Procédures sévères
Evaluation de l’activité anti-tumorale et/ou métastatique de composés sur différents modèles de greffe implantée chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
50 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 49 300 d'entre elles et sévère pour 700, afin de cribler des molécules anti-cancéreuses. Elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments tumoraux sous la peau, dans la glande mammaire, la plèvre ou le sang, subissent parfois une résection de la tumeur, des gavages, des injections répétées et jusqu'à huit prélèvements sanguins. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer et provoquer des difficultés respiratoires en cas de métastases pulmonaires, et que la totalité des animaux est tuée à la fin de chaque étude parce que les tumeurs sont incurables. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ne modélise la dissémination métastatique dans un "organisme entier" et conclut que l'évaluation finale sur la souris est incontournable.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'identifier et de caractériser des molécules anti-cancéreuses
Bénéfices attendus
Le cancer demeure la première cause de mortalité en France. Même lorsque des traitements de première ligne existent, de nombreux mécanismes de résistance provoquent un échappement des tumeurs aux traitements administrés, les tumeurs métastasent et sur le long terme, rares sont les cancers curables définitivement. En effet, les nouvelles stratégies thérapeutiques telle que l’immuno-oncologie ne permettent de soigner que 20% des patients traités. Il a donc encore un énorme besoin médical pour pouvoir prendre en charge correctement ces patients. L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, la compréhension de leur mécanisme d’action et la découverte de nouveaux traitements adaptés à chaque patient sont autant d’enjeux de ce projet. Les composés démontrant une activité anti-tumorale significative poursuivront leur phase de développement avec pour finalité l’évaluation en essais cliniques chez l’homme.
Procédures
implantation de cellules sous-cutanée (s.c.) : 1 fois 1 minute pour chaque animal /ou implantation de fragments tumoraux (granules) : 1 fois 5 minutes pour chaque animal - Anesthésie volatile - Positionnement du fragment tumoral (≤ 0.5 x 0.5 mm) dans le trocart et insertion sous cutanée. - Suture (agrafe)/ Ou implantation de cellules tumorales en intra-mammaire : 1 fois 1 minute pour chaque animal - Anesthésie volatile - Positionnement en décubitus dorsal, « ponction » de la glande et injection des cellules /Ou injection de cellules en intra-pleurale (i.pl) : 1 fois 5 minutes pour chaque animal - Anesthésie volatile - Positionnement en décubitus dorsal - Injection à travers la cage thoracique dans l’espace pleural gauche de la souris/ Ou injection de cellules en intraveineuse (i.v.) : 1 fois 1 minute pour chaque animal - Animaux vigiles - Introduction dans un cylindre de contention - Vasodilatation des veines latérales de la queue - Injection des cellules/ Randomisation : 1 fois 2 minutes pour chaque animal - Animaux vigiles - Contention manuelle - mesure de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse/ Identification : 1 fois 1minute pour chaque animal - Animaux vigiles - Contention manuelle - Entaille oreille/ Mesures des tumeurs au pied à coulisse : 2 à 3 fois 2 minutes par semaine pendant 3 à 10 semaines pour chaque animal/ Résection de la tumeur primaire (sous anesthésie générale) : 1 fois 5 minutes pour chaque animal - Anesthésie volatile - Positionnement en décubitus ventral - Resection de la tumeur primaire par incision au scalpel - Suture (agrafe ou colle chirurgicale) /Traitements : 1 à 3 fois (1 minute) par semaine pendant 3 à 10 semaines pour chaque animal soit, par gavage , par injection sous- cutané, par injection intrapéritonéale, par injection intra-musculaire, par injection intra-veineuse. les composés sont évalués en effet dose, avec 3 doses./ Prélèvements sanguins : 8 fois 1 minute pour chaque animal - Animaux vigiles - Ponction de la veine saphène ou - Introduction dans un cylindre de contention - Scarification de la veine caudale latérale/ Injection de thioglycolate par voie intra-péritonéale : 1 fois 1 minute pour chaque animal - Contention manuelle - Injection de buprénorphine - Positionnement en décubitus dorsal - Injection par voie intra-veineuse
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet les effets indésirables prévisibles chez l’animal peuvent être liés soit à la présence de la tumeur soit à l’administration du composé à évaluer. Le développement de la tumeur chez l’animal peut occasionner plusieurs types d’effets indésirables tel que des difficultés de déplacement liées à la localisation de la tumeur, la perte de poids, l’ulcération de la tumeur, des difficultés respiratoires (dans le cas de métastases pulmonaires). Dans le cas d’apparition d’ulcération sur la tumeur, afin de limiter sa progression, l’animal conserné peut être isolé de ses congénéres. L’administration de composés à visée thérapeutique peut induire de la toxicité qui se manifeste par da la perte de poids, de la douleur, de la prostration et dans les cas extrêmes, la mise à mort de l’animal est nécessaire.
Devenir
A la fin de chaque étude, la totalité des animaux sont mis à mort. En effet, tous nos animaux sont porteurs de tumeurs sous-cutanées ou de métastases incurables. Afin de ne pas provoquer de souffrance inutile liée à la présence d'une tumeur de plus en plus grosse ou liée à présence de métastases, les animaux sont mis à mort à la fin de chaque étude.
Remplacement
Les molécules évaluées dans ce projet, font au préalable l'objet d'une évaluation in vitro afin de d'assurer un premier crible. Seuls les composés ayant fait la preuve d'une efficacité dans ces tests sont ensuite évalués dans les modèles animaux. L'activité anti-tumorale ou métastatique d'un composé évalué in vivo peut résulter de son activité anti-proliférative, anti-angiogénique, pro-apoptotique, immunologique, etc… ou d'un mécanisme encore inconnu. Malgré les nombreux tests in vitro ou cellulaires disponibles capables de mimer une fonction de la biologie de la tumeur, aucun test in vitro à ce jour n'est assez complexe pour permettre de modéliser la dissémination métastatique et donc l'activité anti-métastatique ou l’impact du système immunitaire d'un composé dans un environnement aussi complexe que celui d'un organisme vivant tel que la souris. Par ailleurs la mise au point de thérapies ciblées nécessite la définition de biomarqueurs d’activité permettant de guider la sélection d’une sous-population de patients répondeurs au traitement. Seule l’utilisation d’un organisme entier intégrant la tumeur et son microenvironnement peuvent permettre une telle évaluation par la mise en place d’analyses ex-vivo. L'ultime étape de sélection d'un futur candidat médicament en oncologie en vue de son passage en développement clinique ne peut donc s'affranchir d'une évaluation in vivo sur la souris de laboratoire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les molécules candidates subissent un premier crible sur une série de tests in vitro et seules les molécules significativement actives dans ces tests sont évaluées chez l'animal. Afin que les résultats soient statistiquement robustes, des lots de 6 à 10 souris sont constitués, et, ainsi 10 à 12 souris par lots à constituer sont commandées pour le protocole. En effet, tous les protocoles d’évaluation de composés sont effectués après randomisation des souris en fonction du volume et de l’aspect des tumeurs. Cette étape, qui permet de constituer des lots statistiquement identiques au premier jour du traitement, est nécessaire à l’interprétation des résultats. Seuls les effets des composés seront mesurés. A ce stade et basé sur notre historique, au maximum 50% des animaux sont exclus de l’étude. Les résultats expérimentaux sont traités par des tests statistiques selon l’objectif expérimental. Chaque modèle fait l’objet d’une étude préliminaire sur un nombre réduit d’animaux (une vingtaine par souche) pour déterminer quelle souche de souris permet le meilleur rendement de greffe. Les animaux présentant des tumeurs non retenues sont euthanasiés et prélevés en vue d’études ex-vivo et ce dans le but de réduire le nombre d’animaux greffés non utilisés. Une tumorothèque est constituée pour l’évaluation des caractéristiques des tumeurs en fonction des projets.
Raffinement
Au cours de ce projet, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans des cages possédant un enrichissement tel que de la litière en sac Nespack et des copeaux de peuplier permettant la création d’un nid, des tunnels à l’arrivage, des bâtonnets en bois et des bâtonnets de coton. Les animaux sont visités tous les jours par du personnel formé et compétant. Les tumeurs sont mesurées 2 à 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse afin d’assurer un suivi du volume tumoral et les animaux sont pesés au minimum 2 fois par semaine afin d’assurer leur suivi pondéral. Dès la suspicion d’un signe de mal être, un suivi clinique quotidien est mis en place à l’aide d’une grille de score, afin de permettre la mise en place de soins palliatifs type buprénorphine si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal de référence en oncologie en raison de sa petite taille, de la facilité avec laquelle elle s’élève et se soigne, de sa disponibilité auprès de fournisseurs agréés, d’une génétique très étudiée et de la disponibilité de nombreux mutants et animaux génétiquement modifiés qui permettent d’adresser des questions particulières concernant le mécanisme d’action des composés et les biomarqueurs d’activité. Les différents fonds génétiques de souris permettent l’implantation de lignées tumorales sans rejet de greffe. La croissance tumorale rapide est également un atout dans les études d’évaluation de l’activité des produits testés. De plus, les modèles vivo d’étude de la dissémination métastasique reproduisent, selon la bibliographie disponible, la même distribution des métastases que celle observée chez l’homme. Les mécanismes liés à la formation de métastases sont similaires pour la pathologie humaine et murine Pour chaque modèle de greffe, la souche retenue est celle permettant un rendement de greffe supérieur afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Les animaux immunodéprimés sont réceptionnés au plus tôt à 5 semaines et correspondent donc à des animaux jeunes adultes sevrés. En effet la littérature abondante sur le sujet des greffes de cellules tumorales humaines chez la souris immunodéprimée décrit l'utilisation des modèles murins à partir de cet age. Les animaux immunocompétents sont réceptionnés au plus tôt à 8 semaines, en effet à cet age le système immunitaire des animaux présente un stade de maturation qui correspond aux besoins de nos expérimentations.
1/2: Impact de la neuro-inflammation dans les déclins cognitifs et comportementaux liés à l’âge et aux diabètes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 160 et sévère pour 160. Soumises à un régime gras pendant 14 semaines puis à des injections de streptozotocine pour induire un diabète, y compris des animaux âgés de 18 à 24 mois, elles passent des tests de champ ouvert, de reconnaissance d'objet et de labyrinthe surélevé. Le porteur fixe des points limites, dont la mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 % ou de glycémie effondrée. Il affirme que les tests de comportement et de métabolisme rendent le modèle in vivo "indispensable".
Objectifs
On sait que le vieillisement est associé à un déclin des fonctions cognitives. Il a été montré que le diabète était lui aussi associé à un déclin cognitif accéléré. A titre d'exemple, 19 à 25% des diabétiques de types 2 souffrent d'un déclin cognitif avant l'âge de 60 ans. De la même façon, les patients avec un diabète de type 1 peuvent présenter des dysfonctions cognitives assez précocement. Le diabète de type 2 est en effet reconnu pour être un facteur de risque du déclin cognitif. De plus le défaut et la résistance à l'insuline observés dans les diabètes sont associés à des altérations de la mémoire hippocampo-dépendante. L'augmentation de la prévalence du diabète ainsi que le vieillissement général de la population font du déclin cognitif un enjeu majeur de santé. Les mécanismes communs au vieillissement et aux diabètes sont : une perte de la tolérance immunitaire, une baisse dans la capacité de réguler son métabolisme ainsi qu'une inflammation centrale (neuro-inflammation) et systémique induisant des changements de comportement, d'habitudes alimentaires, d'activité, ainsi que des troubles cognitifs (perte de mémoire, anxiété). La neuro-inflammation est souvent associée aux maladies neuro-dégénératives. Cette neuro-inflammation présente dans les diabètes est suspectée d'être à l'origine de l'aggravation du déclin cognitif lié à l'âge. Au niveau cellulaire, la neuro-inflammation est un processus résultant de la présence de cellules gliales activées (astrocytes/microglies) dans le cerveau. Cibler la neuro-inflammation dans le but de traiter les maladies neuro-dégénératives pourrait donc être une porte d'entrée dans le ralentissement de l'apparition du déclin cognitif voire sa résolution.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier le rôle de la neuro-inflammation, dépendante du facteur de transcription étudié, dans l'accélération du déclin cognitif lié à l'âge, dans un contexte diabétogène (diabète de type 1 ou 2) ou non-diabétogène. Ce facteur de transcription pourrait donc être une cible thérapeutique intéressante permettant de ralentir le déclin cognitif. Celui-ci étant considéré, avec le vieillissement de la population et l'augmentation de la prévalence des diabètes comme un enjeu majeur de santé pour les années à venir. A terme, le projet permettra de déchiffrer les mécanismes inflammatoires qui contrôlent le déclin cognitif lié à l'homéostasie glycémique du patient. Ces études permettront d'associer l'inflammation locale du système nerveux central à l'inflammation systémique dépendante du facteur de transcription en question, qui était mis en évidence dans des études précédentes. Cette inflammation systémique pourrait être un bio-marqueur du déclin cognitif précoce dans le diabète.
Procédures
Les souris suivront un régime commercial contenant 60% de lipides pendant 14 semaines. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Les souris seront observées et pesées une fois par semaine. Classiquement les souris atteignent un poids situé entre 35 et 45 grammes à la fin du régime. A la 12e semaine du régime, les animaux recevront des évaluations comportementales sur 2 semaines. Le protocole d'injection stréptozotocine consiste en l'injection quotidienne de faibles doses de streptozotocine (40mg/Kg, diluée dans du tampon citrate à 50mM; pH 4.5) en intrapéritonéal pendant 5 jours à l'aide de seringues de 1mL et d'aiguilles de 25G. Les souris sont ensuite remises dans leur cage d'origine avec de la nourriture et boisson ad Libitum. La glycémie des animaux sera mesurée quotidiennement durant cette période. En cas de glycémie trop basse malgré la supplémentation en sucrose de l'eau, un bolus de sucrose (20%) sera administré en intra-péritonéal. Environ 9 jours après la dernière injection de streptozotocyne, la glycémie des animaux sera mesurée à jeun (6h de jeûne). Tests comportementaux: Pour évaluer les capacités cognitives, nous allons utiliser 3 tests de comportement: le test de l'espace ouvert (Open Field; OF), le test de la reconnaissance d'un nouvel objet (NOR) et le test du labyrinthe surélevé (Elevated + maze). Les souris recevront ces tests avec un délai de 7 jours entre chaque. Le OF et l'elevated +maze sont des tests qui mesurent le comportement exploratoire du rongeur. Pour les 2 tests, les souris seront transportées vers la salle d'expérimentation dans leurs cages d'hébergement contenant une partie de leur litière d'origine. Elles seront laissées au repos durant 1 heure avant le test. Pour le test de l'OF, les souris seront placées à l'intérieur d'une enceinte de dimension 43X43 cm pendant 30 min. Le système est automatisé et permet la mesure de plusieurs paramètres comme la distance parcourue au centre, en periphérie, le temps et la vitesse. D'une façon similaire, pour l'elevated plus maze les souris sont observées par un système automatisé durant le test pour 15-20 min. Pour le NOR la souris sera placée dans la boite de comportement de dimension 60 x40 x 32 cm, qu’elle pourra explorer librement durant 5 min. 24 h plus tard, la souris sera placée dans le même environnement pendant 10 minutes avec 2 objets identiques, le lendemain un de ces objets est ramplacé par un nouveau, le comportement exploratoire est observé.
Impact sur les animaux
Les animaux sous régime gras auront une prise de poids plus importante que ceux sous régime normal. Ceux chez qui un diabète (de type 1 ou 2) sera induit présenteront une hyperglycémie. Les seules nuisances pouvant apparaitre concernent les injections de streptozotocine, qui est un composé toxique, il faudra alors veiller à ce que les souris ne perdent pas trop de poids (
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'effectuer des analyses de biologie moléculaire et cellulaire ainsi que d'histologie.
Remplacement
Pour réaliser les tests de comportement et de métabolisme, les modèles in vivo sont indispensables. La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car se rapprochant physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de cognitives et de comportement. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des publications précédentes. Pour finir les études de comportement et de cognition ne permettent pas l'utilisation de modèle in vitro en remplacement des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. Chaque souris est réutilisée pour chaque test comportemental. De plus de nombreux tissus (tissus adipeux, foie, rate, cerveau...) seront collectés après mis à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. De plus nous avons choisi et déterminé un nombre de 20 souris par groupe en fonction de données de la littérature (Etudes de comportement suite à un régime riche en graisse, Ogrodnik et al., 2019) et grâce à l'utilisation d'un outil statistique "sample size calculation" (http://www.lasec.cuhk.edu.hk/sample-size-calculation.html). En se basant sur les résultats de tests comportementaux de l'article ci-dessus, nous avons calculé que pour obtenir une puissance de 90% avec une valeur alpha de 0.05, la taille de l'échantillon doit être de n=8 individus par groupe. En tenant compte des 10% de mortalité intrinsèque de cette lignée (C57Bl6/J) ainsi qu'à la mortalité dû au traitement (streptozotocine) et au vieillissement des souris, le nombre de 20 individus par groupe a été arrêté. Concernant les résultats, une analyse statistique (test de Wilcolxon) sera réalisée en tenant compte de la variabilité intra-groupe (T test (2 conditions), Test anova (plus de 2 conditions)), ainsi qu'un test ANOVA sur mesures répétées pour les mesures de glycémie et les poids des souris.
Raffinement
Dans cette étude aucun test douloureux n'est effectué. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les animaux seront nourris avec un régime enrichi en lipides pour induire une obésité et une insulino-résistance nutritionnelle, ou avec un régime normal (chow diet). Le change de la litière est réalisé une fois par semaine. Ce rythme pourra être réajusté si besoin pour les souris diabétiques grâce à une surveillance bihebdomadaire. Concernant les tests comportementaux les points limites suivants ont été établis: Grille d'évaluation pour les procédures comportementales: tout score ≥ 3 entrainera le retrait de l’animal et donc sa mise à mort. a) Variation du poids corporel (mesuré 2 fois par semaine). Le poids de référence sera celui de l'animal à l'arrivée. 0) Normal 1) Perte de poids 20% b) Apparence physique0) Normal 1) Manque de toilettage 2) Poil ébouriffé, yeux plissés ou bridés 3) Pelage ébouriffé, posture anormale (dos voûté) c) Changements comportementaux 0) Normal 1) Changements mineurs : démarche boîtante 2) Anormal : mobilité réduite, inactif, peu réactif aux stimulations 3) Très agité ou immobile, auto mutilation, agressif, prostré ou immobile. Pour les animaux traités avec la streptozotocine, une glycémie inférieure à 30mg/dL, suite aux injections, entrainera la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont adaptés à ce projet. De plus le laboratoire dispose déjà des souris transgéniques nécessaires pour l'étude, desquelles proviennent nos résultats précédents. Les animaux seront utilisés à environ 6 à 8 semaines pour certains afin d'étudier les effets du diabète à un stade précoce. Et à un stade adulte très avancé (18 - 24 mois) pour d'autres cohortes afin d'étudier le vieillissement.
Modulation de la tVTA dans les troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 40 et sévère pour 560. Après implantation de canules par chirurgie, ils subissent un modèle de dépression fondé sur des chocs électriques inéluctables et imprévisibles, puis des tests d'évitement avec 30 chocs, de nage forcée et de champ ouvert. Le porteur attend l'apparition de symptômes dépressifs chez au moins 30 % des animaux et teste une molécule censée les prévenir. Il affirme qu'aucune méthode alternative in vitro ne répond à cette question.
Objectifs
Ce projet concerne la caractérisation et la manipulation de mécanismes impliqués dans le développement de symptômes dépressifs induits par le stress chronique. Notre but est de déterminer si les symptômes dépressifs observés peuvent découler de la modification de récepteurs neuronaux. Notre premier objectif est de confirmer les résultats obtenus par analyse moléculaire (PCR) et de vérifier si ces modifications se produisent également chez des rats ne présentant pas de symptômes de type dépressifs malgré avoir également subi un stress chronique. Ensuite nous souhaitons bloquer pharmacologiquement ces récepteurs par approche préventive (avant le stress) et curative (après le stress) pour voir si cela suffit à empêcher l’expression de ces symptômes de type dépressifs.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous pourrons mieux comprendre le rôle de la tVTA, une structure du cerveau récemment découverte et impliquée dans le développement de symptômes de type dépressifs induits par le stress. Nous pourrons également vérifier si le blocage des récepteurs des neurones de la tVTA permet de diminuer ou de prévenir l'apparition des troubles dépressifs. Si tel est le cas, ces récepteurs pourraient être la cible de futurs traitements plus spécifiques de la dépression.
Procédures
Implantation des canules : (520 rats maximum). La durée de la chirurgie ne dépassera pas 2h. Les animaux subiront le modèle de stress consistant en 2 séances de stress de 50 min (jour 1 et 2) où les rats seront soumis à des chocs électriques non échappables et non prédictibles (séances de 10 sec avec un intervalle moyen de 5-30 secondes) et le test comportemental d'une durée de 15 min visant à évaluer les conséquences dépressives du modèle et qui consiste en l’application de 30 chocs électriques, que l’animal peut éviter en changeant de compartiment dans la chambre de test. Les animaux subiront également le test comportemental de nage d'une durée de 15 min nous permettant de voir si l’animal montre également des signes de dépression en utilisant un autre test comportemental dans un environnement nouveau pour l’animal et le test comportemental du champ ouvert d'une durée de 15 min consistant à laisser le rat explorer un nouvel environnement.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie d'implantation de canules, les rats devront s'habituer au dispositif sur leur tête. Dans le modèle utilisé, les rats sont soumis un stress intense lors de l'établissement du modèle. Ce stress est attendu et nécessaire à l'expérience. Nous nous attendons à l'apparition de symptômes de type dépressifs pour au moins 30% des animaux dans le modèle étudié. Néanmoins, les animaux seront traités avec une molécule permettant d'inhiber une structure cérébrale qui serait en partie responsable du développement de la dépression, notre hypothèse étant que ce traitement permettrait d'empêcher le développement de la dépression chez ces animaux.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux sont mis à mort afin de prélever leur cerveau pour procéder aux analyses biologiques.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chronique chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, est un processus intégré et repose sur l’observation du comportement de l’animal vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum afin d'obtenir un nombre d'échantillons statistiquement significatif, compte tenu du taux de succès de la chirurgie (60-90%), du modèle qui génère seulement 30% d'animaux susceptibles ainsi que de la qualité de prélèvement des structures cérébrales et le succès des analyses moléculaires. Pour optimiser l'expérience et réduire le nombre final d'animaux utilisés, les expériences seront également menées par petits lots d'animaux jusqu'à ce que suffisamment d'échantillons de qualité adéquate aient pu être obtenus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage collective afin de respecter leurs besoins sociaux. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et analgésie (sans que l'animal ne ressente de la douleur) et durant toute la chirurgie, l'animal est maintenu au chaud à l'aide d'un tapis chauffant. En post-chirurgie, les animaux seront quotidiennement surveillés afin de contrôler leur bien-être et de mettre en place une analgésie si besoin. A chaque étape de l'étude, nous avons établi des points limites nous permettant de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
La tVTA (structure cérébrale étudiée) a été initialement décrite chez le rat, puis chez le singe. Chez la souris, cette structure est présente mais moins bien définie que chez le rat. Le projet utilise donc l'espèce chez laquelle le plus d’informations sont présentes. Pour ce projet, des rats adultes ( poids>200g à la chirurgie) seront utilisés puisque l’étude nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures.
Digestibilité iléale des nutriments des aliments ou des matières premières chez le porc mâle en croissance : préparation chirurgicale et mesures in vivo (2/2).
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
40 porcs mâles en croissance vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue car leur modification chirurgicale interdit toute adoption ou retour en élevage. Munis d'une canule posée par chirurgie abdominale, ils sont hébergés en cage individuelle et placés trois jours par semaine en espace restreint pour collecter les jus intestinaux, afin de mesurer la valeur nutritionnelle d'aliments d'élevage. Le porteur présente ce travail comme un moyen de mieux formuler les aliments et de réduire les rejets azotés dans l'environnement. Il affirme que la mesure ne peut être obtenue que sur des animaux ainsi préparés chirurgicalement.
Objectifs
Les essais de digestibilité iléale sur porcs en croissance sont réalisés partout dans le monde, par des équipes de recherche spécialisées dans ces méthodes, afin d’évaluer de la manière la plus précise possible la valeur nutritionnelle des matières premières, coproduits ou aliments destinés aux porcs, particulièrement celle des protéines et des acides aminés. En effet, les matières premières et coproduits ne cessent d’évoluer, par les changements des itinéraires techniques plus respectueux de l’environnement, l’apparition de nouvelles sources de protéines locales particulièrement et l’optimisation des procédés. Les résultats obtenus permettent aux producteurs d’aliments et aux éleveurs d’adapter au mieux la formulation aux besoins des animaux, contribuant au maintien d’une flore digestive équilibrée et d’une bonne santé des animaux mais aussi à réduire les rejets azotés dans l’environnement, , à améliorer leur santé digestive (moins de fermentations indésirables) et à appuyer la recherche sur les procédés appliqués en vue d’améliorer la qualité des matières premières ou leur empreinte environnementale (ex. procédé de trituration). En effet, la présence d’éléments nutritifs non digérés et en particulier les protéines, augmente les fermentations des déjections et dégrade les conditions sanitaires de l’élevage. In fine, tous ces rejets se retrouvent en tant que polluants dans l’environnement (sol, air, eau). Ce projet est la continuité dans l’acquisition des données d’un projet précédent avec les mêmes objectifs. Il contribue à la validation d’une méthode alternative ayant pour but de réduire ou remplacer à terme les essais in vivo en utilisant une méthode in vitro qui est à raffiner avec des avancées méthodologiques du procédé et en agrégeant les résultats dans des modèles mathématiques avec d’autres informations sur les propriétés physicochimiques des aliments et matières premières ou leurs spectres proche infrarouge. Des données de digestibilité iléale issues d’essais in vivo réalisés sur plusieurs années ont été mises en commun servant de base au projet. Dès l’obtention des modèles, des essais de validation seront nécessaires et probablement aussi certains essais pour ajouter de la variabilité au modèle. Deux parties permettent de mener à bien ce protocole : 1- modification chirurgicale nécessaire aux mesures (projet 1/2) et 2- préparation, transport des animaux avant / après préparation chirurgicale et hébergement en cage individuelle (projet 2/2).
Bénéfices attendus
Ce projet (2/2) permettra de continuer l’acquisition de données de digestibilité iléale chez le porc nécessaires afin de formuler au mieux les aliments d’élevage pour limiter les désordres digestifs liées à un déséquilibre protéique mais aussi les rejets dans l’environnement tout en développant les connaissances sur des matières premières notamment locales. Les essais de digestibilité permettent d’évaluer des hypothèses de manière fine et donner des valeurs de référence de la valeur nutritionnelle d’une matière première ou d’un aliment avec un nombre d’animaux très réduit. Ces matières premières ne cessent d’évoluer d’où le maintien de ce type d’essai, mais le développement en parallèle des méthodes in vitro pourra à terme réduire ou remplacer la méthode in vivo. Ces résultats sont importants pour les filières animales et de plus en plus avec le développement d’une alimentation locale. Aucune autre méthode ne permet de faire la mesure avec un meilleur rapport bénéfice / risque. La seule autre technique est avec utilisation d’un marqueur et abattage de l’animal pour prélèvement du contenu. Non seulement elle est moins précise, mais avec un nombre identique de répétitions (n=6), il faut abattre 6 porcs pour une seule matière première, alors qu’avec 6 porcs nous pouvons évaluer 10-12 matières premières.
Procédures
Les porcs sont hébergés en individuel. Chaque semaine, ils sont placés 3 jours en cage avec une surface au sol restreinte pour permettre de collecter les jus iléaux sans contamination par les urines. Le reste du temps, ils sont dans un module loge + cage leur permettant une liberté de mouvement.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus pour les animaux, autres que ceux de la période post-opératoire (cicatrisation, gène voire douleur maitrisée par l’analgésie). Une période de soin est nécessaire afin de faciliter la cicatrisation de la suture abdominale ainsi que de la zone de sortie de canule. Les animaux commencent à manger habituellement 24 heures après l’opération. L’aliment est réintroduit à des quantités augmentant au fur et à mesure des jours qui passent. Les jus iléaux étant plus acides que des fèces, un film protecteur (très efficace) est sprayé sur l’arrière-train des porcs afin de protéger la peau dès la fin de l’opération. La manipulation peut être renouvelée si la peau est propre et sèche. Si des rougeurs commencent à apparaître, de la crème apaisante et cicatrisante est utilisée en local également. La canule est retirée (sans intervention) après 3 à 4 semaines post-opération, lorsqu’elle ne tombe pas toute seule. Les périodes de collecte, avec un hébergement en cage, contraignent les animaux à un espace réduit. Ces périodes sont limitées au maximum en permettant aux animaux pendant les périodes d'adaptation aux aliments d'être dans un module les laissant libres de leurs mouvements : cage ouverte vers la loge en caillebotis plastique.
Devenir
A la fin des mesures, les porcs sont euthanasiés car ils ne peuvent pas être adoptés ni envoyés vers d’autres élevages à cause de leur modification chirurgicale.
Remplacement
La mesure de la digestibilité iléale des acides aminés chez le porc ne peut aujourd’hui être réalisée que par des essais sur des animaux de l’espèce cible ayant suivi la procédure de préparation chirurgicale décrite dans ce projet. Ce type d’essai a déjà contribué à établir des valeurs de référence largement utilisées dans le monde, mais la production de nouvelles matières premières et coproduits, d’additifs améliorants ou de process, nécessite d’établir de nouvelles références, qui ne peuvent être évaluées que par les études in vivo. Néanmoins, ce programme sert également à alimenter les bases pour le développement d’une méthode in vitro qui pourrait à terme, réduire ou remplacer les essais sur animaux.
Réduction
Ce projet utilise des animaux préparés chirurgicalement dans un autre projet (1/2). Les 6 animaux serviront à évaluer environ 10 matières premières différentes, sans recourir à d’autres interventions. Un dispositif en carré latin permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés par année (6 répétitions + 1 de remplacement) utilisés dans un essai. Ce dispositif a été validé par un service d’études méthodologiques et statistiques. 6 répétitions par aliment nous permettent d'obtenir une puissance suffisante pour mettre en évidence des différences significatives ayant un sens biologiquement sur les différents critères d'intérêt mesurés. Le traitement des données est réalisé en deux temps : un test permettant d’écarter un arrière-effet pour toutes les variables (semaine, animal, poids des animaux), et ensuite une analyse de variance et un test a posteriori (Tukey, méthode des contrastes, ...).
Raffinement
Le raffinement a été réfléchi sur les deux projets le constituant, d’abord sur les conditions pré-opératoires (EU A), puis sur l’intervention chirurgicale du projet 1/2 (EU B) et enfin sur les phases post-opératoires et d’essai de ce projet 2/2 (EU A). Les mesures de raffinement décrites ci-dessous sont celle concernant uniquement l’EU A. Le choix de replacer l’animal dans l’EU A pour la phase post-opératoire a été fait en considérant le peu de km de distance (36 km, environ 30 minutes) entre les deux sites et les bénéfices pour l’animal. Les animaux transportés par le personnel de l’EU A, dans un véhicule spécialement équipé pour le confort des animaux. Ils arrivent à l’EU B le jour même de l’intervention. Les animaux sont habitués à leur lieu d’hébergement avant l’opération et le retrouvent rapidement après, évitant un stress supplémentaire. Le lieu d’hébergement (EU A) a été spécifiquement construit pour ce type d’essai (loges et cages sécurisées sans éléments blessants, facilité d’accès pour les soins, enrichissement adapté, contrôle automatisé de la ventilation et de la température, …). Son personnel est spécifiquement formé aux soins post-opératoires de ce type d’intervention et est présent 7j/7j, …). Les hébergements sont disposés en deux files de manière à procurer aux porcs une perception visuelle, auditive et olfactive entre congénères. L’animalier surveille les porcs plusieurs fois par jour et il y a des périodes de présence le week-end. Par expérience, les animaux s’habituent bien aux cages (pas de nervosité ni de comportements agressifs, comportement alimentaire normal, absence de problèmes d’aplombs). Des objets d'enrichissement sont placés dans chaque module (loge + cage) : chaine avec triangle métallique, brosse dure. Lors de la période post-opératoire, les animaux sont en cage uniquement, ils ont accès au triangle, aux rondelles et à la chaine métallique (utilisation régulière). Lors de la 2ème semaine, si les observations sont satisfaisantes pendant les soins et que les animaux sont calmes, l’accès à la loge est ouvert pour leur laisser un temps de promenade, sous surveillance. Des traitements médicamenteux sont prévus pour fournir une antibiothérapie et une gestion de la douleur appropriées en suivi post-opératoire.
Choix des espèces
Ces essais concernent la mesure de la digestibilité iléale des acides aminés chez le porc. Ce type d’essai a déjà contribué à établir des valeurs de référence largement utilisées, mais la production de nouvelles matières premières et coproduits, d’additifs améliorants ou de process, nécessite d’établir de nouvelles références, qui ne peuvent être évaluées que par les études in vivo sur des animaux ayant suivi la procédure détaillée dans le projet 1/2. La technique nécessite des mâles pour éviter les mélanges entre urine et jus iléaux lors de la collecte, mais les résultats sont valides pour les mâles et les femelles (pas de différences avérées de digestibilité). La formulation des aliments ne se fait pas par sexe. Les animaux sont en phase de croissance. Cela permet de refléter au mieux les animaux ciblés en élevage par ce modèle
Evaluation de l’efficacité antibactérienne des Eligobiotiques® (EB) contre Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) productrice de Shiga-toxine (STEC) chez le lapereau.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
48 lapins, lapereaux âgés de deux jours et leurs mères, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Les lapereaux sont infectés par une Escherichia coli entérohémorragique responsable de diarrhées hémorragiques, puis traités par gavage avec trois doses d'un produit antibactérien commercial, les mères étant tuées car exposées aux animaux infectés. Le porteur indique que la principale cause de souffrance est la sous-nutrition des lapereaux délaissés par la mère et prévoit un suivi du poids. Il affirme que la complexité d'un être vivant ne peut pas être reproduite en laboratoire.
Objectifs
Le présent projet vise à tester l’efficacité d’un composé antibactérien (EB) dans un modèle d’infection du tube digestif à E. coli chez le lapereau. Trois concentrations du composé seront testées, une correspondant à la dose pharmacologiquement active (EB) et cette même dose divisée par 10 (EB/10) et 100 (EB/100). Cette étude sera réalisée avant le passage de ce composé EB en phase d’évaluation clinique.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est de mettre en évidence l’efficacité d’une thérapie ciblée offrant une alternative à l’utilisation des antibiotiques et permettant un contrôle précis des écosystèmes microbiens complexes. Dans cette optique, le projet vise à utiliser une nouvelle technologie antimicrobienne basée sur l’utilisation d’un dérivé des bactériophages (ciblant exclusivement certaines espèces bactériennes) transportant des « ciseaux moléculaires » qui, une fois à l’intérieur des bactéries, vont scanner leur matériel génétique et trouver la séquence à couper pour laquelle ils ont été « programmés ». Ainsi seules les bactéries possédant la séquence d’ADN ciblée seront tuées, sans affecter le reste du microbiote. Les bactéries d’intérêt dans ce projet sont des Escherichia coli (E. coli) entérohémorragiques (peuplant le système digestif et responsable d’hémorragies) productrices de Shiga-toxine (EH-STEC). Ces bactéries sont à l’origine de maladies rares mais graves en particulier chez les jeunes enfants chez qui elles induisent des diarrhées hémorragiques et une atteinte rénale sévère. Une précédente étude a déjà permis de mettre au point le modèle d’infection du tube digestif chez le jeune lapereau et d’appréhender le potentiel bénéfice d’un traitement aux Eligobiotiques® (EB). Les précédents résultats ont également entrainé un réajustement de la composition du traitement (proportion composé actif/ tampon). Cette étude a pour but d’évaluer l’efficacité de 3 doses issues d’un lot clinique, sur cette bactérie.
Procédures
Les méthodes d’infection et de traitement par gavage (quelques secondes par lapereaux) ont été choisies pour leur qualité non invasive et indolore pour les animaux. Les lapereaux seront infectés une seule fois à J0 et les traitements auront lieu deux fois par jour, dès J3 après infection et pendant 4 jours. L’expérience durera 7 jours. Dans ce modèle, l’infection, même symptomatique (diarrhée), n’empêche pas la prise de poids des lapereaux et n’entraine pas de souffrance particulière s’ils sont bien nourris par leur mère. En revanche, il est possible que l’infection favorise le délaissement de la lapine pour ses lapereaux les plus fragiles. Dans ce cas, le poids des lapereaux et leur score clinique enregistrés quotidiennement nous permettrons d’évaluer leur état et d’interrompre l’étude pour les animaux en état de souffrance. En fin d’étude, les lapereaux seront soumis à une ponction intracardiaque sous anesthésie volatile (vetflurane 5%) avant leurs mises à mort.
Impact sur les animaux
Les précédentes études nous ont permis de déterminer que la principale cause de souffrance dans ce modèle était la sous nutrition des lapereaux (résultant ou non de l’infection). Le nombre d’animaux par portée est assez variable. Les lapines donnant naissance à plus de 9 lapereaux ont souvent tendance à en délaisser certains au profit des autres.
Devenir
Tous les animaux (lapereaux + lapines) seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer chez les lapereaux, le sang pour analyses biologiques et le colon pour dénombrement des CFU. Les lapines seront également mises à mort car elles auront été en contact avec des animaux infectés.
Remplacement
Une partie des résultats préliminaires a été obtenue in vitro mais la complexité d’un être vivant ne peut pas être mimée en laboratoire nécessitant l’utilisation de modèles animaux. Également, une étude similaire a déjà été réalisée et a permis de mettre en évidence des résultats très encourageants. Toutefois, la validation de l’efficacité est requise sur un lot clinique par les autorités et le conseil scientifique du commanditaire de l’étude.
Réduction
Le modèle étant déjà maitrisé, aucune phase de mise au point n’est prévue. En tenant compte de possible perte dans les portées et afin d’obtenir une étude statistique solide (Mann-Whitney), 12 animaux par groupe de traitements seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les lapereaux et leur mère ne seront pas séparés durant l’étude pour limiter leur stress et permettre une alimentation naturelle par la tétée. L’infection bactérienne du tube digestif et l’administration du traitement seront réalisées par voie orale et seront donc indolores. Des critères d’arrêts de l’étude, supportés par une grille de score clinique, ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux. Pour pallier au problème de dénutrition observé pour les grandes portées, des lapereaux pourront être transférés à des portées plus petites au cours de leur premier jour de vie. De plus, une vigilance particulière sera appliquée après chaque allaitement, où la présence d’une tâche de lait sera surveillée car elle représente un marqueur spécifique de la bonne prise alimentaire chez le lapereau. Une observation quotidienne durant les 5 jours suivant la naissance des lapereaux (pouvant être modulé en fonction de l’état des lapereaux après leur naissance) puis biquotidienne jusqu’à la fin de l’expérience nous permettra de déterminer lesquels ont le plus de mal à se nourrir et ainsi de favoriser leur alimentation en les plaçant en priorité dans le nid avec leur mère. Ce suivi nous permettra également de déceler le plus rapidement possible des signes de souffrance et pouvoir anticiper l’atteinte des points limites.
Choix des espèces
Le lapin développe des symptômes très semblables à l’homme dans un contexte d’infection à E. coli, notamment au niveau de la diarrhée, contrairement au modèle murin. Des lapereaux de 2 jours seront utilisés de façon à correspondre à une population de jeunes enfants particulièrement sensibles aux infections à EH-STEC.
Caractérisation et traitement de l’inflammation intestinale dans un modèle murin de Sclérose En Plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
730 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux modèles de sclérose en plaques leur sont induits par injections d'un cocktail pro-inflammatoire et de toxine pertussique, avec pose d'un cathéter pour l'imagerie, provoquant une perte de mobilité et des poussées de paralysie sur plusieurs semaines. Le porteur prévoit une mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si le score de douleur reste élevé. Il affirme que les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro et parle de "stricte nécessité".
Objectifs
Nous utiliserons l'imagerie ciblée à l'aide de molécules spécifiques pour visualiser l'inflammation intestinale dans deux modèles de sclérose en plaques. Il s'agit d'un modèle progressif et d'un modèle avec une phase de rémission et une autre phase de récurrence. Pour chacun de ces deux modèles deux objectifs sont prévus : mesurer l’évolution de l’inflammation intestinale au cours de la maladie ainsi que de savoir si une inflammation intestinale apparait avant l’apparition des symptômes moteurs et/ou avant une rechute de la pathologie (réapparition des symptômes après une période de rémission), et si, le cas échéant, une telle inflammation est prédictive d’une déclaration, d’une rechute imminente de la pathologie et/ou de sa sévérité.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’approfondir nos connaissances sur le lien entre l’inflammation intestinale et la sclérose en plaques. Ce projet vise également à développer de nouvelles méthodes de diagnostic (imagerie) et de thérapeutique (traitement de l’inflammation intestinale) dans la sclérose en plaques.
Procédures
Injections s.c. à J0 de 50 µl au niveau de chaque hanche et de chaque épaule (soit 200 μl au total pour l’animal) : durée 20 secondes par injection, moins de 2 minutes pour tout + Injection i.p. à J0 et à J2 de toxine pertussique (200ng dans un volume final de 200 µl) 30 secondes en tout à chaque injection. Pose d'un cathéter veineux à la veine caudale pour l'imagerie et injection du contraste (200 µL au total) 5 minutes en tout. Suivi du score neurologique : observation pendant 5 minutes environ et pesées : 30 secondes en tout à chaque pesée après une habituation de quelques minutes une fois la cage déplacée à proximité de la balance.
Impact sur les animaux
Ce projet, sur la sclérose en plaques utilisera deux modèles chez la souris : un modèle progressif et un autre récurrent-intermittant. Des injections seront nécessaires ainsi que la pose d'un cathéter pour l'imagerie. Les animaux auront des injections d'un cocktail pro-inflammatoire qui provoquera une inflammation intestinale suivie en imagerie en plus que les symptomes moteurs. Le temps nécessaire entre le début du projet et l'imagerie est de 12-20 jours pour le modèle progressif et jusqu'à 40 jours pour le modèle récurrent intermittant (le scoring identifiera ce point). Pour le premier modèle, des signes cliniques de la sclérose apparaitront au bout de 8-10 jours et comprendront une perte de la mobilité. Pour le deuxième modèle, les signes cliniques apparaitront au bout de 10-15 jours pour la première poussée, une phase de rémission autour de 15-30 jours avec une deuxième poussée vers 30-40 jours.
Devenir
Procédure 1 : animaux mis à mort et tissus récupérés. Procédure 2 : animaux mis à mort et tissus récupérés. Procédure 3: tous les animaux inclus dans cette procédure seront gardés en vie à la fin afin d’évaluer les effets thérapeutiques des injections des anticorps monoclonaux. La mise à mort sera réalisée aux temps prévus par les procédures 1 et 2.
Remplacement
Ces études seront réalisées en parallèle avec des études in vitro (modèle de barrière hématoencéphalique, modèle de barrière intestinale, culture de cellules immunitaires). La réalisation de ces expériences in vitro est de nature à réduire le nombre d’animaux utilisés dans les procédures d’expérimentation décrites dans ce projet. Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro pour la bonne réussite de ce projet. En effet, des études dans des modèles animaux intégrés sont nécessaires pour la validation des données obtenues in vitro et pour la future translation à la santé humaine. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés comprendront des tests non-paramétriques (test de Kruskall-Wallis suivi d’un test de Mann-Whitney), des tests paramétriques (ANOVA à mesures répétées suivi d’un test de Bonferroni, et tests de Student appariés et non appariés), des tests de régression linéaire ainsi que des tests de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui puissent suivre ces tests statistiques.
Raffinement
Un score clinique neurologique sera effectué tous les jours (dès le 1er jour jusqu’au jour de la mise à mort) afin d’évaluer la douleur et l’atteinte neurologique des souris. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée par rapport au poids initial et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel utilisé dans cette procédure expérimentale est neuf (pour les consommables, comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyé et désinfecté pour les réutilisables (pinces métalliques). Afin de prévenir toute douleur occasionnée par l’injection sous-cutanée du cocktail de protéines et par l’injection intra-péritonéale de la solution de toxine pertussique, une anesthésie générale gazeuse de courte durée sera réalisée (oxygène/protoxyde d’azote 30%/70% + 2.5 % d’Isoflurane) et un patch de Lidocaïne sera posé sur le dos et sur le ventre de l’animal 1h avant les injections. Une application de Lidocaïne par spray sera également réalisée quotidiennement au niveau de chaque point d’injection, du 1er jour de l’induction jusqu’au 5e jour après celle-ci (soit par l’animalier, soit par l’expérimentateur). Les animaux ne présentant pas de signe d’arrêt (voir plus loin : points limites) seront mis à mort 40 jours après l’induction de la maladie. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et à la boisson lors des atteintes cliniques neurologiques sévères, une boite de pétri rempli de croquettes humidifiés est déposée dans la cage même et ceci dès le premier jour de l’induction du modèle. Un anesthésique gazeux sera utilisé qui permet une récupération rapide des animaux (isoflurane) et une analgésie est prévue (lidocaine en application locale et buprénorphine en s.c.).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus utilisée pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SEP, grâce à différents modèles bien caractérisés. Elle constitue également une espèce très étudiée dans le domaine de l’inflammation intestinale. L’anatomie de l’intestin et du système nerveux murin ainsi que la physiologie de la souris (notamment en ce qui concerne la barrière intestinale, la barrière hémato-encéphalique et le système immunitaire) sont également bien connues et sont proches de celles de l’homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables de la pathologie humaine de l’inflammation. Enfin, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme. Les souris utilisées auront 6-7 semaines. En effet, la SEP est une pathologie qui survient principalement dans une population jeune (entre 25 et 35 ans majoritairement).
Evaluation de l’efficacité de composés dans le traitement de la décompensation aigue de la cirrhose hépatique. Utilisation d’un modèle rongeur induit par l’association du tétrachlorure de carbone, du phénobarbital et du lipopolysaccharide.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 320 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers, modérés puis sévères pour 1 040 d'entre eux. Ils reçoivent du tétrachlorure de carbone par voie orale pendant vingt semaines, du phénobarbital, puis une injection de lipopolysaccharide dans l'abdomen destinée à déclencher une défaillance aiguë de plusieurs organes, le protocole mesurant la durée de survie avant la mise à mort. Le porteur teste des composés censés réduire cette mortalité et renvoie les retombées pour les patients cirrhotiques au conditionnel. Sur le remplacement, il indique ne disposer d'aucun modèle in vitro équivalent et conclut à la nécessité d'un système biologique complexe et "global".
Objectifs
Notre projet consiste à reproduire dans un modèle expérimental murin (rat), un épisode aigu de défaillance multiorganes appelé « acute on chronic liver failure » (ACLF), et d’évaluer les effets de composés sur le traitement ou la protection qu’ils pourraient avoir dans cette pathologie. La cirrhose hépatique est une pathologie caractérisée par une fibrose diffuse, une perturbation sévère du flux artériel et veineux intrahépatique, une hypertension portale et évoluant vers une insuffisance hépatique. La cirrhose a classiquement été catégorisée en deux états : compensée et décompensée. La décompensation aiguë est définie par l’apparition récente d’ascite, un épisode d’encéphalopathie hépatique, une hémorragie digestive, et un épisode infectieux ou n’importe quelle combinaison de ces critères. Il y a deux catégories de décompensation aiguë: la première dite traditionnelle, de bon pronostic à court terme et la seconde, appelée ACLF plus complexe, associée à des défaillances multiples d’organe et de mauvais pronostic. L’ACLF est un syndrome fulminant déclenché par un événement précipitant produisant la défaillance de multiples organes. Il apparait donc que cette phase d’emballement de la réaction immunitaire et inflammatoire soit déterminante lorsque l’ACLF survient chez des patients cirrhotiques qui présentent des lésions hépatiques. Ils ont souvent une endotoxémie importante et une augmentation des taux de cytokines inflammatoires plasmatiques qui sont des facteurs prédisposants. Le modèle d’étude de cette pathologie sera reproduit chez le rat Sprague Dawley par administration orale chronique de tétrachlorure de carbone (CCl4). Afin de potentialiser l'effet du CCl4, les animaux seront préalablement exposés au phénobarbital (activateur des cytochromes de détoxification hépatique). A un stade avancé de la cirrhose, nous administrerons du lipopolysaccharide afin de mimer le facteur infectieux retrouvé dans la pathologie humaine, Les effets des composés testés seront évalués sur leur capacité à réduire l’orage cytokiniques et à prolonger la survie des animaux après un épisode d’ACLF.
Bénéfices attendus
Il est attendu que les composés que nous allons tester exercent des effets multiples, c'est à dire qu'ils puissent agir sur plusieurs cibles en même temps. Par exemple si ces produits réduisent à la fois le processus inflammatoire, l’infection, et améliorent le fonctionnement du foie , nous pensons réduire de manière significative les effets aigus de l'épisode d’ACLF chez les patients cirrhotiques.
Procédures
Au cours de la première phase au cours de laquelle va s’installer la pathologie du foie qui durera 20 semaines au maximum, les animaux subiront des traitements par voie orale à raison de de deux fois par semaine. Cette administration sera pratiquée par une personne expérimentée et ne représente pas une action invasive traumatisante. Il y aura donc 40 administrations par voie orale au maximum. A l'issue de cette phase 1, tous les animaux subiront un prélèvement sanguin, sous anesthésie gazeuse de courte durée. Au cours de la seconde phase sera déclenché l'épisode aigu d’ACLF, les rats recevront une seule administration par injection dans l’abdomen (voie intrapéritonéale). Pour les animaux qui survivront au-delà de 24h, un prélèvement sanguin terminal sera réalisé au moment de leur mise à mort, ils seront alors sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Le modèle est réalisé en deux phases : 1) La première phase est longue (de 10 à 20 sem max ) , elle permet le développement de la pathologie hépatique , les traitements pour l’induire sont doux (voie orale), il n'y a pas de souffrance ni inconfort manifeste. 2) La seconde phase qui correspond à la précipitation de l'ACLF par injection du composé qui mime un infection bactérienne majeure (LPS) est par définition aigue. Elle génère rapidement des signes de stress et d'inconfort chez le rat (trouble de l'homéothermie, prostration, pâleur des muqueuses etc). Ces effets sont évalués et scorés à la fois dans le but de grader la sévérité ce qui reflète aussi un effet pharmacologique du produit testé, et pour évaluer les points d'arrêts anticipés ou points limites. Deux approches expérimentales sont envisagées, 1) : l'étude de survie à 24h qui permettra d'évaluer la protection éventuelle de notre composé en comparaison à un groupe d'animaux contrôles ou 2) : évaluation dans un temps précoce juste après l'induction des paramètres hémodynamiques et biochimiques (enzymes, cytokines), cela permet également une approche mécanistique par le biais de l'expression de gènes de régulation des processus inflammatoires ou métaboliques.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale les animaux seront observés au cours d'une période de 24heures maximum après le déclenchement de la phase aigue de la défaillance multi organe. Cette phase d'observation se traduira soit pas la mort de l'animal (avec mesure de la durée de survie = étude de survie) soit par une mise à mort pour les animaux survivants. La jsutification repsoe sur l'objectif de ce projet qui consiste à évaluer les effets de composés sencés réduire la mortalité lors de défaillance aigue de l'organisme. les animaux qui survivent seront mis à mort et seront nécropsiés.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présent chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles un outil translationnel très pertinent. Nous ne disposons pas actuellement de modèles in vitro ayant des caractéristiques permettant d'évaluer les propriétés de composé sur l'ACLF. Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, et même sur des modèles de tyoe organoïdes contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global ».
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La chimie des médicaments peut produire des familles de composés chimiques très importante, la stratégie de sélection de produits intéressants à l’aide de tests in vitro exclue une très grande majorité des produits et diminue donc drastiquement le nombre de tests à réaliser chez l’animal.
Raffinement
L'ACLF qui par définition est chez l'homme une pathologie qui entraine le décès à 28 jours de 20 à 70% des patients hospitalisés . Le modèle d'étude expérimetal est lui aussi sévère , la précipitation de la décompensation est subite , nous avons établi des grilles de scoring et une surveillance accrue des animaux de manière à ne pas conserver un animal qui aurait atteint les points d'arrêt anticipés.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Rats juvéniles en période post sevrage au début des études expérimentales (environ 21-28 jours), le poids optimal des rats est de 100 grammes dans la littérature scientifique.
Etude en IRM de l’effet d’un inhibiteur de kinases dépendantes des cyclines sur la formation de l’œdème cérébral chez le rat en cas d’ischémie cérébrale transitoire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
31 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, 26 dans des procédures classées sévères et 5 tués sans réveil comme témoins. Chez les 26 premiers, un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau, suivie de deux passages en IRM, pour étudier l'œdème cérébral et un candidat-médicament. Le porteur indique un taux d'échec de 30 %, dont 25 % de mortalité, et cite parmi les atteintes l'hypothermie, des difficultés à se nourrir et une douleur liée à l'œdème. Il revendique un modèle in vivo "indispensable", les modèles in vitro ne reproduisant pas selon lui les mécanismes entre cerveau et sang.
Objectifs
La World Stroke Organization rapporte 13.7 millions d'Accidents Vasculaires Cérébraux chaque année, dont 5.5 millions sont fatales. 80% des AVC sont d’origine ischémique (AIC) et sont causés par l’obstruction d’un vaisseau sanguin cérébral. Cette interruption de la circulation sanguine bloque l’apport d’oxygène et de glucose nécessaire à l’activité cérébrale, endommageant progressivement les cellules et formant un œdème cérébral avec une composante cellulaire et une composante vasculaire. Les premières heures qui suivent un AIC sont déterminantes quant à ses conséquences, mais les approches thérapeutiques actuelles sont limitées dans le temps et ne peuvent contrer l’œdème qui ne peut être soulagé que par une chirurgie décompressive invasive : l’hémicrâniectomie. L’objectif aujourd’hui pour la recherche est de proposer un traitement neuroprotecteur permettant d’élargir cette fenêtre thérapeutique en protégeant les cellules et en limitant l’œdème cérébral. Notre équipe travaille sur un candidat médicament répondant à ces attentes. C'est un inhibiteur de kinases cyclines dépendantes dont les effets neuroprotecteurs et anti-œdémateux à 24 et 48h post-AVC ont été montrés dans différentes études indépendantes dans un modèle d’ischémie cérébrale focale transitoire chez le rat. Nos résultats histologiques préliminaires indiquent un effet potentiel de notre molécule sur l'œdème cellulaire. D'autre part, les biomarqueurs de pathologie neurodégénératives constituent un axe de recherche aux enjeux majeurs, cependant ils ne sont pas encore appliqués aux AVC. De plus en plus de recherches suggèrent que certaines molécules anormalement présentes dans le sang en cas d'AVC pourraient être utilisées pour le diagnostic et le suivi de cette pathologie. Parmi environ 150 candidats, nous avons sélectionné l'aquaporine-4, un canal perméable à l'eau situé à l'interface entre le sang et le cerveau particulièrement impliqué dans l'œdème cérébral et dont la présence dans le sang a récemment été rapportée dans une étude pilote chez l'homme. Cette étude a 2 objectifs : 1) évaluer l'effet de notre candidat médicament sur la formation de l’œdème cellulaire cérébral à un stade précoce de l’AVC en imagerie par IRM ; 2) identifier un potentiel marqueur sanguin de l’AVC chez le rat.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra dans un premier temps d’étudier l'effet de notre candidat médicament sur l'œdème cérébral en cas d'AVC ischémique en IRM. L’impact de notre molécule sur l’œdème n’a jamais été mesurée par cette technique. Dans un second temps, la comparaison des taux d’aquaporine 4 dans le sang des différents groupes nous permettra d’identifier un potentiel marqueur de l’AVC et d’investiguer l’effet de notre traitement sur ce marqueur. A terme, ce projet pourrait mener au développement d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement des AVC.
Procédures
Au total, 31 rats mâles Sprague-Dawley adultes (6-8 semaines) seront utilisés dans cette étude, et inclus dans une procédure 1 intitulée « Etude de l’oedème cérébral en IRM après induction d’une ischémie cérébrale transitoire chez le rat ». Cette procédure comprend l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) permettant de reproduire un AVC ischémique (~30min), l’administration en aveugle du traitement ou de son placebo (~15min), deux passages à l’IRM (~30min chaque) à 6h et 24h post-AVC et la mise à mort des rats. Trois groupes de rats seront distingués au cours de cette procédure : un premier groupe de 13 rats recevra le traitement, un second groupe de 13 rats recevra le placebo, et un troisième groupe de 5 rats sera seulement mis à mort pour constituer un groupe contrôle sans AVC ni traitement. Ces rats contrôles ne passeront pas d’IRM. Par ailleurs, l’atteinte d’un point limite au cours du protocole entrainera la mise à mort immédiate de l’animal.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales ont été conçues de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. La procédure a un taux d’échec de 30% : la chirurgie du modèle d’ischémie cérébrale par occlusion temporaire de l’artère cérébrale moyenne via l’insertion d’un filament dans l’artère carotide externe est un modèle complexe qui a un taux de mortalité de 25% et un risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique de 5%. Les nuisances attendues pour les animaux sont : (1) Une hypothermie : au cours de la chirurgie, le risque d’hypothermie est strictement monitoré à l’aide d’une sonde rectale et d’un tapis chauffant, cependant certains rats peuvent avoir du mal à réguler leur température corporelle après la chirurgie, c’est pourquoi des mesures seront prises pour prévenir tout risque d’hypothermie jusqu’à la mise à mort des animaux. (2) Une diminution de leur capacité à se nourrir et à s'abreuver : la zone d’opération se trouvant au niveau des muscles mandibulaires, les rats peuvent avoir du mal à mastiquer et à se redresser pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau. (3) Une douleur céphalée conséquente à l’œdème cérébral apparait dans les premières heures après la chirurgie. L’intensité de cette douleur dépend du degré de sévérité de l’AVC et est évaluée lors du test de suspension par la queue. Cette douleur peut également gêner le redressement pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau, malgré l’analgésie mise en place post-chirurgie. (4) Une gêne pour se déplacer : une paralysie de la patte avant droite apparait au cours des premières heures après la chirurgie. Cette atteinte est plus ou moins importante selon le degré de sévérité de l’AVC et est mesurée dans le neuroscore via le test de rotation. (5) Un stress au cours au transport : 5h et 24h après la chirurgie, les animaux seront transportés vigiles à l’aller et au retour dans une cage de transport entre l'animalerie et l'IRM. Ces quatre trajets de 10-15 minutes en voiture peuvent engendrer un stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente selon une méthode de mise à mort réglementaire et les informations sont conservés pour les contrôles de la SBEA, du vétérinaire référent de l'établissement ou des services vétérinaires départementaux.
Remplacement
S’il existe des modèles alternatifs in vitro recréant des conditions ischémiques sur des cultures de cellules cérébrales, ils ne permettent pas d’étudier les mécanismes inflammatoires complexes et coordonnés entre différents tissus (cerveau-sang), formés de multiples types cellulaires, ni le développement de l’oedème cérébral et sont donc inappropriés à notre étude. De plus, ce projet s’inscrivant dans la continuité de notre étude de l’effet du traitement test sur le cerveau du rat en cas d’AVC, il est indispensable d’utiliser le même modèle expérimental pour intégrer et comparer nos résultats. Cependant, en accord avec les exigences de remplacement et de réduction, des tests in vitro ont préalablement permis de sélectionner la molécule traitement parmi plusieurs candidats médicaments et de définir une gamme étroite de concentrations efficace in vivo.
Réduction
Un test sur un rat mort récupéré de notre précédent projet a été effectué au préalable pour vérifier la faisabilité de l’expérience et mettre au point les paramètres de l'IRM, évitant l'inclusion de rats supplémentaires dans l'étude pour le réglage de l'IRM. La procédure n°1 d’étude de l’effet du traitement sur l’oedème est réalisée sur le nombre d’animaux minimal tout en permettant d’accomplir son objectif. D’après nos précédentes études et en se basant sur la méthode statistique d'estimation développée par Noordzij et al. (2010), un effet sur l’oedème cérébral est observable et significatif à partir de 8 rats par groupes. L’induction de l’ischémie cérébrale a un taux d’échec d’environ 30%, comprenant la mortalité (25%) et le risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique (5%), c’est pourquoi nous prévoyons 13 rats par groupes. Nous estimons que 5 rats non ischémiés seront suffisants à l’acquisition de données de « contrôle » étant donné qu’il n’y a aucun risque de perte. Les tests statistiques utilisés par la suite seront Student ou ANOVA (données paramétriques), ou Mann Whitney ou Kruskal-Wallis (données non paramétriques).
Raffinement
Pour limiter leur stress et selon les mesures de raffinement, une période d’acclimatation de 1-2 semaines sera respectée à leur arrivée. Les rats opérés seront gardés par 2 pour réduire leur stress avant et après chirurgie. Le transport en voiture entre l’animalerie et l’IRM pouvant engendrer un stress chez l’animal, un temps de calme de 20-30min sur tapis chauffant sera respecté avant toute manipulation de l'animal à l’aller et au retour. Au cours de la chirurgie, l’hypothermie est compensée par l’utilisation d’un tapis chauffant thermostaté à 37°C relié à une sonde rectale et par une couverture de survie. Après la chirurgie, la cage des rats sera posée sur un tapis chauffant à l’animalerie et à l’IRM pendant les phases de calme et de réveil de l’anesthésie. Un pack de gel chauffé à 30-37°C sera placé dans le fond de leur cage pendant leur transport et sous leur ventre pendant les 30 minutes d’IRM. Pour contrer les difficultés à se nourrir et à s’abreuver après la chirurgie, des pipettes à tige longue seront mises à leur disposition et des croquettes humidifiées (pellets mélangés à de l’eau) seront placées dans le fond de leur cage. L’option des DietGels a été écartée puisqu’ils contiennent du glucose, composé influençant le volume de l’œdème ; les alternatives sans glucoses ont été testées mais les animaux ne s’y intéressent pas. En accord avec le vétérinaire référent, une stratégie d'analgésie par injection sous-cutanée de lurocaïne 0,5% (7mg/kg) préopératoire sur le site d’incision associée à la buprénorphine post-opératoire (0,03-0,05mg/kg 2x/jour) a été privilégiée. Du gel ophtalmique sera également appliqué avant la chirurgie afin de protéger les yeux des animaux. Ils bénéficieront d'un soin adapté par l'utilisation d'anesthésique et analgésique avant l’IRM et avant leur mise à mort.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 6-8 semaines, pesant 320g +/- 40g, notre étude principale portant sur des pathologies principalement observées chez l’adulte et visant à traiter les patients victimes d’un AVC. Nous avons choisi la même espèce de rat pour cette étude pilote que pour nos études sur l'AVC puisqu'il s'agit d'une mise au point propre à l'espèce. Nous travaillons sur un modèle d'ischémie focale transitoire chez le rat, espèce que nous avons sélectionnée pour son système vasculaire cérébral très similaire à celui de l’homme, en faisant un modèle de choix pour reproduire un AIC. De plus, ce type d’ischémie cérébrale est déjà bien décrit chez le rat et de nombreuses données sont disponibles, nous permettant d’anticiper et de comparer nos résultats. Le rat est également l’espèce de référence dans les études de pharmacologie et les études précliniques. L’utilisation du rat évite de mettre en place de nouvelles études préliminaires pour valider le modèle, et donc d’augmenter le nombre d’animaux nécessaire.
Etude de l’efficacité anti-tumorale de différents formats d’anticorps anti-B7-H3
- Recherche appliquée
- Cancers
10 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 950 dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent des injections répétées et des greffes de cellules tumorales sous la peau ou dans le sang, pour tester différents formats d'anticorps anti-B7-H3 en cancérologie. Le porteur indique que les greffes peuvent provoquer nécrose, saignement, ulcération et perte de poids, et que les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou en fin de protocole par dislocation cervicale. Il conclut au "besoin de nouveaux traitements innovants" et affirme que l'efficacité ne peut être évaluée que dans un modèle vivant, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 9 millions de décès. L’immuno-oncologie est aujourd’hui une approche thérapeutique prometteuse. Sa particularité n’est pas uniquement de cibler la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques mais aussi d’aider le système immunitaire à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. L’utilisation d’anticorps dans le traitement des cancers est l’une des stratégies approuvées et en continuel développement. Différents formats d’anticorps ont été approuvés en clinique : les anticorps monoclonaux présentant une action cytotoxique par ADCC via l’engagement des récepteurs Fc sur les cellules cytotoxiques (Rituximab, Cetuximab,…) ; les anticorps multi-spécifiques liant les cellules tumorales et les cellules effectrices de l’immunité, favorisant l’élimination des cellules tumorales par les cellules immunitaires (Blinatumomab) ; les anticorps conjugués à un agent cytotoxique appelés ADC (Antibody Drug Conjugate) qui est libéré au niveau du site tumoral (Padcev, Enhertu..). Notre laboratoire travaille sur le développement d’anticorps thérapeutiques équivalents sur les formats monoclonaux (mAb), ADC mais également sur le format multi-spécifiques. Les anticorps multi-spécifiques développés par notre laboratoire engagent les cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale ainsi que les cellules tumorales (via un antigène tumoral). Dans le cadre de ce projet, l’antigène ciblé est une molécule que l’on retrouve exprimée à la surface des cellules présentatrices d’antigène ainsi qu’à la surface de cellules tumorales. Des anticorps de la concurrence, dirigés contre cette molécule, sont actuellement en cours d’évaluation clinique. Les premiers essais montrent des signes d’efficacité, ce qui nous conforte dans le choix de cibler cette molécule. L’objectif de ce projet consistera à évaluer chez la souris l’efficacité d’anticorps anti-antigène tumoral sous différents formats (ADCC, multi-spécifique ou ADC).
Bénéfices attendus
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, on dénombre plus de 9 millions de décès par an. Ce chiffre démontre le besoin de nouveaux traitements innovants. Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de l’efficacité anti-tumorale de nouveaux anticorps dans des modèles pré-cliniques, une meilleure connaissance de leur mode d’action et de leur potentiel d’efficacité en combinaison avec des traitements de références. Tout ceci afin d’amener ces anticorps dans des phases de tests cliniques sur des patients atteints de cancer. Le bénéfice à long-terme est le traitement et l’augmentation de l’espérance de vie de patients atteints de cancer exprimant la cible à la surface de leurs cellules tumorales.
Procédures
Pharmacodynamie / pharmacocinétique : a. 1 injection IV de composés thérapeutiques avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse. Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. 1 injection IP de composés thérapeutiques avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL. Test fonctionnel ex-vivo : a. 1 injection en IP de poly(I:C) avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL ; b. prélèvement de rate post-mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle sous-cutané (SC) : a. injection sous-cutané de cellules tumorales avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, une à deux injections SC par animal, volume ≤200 µL par injection ; b. prélèvement de tumeurs et/ou organes en post mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle intra-veineux (IV) : a. 1 injection intra-veineuse de cellules tumorales via veine caudale avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigile, volume ≤100 µL pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. prèlèvement de poumons et/ou foie post-mortem après dislocation cervicale ou surdosage chimique d’anesthésique. Test d’efficacité modèles SC et IV : a. injections IV de composés thérapeutiques ou de composés déplétant 1 population immunitaire avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL. A doses et fréquences variables. Si les injections IV sont réalisées via le sinus rétro-orbital, maximum de 1 injection par œil et par jour sera réalisé avec un maximum de 5 injections par œil ; b. injections IP de composés thérapeutiques ou de composés déplétant une population immunitaire avec aiguilles 30G 1/2 ou 26G, sur animaux vigiles. Doses et fréquences variables dans un volume ≤400 µL ; c. injections per os de composés thérapeutiques avec sondes de gavage, sur animaux vigiles. Volume ≤200 µL et pouvant aller jusqu’à 400 µL. A doses et fréquences variables. Etude de pharmacodynamie et pharmacocinétique + test d’efficacité dans modèles SC et IV : a. prélèvement de sang au sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume de sang prélevé par animal < à 7.5% du volume sanguin total par semaine. Si prélèvements à la fin de la procédure expérimentale, volume prélevé pouvant aller jusqu’à 600µL et l’animal sera sacrifié par dislocation cervicale avant réveil.
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique sont de gravité légère. Aucune incidence significative sur le bien-être ou l’état général ne devrait être observée. Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux bien que répétés et/ou multiples, sont de gravité modérée. Cependant, les composés thérapeutiques injectés dans études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une toxicité dans les jours suivant l’administration. Celle-ci se traduisant par une perte de poids sur 4-5 jours. Les animaux revenant en phase de prise de poids et donc à un état général normal au maximum 7 jours après l’injection. Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèles sous-cutané peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, une nécrose importante et/ou saignement et/ou ulcération et/ou inflammation très importante, une tumeur altérant la mobilité des animaux, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme). Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme).
Devenir
Les animaux de la procédure 1, ayant subit un nombre répété de gestes techniques (injection et prélèvement), seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 2 doivent être sacrifiés pour prélèvement de rate post-mortem. Les animaux de la procédure 3 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de réduire les nuisances sur le bien-être des animaux et d’éviter tout effet indésirable. Les animaux exclus lors de la randomisation seront sacrifiés avant atteinte des points limites et pour certains un prélèvement d’organes/de sang sera effectué pour des analyses ex-vivo et de caractérisation du mode d’action du composé thérapeutique. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 4 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable.
Remplacement
Evaluer des stratégies d’immuno-oncologie implique d’être dans un système biologique complexe qui rassemble tumeur, environnement tumoral et système immunitaire. Compte tenu de l’interaction étroite entre ces différents systèmes, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro, il est nécessaire d’obtenir des preuves de concept chez l’animal dans le processus de développement d’anticorps thérapeutiques. Le remplacement des animaux est donc impossible à mettre en place du fait de la nécessité d’étudier l’efficacité dans un modèle vivo complexe, impossible à mimer in vitro.
Réduction
Le nombre nécessaire de souris a été calculé afin de couvrir les différentes études qui permettront d’investiguer les effets anti-tumoraux des anticorps développés par notre laboratoire et de fournir des résultats statistiquement significatifs. Les données obtenues pour chaque paramètre sur des animaux traités seront comparées aux données obtenues sur des animaux ayant reçu un traitement placebo et/ou traitement de référence et permettre ainsi l’évaluation précise de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre moyen de 10 souris par groupe a été préalablement déterminé sur la base des moyennes et déviations mesurées pour chaque paramètre. C’est le nombre minimum de souris nécessaire afin d’obtenir des données statistiquement interprétables. Si plusieurs composés candidats ou plusieurs doses du même composé doivent être testés dans le cadre de la même série expérimentale, les groupes contrôles ne seront réalisés qu’une seule fois. Pour l’utilisation des souris transgéniques, animaux mâles et femelles d’âges différents pourront être utilisés, afin de réduire le nombre d’animaux générés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans la mesure du possible, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage en cours d’expérimentation, sinon un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse à l’isoflurane) et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. Les schémas d’injections des traitements de déplétion de populations immunitaires seront établis et l’absence de toxicité vérifiée lors de mise au point préalable sur un petit nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, des aiguilles de diamètre 30G 1/2 seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. Le poids des animaux sera suivi une fois par semaine. Certains composés thérapeutiques peuvent induire une perte de poids transitoire des animaux intervenant généralement entre 1 à 6 jours après le traitement. Lorsqu’une perte de poids sera initiée (10% de perte de poids), les souris seront pesées 3 fois par semaine. Dès l'atteinte de 15% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. De plus, dès l'atteinte de 15% de perte de poids, il sera ajouté de la nourriture humidifiée ou gélifiée, au fond de la cage, afin de faciliter l’accès à la nourriture. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou de volume tumoraux (classiquement deux fois par semaine). Si une tumeur commence à montrer des signes de nécrose modérée (inflammation importante et/ou croute), les souris seront surveillées tous les deux jours. Dans le cas d’un modèle agressif avec signe de nécrose modérée, les souris seront surveillées quotidiennement. De plus, si l’aspect général et le comportement de l’animal se dégrade (yeux plissés, oreilles rabattues, prostration, isolement) mais ne nécessitant pas son euthanasie, la surveillance des animaux sera réalisée tous les deux jours. Les points limites relatifs à la perte de poids, à l’apparence et au comportement des animaux, à l’aspect et aux volumes des tumeurs sont des critères qui justifieront l’euthanasie des animaux.
Choix des espèces
La majorité des modèles animaux en immuno-oncologie ont été développés chez la souris. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité d’anticorps thérapeutiques et l’activation du système immunitaire. Des modèles murins de tumeurs solides et hématologiques sont à disposition dans différentes souches. Dans les souches de souris immuno-déficientes : xénogreffes pour tester le candidat médicament sur des cellules tumorales humaines. Le système immunitaire de ces souris bien que déficient, possède tout de même des macrophages ainsi que des cellules NK permettant l’évaluation de nos molécules. Dans les souches de souris immuno-compétentes : modèles syngéniques via la greffe de cellules tumorales murines exprimant l’antigène humain permettant ainsi de tester le candidat médicament en évaluant l’impact de la réponse immunitaire. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études auront un âge minimal de 7 semaines, âge auquel le système immunitaire est décrit comme mature.
Rôle de l’oxygène dans les mécanismes de régénération hépatique : étude de deux modèles d’occlusion veineuse du foie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
61 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent sous anesthésie une chirurgie du ventre avec occlusion des veines du foie et prélèvement d'une partie de l'organe, puis quatre prélèvements de sang à la queue. Le porteur indique qu'une hémorragie, une insuffisance du foie ou une ouverture de la cicatrice sont possibles, et que les rats perdant plus de 20 % de leur poids seront mis à mort. L'ensemble de l'effectif est tué pour prélever le tissu du foie, le porteur revendiquant chez le rat un patrimoine génétique proche de l'humain et une taille facilitant la chirurgie des vaisseaux.
Objectifs
Le projet est intitulé « Rôle de l'oxygène dans les mécanismes de régénération hépatique : étude de deux modèles d'occlusion veineuse du foie ». Le foie est capable de se régénérer, c’est à dire de renouveler le volume et la fonction qu’il perd lorsqu’on enlève une quantité trop importante de foie. L’embolisation portale pré-opératoire (occlusion de la veine porte qui perfuse le foie) est la procédure la plus pratiquée pour faire grossir le foie avant une intervention au cours de laquelle une partie importante de foie doit être enlevée. La mortalité après l’intervention par dysfonction du foie est ainsi beaucoup diminuée en faisant compenser le foie, avant l’opération de résection hépatique. La technique de déprivation veineuse du foie : embolisation portale pré-opératoire et veineuse sushépatique du foie (occlusion de veines de drainages du foie) en un seul temps est une nouvelle procédure faisant augmenter le volume du foie, réalisée chez l’homme depuis peu, avec des résultats de l’ordre du double d’efficacité en deux fois moins de temps. Les mécanismes sous-jacents de ce gain d’augmentation de volume ne sont pas élucidés. Elle représente donc un nouveau modèle de compréhension d’une science du foie appelée régénération hépatique qui étudie la capacité du foie à renouveler son volume et sa fonction après agression. Cette science permet les avancées sur les traitements des maladies hépatiques. L'objectif principal du projet est de valider un modèle expérimental animal de déprivation veineuse du foie chez le rat. Le second objectif est de répondre à la question suivante : le niveau d’oxygène dans le foie après une procédure visant à faire augmenter le volume du foie prédit-il son efficacité à faire grossir le foie ?
Bénéfices attendus
Notre objectif est de développer un modèle expérimental fiable et exploitable de déprivation veineuse du foie afin d’étudier davantage cette technique prometteuse dont la pratique internationale est récente. En effet cette technique représente un nouveau modèle de compréhension de la régénération hépatique. Une fois validé, ce modèle pourra être exploité pour la compréhension d’autres phénomènes : immunitaires, tumoraux ou hémodynamiques par exemple. Ici, nous tentons d’investiguer le rôle que joue l'oxygène dans cette technique. Si le manque d'oxygène permet un gain de volume plus important que dans la technique classique alors nous pourrions cibler le manque d'oxygène comme une thérapie possible dans de multiples maladies du foie. La compréhension scientifique de la régénération hépatique permet d'avancer dans le domaine du traitement des maladies du foie, aigues ou chroniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types de procédures sous anesthésie générale : - Ligature portale (40 minutes) : Occlusion de la veine de perfusion du foie (veine porte) et prélèvement d’une partie du foie (biopsie) par voie chirurgicale par une incision du ventre sous anesthésie générale suivi de l’administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. - Déprivation veineuse (50 minutes) : Occlusion de la veine de perfusion du foie (veine porte), occlusion de la veine de drainage du foie (sushépatique) et prélèvement d’une partie du foie (biopsie) par voie chirurgicale par une incision du ventre sous anesthésie générale suivi de l’administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. - Simulation occlusion (40 minutes) : Groupe contrôle servant de référence de comparaison : incision du ventre, simulation d’une occlusion de la veine porte du foie sans l’occlure, puis administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. Les animaux subiront 4 prélèvements sanguins de 200 µL sur site de la queue : 1 prélèvement la veille de l’opération puis 1 prélèvement par jour les trois premiers jours pour l’analyse de la fonction hépatique ainsi que de la phosphorémie. Ils recevront peu avant le sacrifice, pour 44 animaux, après injection d’antidouleurs, une injection unique dans le ventre d’un produit révélant l’oxygénation des tissus nécessaires aux analyses réalisées Une imagerie de type scintigraphie (30 minutes) visant à évaluer l’oxygénation du foie sera réalisée sur 8 animaux. Une imagerie de scanner (20 minutes) nécessaire à l’analyse des volumes du foie sera réalisée sur 17 animaux.
Impact sur les animaux
La fiche d’évaluation clinique utilisée en routine au sein de notre institut de recherche a été adaptée aux procédures réalisées afin de pallier au mieux aux éventuels effets indésirables. 1) La douleur est la première nuisance possible aux animaux. 2) L’anxiété de l’animal sera diminuée grâce à l’aide d’un environnement enrichit en coton avec un abri. 4) Il est habituel de constater une perte de poids après embolisation portale de l’ordre de 5 à 10 % en 5 jours. Ce pour quoi la perte de poids < 20% ne constituera pas un point limite dans cette étude. Au-delà de 20% de perte de poids une mise à mort sera réalisée par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane. 5) Une hémorragie est possible après l’opération chirurgicale 6) Une insuffisance du foie est possible en tant que complication qui causerait une somnolence de l’animal et diminution de ses mouvements. 7) Des troubles de cicatrisation sont possibles en tant que complication. 8) Une extériorisation des organes du ventre par la cicatrice du ventre est possible en cas de lâchage de la suture de parois qui conduirait à une mise à mort de l’animal sous anesthésie générale.
Devenir
L’ensemble de l’effectif est destiné à être sacrifié afin de pouvoir prélever les échantillons de tissus hépatiques à analyser. Le prélèvement de tissus hépatique permet : - D’analyser la composition du foie en cellules immunitaires et cellules spécifiques du foie. - D’analyser l’oxygénation du tissu après occlusion d’une ou deux veines du foie afin de comprendre s’il existe un lien avec le gain d’augmentation du volume du foie dans la nouvelle procédure d’occlusion des deux veines du foie étudié dans ce projet. - L’analyse de données concernant les messagers envoyés par les cellules du foie pour recruter de nouvelles cellules et se reconstruire.
Remplacement
Les méthodes de culture in vitro ne peuvent simuler les effets mécaniques que sont la privation d’apports nutritifs sanguins veineux ainsi que l'oedème induit par l'occlusion de la veine de perfusion et de la veine de drainage du foie. Le processus d'augmentation de volume du foie s’appuie également sur des messagers qui ne dépendent pas que du foie, ainsi que sur une mécanique vasculaire de débit, de pression et de recrutement de cellules en provenance d'autres organes que le foie. L'analyse du foie et de son oxygénation après l'occlusion d'une ou deux veines du foie chez l'Homme nécessiterait de faire des prélèvements de foie de façon répétée au cours du temps, ce qui serait difficilement concevable car trop risqué pour la santé des patients. Le rat constitue une espèce animale dont le génome est le plus proche de l’être humain, largement étudié en science du foie et dont la taille, plus importante que celle de la souris, permet la réalisation de contrôles des vaisseaux du foie et notamment des veines de drainage .
Réduction
Dans une logique de réduction, le nombre de sujets nécessaire par groupe est calculé selon la bilbiographie dans laquelle des résultats significatifs peuvent être mis en évidence avec des effectifs de 5 rats par groupe en considérant une mortalité post-opératoire d'environ 10%. Le nombre d’animaux nécessaire pour notre étude est de 61. Nous réaliserons dans un premier temps, une étude de l'oxygénation du foie par une méthode non invasive de scintigraphie afin de déterminer quel est le moment où la baisse d'oxygène dans le foie est la plus importante.
Raffinement
Pour tenir compte des contraintes liées à la chirurgie, les animaux pourront être hébergés à raison de deux rats par cage. L’environnement du rongeur sera enrichi avec du coton, un abri et un accès illimité à la nourriture et l’eau. L'alimentation sera enrichie en protéines pour limiter l'impact de l'intervention et limiter une perte de poids. La température de la pièce sera contrôlée à 22°C avec un rythme jour nuit de 12h/12h et contrôle du taux d'humidité. Les procédures ne débuteront que 7 jours après réception des animaux pour permettre leur acclimatation à leur nouvel environnement. Le rythme circadien des rongeurs sera respecté et les procédures réalisées à heures fixes. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane). Une injection d'anti-douleurs morphiniques (buprénorphine) sera réalisée par voie sous-cutanée 0.05 mg/kg lors de l'anesthésie puis toutes les douze heures pendant les 2 premiers jours puis adaptée en période post-procédure. Une injection d'anesthésique local sous-cutanée sera également réalisée en fin de procédure. Si la douleur n'est pas soulagée par la prise de mesures antalgiques, une mise à mort sera envisagée pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous avons choisi, conformément à la littérature, d’étudier les rats mâles adultes car ils ne sont pas soumis aux variations hormonales des animaux en croissance ce qui pourrait interférer avec l'augmentation du volume du foie, du fait de stades de développement différents ou de vitesses de croissance différentes d’un animal à l’autre et d’un nuage hormonal complexe. Les rats possèdent un patrimoine génétique très proche de l’espèce humaine tout en conservant une taille supérieure à la souris, ce qui augmente la faisabilité de la dissection des vaisseaux sushépatiques.
Ciblage thérapeutique de l’autotaxine dans la dégradation ostéoarticulaire en conditions inflammatoires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une inflammation aiguë est induite par injection de LPS et une inflammation chronique de type polyarthrite par des anticorps anti-collagène, avec des injections répétées de traitements et des analyses osseuses par microtomographie. Le porteur indique que ces modèles provoquent fièvre, gonflements articulaires et perte de masse osseuse, la douleur étant atténuée par du paracétamol dans l'eau de boisson. Il affirme que l'effet de l'autotaxine ne peut être apprécié in vitro.
Objectifs
Les maladies inflammatoires sous formes aigües ou chroniques induisent fréquemment la dégradation des articulations et des os. Ces maladies induisent des douleurs conduisant à une dégradation dramatique de la qualité de vie des patients. La mise en place de nouvelles thérapies permettant de stopper la dégradation osseuse dans ces conditions constitue une priorité de santé publique. Le projet a pour objectif d’étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la complexité du processus de progression de la maladie impossible à reproduire in vitro. Le projet a pour objectif de tester l’effet d’un inhibiteur de l’activité d’une enzyme, l’autotaxine, ainsi que celle d’anticorps dirigés contre l’autotaxine elle-même sur l’atteinte ostéoarticulaire dans deux conditions inflammatoires, d’une part aigüe et d’autre part chronique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra le développement de nouvelles thérapeutiques permettant de bloquer l’inflammation et la dégradation osseuse chez les patients atteints d’inflammation articulaire aigüe et chronique suite à un infection bactérienne et en situation de polyarthrite rhumatoïde, respectivement.
Procédures
Le projet est constitué de deux procédures. Au début de la procédure 1, les animaux recevront une injection de lypopolisaccharide par voie intrapéritonéale qui durera moins d’une minute, puis 2 fois par semaine avec des solutions d’anticorps dirigés contre les composés ciblés ou quotidiennement avec des solutions de dexaméthasone, ou d’un inhibiteur des composés ciblés par injections sous-cutanées qui dureront moins d'une minute chacune. La procédure 1 a une durée totale de 7 jours. Au début de la procédure 2, les animaux recevront une injection d’une solution d’anticorps anti-collagène par voie intraveineuse qui durera moins d’une minute puis 2 fois par semaine avec des solutions d’anticorps dirigés contre les composés ciblés ou quotidiennement avec des solutions de dexaméthasone, ou d’un inhibiteur des composés ciblés par injections sous-cutanées qui dureront moins d'une minute chacune. La durée totale de la procédure 2 sera de 28 jours. Un prélèvement sanguin sera réalisé par ponction de la veine sub-mandibullaire qui durera moins d'une minute en fin de chacune des deux procédures, et à J+14 pour la procédure 2. Dans les deux procédures les animaux seront anesthésiés pendant 10 minutes par anesthésie gazeuse en début et en fin de procédure afin de procéder à l’analyse non invasive du tissu osseux par microtomographie.
Impact sur les animaux
Dans le cas de la procédure 1, le projet vise à induire une inflammation aigüe qui se caractérise par un état fiévreux transitoire et par une chute de la masse osseuse. L’intensité de l’inflammation et de la douleur sera atténuée par l’ajout de paracétamol dans l’eau de boisson durant la totalité de la procédure. De plus, dans le but de réduire l’exposition des animaux au stress et à la douleur, la procédure 1 sera arrêtée 7 jours après l’induction de l’inflammation. Dans le cas de la procédure 2, le projet vise à induire une inflammation chronique qui se caractérise par des gonflements articulaires et une chute de la masse osseuse. La durée de la procédure 2 est de 28 jours. Nous avons choisi le modèle d’inflammatoire chronique induite par des anticorps anti-collagène car c’est un modèle transitoire qui présente une résolution spontanée de l’inflammation au cours de la deuxième partie de la procédure. L’intensité de l’inflammation et de la douleur sera atténuée par l’ajout de paracétamol dans l’eau de boisson durant la totalité de la procédure incluant l’ensemble des phases de développement et de résolution de l’inflammation. Les effets attendus pour chaque procédure sont une réduction de l’inflammation et de la perte osseuse dans les groupes d’animaux recevant les différents traitements par rapport aux groupes contrôles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir évaluer la perte de masse osseuse post-mortem.
Remplacement
L’influence de l’autotaxine sur l’inflammation aigüe ou chronique ainsi que sur la dégradation du tissus osseux induite par l’inflammation aigüe ou chronique ne peuvent pas être appréciées par des tests in vitro. L’utilisation du lypolysaccharide et d’anticorps dirigés contre le collagène nous permettront de reproduire chez la souris le plus fidèlement possible la maladie des patients atteints d’inflammation articulaire aigüe suite à une infection bactérienne et de polyarthrite rhumatoïde, respectivement.
Réduction
Pour évaluer la perte osseuse chaque souris sera son propre contrôle grâce à la stratégie d’analyse non invasive par microtomographie au début et à la fin de chaque procédure. De ce fait, la puissance d’analyse statistique permet de réduire fortement le nombre d’animaux par groupe. La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse de puissance réalisée avec BiostaTGV. Sur les 5 ans de réalisation du projet, un nombre total de 160 souris sera nécessaire.
Raffinement
Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (maison rouge, coton) renouvelé une fois par semaine. Afin de permettre l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, les souris seront placées en stabulation durant deux semaines au sein de l’animalerie d’accueil sous surveillance journalière. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort.
Choix des espèces
Les souris adultes BALB/C âgées de 10 semaines. Ces souris disposent d’un système immunitaire complet nécessaire à l’étude de l’inflammation.
Détermination du nombre de cellules tumorales à injecter pour induire des métastases hépatiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules tumorales sont injectées dans la rate par chirurgie pour induire des métastases du foie, suivies de jusqu'à cinq séances d'IRM sous anesthésie, afin d'étudier la résistance aux traitements du cancer colorectal. Le porteur indique que la douleur peut venir de l'implantation tumorale et prévoit la mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids ou en cas de troubles du comportement. Il affirme que la complexité de ce cancer interdit actuellement tout remplacement in vitro.
Objectifs
Le cancer colorectal est l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde, aussi bien chez les femmes que les hommes. Le risque de métastases dans des organes distants est fréquent, le foie représentant généralement le premier organe touché et donc représentatif pour le pronostic du patient. Chez ces derniers patients, le traitement de référence reste est un traitement médicamenteux composé d’une chimiothérapie associée à un agent anti-vasculaire (suivi d’une ablation de la partie cancéreuse du foie). Cette stratégie thérapeutique permet l’augmentation de la survie des patients. Malheureusement, environ 40 à 50% des patients présentent des résistances aux traitements médicamenteux, ne laissant pas la possibilité de les opérer. Le but de cette étude est de déterminer les mécanismes (cellulaire et moléculaire) de cette résistance aux traitements. Le projet vise à étudier la tumeur (les cellules cancéreuses) et son microenvironnement (cellules des vaisseaux sanguins) par IRM (imagerie par résonance magnétique).
Bénéfices attendus
Développer des nouveaux biomarqueurs pour évaluer l'effet du traitement sur le microenvironnement tumoral et le réseau vasculaire. Valider l'efficacité de ces marqueurs sur une cohorte de patients. Prédiction de la réponse aux traitements pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à : 1) Chirurgie : injection des cellules tumorales dans la rate, la durée de la procédure est estimée à 30 minutes. Cette procédure est réalisée sous anesthésie. 2) Imagerie par résonance magnétique :12 jours après l’injection des cellules tumorales, le nombre de séance d’IRM peut aller jusqu’à 5 séances au total, le délai minimal entre les séances d'IRM (Après la première IRM) est d’une semaine à 10 jours (selon la vitesse de croissance de la tumeur). La durée des IRM est 1h par souris (réalisé sous anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
(1) Risque de douleurs suite à la chirurgie. (2) Développement d'un cancer
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin du protocole.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude in vivo ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes, compte-tenu de la complexité́ de ce cancer . Ce modèle permettrait d'étudier les métastases du foie dans leur environnement (développement de tumeur dans l’organe), notamment les cellules des vaisseaux sanguins qui jouent un rôle important dans le développement tumoral. Des études in vitro ont été réalisées en amont, qui complèteront ce volet d'expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation de 30 souris pour une durée maximale de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisé est le minimum requis pour atteindre l’objectif fixé en prenant en compte que le taux tumoral peut varier.
Raffinement
Acclimatation de 10 jours pour les souris après leur arrivée à l'animalerie avant de débuter le protocole. Les animaux sont surveillés quotidiennement et ont accès à la nourriture et à l’eau. Ils sont hébergés dans un environnement enrichi permettant la formation de groupes sociaux. La procédure chirurgicale sera d'environ 30 minutes (maximum), les souris seront endormies et allongée sur un lit chauffant. A la fin de la procédure chirurgicale, le réveil des animaux sera surveillé de près. Après leur réveil les animaux seront réintégrés dans leur cage. Des croquettes humidifiées et de l'hydrogel seront mis en place pour favoriser le bien-être des animaux. Toutes les manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées. Un analgésique qui sera administré avant, pendant et après la chirurgie. L’utilisation de ce dernier sera renouvelée si besoin afin d’éviter toute souffrance à l’animal. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé́, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.) puis l'anorexie, perte de poids > 20%. Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité́ de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris adultes de 8 semaines. Ce modèle est le plus utilisé et validé par la littérature scientifique. Les cellules tumorales qui seront utilisées dans ce protocole sont des cellules murines, qui sont compatible avec l'espèce choisie.