Procédures sévères
Mise au point du modèle d’ischémie/reperfusion cérébrale chez la souris : Rôle de nouveaux gènes et identification de cibles thérapeutiques d’intérêt dans l’ischémie cérébrale.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 230 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chez ces dernières, un monofilament siliconé bouche une artère cérébrale pendant une heure pour provoquer un accident vasculaire, avant 24 heures de reperfusion puis la mise à mort pour mesurer la zone du cerveau détruite. Le porteur décrit une paralysie possible, une prostration et une hypothermie, les souris les plus atteintes selon l'échelle neurologique étant alors tuées, et 40 autres subissent un prélèvement de sang terminal sans réveil. Il affirme que les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier le rôle des gènes dans un "système intégré" et juge le recours à la souris "indispensable".
Objectifs
En France, les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap acquis de l’adulte et la seconde cause de démence. Dans plus de 80% des cas, les AVC résultent de l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot sanguin ou thrombus. On parle alors d’« AVC ischémique » ou « infarctus cérébral ». La principale cause de ces AVC reste l'athérosclérose qui se définit comme une accumulation de dépôts de cholestérol sur les parois des artères. Ces dépôts durcissent et forment des plaques d'athérome qui favorisent la formation du caillot. L’élimination du caillot devient alors une priorité pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale reste une pathologie complexe à explorer chez l’homme. Les modèles in vivo ont pour objectif de reproduire, chez l'animal, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet alors de pouvoir tester plus facilement des hypothèses physiopathologiques et déterminer des stratégies thérapeutiques potentielles pour les patients atteints d’accident vasculaire cérébral. Pour ce projet, nous allons donc utiliser un modèle mis en place et développé chez le rat puis adapté à la souris. Ce modèle, reconnu pour être fiable et reproductible, est un modèle d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (tOMCA), par insertion, pendant 1 h, d’un monofilament siliconé au niveau de l’artère cérébrale moyenne. Après 24 h de reperfusion, la taille de l’infarct sera évaluée. La mise au point et la validation de ce modèle nécessiteront l’utilisation de 80 souris au maximum. Nous pourrons ensuite étudier le rôle de différents gènes potentiellement impliqués dans la formation du thrombus (jusqu’à 5) en mesurant la taille de la zone cérébrale infarcie dans des souris avec délétion ou mutation des ces gènes d'intérêt. Nous prévoyons d’utiliser 30 souris par mutation, soit 150 souris pour 5 gènes. Les premières mutations étudiées portent sur des gènes jouant un rôle important dans la régulation de l’agrégation plaquettaire. Des prélèvements sanguins seront donc réalisés pour évaluer cette fonction chez nos souris (besoin de 40 souris). Pour la réalisation de ce projet, 270 souris au maximum seront donc utilisées
Bénéfices attendus
Les accidents vasculaires cérébraux ischémiques (80% des AVC) résultent de l’occlusion d’une artère cérébrale par un thrombus (caillot sanguin) qui empêche le cerveau d’être alimenté en oxygène par une circulation sanguine normale. Ce type d’accident vasculaire est favorisé par les facteurs de risque cardio-vasculaires comme le tabagisme, l’hypercholestérolémie ou le diabète. Les accidents ischémiques cérébraux provoquent des dommages cérébraux parfois irréversibles, pouvant conduire, lorsque les lésions sont étendues, au décès. Il s’agit donc d’une urgence médicale absolue : le caillot doit être éliminé le plus rapidement possible pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale, en dépit de sa grande fréquence, reste une pathologie complexe à explorer, de par son hétérogénéité clinique mais aussi de par ses interactions possibles avec les nombreux facteurs de risque cardio-vasculaires. Ceci explique les difficultés à aborder, chez l'homme, les nombreux mécanismes physiopathologiques et/ou à identifier des cibles pharmacologiques potentielles de la pathologie ischémique cérébrale. Ces faits ont conduit à développer de nombreux modèles expérimentaux d'ischémie cérébrale chez le rat dans un premier temps, pour les adapter ensuite à la souris transgénique. Les modèles in vivo ont donc pour objectif de reproduire chez l'animal, dans un contexte physiologique proche de celui de l'homme, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet ainsi de tester des hypothèses physiopathologiques et d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Procédure 1: prélèvement terminal de sang en veine cave sur animaux anesthésiés (40 souris au maximum). Procédure 2: modèle d'ischémie/reperfusion réalisé sur 230 souris. L'ischémie transitoire est induite pendant 1h et la reperfusion se fait sur 24h. A l'issue, les animaux sont sacrifiés pour évaluer la taille de la zone infarcie.
Impact sur les animaux
Ce modèle d'occlusion transitoire induit des infarctus plus ou moins sévères qui se traduisent par une mortalité importante si le temps d’occlusion de l’artère est supérieur à 3h. Dans notre étude, le temps d’occlusion n’excèdera pas 1h, limitant ainsi la taille de l’infarct et les éventuelles complications. Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h après la reperfusion . Cette évaluation confirme le succès de la tMCAO post-AVC et détermine l'efficacité de la tMCAO post-reperfusion. Pour une occlusion d’1h, les souris devraient présenter au moins un léger enroulement cohérent (neuroscore 2) et selon la littérature, les déficits neurologiques sont généralement stables jusqu'à 72 heures. Un neuroscore de 4 ou 5 entrainera une mise à mort de l’animal par injection IP d’un bolus d’Euthasol. Les principales complications liées à ce modèle expérimental sont : risque d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, déplacement du fil induisant un risque d’hémorragie sous-arachnoïdienne par rupture vasculaire ou encore reperfusion diminuée liée à l’altération de la paroi carotidienne. La souris , prostrée, dos voûté, poils hérissé, et probablement en hypothermie, sera alors mise à mort. Pour les autres souris, la taille de l'infarct sera évaluée histologiquement après 24h de reperfusion.
Devenir
Procédure 1: Prélèvement de sang en veine cave: procédure sans réveil car nous avons besoin d'une grande quantité de sang pour étudier l'agrégation plaquettaire. Procédure 2 d'ischémie/reperfusion: les souris sont gardées en vie pendant 24h. Après 24h de reperfusion, l'animal est mis à mort pour prélever le cerveau et évaluer la taille de la zone infarcie
Remplacement
Les modèles in vitro disponibles à ce jour ne permettent malheureusement pas l’étude de l’implication de gènes dans un système intégré. Le recours au modèle animal reste ici indispensable pour nous permettre de cibler rapidement et efficacement les gènes ayant un impact positif sur la taille de l’infarctus.
Réduction
Quand ce sera possible, les souris contrôles serviront à l’étude de plusieurs gènes. Le modèle sera alors mis en place par des personnes expérimentées et un protocole analgésique adapté sera mis en place sur toute la durée du protocole pour limiter toute souffrance de l’animal.
Raffinement
Les animaux sont stabulées dans des conditions standards d’animalerie, avec dans la cage nourriture à volonté et milieu enrichi (frisottis ou dôme). Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h , selon une échelle en 6 points. Si l’atteinte neurologique est trop importante, l’animal sera alors exclu de l’étude.
Choix des espèces
Ce modèle d'AVC ischémique a tout d’abord été mis au point chez le rat. En raison de la disponibilité de souris génétiquement modifiées permettant d'analyser le rôle physiopathologique et/ou l'intérêt thérapeutique de gènes candidats, ce modèle a également été développé chez la souris. Pour l'étude de la physiologie et la physiopathologie du système cérébro-vasculaire, il est fondamental de prendre en compte l’ensemble des systèmes régulateurs de façon intégrée. Malheureusement, il n’existe pas, à ce jour, d’approche expérimentale in vitro ou in silico apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques ne faisant pas appel à l’expérimentation animale. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude des gènes identifiés en amont. De plus, nous disposons déjà du modèle de souris Arhgef1, premier gène que nous étudierons dans le cadre de ce projet Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes âgés entre 2 et 4 mois.
Mise en place d’un modèle d’insuffisance cardiaque post infarctus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
127 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature d'une artère du cœur reproduisant un infarctus, la pose d'un implant abdominal puis une chirurgie du thorax pouvant durer jusqu'à 140 minutes, avec six échographies et six prélèvements sanguins sous anesthésie, avant la mise à mort jusqu'à seize semaines plus tard pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'une insuffisance cardiaque doit se développer après la seconde opération et prévoit des points limites en cas de souffrance qu'il ne pourrait soulager. Les retombées annoncées, mieux comprendre la maladie et évaluer des médicaments développés par des entreprises pharmaceutiques, restent au conditionnel et à long terme, tandis qu'il affirme que suivre la fonction cardiaque sur plusieurs semaines exige un "organisme entier".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque touche près d’un million de personne en France et on lui attribue 70 000 décès par an. L’insuffisance cardiaque se traduit par un remodelage du tissu cardiaque associé à des dysfonctions cardiaques. Outre une lourde mortalité (50% à 5ans après l’apparition des premiers symptômes), cette pathologie se traduit également à terme par des symptômes parfois invalidants et des hospitalisations longues et récurrentes. Les insuffisances cardiaques surviennent en très grande majorité dans les suites d’un infarctus du myocarde aigu et sont souvent associées à un remodelage cardiaque délétère. Plusieurs pistes de traitement sont à l’étude mais des efforts majeurs en ce sens restent à entreprendre. L’objectif de ce projet est d’adapter notre modèle de ligature transitoire de l’une des artères principales du coeur (mimant un infarctus du myocarde), afin de développer et caractériser un modèle murin d’insuffisance cardiaque post infarctus. Ce modèle devrait permettre, à terme, de mieux comprendre l’évolution de cette pathologie et de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux traitements médicamenteux, actuellement développés par les entreprises pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
L’insuffisance cardiaque est une pathologie à forte incidence (2,3% de la population adulte française) et aux conséquences lourdes (hospitalisations multiples, syndromes invalidants). Notre projet vise à caractériser un modèle murin d’insuffisance cardiaque, nous permettant à court et moyen terme d’étudier les mécanismes impliqués dans cette pathologie et proposer à terme des cibles thérapeutiques pertinentes et tester l’efficacité de molécules thérapeutiques nouvelles (études précliniques).
Procédures
Selon les groupes expérimentaux, les animaux suivront l’un des parcours suivants : 1) Deux chirurgies, espacées de 14 jours, seront réalisées sur l’animal, sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée (durée : environ 20mn et 140mn maximum respectivement) : la première chirurgie implique la pose d’un implant dans l’abdomen et la seconde chirurgie implique une chirurgie au niveau du thorax. Le suivi des animaux implique 6 examens échographiques (20-30 minutes chaque examen) et 6 prélèvements sanguins (1 minute chaque prélèvement), sous sédation ou anesthésie générale, répartis tout au long de l’expérimentation (à 6 reprises). L’animal est mis à mort au plus tard 16 semaines après l’infarctus pour le prélèvement et l’analyse du tissu cardiaque. 2) Une chirurgie unique, impliquant une chirurgie au niveau du thorax est réalisée sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée (durée de 140mn maximum). La mise à mort est réalisée 48h plus tard (sous anesthésie et analgésie), après un rapide examen échographique (10mn, sous anesthésie et analgésie), pour permettre le prélèvement et l’analyse du tissu cardiaque.
Impact sur les animaux
Les chirurgies sont réalisées intégralement sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée, impliquant l’injection de substances en sous-cutané et une mise sous respirateur (pour la seconde chirurgie). Les animaux sont réveillés en fin de chirurgie, impliquant des soins post-opératoires adaptés aux gestes réalisés. Un délai de 15 jours entre les deux opérations permet un rétablissement complet de l’animal avant la seconde opération. Les examens échographiques (non invasifs) et prélèvements sanguins sont réalisés sous sédation ou anesthésie générale selon l’examen. Pour les groupes d’animaux avec infarctus, le développement d’une insuffisance cardiaque est attendu après la seconde chirurgie. Des points limites sont donc établis en conséquence pour permettre d’interrompre l’expérimentation en cas de douleur/stress/angoisse/dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou soulager.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation, avec prélèvement du cœur pour mesures de la taille d’infarctus ou analyses tissulaires (selon les groupes expérimentaux).
Remplacement
L’insuffisance cardiaque post-infarctus est une pathologie complexe que les méthodes alternatives actuelles ne permettent pas de simuler dans son ensemble. Aussi, réaliser un suivi de paramètres tels que l’activité électrique cardiaque, la fonction cardiaque ou la température corporelle, sur plusieurs semaines d’évolution de la pathologie nécessite le recours à un organisme entier. Il s’agit enfin ici de la mise en place d’un modèle chirurgical animal d’étude de l’insuffisance cardiaque nécessitant par essence le recours à l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - Les approches chirurgicales et la compatibilité entres les méthodes de chirurgie, de mesures et d’imagerie seront au préalable validés sur des cadavres d’animaux mis à mort dans le cadre d’autres projets. - Les procédures seront réalisées de manière successive pour une validation par étape, limitant ainsi le nombre de tests et de groupe d’animaux au strict minimum nécessaire. - L’adaptation d’un protocole d’infarctus du myocarde déjà éprouvé au laboratoire nous permet de pouvoir comparer les résultats obtenus à nos données historiques, nous affranchissant d’avoir recours ici à des animaux pour l’un des groupes d’intérêt de ce projet. - Certains groupes seront réalisés en 2 sessions décalées : la première session comportera 2/3 des effectifs de chaque groupe. La seconde session (1/3 restant, au maximum) ne débutera qu’après analyse des résultats complets de la première session. De cette manière, l’interprétation des résultats de la première session nous permettra d’adapter au plus juste l’effectif et le sexe des animaux de la seconde session. Les effectifs ont été calculés afin d’obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
- Le présent projet doit permettre de valider une approche chirurgicale moins invasive que la méthode classique utilisée dans les études antérieures. C’est une approche que nous souhaitons pouvoir ainsi appliquer à nos futurs projets impliquant un infarctus du myocarde. - Le suivi de la température corporelle et de l’activité électrique cardiaque à l’aide d’un implant, en particulier en période post-opératoire, fournira des données importantes longitudinales supplémentaires sur l’état général des animaux en expérimentation. Ces données doivent nous permettre notamment d’optimiser nos conditions de réveil (température de la couveuse de réveil, timing d’extubation de l’animal, etc.) pour l’ensemble de nos projets impliquant un infarctus du myocarde.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires : Malgré certaines différences physiologiques telles qu’un rythme cardiaque plus rapide, la souris est en effet un modèle qui a fait ses preuves dans l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde et de la cardioprotection. La procédure chirurgicale d’infarctus du myocarde nécessaire pour induire une insuffisance cardiaque est par ailleurs maîtrisée au laboratoire, nous permettant de profiter d’un excellent retour d’expérience. A l’inverse, ce projet doit justement permettre de raffiner davantage notre modèle murin d’infarctus du myocarde utilisé par ailleurs dans d’autres projets. Les animaux participant à ce projet devront être de jeunes adultes (6 à 16 semaines) pour faciliter les examens échographiques : plus les os sont denses, plus ils gênent le passage des ondes ultrasonores, créant des « cônes d’ombre » sur les images échographiques, dont l’analyse peut alors s’avérer plus complexe.
La thermoception chez le nouveau-né murin, un biomarqueur potentiel des troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
560 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les souriceaux, séparés de leur mère, subissent une ouverture du crâne pour des enregistrements du cerveau, le porteur anticipant que certains se réveilleront pendant l'opération ou en mourront. Ils ne sont pas rendus à leur mère, qui risquerait de les délaisser, et sont tués pour prélever le cerveau. Le projet cherche un éventuel biomarqueur précoce de l'autisme et le porteur affirme que ces mesures "ne peuvent pas être envisagées" hors de "l'organisme entier".
Objectifs
L’objectif de notre projet actuel et pour les 4 années à venir est de démontrer l’existence de potentiels évoqués dans le cortex somatosensoriel à la suite d’un stimulus thermique périphérique oro-facial frais non-nociceptif. Il s’agira donc de conduire chez le nouveau-né des enregistrements en imagerie et en électrophysiologie in-vivo combiné à des traitements pharmacologiques appliqués en topique afin de vérifier que l’activité observée provient bien d’une activation par le frais des thermorécepteurs périphériques et notamment des TRPM8.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’apporter des réponses à différents niveaux : Du point de vue fondamentale il va permettre de donner des indications sur la présence ou non d’une intégration corticale de la sensibilité thermique aux températures fraiches. Si des activités corticales sont mesurées, nous pourrons également obtenir des résultats quant à la régionalisation topique du cortex somatosensoriel concernant cette sensibilité thermique. En faisant nos études sur les deux premières semaines de vies, nous allons également savoir s’il y a une modification du codage de l’information de la sensibilité thermique au sein de cette aire. Du point de vue plus translationnel, l’étude sur un modèle murin autistique va nous permettre d’explorer plus précisément au niveau cortical les atypies sensoriels. Les traitements avec l’ocytocine vont nous permettre de vérifier le site d’action périphérique et/ou central de l’ocytocine. Si des altérations des potentiels évoqués en réponse à des stimuli au frais sont démontrés chez les souriceaux autistes, plusieurs perspectives peuvent être alors engagées pour essayer de savoir si cette atypie de thermosensibilité est une caractéristique partagée chez d’autres modèles autistiques. On pourrait alors envisager pour cette atypie un potentiel rôle de biomarqueur précoce de l’autisme. Les traitements à l’ocytocine nous permettront de vérifier son action de modulateur de la sensibilité thermique et d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques pour traiter les atypies sensorielles.
Procédures
- procédures chirurgicales: craniotomie pour l'enregistrement in vivo pour tous les animaux. Durée de l'intervention 30-45 min - Prélèvements de cerveaux après anesthésie et perfusion intracardiaque pour tous les animaux de la procédure 2. Durée de l'intervention 20-30 min
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être stressés par leur séparation avec leur mère avant l’opération. On s’attend à ce qu’une partie des animaux notamment pour les stades les plus précoce se réveillent au cours de la chirurgie due à des problèmes de maintien de l’anesthésie à l’isoflurane ou même décèdent durant la chirurgie par surdose d’anesthésique. On peut s’attendre également à avoir des animaux avec des états post-opératoire mauvais marqué par une hypotonie, une absence de réaction, une souffrance trop importante avec des mouvements excessifs. Dans les cas les plus extrême, un décès à la suite de la chirurgie peut être attendu. Durant les enregistrements in vivo on peut constater des signes de mal-être des animaux tels une agitation, une tachycardie, une hyperventilation des vocalisations excessives ou à l’inverse une totale absence de réaction.
Devenir
L'ensemble des animaux seront sacrifiés après chaque procédure. Ces procédures ne permettent pas de remettre les souriceaux avec leur mère sous risque que cette dernière les délaisse ou les blaisse. Pour éviter ces souffrances des souriceaux, il convient de les euthanasier.
Remplacement
Les mesures d’activité cérébrale et potentiels évoqués à la suite d’un stimulus thermique périphérique ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, ces connaissances fondamentales ne pouvant pas être transposées sur des modèles ex-vivo ou organoïdes, le remplacement n’est donc pas possible
Réduction
Un plan d’expérience sera systématique rédigé avant les expérimentations dans un souci permanent d’optimisation du nombre d’animaux. Aucune étude antérieure n’a été menée sur ce projet auparavant. Utilisation de pharmacologie au lieu de prendre différentes lignées de souris Utilisation de tests statistiques non-paramétriques afin de faire diminuer le nombre d’animaux utilisé dans cette étude L'enregistrement de plusieurs centaines de neurones par animal, permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Expérience faite sur trois stade clés pour éviter de faire une étude sur tous les stades des deux premières semaines de vie dans le but de diminuer le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les expériences seront conduites sur un seul modèle animal. Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés au cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict post-chirurgie des nouveau-nés). Les mères et leur nouveau-nés opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids. Afin de réduire la souffrance des traitements pharmacologiques, ceux-ci seront appliqués de manière non-invasive soit par administration topique d’agonistes/antagonistes des TRMP8 soit par dépôt dans la fenêtre crânienne d’agonistes ocytocinergiques. Les stimuli thermiques seront réalisés à des température fraiches et non froides pour éviter tout test douloureux. Les expériences seront conduites uniquement en situation aigües et non chroniques.
Choix des espèces
L’étude des réseaux corticaux, par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. De plus la réalisation de l’étude sur un modèle autistique doit passer par une mutation génétique, mutation qui n’existe, pour ce modèle Magel2, que chez la souris. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d'étudier la mise en place des activités corticales en lien avec un stimulus thermique frais non-nociceptif de l'échelle cellulaire et à l’échelle du réseau. Les enregistrements in vivo (imagerie et électrophysiologie) seront étudiés durant les deux premières semaines de vie aux stades suivant : P2 : un stade précoce au cours duquel nous avons identifié des troubles sensori-moteurs dans nos études précédentes. P7 : un stade intermédiaire où le système ocytocinergique est en plein développement. P15 : un stade où le système ocytocinergique est complètement mature
Effets cognitifs d’un traitement par un antagoniste des récepteurs 5-HT6 (SB-271046) dans un modèle murin de schizophrénie combinant un facteur génétique et un facteur environnemental
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès le neuvième jour de vie, les souriceaux sont séparés de leur mère pendant 24 heures, en hypoglycémie et hypothermie, puis soumis à une batterie de tests comportementaux nommés, labyrinthe en Y, labyrinthe en croix surélevé, test de sursaut et préférence au sucrose, avec une restriction alimentaire maintenant leur poids à 85-90 %. Ce modèle dit "2-hit" combine une mutation génétique et ce stress précoce pour imiter la schizophrénie, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur revendique une "nécessité majeure" de nouveaux traitements et affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal vivant.
Objectifs
La schizophrénie est une pathologie psychiatrique qui touche environ 1% de la population. Les traitements pharmacologiques actuels sont efficaces sur une partie des symptômes (les délires et les hallucinations) mais d’autres symptômes (perte de motivation, anhédonie, déficits mnésiques, troubles de la perception et de l’attention) ne répondent pas aux traitements. D’autre part, ces traitements ont de nombreux effets secondaires et environ 30% des patients y sont résistants. Il y a donc une nécessité majeure d’en développer de nouveaux, particulièrement pour viser la sphère cognitive, ce qui ne pourra se faire que par l’amélioration de la validité des modèles animaux dans les études précliniques. Ainsi, ce projet se positionne dans le développement d’un nouveau modèle de schizophrénie pour tester par la suite, une molécule potentiellement intéressante pour traiter les symptômes qui ne sont pas encore pris en charge. Le modèle, appelé « 2-hit », combine deux facteurs connus pour être impliqués dans l’étiologie de la schizophrénie : un facteur génétique, la délétion du gène de la sérine racémase, enzyme nécessaire à la production de l’acide aminé D-sérine, et un facteur environnemental qui est un stress précoce induit par une séparation maternelle de 24h au 9ème jour de vie post-natal. La combinaison de ces deux facteurs devrait permettre d’obtenir un modèle animal plus fidèle aux données épidémiologiques actuelles de la maladie humaine. Le projet se découpe donc en trois procédures : • La caractérisation comportementale du modèle 2-hit sur un lot d’animaux (n=125). • L’étude des effets d’un traitement chronique par un antagoniste des récepteurs sérotoninergiques de type 6 (5-HT6), le SB-271046, sur le comportement du modèle 2-hit (n=131). • L’intervention pour la mise à mort induite par perfusion intracardiaque a été rajouté à la fin de chaque procédure Une étude post-mortem sera ensuite effectuée pour comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans ces comportements (électrophysiologie et immunohistochimie).
Bénéfices attendus
La schizophrénie est une pathologie psychiatrique qui touche environ 1% de la population. Les traitements pharmacologiques actuels sont efficaces sur une partie des symptômes (les délires et les hallucinations) mais d’autres symptômes (perte de motivation, anhédonie, déficits mnésiques, troubles de la perception et de l’attention) ne répondent pas aux traitements. D’autre part, ces traitements ont de nombreux effets secondaires et environ 30% des patients y sont résistants. Il y a donc une nécessité majeure d’en développer de nouveaux, particulièrement pour viser la sphère cognitive, ce qui ne pourra se faire que par l’amélioration de la validité des modèles animaux dans les études précliniques. Ainsi, les données obtenues chez l’animal permettront d’apporter de nouvelles connaissances scientifiques sur les effets pro-cognitifs d’un traitement pharmacologique (blocage des récepteurs 5HT6 par un antagoniste) et sur les effets secondaires indésirables de ces substances.
Procédures
Les différentes interventions auxquels les animaux seront soumis durant 3 mois sont : - Séparation maternelle : une seule fois à l’âge de 9 jours, durée : 24h - Identification sous anesthésie générale permettant de placer une puce RFID : une seule fois à l’âge de 30 jours, durée : 2 minutes - Tests comportementaux réalisés une seule fois : mémoire de travail en labyrinthe en Y (5 minutes), activité motrice à l'aide d'un actimètre (30 minutes), comportement de type anxieux dans un labyrinthe en croix surélevé (5 minutes), comportement social (5 minutes) - Restriction alimentaire et test d’apprentissage sur écrans tactiles durant 6 semaines (85-90% du poids). Durée de chaque phase de test d’apprentissage : 1h. - Test de l’inhibition du réflexe de sursaut deux fois, durée : 30 minutes. Avec un sans injection intra-péritonéale préalable selon le groupe (injection 30 minutes avant). - Test de préférence au sucrose, durée : 3 jours. - Mise à mort lors d’une perfusion-fixation. Les animaux de la procédure 2 recevront une injection intra-péritonéale quotidienne durant 15 jours avant le début des tests.
Impact sur les animaux
Lors de la séparation maternelle de 24h, les animaux sont en état d’hypoglycémie, d’hypothermie et de stress psychologique. Une augmentation de l’anxiété à l’âge adulte peut être observée, il s’agit d’un état attendu à la suite de cette manipulation. Une légère perte de poids transitoire peut être observée suite à la séparation. Cet état est attendu, c’est le but de la modélisation, mais toutes les mesures seront prises pour réduire au maximum ces formes d’inconfort et de souffrance. Afin qu’ils puissent maintenir au mieux leur température en restant groupés, les souriceaux restent dans le nid et c’est la mère qui est placée dans une cage attenante. La restriction alimentaire nécessaire pour le test de l’écran tactile sera contrôlée quotidiennement et sera stoppée et/ou réadaptée si nécessaire. Le calcul des 15% maximum de perte de poids sera basé sur le poids moyen des animaux témoins nourris ad libitum afin de prendre en compte l’évolution des besoins inhérents à la croissance « normale » des souris. La quantité de nourriture donnée chaque jour aux animaux dépendra également du poids moyen des animaux de la cage ce jour-là. Si une grande différence de poids apparaît entre les animaux d’une même cage alors les animaux ayant perdu le plus de poids seront alimentés séparément puis replacés avec leurs congénères. La restriction alimentaire sera effective seulement durant le test de -l’écran tactile et sera stoppée dès le test fini.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort dont une partie (160) seront réutilisés pour des études immunologiques.
Remplacement
S’agissant d’études comportementales faisant appel à des fonctions cérébrales très intégrées et à une pathologie psychiatrique très complexe, aucun modèle in vitro ne peut remplacer, à l’heure actuelle, l’utilisation des animaux vivants dans notre projet.
Réduction
Les animaux seront utilisés pour l’ensemble des tests comportementaux puis pour les études post-mortem permettant ainsi de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. De plus, nous avons déterminé un nombre de 15 animaux minimum par groupe. En effet, un test de puissance proposé sur le site https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets# nous a permis d'aboutir à ce nombre sur la base de données précédentes acquises au laboratoire.
Raffinement
Les animaux seront quotidiennement surveillés, et régulièrement pesés. Ils seront manipulés par du personnel expérimenté. Une semaine avant le début des expériences, les animaux seront manipulés quotidiennement (handling). De plus, au moins 30 min avant le début de chaque test, les animaux seront placés dans la pièce d’expérimentation pour leur permettre de s’habituer à l’environnement.
Choix des espèces
A l’heure actuelle, il n’existe qu’une seule espèce animale, la souris de souche C57BL/6, dont le génome a été modifié pour porter la délétion du gène sérine racémase (souris SR-KO). Les animaux seront testés une fois devenus adulte entre le 3ème et le 5ème mois puisque que les déficits cognitifs apparaissent dès l’âge adulte. Ils seront cependant préparés en amont : accouplement des animaux (témoins et SRKO) puis séparation maternelle au 9ème jour de vie post-natale mimant ainsi un des facteurs de risque chez l’Homme, le stress post natal. Les études en électrophysiologie et immunohistochimie seront réalisées post-mortem.
Caractérisation d’un modèle murin de xénogreffe de cellules de cancer du sein et évaluation des effets de l’irradiation sur la progression tumorale et la réponse immunitaire associée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules de tumeur mammaire sont injectées dans deux coussinets graisseux mammaires de chaque souris, puis les tumeurs sont irradiées sous anesthésie, ce qui peut provoquer leur nécrose ou leur ulcération. 110 souris femelles de six à huit semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec une prise de sang par semaine au plus, sous sédation, pendant quatre mois au maximum, et toutes sont tuées à l'issue ou dès qu'un point limite est atteint. Le but est de caler les doses d'irradiation pour un projet ultérieur associant nanoparticules et rayons, en cherchant un effet qui laisse subsister une partie des cellules tumorales. Le porteur indique que des métastases, surtout pulmonaires, peuvent apparaître sans être détectables avant l'autopsie, et ne chiffre pas le "volume critique" de tumeur qui déclenche la mise à mort.
Objectifs
Un des axes d’amélioration thérapeutique dans le traitement du cancer par radiothérapie consiste en une augmentation de la dose d’irradiation ciblant les cellules tumorales, tout en limitant au maximum l’irradiation des cellules saines localisées autour de la masse tumorale. . Après avoir réalisé des études in vitro sur le potentiel thérapeutique d’une approche combinant irradiation et présence de nanoparticules dans les cellules cancéreuses , il est désormais nécessaire d’évaluer l’effet in vivo, où le système immunitaire des animaux pourrait augmenter encore l’effet souhaité. Ainsi, dans le cadre de ce projet, nous cherchons à développer et caractériser un nouveau modèle murin de cancer du sein, pour l’utiliser afin d’évaluer l’action de nouvelles nanoparticules sur la sensibilité aux irradiations des cellules cancéreuses. Nous utiliserons également ce modèle pour étudier l’impact de la réponse immunitaire sur l’effet à distance suite à un traitement. Le développement de ce nouveau modèle nécessite la réalisation de greffes de cellules tumorales mammaires dérivées d’un type de souris génétiquement modifiée dans des souris receveuses/hôtes, pour mimer ainsi les différentes étapes de la progression tumorale du cancer du sein. Le premier objectif est d’évaluer les paramètres cliniques de la progression tumorale, après greffe de ces cellules de tumeurs mammaires. Le second objectif correspond à la détermination des doses optimales d’irradiations et de leurs fractionnements pour observer une régression tumorale dans ce modèle murin. Enfin, le dernier objectif est d’évaluer la réponse immunitaire sanguine et tumorale des animaux suivant l’irradiation.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre - d’évaluer la faisabilité d’un modèle de greffe de cellules tumorales du sein, qui puisse être reproductible et utilisable pour tester des traitements anti-cancéreux. - de déterminer les conditions optimales d’irradiation de ce modèle. Pour un projet ultérieur, testant l’efficacité d’un double traitement avec nanoparticules et irradiations, il est nécessaire de déterminer une fenêtre d’irradiation réunissant deux conditions : un effet de l’irradiation seule doit être observé d’une part, mais sans éliminer l’ensemble des cellules tumorales présentes d’autre part, afin d’évaluer objectivement l’effet d’un double traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types d’intervention, à savoir des prélèvements sanguins, une injection de cellules tumorales, et une irradiation. Chacune de ces interventions ne dure pas plus de quelques minutes (anesthésie comprise) - Les prélèvements sanguins sous sédation seront réalisés à partir du jour de l’injection de cellules tumorales, au maximum une fois par semaine, et pour un volume maximal de 60µl de sang. Les prélèvements seront effectués au maximum pendant quatre mois, correspondant au temps d’inclusion des animaux dans les procédures. - L’injection de cellules tumorales sera réalisée en une fois, dans deux coussins adipeux mammaires par souris. - Les irradiations seront effectuées sous anesthésie dans un irradiateur pour petit animal. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique, et l’apparition de nécrose ou ulcération tumorale sera répertoriée, afin de détecter l’apparition d’un point limite
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits par les traitements peuvent être d’une part dus à l’injection de cellules, avec une possible réaction inflammatoire au point d’injection. Avec un suivi adapté et une analgésie si nécessaire, ces effets peuvent être limités à quelques heures. Si l’inflammation persiste, l’animal sera exclu de l’étude, cette réaction pouvant entrainer un biais dans l’analyse de la réaction immunitaire. Les cellules tumorales injectées sont censées former une masse tumorale en croissance. Cette croissance sera progressive et pourra atteindre un volume critique, qui sera considéré comme un point limite. Dès l’atteinte de ce point limite, l’animal sera euthanasié. De même, une croissance tumorale qui serait défavorable au comportement normal de l’animal sera considérée comme point limite. Des métastases (pulmonaires essentiellement) sont susceptibles d’apparaître chez certains animaux. Elles ne seront pas détectables avant l’autopsie. La croissance des tumeurs et métastases peut également mener à une perte de poids globale et des signes cliniques de mauvais état général. Dans ce cas, l’utilisation d’une grille de score (outil d’évaluation quantitatif de points limites) permettra d’évaluer la nécessité de procéder à une euthanasie. Enfin, l’irradiation peut favoriser, notamment avec de fortes doses, l’apparition d’une nécrose ou ulcération de la tumeur irradiée. Cet effet sera reporté dans le tableau de scoring et utilisé comme point limite menant à l’euthanasie.
Devenir
Les animaux du projet seront tous euthanasiés, selon deux critères : - soit l’animal a atteint un point limite fixé dans ce document et sera euthanasié. - Soit l’animal n’a pas atteint de point limite dans le cadre de l’étude, mais est porteur de tumeurs, donc sera euthanasié en fin d’étude (soit au plus tard quatre mois après inclusion) car ne pourra pas être réutilisé.
Remplacement
Le projet présenté s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large, visant à évaluer l’efficacité antitumorale d’un double traitement associant des nanoparticules à des irradiations. De nombreuses études sur l’augmentation des effets des irradiations par les nanoparticules métalliques ont été réalisées in vitro, et parfois sur des modèles 3D. Les résultats obtenus, très contrastés, sont la plupart du temps éloignés des résultats obtenus in vivo chez la souris, voire en essais cliniques. En effet, il est désormais admis que cet effet potentialisant est au moins en partie dû à la survenue d’une réponse inflammatoire et l’intervention de cellules immunitaires. De plus, le projet cherche également à mettre en évidence l’effet à distance d’un tel traitement, c’est-à-dire la régression d’une tumeur à distance du lieu d’irradiation. Ainsi un modèle in vitro, même de type organoïdes, ne permettrait ni de réellement évaluer l’efficacité de radiosensibilisation des nanoparticules, ni d’estimer le potentiel abscopal de ce type de traitement. Par conséquent, il est nécessaire de mettre en place un modèle pertinent de tumeurs du sein, objet de cette demande .
Réduction
Ce projet va permettre de déterminer les fenêtres de caractérisation et d’irradiations (doses et fractionnement) optimales dans ce modèle pour observer un effet sur la régression tumorale. Ce projet nous permettra de réduire le nombre d’animaux au minimum pour déterminer la dose d’irradiation optimale. Le modèle développé pour ce projet permet également de générer des tumeurs homogènes chez les souris receveuses/hôtes, assurant ainsi une meilleure reproductibilité dans la réponse thérapeutique.
Raffinement
Dès l’injection des cellules tumorales dans les souris, les animaux seront surveillés les lundis, mercredis et vendredis, chaque semaine. Chaque animal fera l’objet d’une observation dans la cage tout d’abord, puis sera anesthésié à l’isoflurane pour être caractérisé plus précisément. Les observations seront répertoriées dans des feuilles de suivi (de scoring) afin de pouvoir assurer un suivi et détecter une évolution défavorable des signes. L’observation du comportement des animaux d’une part, et la mesure du poids et de la taille des tumeurs d’autre part, nous permettra d’évaluer la nécessité d’apporter une solution analgésique ou de procéder à l’euthanasie des animaux si leur condition l’indique (amaigrissement important, prostration, etc...). Des aspects supplémentaires seront répertoriés (réaction à l’anesthésie et aux prélèvements sanguins, aspect clinique de la tumeur), afin de déterminer l’apparition d’autres points limites menant à l’euthanasie. Les animaux seront maintenus en groupe selon les conditions habituelles d’hébergement dans l’établissement utilisateur.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en cancérologie. Les cellules tumorales utilisées proviennent du modèle murin génétiquement modifié qui développe des tumeurs mammaires spontanées comparables aux tumeurs humaines, en matière de carcinogénèse, et de types histologiques et moléculaires. Les cellules seront greffées dans des souris receveuses/hôtes, qui ont donc le même fond génétique que les cellules greffées, afin d’éviter tout rejet de greffe ou réaction inflammatoire indésirable. Enfin, les souris receveuses sont immunocompétentes (capables de produire une réponse immunitaire face à un corps étranger), critère indispensable dans notre étude qui cherche à déterminer les modifications de la réponse immunitaire. Le développement de cancers étant évalué à l’âge adulte, nous utiliserons des souris femelles âgées de 6 à 8 semaines. Le développement de cancers étant évalué à l’âge adulte, nous utiliserons des femelles âgées de 6 à 8 semaines.
Enregistrement du nerfs splanchnique et renal (sympatique) chez le rat paraplegique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
27 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 20 opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil et 7 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces 7 rats subissent une lésion de la moelle épinière puis quinze jours de paraplégie avant l'enregistrement de nerfs du système nerveux autonome, les 20 autres ne subissant que la chirurgie finale. Le porteur affirme que réveiller les animaux après la pose d'électrodes autour des nerfs sympathiques ne serait pas éthique, ce qui justifie leur mise à mort. Il décrit des tests préliminaires menés in vitro sur des moelles de ratons mais indique que l'enregistrement des nerfs ne peut se faire que sur un système intégré vivant.
Objectifs
Les lésions spinales (SCI) sont parmi les atteintes les plus invalidantes et répandues dans le monde, avec une incidence de 15 à 52,5 cas par million (soit 12000 nouveaux cas par an aux Etats-Unis d’Amérique et 40000 patients en France), affectant majoritairement des individus jeunes et en bonne santé (80% sont des hommes âgés entre 15 et 35 ans), avec un impact dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne. En plus des effets sur le système sensori-moteur bien connus et identifiés (paralysie, insensibilité), les sujets SCI présentent une détérioration importante de l’activité de leur système nerveux autonome, système nerveux en charge des grandes fonctions de l’organisme (rythmes respiratoire et cardiaque, pression artérielle, thermorégulation…) entrainant des troubles cardiovasculaires majeurs (atteinte du rythme cardiaque et de la régulation de la pression artérielle). Le but de notre projet de recherche est d’élucider les dysfonctions cardiovasculaires chez l’animal lésé médullaire. Lors d’une lésion spinale, les commandes envoyées par le cerveau vers la moelle sont perdues. Des travaux ont proposé que pour partie, le contrôle du tonus vasculaire pouvait être réalisé par un système « décentralisé », localisé dans la moelle épinière. En accord avec ces données, il a été découvert récemment l’existence d’un circuit rythmogène au sein de la moelle épinière qui réaliserait le couplage entre les activités somatique (qui achemine les informations provenant des organes sensoriels) et sympathique (qui permet une réponse adaptée du corps). De plus, les résultats in-vivo d’une étude faite sur l’activation pharmacologique d’un couplage sympathico-somatique au sein de la moelle épinière est porteuse de perspectives de traitements afin de réduire la gravité des symptômes vasculaires chez les patients lésés
Bénéfices attendus
Ce projet éthique fait partie d'une étude visant à identifier de nouvelles molécules permettant le rétablissement des ondes de Mayer (oscillation de la pression artérielle de nature vasomotrice). Cela pourra être une avancée dans le traitement des dysreflexies autonomes (épisodes soudains et brutaux d’hypertension et de bradycardie, déclenchés par des stimuli nociceptifs) survenant chez les personnes présentant des lésions hautes de la moelle épinière. Ce projet en particulier a pour but de définir si l'oxotremorine joue un rôle sur dans l’activation sympatique de la moelle épinière.
Procédures
7 animaux subiront une lésion haute de la moelle épinière (chuirurgie d'environ 1 heure). Ils resteront paraplégiques pendant 15 jours avant d'être endormis une dernière fois et permettre l'enregistrement de certains nerfs du système nerveux autonome (système nerveux qui régulent de façon automatique - sans en être conscient (maximum 2h30 avec la chirurgie et l'enregistrement du nerf) – les grandes fonctions de notre corps telle que la respiration, la pression artérielle, le rythme cardiaque…). 20 autres animaux subiront uniquement la dernière chirurgie sans réveil (enregistrements des nerfs).
Impact sur les animaux
Les animaux tout comme les humains présentant des lésions de la moelles épinières présentent des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée en hauteur.
Devenir
Le placement d'électrodes autour des nerfs sympatiques peuvent les abimer. Il n'est donc pas éthique de réveiller ces animaux dont les fonctions vitales pourront être impactées.
Remplacement
Des tests préliminaires à cette grosse étude, ont été faits sur des moelles épinières de rats nouveaux nés in vitro avant d’envisager des études in-vivo. Concernant l'enregistrement des nerfs sympathiques (nerfs du système nerveux autonome - défini précédemment - qui induisent des augmentations de fréquence cardiaque, respiratoire, sécrétion d'adrénaline ou encore diminution de l'activité digestive), il n'est pas possible de faire cette étude ex-vivo car l'enregistrement de l'activité des nerfs est la résultante d'un système intégré
Réduction
Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux par lots (n=5) afin de pouvoir finaliser une grosse étude sur les lesions hautes de la moelle épinière. Nous utiliserons les tests de Mann-Whitney pour comparer nos résultats.
Raffinement
(alimentation semi-liquide pour pallier au ralentissement de la vidange gastrique), ajout de paraffine dans celle-ci (pour pallier au ralentissement de la motricité intestinale), cage sur tapis chauffant (pour pallier aux problèmes de thermorégulation), vidange de la vessie plusieurs fois par jour par des expérimentateurs expérimentés, alimentation et eau au fond de la cage (cage avec un biberon bas et des coupelles d'aliment posées au sol. Le tunnel est en plastique rouge rainuré pour permetre une meilleur mobilité dedans, tapis aggripant au fond de la cage (pour facilité la mobilité). De même, le protocole analgésique a été validé par 2 vétérinaires. Seul un nombre minimum de personne (1 ingénieur - niveau concepteur et chirurgie et 1 chercheur - niveau concepteur et chirurgie - 1 animalier - niveau expérimentateur + le vétérinaire en cas de besoin) seront amenés à rentrer dans la pièce où se trouveront les animaux afin de s'assurer que les animaux soient manipulés par peu de personne (personnes habituées à leur conditions particulières, pouvant s'adapter aux problématiques éventuelles).
Choix des espèces
Les premières études de ce projet ont été faites sur des rats sprague-dawley. Le choix initial de l'espèce est lié à la taille de l'animal facilement hébergé dans une animalerie mais pas trop petit comme la souris afin de pouvoir facilement pratiquer la lésion de la moelle épinière. Nous gardons la même espèce ici dans un soucis de continuité de projet. Nous utiliserons des rats adultes d'environ 300gr (âge : 70 à 80 jours)
Expérimentations de marquage pour mieux comprendre le cycle de vie du thon rouge Thunnus thynnus
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
234 poissons, thons rouges et listaos, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour poser des marques électroniques et suivre leurs migrations. Le porteur indique que 222 seront relâchés en mer après capture, sortie de l'eau et pose de marque, et que 12 seront tués pour récupérer les capteurs. Il décrit un protocole de capture rapide, moins de deux minutes hors de l'eau, avec intubation et double ancrage de la marque pour limiter les blessures. Une partie des tests met au point des marques internes de fréquence cardiaque, essayées au préalable sur des thons morts.
Objectifs
Le thon rouge Thunnus thynnus est une espèce qui a historiquement subi une surexploitation, ce qui a mené à un plan de reconstitution initié en 2007. Depuis, la situation du stock Est-Méditerranée s’est substantiellement améliorée. Il reste néanmoins de grandes étapes à franchir pour la gestion et la conservation de ce stock, ainsi que des espèces de grands pélagiques en général. En particulier, la compréhension des liens entre l’environnement physique (e.g. le climat) et les processus biologiques (migrations, reproduction, nutrition) sont aujourd’hui mal connus pour ces espèces à très larges aires de répartition. Ce projet a pour objectif général de mieux comprendre le cycle de vie du thon rouge, et les expérimentations ont deux volets principaux. Le premier sera le marquage d’animaux sauvages en haute mer, avec des marques archives électroniques externes de type 'pop-up' qui enregistrent des informations environnementales (température, lumière, pression), à transmission satellite pour pouvoir retracer les parcours de migration. Les marquages auront lieu sur des bateaux de pêche commerciale. Le deuxième volet sera des expériences pour le développement de marques 'pop-up' innovantes et pour la mise au point de méthodes de marquage avec des capteurs internes. Ces expériences seront toujours des marquages en bateau, sur des thons listao Katsuwonus pelamis (île de La Réunion, en palangrier) et des juvéniles de thon rouge (Golfe du Lion en palangrier). Contrairement au thon rouge, le thon listao est plus abondant, plus facilement accessible à la pêche et de moindre importance commerciale. Le listao est un modèle idéal pour faire des tests de dispositifs électroniques innovants qui seront utilisés in fine sur les thons rouges. Des marquages sur des juvéniles de thon rouge serviront pour la mise au point de déploiements de capteurs internes qui enregistrent des données physiologiques, notamment l’impédance des tissus et la fréquence cardiaque. À long terme, l’ensemble des expériences vont servir au développement des marques archives à transmission satellite qui enregistrent des données physiologiques, à utiliser pour comprendre les liens entre environnement et physiologie pendant le cycle de vie des animaux sauvages.
Bénéfices attendus
Les expériences de marquage ‘pop-up des thons rouges représenteront une avancée majeure dans notre compréhension de la biologie de cette espèce. Le projet permettra aussi des avancements importants vers le développement de tags externes archives qui enregistrent plusieurs variables physiologiques chez les espèces des grands pélagiques marines. Les expériences sur les thons listaos (masse 3 - 6 kg), permettront de tester des marques pop-up qui sont des alternatives aux marques actuellement en commerce, moins chères mais plus performants. En particulier, avec un ancrage dans le muscle axial qui sera équipée d’un système d’électrodes pour un capteur de taux de gras, par mesure de l’impédance des tissus. Les mesures de taux de gras indiquent l’état nutritionnel du poisson et pourront fournir des aperçus sur les zones de nourrissage des thons le long de leur trajet migratoire. Les expériences avec les marques physiologiques sur les juvéniles de thon rouge dans le Golfe Lion permettront de maîtriser les protocoles de déploiement des marques externes qui mesure l’impédance, mais aussi des marques internes qui enregistrent la fréquence cardiaque. L’observation de la fréquence cardiaque est la meilleure façon d’estimer l’activité métabolique des animaux en liberté. Il existe des marques en commerce qui enregistrent l’électrocardiogramme (ECG) pour pouvoir calculer la fréquence cardiaque mais, étant des systèmes archive interne, le tag doit être récupéré pour obtenir les données. Une approche issue de la chirurgie humaine, la laparoscopie, a été utilisée sur des thons morts pour établir le placement optimal des marques ECG en proximité du cœur.
Procédures
Le présent projet envisage le marquage de 110 thons rouges avec des marques archives électroniques externes de type 'pop-up'. Les individus seront pêchés à la canne sur des palangriers commerciaux ou depuis des senneurs sur les sites de reproduction. Le protocole de capture limite au maximum la souffrance et le stress des animaux grâce à des temps de pêche réduits (
Impact sur les animaux
Pour le marquage avec les tags externes 'pop-up', les nuisances et les effets indésirables seront très limités, grace au méthode de capture et marquage rapide. Un système de trocart sera utilisé pour implanter les marques internes de la façon la plus rapide et le moins nuisible possible, soit dans la cavité péritonéale, soit intramusculaire dans la mâchoire. Le fait de minimiser l’invasivité de l’intervention maximisera les chances de survie de l’animal, et évitera les effets sur son comportement et son bien-être. Certains des thons marqués avec des tag physiologiques (n = 6) seront relâchés équipés avec des ‘survival tags’, pour confirmer que le marquage n’a pas d’impact sur leur survie, en comparaison avec des thons capturés mais non-marqués (n = 6). Pour n = 12 de ces thons rouges, la marque sera placée puis les animaux seront remis à l'eau attachés avec un hameçon, pour enregistrer leur fréquence cardiaque et évaluer la qualité du signal ECG obtenu. Ces dernières expériences serviront pour la mise en œuvre du marquage de thons adultes en cage.
Devenir
222 thons seront relâchés dans leur milieu naturel et 12 seront mis à mort pour récupérer les marques électroniques.
Remplacement
Ces études doivent être réalisées sur le thon rouge car l’objectif est d’améliorer les connaissances sur l’écologie de cette espèce dans son environnement naturel. On remplacera cependant celui-ci par des poissons morts ou par le thon listao quand cela sera possible, notamment pour les tests de mise au point méthodologique ou pour des développements électroniques.
Réduction
Le nombre d’individus utilisés est optimisé afin de permettre de réaliser des tests statistiques appropriés aux différents objectifs du projet et tenant compte de la grande valeur économique des thons rouges adultes. Le nombre a été déterminé pour permettre de capturer plusieurs réplicats de séries temporelles générées par les capteurs des marques électroniques permettant de renseigner fréquence cardiaque, profondeur, température ambiente, lumière, accélération. Les expérimentations ne relèvent pas de la comparaison de population, mais de la collecte de données en milieu naturel sur des processus que nous cherchons à caractériser (e.g. migrations). Il n’est donc pas possible de calculer le nombre nécessaire d’individus a priori et nous avons choisi un chiffre permettant d’obtenir suffisamment d’information exploitable en tenant compte des aspects logistiques complexes de ces opérations, de la probabilité que la marque ne fonctionne pas correctement ainsi que de la valeur commerciale des individus. Pour le marquage des thons rouges avec marques archives en bateau, chaque année pendant 5 ans, 5 individus juvéniles seront marqués dans le Golfe du Lion et sur la côte Atlantique, et 12 individus adultes matures sur les sites de reproduction. Pour les thons listao, chaque année pendant 5 ans, 20 individus seront marqués avec différents prototypes de marques archives électroniques. Pour la mise au point des méthodes de déploiements de capteurs internes, des études préliminaires seront achevées sur 24 thons juvéniles pour évaluer la méthode la plus rapide et moins stressante de placement des deux types de marque.
Raffinement
Le protocole de marquage des thons rouges et listaos sur bateau avec des marques externes a déjà été mis au point. Notamment, le protocole limite au maximum la souffrance et le stress des animaux grâce à des temps de pêche réduits (
Choix des espèces
Le thon rouge est le modèle principal du projet. C’est une espèce exploitée emblématique, notamment en Méditerranée. De nombreuses questions scientifiques importantes tant au point de vue fondamental (e.g. déterminisme des migrations et des routes migratoires en relation avec l’environnement) qu’appliqué (e.g. zones de pontes, temps de résidence, structuration de la population) doivent cependant être résolues pour gérer de façon durable cette espèce. Les outils développés dans le cadre du présent projet visent précisément à aborder ces questions. Le thon listao est une espèce abondante dans l'Océan Indien, son utilisation permet de réduire le nombre de thons rouges utilisés pour achever les tests de différentes modèles nouveaux de marques archives. Les individus seront une combinaison de juvéniles (pas sexuellement matures) et adultes (stade reproductif). Les expériences avec les marques physiologiques sur les juvéniles de thon rouge permettront de maîtriser les protocoles de déploiement des marques externes qui mesure l’impédance, mais aussi des marques internes qui enregistrent la fréquence cardiaque. Le marquage de 110 thons rouges adultes avec des marques archives 'pop-up' permettra de mieux connaitre les zones de reproductions, les migrations transatlantiques et les zones de nourricerie de cette espèce. Les marquages de 100 thons listaos en Océan Indien permettront de tester des marques pop-up qui sont des alternatives aux marques actuellement commercialisées, moins chères et plus performants.
ONCO-SC Evaluation de thérapies cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées en sous cutané
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 5000
Près de 250 études par an, au gré des commandes des clients : 62 500 rongeurs, soit 57 500 souris et 5 000 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une société prestataire de recherche préclinique leur greffe des tumeurs sous la peau, dans la peau ou dans la graisse mammaire, puis leur administre des composés anticancéreux par le nez, la trachée, la bouche ou par injection, jusqu'à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde. Dans le résumé publié, la description des effets néfastes s'arrête au milieu d'une phrase, sur "une évolution du volume tumoral". Le porteur affirme que seuls les petits rongeurs offrent un statut immunodéprimé "indispensable à l'implantation de cellules tumorales humaines". Sur le devenir, il écrit seulement "Les animaux seront mis à mort", alors que le champ structuré déclare 3 000 souris et 200 rats réutilisés.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cette évaluation chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Implantation de transpondeur pour identifier l’animal en sous cutané, sous anesthésie générale (Isoflurane 3-5%) en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe. Induction tumorale : Sous anesthésie Test de composés chimiques ou biologiques : - Administrations intra-nasales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%), maximum 25µL par narine. - Administrations intratrachéales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%). - Administrations IV, IM, IP, SC et ID sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%) si nécessaire, si possible sous contention. - Administrations PO sous contention Mesure des animaux : sous contention Prélèvements : - Sang : o prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale à l’isoflurane (exemple non exhaustif : veine faciale, jugulaire, caudale, ou sinus rétro-orbitaire). o prélèvement par piqure à la veine caudale potentiellement uniquement sous contention. o prélèvement terminal (grand volume de sang) par ponction cardiaque ou par prélèvement sinusal sous anesthésie générale profonde. Ensuite, constat de la mort de l’animal et si nécessaire dislocation cervicale. - Prélèvements de tissus (foie, cœur, poumons etc…) post mortem. Euthanasie : - Overdose d’anesthésique, confirmée par une deuxième méthode physique. Le pentobarbital sera évité en cas de prélèvement des poumons du fait de son caractère irritant. - Mise à mort par le CO2, confirmée par une deuxième méthode physique. Cette méthode sera évitée en cas de prélèvement des poumons. - Dislocation cervicale - Sur animaux inconscients, sans reprise de conscience avant de mourir : prélèvement de sang terminal et dislocation cervicale
Impact sur les animaux
Trois types de greffe pourront être faites dans ce projet : Sous cutanée, intradermique et dans la graisse mammaire. Dans chaque cas, il y aura une évolution du volume tumoral ce
Devenir
Les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. Près de 250 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 2 à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit. Pour des études de screening de composés ou de modèles, il sera proposé d’utiliser 1 à 3 animaux par groupe (Single Mouse Trial). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Dans l’objectif de raffinement, toutes les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la structure chargée du bien-être animal. Pour les nouveaux modèles la SBEA analysera les conséquences des procédures sur le bien-être des animaux, la validité des résultats scientifiques obtenus, et ils détermineront les points limites. Toutes les procédures invasives, mais aussi la plupart des procédures faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle tumoral. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal est observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance, sont suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Trois types d’enrichissements sont systématiquement ajoutés (sizzle-dri (souris), hutte ou tunnel (rats), batônnets, nourriture dans la cage) La greffe de tumeur est une procédure de gravité modérée, réalisée sous anesthésie générale gazeuse à l’Isoflurane. Lorsque l’implantation de la greffe nécessite l’incision de la peau, la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprenorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. En cas de toxicité sur l’animal, afin de limiter la souffrance des animaux une procédure sous forme d’un arbre décisionnel validée par la SBEA sera suivi par l’équipe projet. Pour le raffinement, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Dans de rares cas il sera possible de travailler avec des animaux plus jeunes (4 semaines d’âge minimum pour leur réception et 6 semaines pour la manipulation).
Etude de l’effet de composés sur la régénérescence des fibres nerveuses lésées consécutives à l’écrasement du nerf sciatique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur nerf sciatique est écrasé chirurgicalement, puis des composés sont administrés et l'état évalué par un test de répartition du poids et une mesure de conduction nerveuse, sur trois mois au plus. Le porteur indique que la chirurgie et l'écrasement du nerf peuvent provoquer des douleurs et que les effets secondaires des composés en développement ne sont pas connus. Il qualifie d'"incontournable" le recours à l'animal et conclut que les cultures cellulaires n'apportent que des réponses partielles.
Objectifs
La neuropathie périphérique désigne l'ensemble des maladies des nerfs périphériques issus de la moelle épinière. Ces pathologies peuvent avoir des causes variées comme le diabète, la carence en vitamine, des phénomènes inflammatoires, les traitements anti-cancéreux ou des traumatismes. Au vu de l’incidence de ces pathologies et de leur impact sur la qualité de vie des patients de nombreuses recherches sont menées pour prévenir les neuropathies ou favoriser la réparation des nerfs périphériques. Dans ce projet nous nous intéressons aux neuropathies induites par un traumatisme mécanique. Chez l’homme, ce phénomène se produit lors d’un accident qui provoque la section ou l’écrasement d’un nerf. Afin de mimer ce qui se passe chez l’homme, l’écrasement du nerf sciatique chez le rat est un modèle largement utilisé pour décrire les processus de neurodégénérescence mis en oeuvre mais aussi évaluer des moyens de favoriser la réparation nerveuse. Dans ce projet nous utiliserons ce modèle d’écrasement du nerf sciatique pour évaluer l’effet de traitement qui améliore la récupération du nerf lésé. Nous utiliserons plusieurs tests pour évaluer l’état clinique des animaux afin de déterminer si les nouveaux traitements en cours de développement peuvent être bénéfiques ou non pour les patients.
Bénéfices attendus
Il est attendu que ce projet permette de mettre en évidence le potentiel de nouvelles molécules pour la régénération nerveuse. Cela serait une grande avancée pour les patients ayant subit des dommages invalidant lors d’accident par exemple.
Procédures
L'ensemble des animaux subiront une chirurgie (durée 30min maximum) sous anesthésie. Les douleurs peri-opératoires sont prises en charge par un traitement antalgique et anti-inflammatoire. Après la chirurgie les animaux pourront être traité par le composé à étudier (4 administrations par jour maximum incluant les traitements antidouleurs) puis ils seront évalués dans deux tests différents : un test de répartition pondérale lors de déplacement libre (durée 7 min) et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie gazeuse (durée 10 min). Chaque test est réalisé au maximum une fois par semaine pendant 3 mois maximum. A la fin de l’expérience un prélèvement sanguin peut être effectué juste avant la mise à mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Ce projet faisant appel à une chirurgie, les douleurs péri-opératoires sont probables. Il n’est pas exclu que l’écrasement du nerf engendre des douleurs. Comme nous administrons des composés qui sont en phase d’études pré-clinique leurs effets secondaires potentiels ne sont pas connus et peuvent apparaitre au cours de l’étude. De plus les traitements qui sont souvent appliqué de façon chronique peuvent engendrer des contraintes sur nos animaux.
Devenir
Tous les animaux sont tous mis à mort à la fin de la procédure soit parce qu’ils subissent des prélèvements de sang ou de tissus soit en raison de la procédure sévère qu’ils viennent de subire.
Remplacement
Ce projet a pour but de développer des molécules à visée thérapeutique. Dans ce domaine, l’utilisation des animaux demeure incontournable. En effet, beaucoup de facteurs sont mis en jeu pour aboutir à une réponse globale de l’animal. Ainsi, les systèmes réduits comme les cultures cellulaires ou les modèles in-silico n’apportent que des réponses sur les mécanismes cellulaires ou moléculaires étudiés. De plus, ces expérimentations permettent de mettre en évidence des effets secondaires qui sont par principe non recherchés et difficiles à prévoir. Ces études restent incontournables avant une étude clinique et ne peuvent être remplacées par des expérimentations in vitro.
Réduction
Nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe après analyse de puissance statistique. Les différents groupes de l’études seront comparés réalisées à l’aide de tests statistique permettant d’évaluer l’effet de nouveau composés sur la régénérescence nerveuse consécutive à une lésion par écrasement du nerf sciatique chez le rat. De plus, nous cherchons toujours un compromis expérimental qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par exemple, nous favorisons le test de plusieurs conditions expérimentales en parallèle afin de ne pas multiplier les groupes témoins. Quand c’est possible nous utiliserons la patte contra-latérale de chaque animal comme contrôle de la patte lésée . Sur une période de 5 ans, nous envisageons de mettre en oeuvre 4 études par an. Pour chaque étude, nous prévoyons un design expérimental comportant 3 différents groupes test en plus du groupe témoin contrôle sans chirurgie et du groupe témoin avec chirurgie. Chaque groupe expérimental comporte 10 animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment une inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations : nourriture et eau ad libitum, température et hygrométrie strictement contrôlées, enrichissement important du milieu, soins. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte des tunnels en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Le projet comprend une gestion de la douleur par rapport à l’intervention chririgicale réalisées. Un traitement antalgique et anti-inflammatoire est réalisé an amont et en aval de l’opération qui elle-même se déroule sous anethésie gazeuse.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes car les pathologies modélisées dans ce projet ne sont pas des pathologies liées au vieillissement. De plus les animaux doivent pouvoir supporter une intervention chirurgicale sans altération de leur état général.
Imagerie TEP-IRM pour l’identification des métastases chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteurs d'un cancer disséminé, ils subissent un jeûne, un prélèvement de sang et une imagerie sous anesthésie avec mise à mort avant réveil, pour valider une caméra hybride TEP-IRM de détection des métastases. Le porteur indique que les métastases peuvent toucher plusieurs organes et provoquer une perte de poids, les animaux étant suivis trois à cinq jours jusqu'à la mise à mort. Il écarte le remplacement au seul motif que l'étude des métastases ne peut s'affranchir du modèle animal.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. La mortalité des patients atteints de cancer est aujourd’hui principalement médiée par l’évolution des tumeurs primaires en maladie plus disséminées du fait de l’apparition de métastases. Il est aujourd’hui difficile en routine clinique de déceler les métastases dans toutes les parties de l’organisme en utilisant une seule technique d’imagerie. En effet, l’examen clinique de routine consiste dans la détection des cellules cancéreuses grâce à l’injection d’une petite dose d’un glucose radioactif. Les cellules cancéreuses étant très actives métaboliquement, elles vont fixer ce glucose et être détectées grâce à un examen d’imagerie TEP (tomographie par émission de positons). Cependant, On détecte aussi sur ces images des zones non cancéreuses car très consommatrices de glucose comme le cerveau ou le cœur, ou les voies d’éliminations du produit comme les reins et la vessie. Ces zones peuvent gêner à l’interprétation des images et masquer des lésions. Les caméras TEP sont la plupart du temps couplées à un scanner qui ne permet pas la détection de lésions cancéreuses. Une nouvelle technologie permettant d’obtenir un meilleur contraste au niveau des tissus mous comme l’IRM (imagerie de résonance magnétique) présenterait donc théoriquement un grand intérêt pour identifier des lésions rénales ou cérébrales non détectables en TEP. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est de montrer l’intérêt d’une caméra hybride permettant de réaliser en simultané 1/ une imagerie d’un traceur radioactif grâce à une caméra ou TEP, et 2/ une imagerie IRM dans un modèles animal de maladie métastatique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de montrer l’avantage de l’imagerie hybride TEP/IRM (en cours de développement pour des applications cliniques) dans la détection des métastases. A terme, le diagnostic des patients atteints de maladie métastatique sera amélioré. Il sera possible également de mieux suivre l’efficacité des traitements en examinant l’évolution des métastases de façon plus précise.
Procédures
les animaux subiront les actes suivant : * mise à jeun de 4-6h (avec accès à l’eau) * prélèvement d’une goutte de sang (10 à 20 µL) à la queue. * injection intraveineuse puis imagerie sous anesthésie avec euthanasie avant tout réveil
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de cancers disséminés sont susceptibles de présenter différents signes cliniques identifiés grâce à l’expérience de nos collaborateurs préparant le modèle. Ces signes sont en relation avec la localisation possible des métastases (ganglions lymphatiques, ovaires, surrénales, cerveau, os et poumons). La perte de poids est cependant le critère le plus souvent observé. Les animaux seront suivis quotidiennement de leur arrivée à leur euthanasie (3 à 5 jours maximum). Le suivi sera intensifié si des signes de détresse sont observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d’imagerie afin de pouvoir identifier la localisation des métastases et valider notre technique d’imagerie diagnostique.
Remplacement
L’étude de la maladie métastatique et de traceurs du métabolisme ne permet pas de s’affranchir de modèles animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons choisi de faire préparer le modèle par une équipe expérimentée afin de s’affranchir de l’utilisation d’animaux supplémentaires pour la mise en place du modèle. La réalisation de l’étude en 2 étapes nous permettra de stopper l’expérimentation si l’effectif est suffisant pour conclure et réduire le nombre d’animaux de moitié.
Raffinement
L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures impliquant les animaux (injection intraveineuse et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.
Choix des espèces
Le modèle animal et les techniques d’imageries ont été développés et caractérisés chez le rat. Les rongeurs sont un modèle de choix en imagerie car leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.
FLAVOCONTROL : Phénotypage de la résistance à la flavobactériose de populations de truites commerciales pour une amélioration progressive par sélection génétique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
5 200 truites et saumons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 4 880 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont infectés par la bactérie Flavobacterium psychrophilum, par bain ou par injection, pour mesurer la résistance de populations commerciales en vue d'une sélection génétique. Le porteur indique que la bactérie peut tuer rapidement les poissons et qu'il est difficile de pratiquer une mise à mort entre l'apparition de signes cliniques et la mort. Il qualifie d'"indispensables" ces infections en milieu contrôlé et les rattache à l'amélioration des programmes de sélection des entreprises aquacoles françaises.
Objectifs
Ce projet a pour objectif le développement d’un dispositif permettant de réaliser des infections expérimentales en milieu contrôlé avec la bactérie pathogène des salmonidés Flavobacterium psychrophilum ainsi que le transfert d’innovation pour améliorer le contrôle de la flavobactériose pour les entreprises aquacoles françaises. Flavobacterium psychrophilum est un agent pathogène majeur des salmonidés (truites et saumons). On le retrouve aujourd’hui dans toutes les régions pratiquant la salmoniculture (Europe, Amérique, Asie du Nord-Est et Océanie). La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), principale espèce d’élevage en France, est très sensible à cette bactérie, aujourd’hui identifiée par les éleveurs comme la première source de nuisance d’origine pathologique dans les élevages. Dans le contexte de la maîtrise de la pathologie infectieuse en production aquacole, ce projet a comme objectif principal de développer un dispositif permettant de réaliser des infections expérimentales avec F. psychrophilum en milieu contrôlé. Ce dispositif expérimental permettra d’évaluer la résistance intrinsèque de quatre populations commerciales de truites et d’entreprendre pour 2 d’entre-elles une épreuve d’infection expérimentale à vocation de sélection pour identifier des marqueurs de résistance génétique par génotypage haut-débit. Ces expériences en milieu contrôlé sont indispensables pour contribuer à l'obtention d'un gain génétique maitrisé et permettre d'améliorer à long terme les programmes de sélection génomique sur la résistance à cette pathologie.
Bénéfices attendus
En France, la truite arc-en-ciel est la principale espèce produite. Quatre entreprises françaises ont développé des programmes de sélection et exportent du matériel génétique amélioré dans le monde entier. Ainsi, les progrès faits par les sélectionneurs français pourront potentiellement bénéficier à l’ensemble de la salmoniculture. Afin d’introduire le caractère de résistance à la flavobactériose dans les programmes de sélection des entreprises françaises, il est nécessaire de mesurer la résistance à l’infection de populations de manière maitrisée, en s’assurant notamment qu’il n’y a pas de co-infection par d’autres agents pathogènes. Ce projet s’intéresse au développement d’installations expérimentales permettant la réalisation d’épreuves infectieuses en conditions contrôlées à vocation, entre autres, de sélection génétique. Le génotypage des individus testés et celui de leurs parents donneront lieu ensuite à des analyses génétiques dans le but d’estimer l’héritabilité de la résistance à la flavobactériose, d’identifier des déterminants génétiques de la résistance et d’évaluer l’efficacité potentielle de la sélection génomique. Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des poissons en élevage ainsi qu’une diminution de l’utilisation des médicaments.
Procédures
Les infections expérimentales sont réalisées soit par balnéation (une balnéation par poisson) soit par injection. Dans le cas des injections, elles sont réalisées sous anesthésie (tricaïne par bain) et une seule injection par poisson est réalisé par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. Les animaux sont mis à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection (suivant le mode d'infection: 48h pour la balnéation et 24h pour l'injection) . Cette mise à jeun prévient toute régurgitation en cours d’anesthésie, diminue les besoins en O2 des poissons au cours des manipulations et limite l’excrétion de matières azotées lors de la balnéation durant 24h, contribuant donc à une meilleure qualité de l’eau.
Impact sur les animaux
Il est complexe de définir des points limites pour ce type d’expérimentation : le critère utilisé pour évaluer la résistance au pathogène de la population est binaire : mortalité (avec précision du temps post-contamination avant la mort) ou survie. La bactérie utilisée peut tuer rapidement les poissons contaminés sans qu’il soit possible de pratiquer une euthanasie entre l’apparition de signes cliniques (parfois peu évidents) et la mort. De plus, l’apparition de signes cliniques ne condamne pas forcément les poissons car certains sont capables de «récupérer». Néanmoins, des points limites sont definis dans ce projet pour limiter la souffrance des individus.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine une sélection des individus génétiquement liés conservés dans le noyau de sélection. L’étude des caractères génétiques impliqués dans la résistance aux maladies infectieuses chez le poisson nécessite d’établir des liens entre génotype et phénotype (ie résistance/sensibilité). Le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé sur cultures cellulaires car il est nécessaire, pour identifier des géniteurs portant des marqueurs de résistance, de soumettre les descendants à des épreuves d’infections expérimentales permettant d’obtenir des critères d'appréciation quantitative de leur résistance. Il n’existe aujourd'hui aucune alternative in vitro à l’évaluation de la susceptibilité des poissons à l’infection étudiée.
Réduction
Les résultats des expérimentations sont traités selon la méthodologie du BLUP (Best Linear Unbiaised Predictor) modèle animal. Cette méthodologie prend en compte les performances des individus testés pour estimer les valeurs génétiques de leurs collatéraux (les frères et sœurs des animaux soumis aux épreuves de sélection ) et permettre de les classer entre eux. Pour que ces estimations soient suffisamment précises, elles nécessitent un grand nombre de données et donc d’individus testés. Toutefois, le nombre d’animaux est réduit au seuil de la pertinence statistique et scientifique pour les approches utilisées. Les individus challengés dans ce projet seront issus d’un croisement de 100 mères et 100 pères. De ce fait, l’effectif total par croisement compte au minimum 20 individus par père, soit 2000 individus pour avoir des estimations de valeurs génétiques suffisamment précises. Ce nombre a été défini comme suffisant dans différentes études de simulations génétiques. En complément du nombre nécessaire à l’objectif de sélection génétique visé, une partie des poissons sera utilisée pour la réalisation de pré-tests (procédures 1 et 2) sur les différents lots à challenger afin d’évaluer la sensibilité des animaux et déterminer les conditions expérimentales optimales (doses, ...).
Raffinement
Une anesthésie par bain de tricaïne est réalisée avant de procéder à l’injection intramusculaire afin de limiter le stress des poissons. Tout au long de l'expérience, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 à 4 fois par jour (distribution, ration, Indices de conversion contrôlés=Quantité d'aliment distribué/Gain de biomasse). Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales (60g/l) sont rigoureusement respectées (loin des standards de la production). La qualité de l’eau est optimale et surveillée en permanence. Des points limites sont definis dans ce projet pour limiter la souffrance des individus.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d'élevage en France et c'est l'hôte naturel de Flavobacterium psychrophilum. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants issus des partenaires privés afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine une sélection des individus. Pour l'évaluation de la sensibilité/résistance à l’infection par Flavobacterium psychrophilum, les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (env 1 gr pour les challenges par bain et 5 à 10g pour les challenges par injection) où la sensibilité à des infections par Flavobacterium psychrophilum est maximale.
Etude de l’induction de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) par virothérapie dans des modèles syngéniques murins présentant des tumeurs sous-cutanées, intrapéritonéales ou pulmonaires orthotopiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées pour prélever leurs tumeurs et analyser les cellules immunitaires qui les infiltrent, 1 632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules cancéreuses leur sont injectées sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine, pour faire pousser des tumeurs sous la peau, dans le péritoine ou dans les poumons, puis elles reçoivent des virus oncolytiques armés de chimiokines, dans la tumeur ou par le nez sous anesthésie, et peuvent passer en imagerie deux fois par semaine. Une tumeur qui dépasse 2 000 mm3 déclenche la mise à mort. Le porteur ne décrit pourtant qu'une "gêne physique", des "difficultés à la mobilité" et une "gêne respiratoire", et juge "primordial d'utiliser des modèles in vivo" pour valider ses virus.
Objectifs
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu immunothérapeutique. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives in situ souvent favorables pour les patients atteints de certains cancers. Il a été montré que certaines chimiokines pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces chimiokines, exprimées in situ par des virus oncolytiques, à induire la formation de TLS. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des virus de la vaccine dont certaines souches ont déjà montré une capacité à induire des TLS. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la capacité de nouveaux virus oncolytiques, armés avec des chimiokines, à induire des TLS et à générer une activité anti-tumorale. Nous verrons dans un second temps, s’il est possible d’augmenter leur efficacité thérapeutique en les combinant avec un inhibiteur d’immune checkpoints.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider chez l’animal les effets thérapeutiques de ce nouveau traitement, en vue de le transposer ensuite chez l’humain dans le but final d’améliorer le pronostic vital de patients atteints de cancers. Si un effet probant est observé, les virus armés avec les chimiokines humaines pourront être générés dans l’entreprise collaboratrice, de sorte à poursuivre le projet vers un développement clinique. Si elle s'avère bénéfique, maitriser l'induction de TLS dans le microenvironnement tumoral pourrait être une nouvelle voie de traitement des cancers. Les résultats issus de ce projet nous permettront aussi d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la néogénèse de TLS.
Procédures
Des tumeurs seront implantées chez les souris, par injection de cellules tumorales en sous-cutané, intrapéritonéal ou en intraveineuse. L'intervention n'aura lieu qu'une fois, durera moins d'une minute et sera réalisée sur souris vigile. L'administration du traitement par voie intratumorale sera aussi réalisé sur souris vigile, ne durera pas plus d'une minute et sera répété au maximum 3 fois (un jour sur deux). L'administration du traitement pas instillation intranasale se fera cette fois-ci sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L'opération durera environ 5 min par souris et sera répétée 1 fois par jour pendant 3 jours. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie IVIS à une fréquence de 2 fois par semaine. Pour cette opération les souris seront anesthésiées avec de l'isoflurane à 2% durant une quinzaine de minute.Toute injection intrapéritonéale d'anesthésiant ou de traitement sera réalisée sur souris vigile et durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les actes d'injections des cellules tumorales ou des virus oncolytiques pourront procurer un stress ponctuel (quelques minutes) dû à la contention des animaux mais sont normalement indolores et auront lieu au maximum à 4 reprises par animal et par procédure. La croissance des tumeurs sous-cutanées ou intrapéritonéales pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires orthotopiques pourra occasionner une gêne respiratoire.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.
Remplacement
Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, vascularisation) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.
Réduction
Avant d’être testés chez l’animal, les virus oncolytiques ont été caractérisés in vitro dans plusieurs lignées tumorales murines et humaines. Seuls ceux qui ont prouvé une activité efficace in vitro seront utilisés dans ce projet. Au sein d’une même expérience nous testerons plusieurs virus avec les mêmes groupes témoins, nous réduirons également le nombre d’animaux utilisés dans le groupe non-traités. Le suivi de la croissance tumorale dans le modèle pulmonaire orthotopique se fera par imagerie IVIS, ce qui permet de faire plusieurs mesures sur un même animal sans avoir à l'euthanasier. Des prélèvements pourront être fait sur les animaux destinés à être euthanasiés, avant et après euthanasie, afin d’évaluer en parallèle la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Ce projet implique l'utilisation de 1632 souris maximum.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (5 souris maximum/cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations >15 jours est appliqué. La stabulation sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 5 animaux maximum/cage de type-IIL, température de 22 °C ± 2 °C, éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 6 h à 18 h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Les points suivants seront considérés comme limitants: tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire; toute modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté); toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance: perte de poids supérieur ou égale à 15% du poids initial pour un animal qui ne porte pas de tumeur et supérieur ou égale à 20 % pour animal portant une tumeur (car en principe, une tumeur sous-cutanée de moins de 2000 mm3 n'excède pas 5 % du poids initial de l'animal), plaies et ulcères, fractures, détresse respiratoire ou tout signe d'essoufflement, tumeurs excédent 2000 mm3 (=(pi/6) x (longueur/2) x (largeur/2) x (épaisseur/2)). Les instillations intra-nasales (i.n.) seront réalisées sur des souris anesthésiées (kétamine par voie i.p.) puis remises dans leur cage au moment du réveil contrôlé visuellement. L'injection par voie intraveineuse (i.v.) sera réalisée dans la veine caudale préalablement dilatée par frottement à l'éthanol 70 % + exposition à une lampe chauffante. L’analyse de la croissance tumorale sera réalisée par imagerie IVIS chez des souris anesthésiées par l’isoflurane 2 %.
Choix des espèces
La souris fait partie des modèles expérimentaux les plus utilisés, il est actuellement possible d'avoir accès à un grand nombre de protocoles et de réactifs adaptés ce qui a permis de comprendre de nombreux mécanismes transposables à l'humain. Le système immunitaire humain possède de nombreuses similitudes avec celui de la souris et des travaux ont montré qu'il était possible d'observer des structures lymphoïdes tertiaires (élément primordial de nos recherches) chez la souris. Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris: les marqueurs des cellules d'intérêts de cette étude sont connus et de nombreux réactifs sont disponibles. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, car ce stade de développement correspond à des souris sevrées, de taille adulte et qui dispose d'un système immunitaire mature.