour la suite de notre étude, le recours à l'animal est indispensable afin de prendre en compte la physiologie à l'échelle de l'organisme complet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal notamment pour le développement des métastases hépatiques, il s'avère indispensable de répéter les expériences.

Raffinement

Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués. Si un animal présentait un état douloureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en œuvre du projet, et si nécessaire, anesthésié puis euthanasié. Par ailleurs, nous suivrons l'évolution des métastases de façon non invasive par imagerie in vivo.

Choix des espèces

La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Les souris utilisées dans ce projet sont de fond génétique C57 Bl/6. Des souris mâles jeunes adultes de 3-4 mois sont utilisées pour le modèle murin de MHCC. Stade adulte (3-4 mois) afin de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.

Toutes tuées à l'issue lors d'un prélèvement terminal, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour provoquer chez elles une allergie alimentaire. Elles sont d'abord sensibilisées à un allergène, "généralement" une fois par semaine pendant plusieurs semaines, puis exposées de nouveau à cet allergène, avec des prises de sang à la veine sous-mandibulaire, sans anesthésie. Le porteur ne nomme ni les allergènes ni la voie d'administration, et décrit "une souffrance plus ou moins intense" dans des procédures "classées de légère à sévère", alors que la totalité de l'effectif est déclarée au niveau sévère. Il revendique un double usage, tester des médicaments contre l'allergie et évaluer l'allergénicité de "nouvelles préparations alimentaires", et affirme que l'effet des médicaments testés sur la réponse allergique des rongeurs est "prédictif de leur efficacité en clinique".

Objectifs

L’allergie alimentaire constitue une préoccupation importante en allergologie du fait de l’augmentation de son incidence au cours des dernières décennies. Les manifestations provoquées par une allergie alimentaire sont nombreuses et surviennent en général quelques secondes à quelques heures après avoir ingéré l'aliment responsable. Elles peuvent provoquer des manifestations modérées et exceptionnellement provoquer des manifestations sévères telles que l’œdème de Quincke ou le choc anaphylactique. La meilleure des solutions pour éviter une allergie alimentaire consiste à supprimer tout contact avec l’allergène. Cette éviction est relativement facile à mettre en œuvre lorsque le produit est peu utilisé dans l'alimentation quotidienne, mais plus difficile quand l'aliment est présent dans de nombreuses préparations, notamment industrielles. A ce jour, aucune thérapie n’a réellement montré son efficacité dans le domaine de l’allergie à l’arachide, contrairement à d’autres types d’allergie, excepté l’administration immédiate d’épinéphrine ou la totale éviction de l’aliment allergisant. Le développement de modèles murins précliniques à des allergènes cliniquement pertinents est donc prometteur pour évaluer non seulement de potentiels traitements pharmacologiques mais également pour tester de nouvelles préparations alimentaires.

Bénéfices attendus

Une allergie alimentaire est une réaction d'hypersensibilité immédiate qui se déroule en deux étapes : une phase de sensibilisation (premier contact de l'organisme avec l'allergène) et une phase de déclenchement (deuxième contact avec le même allergène). L'objectif est double: - mimer l'allergie et rechercher à diminuer la réponse allergique à l'aide d'agents pharmacologiques - évaluer l’allergénicité de certains aliments/formulations Après sensibilisation pendant plusieurs semaines, les souris subissent un test de provocation avec l’allergène sensibilisant. Les médiateurs de la réaction allergique précoce et tardive sont alors quantifiés. La majorité des signes cliniques observés chez l’homme sont mis en évidence chez la souris : bronchoconstriction, production locale de cytokines impliquées dans la réaction allergique,…

Procédures

Lors de la première phase, les animaux seront sensibilisés (généralement une administration par semaine) puis seront challengés avec l'allergène. Au cours de l'étude, les animaux resteront hébergés en groupe. A différents temps définis par le protocole d'étude, des prélèvements de sang seront réalisés au niveau de la veine sub-mandibulaire chez l'animal vigile. En fin d’expérience, tous les prélèvements nécessaires (histologie, prélèvement sang etc…) sont réalisés de façon à pouvoir effectuer l’ensemble des analyses nécessaires sur les mêmes lots. Cela permet de réduire significativement le nombre d’études, d’éviter d’avoir à dupliquer des expériences ou d’inclure des animaux satellites pour la vérification de paramètres complémentaires. Pour les besoins des études, les animaux peuvent être euthanasiés pour le prélèvement des organes cibles d'intérêt (cerveau, rein, …).

Impact sur les animaux

Lors de l'évaluation de l’allergénicité de certains aliments, il est attendu de voir la potentielle apparition de signes cliniques plus ou moins marqués. L’anticipation de ces effets sert à écarter des aliments pouvant provoquer de sévères réactions. Quand on cherche à moduler la réponse allergique à l'aide d'agents pharmacologiques, il est possible d'établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. Les expérimentations animales occupent aujourd’hui une place centrale dans les démonstrations. Ces études ont pour objectif de renseigner les effets secondaires ou l’efficacité des substances testées, les doses ayant induit ces effets et la vraisemblance biologique d’un effet suspecté chez l’homme. Selon la durée et la fréquence de ces événements, ces procédures engendrent une souffrance plus ou moins intense et sont donc classées de légère à sévère. Un effectif minimum de 10 souris est inclus dans les expériences pour mettre en évidence un effet suffisamment robuste. Il est donc difficile de diminuer l'effectif en fonction de la sévérité de la procédure.

Devenir

Pour les 2 procédures décrites dans ce projet, tous les animaux sont soumis à un prélèvement terminal et sont donc euthanasiés.

Remplacement

Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la réaction allergique.

Réduction

Dans le contexte de l'évaluation de composés potentiellement allergisants, la stratégie expérimentale consiste à comparer, les groupes recevant l'allergène à un groupe contrôle non-sensibilisé, l'objectif étant de réduire la réaction allergique induite par l'allergisant. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet ou plusieurs agents en comparaison par rapport à un groupe contrôle non sensibilisé. Cherchant à réverser/diminuer la réaction allergique, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent allergisant utilisé et à la substance d’essai évaluée. Compte-tenu de la variabilité de réponse connue d'un individu à une autre, 10 souris minimum sont nécessaires pour disposer de la puissance statistique suffisante et nécessaire pour comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur la réponse allergique des rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.

2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections jusqu'à deux fois par jour pendant un à trois mois, puis subissent une fois une contention forcée d'une à trois heures destinée à provoquer le stress que le projet cherche à étudier, avant d'être décapitées ou perfusées sous anesthésie. Le porteur indique que les souris génétiquement modifiées ne peuvent pas échapper à leur phénotype dommageable et que la mise à mort peut entraîner un stress pré-mortem important. Le projet répond à des demandes de laboratoires clients pour évaluer, avant les essais réglementaires, des molécules liées au stress.

Objectifs

Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour identifier des molécules anti-stress. Pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules isolées de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour se faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le Patch-clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de stress induit par une contention forcée. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central liées au stress. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aiguë, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de disponibilité dans le système nerveux central et dans la circulation sanguine. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés deux fois par jour, au maximum, pour assurer une exposition in vivo de la molécule à tester. Le protocole est en moyenne d’un mois mais peut durer jusqu’à trois mois. Les contentions répétées nécessaires à ces injections répétées génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée, soit intrapéritonéale ou soit intramusculaire. Si les animaux sont génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas par définition échapper à leur phénotype dommageable. Nous travaillerons uniquement sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Ils seront, pour les groupes subissant le stress, exposés, une seule fois entre une et trois heures maximum, à une contention qui a pour but de générer du stress que nous cherchons à étudier. Tous les animaux seront mis à mort par deux techniques, en fonction de leur âge, par décapitation rapide ou par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse juste après l’induction de ce stress.

Impact sur les animaux

Notre procédure amène des effets indésirables: *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-*- Ce projet a pour but de déclencher du stress par une contention forcée de une à trois heures, nous permettant l’étude des mécanismes du stress ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse et la décapitation rapide peuvent amener un stress pre-mortem important.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant l’étape par quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes/cage). Ils bénéficieront d’enrichissement adapté, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois d’hébergement maximum avant d’entrer dans le projet. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptômes possibles et nous adapterons notre surveillance. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 10 animaux contrôles et 10 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne significativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de cette espèce un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de cette espèce, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. Toutefois, les symptômes ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limites modifiés pour pallier des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des animaux adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée liée au stress. Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.

494 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des adultes et des souriceaux d'une semaine sont infectés par le virus Zika ou Sindbis par injection, pour étudier le rôle antiviral d'une protéine in vivo. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une cachexie avec perte de poids supérieure à 20 %, poil hérissé, prostration et rejet des souriceaux par la mère. Il affirme que le modèle souris reste "indispensable" malgré des méthodes alternatives déjà utilisées par le laboratoire.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’infection aux virus SARS-CoV-2 et Zika, deux virus d’importance médicale chez l’humain, et d’analyser les mécanismes immunitaires en jeu lors de l’infection virale. La rencontre avec un virus se traduit en effet par l’activation de multiples mécanismes de protection nommés immunité innée (interféron) et adaptative. Cependant, toutes les cellules du corps ne sont pas protégées de la même façon par ces mécanismes. En effet, le corps humain est composé de cellules dites différenciées, qui forment les organes et effectuent des fonctions spécialisées, ainsi que de cellules souches. Le remplacement des cellules différenciées dépend de la division des cellules souches, qui ont donc pour rôle de maintenir l‘architecture des tissus. Les cellules différenciées sont protégées par des mécanismes appartenant à l’immunité innée, notamment l’interféron, qui ne sont pas actifs dans les cellules souches. Malgré cela, les cellules souches sont généralement peu susceptible d’être infectées par des virus, car elles possèdent des mécanismes de défense spécifiques. Ces mécanismes peuvent être étudiés avec des modèles de souris. Par exemple, un de ces mécanismes est capable de dégrader l’ARN viral (grâce à une protéine d’intérêt) et ainsi de contrecarrer l’infection par les virus à ARN, notamment les virus Sindbis et Zika. Nous avons en effet démontré in vitro que l’activité de cette protéine d’intérêt permettait de protéger les cellules souches neuronales des virus zika et SARS-CoV-2 Le but de ce projet est d’identifier les mécanismes de stimulation de cette voie récemment identifiée qui induit une réponse spécifique anti virale efficace Pour cela, nous allons interroger la perte de notre protéine d’intérêt sur : 1) l’évolution de l’infection virale, en mesurant l’accumulation de particules virales durant l’infection 2) « l’infectabilité » et la mortalité des cellules souches dans les organes cibles du virus (intestin, cerveau, peau). 3) la capacité des cellules souches à régénérer les tissus dans les organes infectés Ce projet représente la première caractérisation du rôle de notre protéine d’intérêt in vivo. Comme cette protéine est aussi présente dans les cellules souches humaines, ce projet pourrait ouvrir la voie à l’exploration de son importance chez les patients.

Bénéfices attendus

Malgré le rôle pivot des cellules souches dans le maintien de l’architecture tissulaire, les mécanismes antiviraux qui les protègent sont peu étudiés. Nous avons récemment découvert une protéine qui protège les cellules souches en culture contre les virus à ARN. Ce projet propose d’analyser le rôle de cette protéine in vivo, en utilisant deux virus, dont Zika virus, d’importance médicale. En effet, le virus Zika a été responsable d’une épidémie massive dans les Amériques il y a quelques années. A long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle in vivo dans la protection de cellules souches, ouvrant la voie à l’étude de cette protéine chez les patients.

Procédures

Injection de virus et anticorps par voie intrapéritonéale sur animaux vigiles : 1 injection/animal Injection d'anticorps par voie sous-cutanée sur animaux anesthésiés : 1 injection/animal. Anesthésie < à 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’infection au virus Sindbis ou Zika peut entraîner, en fonction de la dose : - Une cachexie (perte de poids >20%du poids initial) - Poils hérissés et prostration - Une altération de l’état général, incluant un défaut de coloration chez les souriceaux. - Rejet des souriceaux par la mère Ces effets peuvent apparaître et durer tout au long de l’infection virale, i.e. jusqu’à sa résolution chez l’adulte out jusqu’à l’atteinte d’un point limite chez le souriceau.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à des temps déterminés pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle antiviral de notre protéine d’intérêt chez la souris, organisme vivant intégré et autonome. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 494 souris Le nombre de souris par groupe a été défini a minima. Afin d’apprécier la reproductibilité des résultats obtenus l’expérience sera répétée trois fois avec le même nombre d’animaux par groupe. Une expérience pilote permettra de sélectionner le meilleur modèle en termes de quantité de virus injecté et seul ce modèle sera utilisé dans les procédures suivantes.

Raffinement

Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les souriceaux seront manipulés a minima afin de perturber le moins possible la portée et la relation avec la mère. Les points limites conduisant à l’euthanasie des souris seront précoces et prédictifs pour l’apparition d’une douleur. Les souris seront alors euthanasiées. Les points limites spécifiques sont : - Cachexie (perte de poids >20% du poids initial) - Poils hérissés et prostration pour les adultes L’altération de l’état général de la souris sera évaluée selon une grille de score adaptée pour les souriceaux ).

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche antivirale : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez la souris. Chez les souris adultes, l’infection aux virus Sindbis et Zika est empêchée par l’activation de la réponse interféron, ce qui se traduit par une très faible réplication virale. Pour obtenir une infection robuste, des souris âgées d'une semaine sont infectées (voir les références https://doi.org/10.1128/JVI.74.7.3366-3378.2000 et https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/JVI.73.12.10387-10398.1999 pour Sindbis et https://doi.org/10.1016/j.chom.2016.03.010 pour Zika). Des souris adultes chez lesquelles la voie interféron sera bloquée seront aussi utilisées.

610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent chaque semaine, jusqu'à six semaines, une injection intra-uréthrale sous anesthésie et des prélèvements d'urine, pour tester un agent immunothérapeutique contre le cancer de la vessie. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer une inflammation urinaire et un affaiblissement de l'état général. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", aucun autre modèle n'évaluant les effets à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Le cancer de la vessie se classe au 10e rang des cancers les plus courants selon le Centre international de recherche sur le cancer. Les malades sont traités via une approche multidisciplinaire (chirurgie avec radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie). En particulier, l’immunothérapie par instillation intravésicale du Bacillus Calmette-Guerin (BCG), initiallement utilisée pour la vaccination contre la tuberculose, est fréquente. Elle a des effets prouvés sur la réduction des récurrences et de progression de la tumeur. Ces effets du BCG résultent d'une interaction entre les effets directs sur les cellules tumorales du BCG et de la réponse immunitaire de l'hôte conduisant à la production de cytokines et à la destruction des cellules tumorales. Néanmoins, ce traitement a encore des effets cliniques insatisfaisants, justifiant le développement de nouvelles thérapies. Ainsi, ce projet de recherche vise à établir une preuve de concept pour une stratégie immunothérapeutique anticancéreuse à partir de vésicules de membranes externes (ou VME en abrégé) naturellement produites par des souches d’E. coli. Des expériences ont été menées dans des lignées cellulaires modèles humaines de cancer de la vessie et dans une lignée cellulaire contrôle de vessie peu transformée afin de mesurer l'impact du traitement par les VME sur la prolifération et la survie cellulaire. Il est maintenant indispensable de vérifier l'innocuité et l'efficacité des VME par des expériences in vivo dans un modèle murin car les expériences sur cultures cellulaires ne prennent pas en compte toute la complexité d’un organisme intégré. Nous évaluerons l’innocuité du traitement en instillant des VME dans la vessie de souris saines (même protocole que pour le BCG, cette technique est maitrisée par notre équipe). Si ce traitement s’avérait toxique (ce qui est peu probable au vu des résultats obtenus avec le BCG et étant donné que le traitement est purement local), nous pourrions alors utiliser une souche bactérienne beaucoup moins toxique et disponible au laboratoire. Cette dernière souche est à réserver en dernier recours, car étant moins toxique, elle est aussi bien moins immunostimulante et est donc moins susceptible d'être efficace contre les tumeurs. Puis, en utilisant deux modèles de cancer de la vessie (induits soit par l'ingestion d'un agent carcinogène soit par une infection par un agent uropathogène), nous évaluerons l'impact d'un traitement par les VME sur les cancers de la vessie.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre d'établir une preuve de concept concernant l’efficacité d’un traitement par des VME sur les cancers de la vessie en évaluant d'une part leur inocuité sur l'animal sain et d'autre part leur(s) effet(s) sur le développement de lésions cancéreuses peu évoluées et sur la régression de tumeurs établies.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés une fois par semaine par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane), pendant au maximum 6 semaines, afin de réaliser l'injection de VME ou de produits contrôles (liquide physiologique, etc...) par voie intra-uréthrale via un catheter adapté. Chaque injection durera 1 à 2 minutes. Des prélèvements d’urine par miction spontanée (quelques gouttes recueillies dans un tube eppendorf) seront réalisés une fois par semaine pendant au maximum 6 semaines.

Impact sur les animaux

Certaines procédures expérimentales prévues génèrent chez la souris un développement tumoral pouvant entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets locaux (inflammation au niveau de l'appareil urinaire par exemple) et des effets systémiques (affaiblissement de l'état général par exemple).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer les lésions éventuelles, notamment au niveau de la vessie (réalisation de scores macro- et microscopiques)

Remplacement

Nous avons déjà réalisé de nombreuses validations in vitro et in cellulo de manière à garantir la qualité des VME utilisées à des fins de stratégie anti-cancéreuses. Nous allons continuer à étudier leur effet sur des lignées cellulaires modèles. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ne permet d’évaluer les répercussions d’un tel traitement à l’échelle d’un organisme (évaluation de l’éventuelle toxicité systémique – non attendue-, et de l’efficacité sur la régression tumorale). Une veille scientifique sera mise en oeuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.

Réduction

Des expériences préalablement réalisées avec ce modèle permettent d'estimer de manière optimale le nombre d'animaux requis. Ce projet nécessite l’utilisation de 610 souris âgées de 6 semaines car il est indispensable de réiterer les expériences 3 fois de manière indépendante pour garantir la robustesse des résultats. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) et une méthode non invasive d'échographie sera appliquée pour suivre la progression tumorale au cours du temps et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les cages possèdent des cabanes dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées de manière à apaiser les animaux. Le change de la litière sera effectué toutes les semaines. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur.

Choix des espèces

La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du cancer de la vessie. En particulier, les lésions néoplasiques liées aux cancers de la vessis développées dans cette espèce animale sont très similaires à celles développées chez l'homme, ce qui rend ce modèle particulièrement intéressant pour l'étude de cette maladie. Nous utilierons des souris de 7 à 8 semaines. Dans la littérature, les souris soumises au carcinogène (BNN) sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.

102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par instillation intra-nasale sous anesthésie, puis mises à mort 24 heures après pour analyser leurs poumons, afin d'étudier une protéine bactérienne comme cible thérapeutique. Le porteur indique des signes d'infection respiratoire, dyspnée et poil hérissé, et une surmortalité possible de 20 % lors de l'instillation. Il affirme qu'un modèle in vitro d'épithélium humain reste "très limité" et ne rend pas compte de la réponse immunitaire globale.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie de l’environnement induisant des infections respiratoires chez les sujets fragilisés comme ceux se trouvant en réanimation, ceux atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ou encore ceux atteints de mucoviscidose. L’émergence de souches de P. aeruginosa de plus en plus résistantes aux antibiotiques est observée partout dans le monde. La resistance aux antibiotiques est un problème car cela risque d’entrainer des impasses thérapeutiques pour les patients. L’objectif est d’étudier si une proteine protégeant P. aeruginosa contre la défense de l’hôte peut servir de cible thérapeutique alternative ou adjuvante aux antibiotiques pour traiter les infections à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques : ce projet scientifique a pour objectif (i) de déterminant les charges bactériennes dans les poumons infectés par les bactéries hyperexprimant ou non la proteine, (ii) d’étudier l’impact de l’infection sur la destruction de l’architecture du poumon et sur la réaction inflammatoire et immunitaire.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de caractériser plus précisement la virulence accrue au niveau pulmonaire induite par la proteine d’intérêt chez la bactérie P. aeruginosa résistante aux antibiotiques utilisés couramment en médecine humaine. Cette caractérisation histologique et bactérienne est indispensable pour affirmer l’implication de cette protéine dans la différence de survie observée chez les souris dans nos travaux précédents et elle est nécessaire pour expliquer le mécanisme global de la virulence augmentée de ces souches. Cette protéine participe à la virulence à la bactérie. Elle constitue donc une cible potentielle pour le développement à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les infections pulmonaires à P. aeruginosa résistants à de nombreux antibiotiques. Le développement d’inhibiteurs de cette proteine peut être envisagé pour constituer une thérapeutique alternative et adjuvante aux antibiotiques en médecine humaine. Son inhibition pendant l’infection respiratoire permettrait de limiter la prolifération de P. aeruginosa en le rendant sensible à la réponse de l’hôte.

Procédures

Pour chaque animal, il sera réalisé : - Une infection respiratoire par instillation intra-nasale : geste réalisé sous anesthésie générale. - Une administration d’un antalgique de palier III par injection intrapéritonéale à 6h post infection. - L’euthanasie à 24h post infection pour prélévement et analyse des poumons (études bactérienne, histologique et cytologique)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont ceux résultants de l’infection pulmonaire bactérienne. Il pourra être observé des signes d’infections respiratoires : dyspnée, mobilité réduite, dos vouté et poil hirissé. Une sur-mortalité possible de 20% lors de l’instillation intranasale est également attendue.

Devenir

Les animaux de la procédure seront mis à mort 24h après l’infection afin de réaliser le dénombrement de la charge bactérienne pulmonaire, les analyses d’histologie/immunomarquage sur poumons et les analyses cytologiques sur LBA

Remplacement

Ce projet requérant un modèle murin a été considéré après une étude in vitro préalable. En effet, la première partie de notre projet, qui a permis la mise en évidence de la virulence augmentée de la souche résistante aux antibiotique et le rôle d’une protéine d’intérêt, a été réalisée sur un modèle in vitro d’épithélium respiratoire humain. Cependant, malgré son utilité, ce modèle reste très limité car il ne permet pas d’étudier la virulence bactérienne à l’échelle du poumon dans son ensemble et il ne prend pas en compte la réponse immunitaire globale de l’hôte vis-à-vis de P. aeruginosa. Seule une partie de la réponse immunitaire innée est assurée mais la réponse immunitaire innée médiée par les phagocytes (polynucléaires, macrophages, …) ainsi que la réponse immunitaire adaptative (humorale et cellulaire) est absente dans ce modèle. Au contraire, dans le modèle murin de pneumonie aiguë, la réponse globale de l’hôte au niveau pulmonaire est assurée et cette étape in vivo est essentielle à la validation du rôle la protéine d’intérêt dans l’infection à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé pour répondre à l’objectif scientifique selon le nombre d’expériences prévues, les besoins en données selon les analyses statistiques envisagées et les données de la litterature. Pour comparer les résultats de charges bactériennes, des tests non paramétriques de Mann-Whitney seront appliqués, ces tests non paramétriques étant adaptés à notre étude comprenant un faible nombre d’individu. Une réflexion biostastistique (utilisant le logiciel G-Power) a été réalisée afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Nous avons également pris en compte le risque de surmortalités, c’est-à-dire la sortie précoce d’animaux avant la fin de la procédure (mortalité lors de l’instillation nasale, atteinte des points limites avant 24h, …), selon les données de la littérature et notre expérience acquise lors de précédentes manipulations. Les groupes ont donc été réduits à la taille minimum nécessaire à l’interprétation des résultats. Pour essayer de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous allons exploiter le plus possible les organes prélèvés, en essayant par exemple de mettre au point l’immunomarquage de P. aeruginosa sur les coupes en paraffine utilisées pour l’étude histologique classique. Si le marquage fonctionne, l’expérimentation (infection 4) prévue pour la cryoconservation/immunomarquage ne sera finalement pas utilisée, permettant de diminuer le nombre d’animaux (16 animaux en moins).

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être de l’animal, plusieurs mesures seront réalisées : - l’anesthésie par injection intrapéritonéale de Kétamine (50 mg/Kg) / Xylazine (5 mg/Kg) lors de l’instillation intra-nasale de l’inoculum bacterien, avec l’utilisation d’un dispositif chauffant lors de l’anesthésie des souris pour éviter l’hypothermie. - une surveillance rapprochée pendant la procédure (toutes les 2 à 4 heures en journée (8h à 18h) et une visite nocturne). Cette surveillance permet le suivi des animaux et la vérification des points limites, requérant l’euthanasie. - l’administration d’un antalgique de palier III (Buprénorphine, 50µg/kg) en intra péritonéal à 6h post-infection pour limiter la douleur et la dyspnée chez l’animal. - un enrichissement des cages et le regroupement des souris dans les cages pour préserver les interactions sociales

Choix des espèces

La souris est une espèce pour laquelle de nombreux protocoles de pneumonie aiguë d’étiologie bactérienne ont été optimisés et validés. Le modèle murin utilise des souris âgées de 6 à 8 semaines et permet d’étudier la pathogénicité bactérienne lors de l’infection pulmonaire aiguë (i) en établissant les courbes de survie (se basant sur l’atteinte des points limites), (ii) en réalisant des coupes histologiques pulmonaires et (iii) en déterminant la charge bactérienne infectante dans les poumons.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une injection de cellules tumorales dans la rate sous anesthésie, puis jusqu'à cinq séances d'IRM, pour déterminer le nombre de cellules nécessaire à l'induction de métastases dans le foie. Le porteur ne mentionne comme impacts qu'un risque de douleur après la chirurgie et le développement d'un cancer. Il affirme que ces connaissances ne peuvent pas être obtenues autrement, compte tenu de la complexité de ce cancer.

Objectifs

Le cancer colorectal est l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde, aussi bien chez les femmes que les hommes. Le risque de métastases dans des organes distants est fréquent, le foie représentant généralement le premier organe touché et donc représentatif pour le pronostic du patient. Chez ces derniers patients, le traitement de référence reste est un traitement médicamenteux composé d’une chimiothérapie associée à un agent anti-vasculaire (suivi d’une ablation de la partie cancéreuse du foie). Cette stratégie thérapeutique permet l’augmentation de la survie des patients. Malheureusement, environ 40 à 50% des patients présentent des résistances aux traitements médicamenteux, ne laissant pas la possibilité de les opérer. Le but de cette étude est de déterminer les mécanismes (cellulaire et moléculaire) de cette résistance aux traitements. Le projet vise à étudier la tumeur (les cellules cancéreuses) et son microenvironnement (cellules des vaisseaux sanguins) par IRM (imagerie par résonance magnétique).

Bénéfices attendus

Développer des nouveaux biomarqueurs pour évaluer l'effet du traitement sur le microenvironnement tumoral et le réseau vasculaire. Valider l'efficacité de ces marqueurs sur une cohorte de patients. Prédiction de la réponse aux traitements pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à : 1) Chirurgie : injection des cellules tumorales dans la rate, la durée de la procédure est estimée à 30 minutes. Cette procédure est réalisée sous anesthésie. 2) Imagerie par résonance magnétique :12 jours après l’injection des cellules tumorales, le nombre de séance d’IRM peut aller jusqu’à 5 séances au total, le délai minimal entre les séances d'IRM (Après la première IRM) est d’une semaine à 10 jours (selon la vitesse de croissance de la tumeur). La durée des IRM est 1h par souris (réalisé sous anesthésie gazeuse).

Impact sur les animaux

(1) Risque de douleurs suite à la chirurgie. (2) Développement d'un cancer

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à la fin du protocole.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude in vivo ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes, compte-tenu de la complexité́ de ce cancer . Ce modèle permettrait d'étudier les métastases du foie dans leur environnement (développement de tumeur dans l’organe), notamment les cellules des vaisseaux sanguins qui jouent un rôle important dans le développement tumoral. Des études in vitro ont été réalisées en amont, qui complèteront ce volet d'expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Ce projet impliquera l’utilisation de 30 souris pour une durée maximale de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisé est le minimum requis pour atteindre l’objectif fixé en prenant en compte que le taux tumoral peut varier.

Raffinement

Acclimatation de 10 jours pour les souris après leur arrivée à l'animalerie avant de débuter le protocole. Les animaux sont surveillés quotidiennement et ont accès à la nourriture et à l’eau. Ils sont hébergés dans un environnement enrichi permettant la formation de groupes sociaux. La procédure chirurgicale sera d'environ 30 minutes (maximum), les souris seront endormies et allongée sur un lit chauffant. A la fin de la procédure chirurgicale, le réveil des animaux sera surveillé de près. Après leur réveil les animaux seront réintégrés dans leur cage. Des croquettes humidifiées et de l'hydrogel seront mis en place pour favoriser le bien-être des animaux. Toutes les manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées. Un analgésique qui sera administré avant, pendant et après la chirurgie. L’utilisation de ce dernier sera renouvelée si besoin afin d’éviter toute souffrance à l’animal. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé́, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.) puis l'anorexie, perte de poids > 20%. Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité́ de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des souris adultes de 8 semaines. Ce modèle est le plus utilisé et validé par la littérature scientifique. Les cellules tumorales qui seront utilisées dans ce protocole sont des cellules murines, qui sont compatible avec l'espèce choisie.