Procédures sévères

221 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, puis des séances d'imagerie et des administrations hebdomadaires de traitement pendant trois semaines, la tumeur pouvant métastaser et provoquer des douleurs. Les animaux sont tués une fois un point limite atteint, dont un volume tumoral dépassant 1500 mm3. Le porteur affirme que la distribution et la toxicité d'un médicament doivent être analysées dans un "organisme entier" et que les systèmes 3D existants, dépourvus de vaisseaux, ne peuvent pas remplacer l'animal.

Objectifs

Le projet global de l’équipe est de fabriquer de nouvelles formulations galéniques injectables par voie sous cutanée (SC), de type nanoppolymères contenant des molécules à visée thérapeutique dans le domaine du cancer. La plupart des chimiothérapies anticancéreuses actuelles présentent une toxicité systémique importante limitant l’augmentation des doses administrées et donc les résultats thérapeutiques. Les nanomédicaments, qui incorporent des molécules médicamenteuses dans des véhicules de taille nanométrique (milliardième de mètre), représentent un espoir important pour le traitement de cette pathologie de par leur capacité à cibler des tissus ou des cellules malades. Afin de permettre aux patients en oncologie de s'injecter en autonomie par voie sous cutanée leur chimiothérapie (i.e., Paclitaxel, PTX), 6 nanopolymeres ont été développés et ont fait preuve de résultats prometteurs in vitro (cytotoxicité, injectabilité, diffusion sous cutanée, innocuité, relargage du PTX). Des études d’innocuité permettant de vérifier que ces nanopolymères n’ont pas d’effet toxiques au niveau du tissu sous-cutané, ainsi que des études de pharmacocinétiques permettant d’évaluer la biodisponibilité du principe actif dans le sang après injection SC ont également déjà démontré des résultats prometteurs. L'objectif de cette étude est alors de tester l’efficacité anti-tumorale de ces nouveaux polymères couplés au paclitaxel en comparaison au paclitaxel standard intra-veineux (IV), ainsi que leur biodégradabilité et leur toxicité éventuelle. La définition du schéma d'administration optimal sera guidé par un modèle mathématique de type PK/PD (pharmacocinétique/pharmacodynamique). Des études de biodistribution des nanopolymères pourront être menées en parallèle afin de notamment pouvoir expliquer le différentiel d'efficacité observé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendues sont la définition du nanopolymère et de son schéma d'administration optimaux, permettant l'administration sous cutanée du PTX chez le patient. Bien que ce projet soit effectué sur le cancer du sein, le PTX est indiqué dans bien d'autres types de cancer (bronchopulmonaires non à petites cellules, ovaire, sarcomes de Kaposi associés au sida) et donc ce nanopolymère pourra être bénéfique chez un grand nombre de patients.

Procédures

Greffe de cellules cancereuses murine sur animal anesthésié (1 greffe par animal), Imagerie sur animal anesthesié (1 fois par semaine par animal) Administration des traitements (1 fois par semaine pendant 3 semaines par animal)

Impact sur les animaux

Les animaux seront greffées de cancer du sein pouvant métastaser et donc engendred de la douleur. Les injections des tratitement se font par voie sous cutanée et et voie intraveineuse rétro orbitale, ainsi une douleur courte au site d'injection peut apparaitre. Les animaux seront anesthésiés à l'aide d'une cage à induction ce qui peut les stresser quelques minutes avant l'endormissement. La mesure quotidienne du volume tumoral sur animal vigile peut également être stressant pour l'animal.

Devenir

Pour les deux procédures, les animaux seront mis à mort une fois le point limite atteint.

Remplacement

Le développement de nouveau médicament nécessite la mise en place d’expérience chez l’animal car la distribution du médicament et sa toxicité éventuelle doivent être analysés dans un organisme entier pour tenir compte des mécanismes de défense et de métabolisation qui seront mis en place par l’organisme et qui ne peuvent pas être reproduit in vitro du fait de l’implication de nombreux systèmes biologiques (système immunitaire notamment). Il existe des systèmes 3D mais ils sont construits avec seulement deux/trois types de cellules et ils manquent de vaisseaux. Ils ne permettent pas de mimer l’extravasation des nanomédicaments et leur pénétration dans la masse tumorale. Seule une étude chez l’animal permettra de reproduire l’interaction des nanomédicaments avec les composants du sang, leur passage de la circulation vers les organes et la tumeur et ainsi d’évaluer leur efficacité thérapeutique.

Réduction

Le nombre de souris par groupe expérimental a été calculé avec un test de puissance pour s’affranchir des variations individuelles et pour garantir la validité statistique de l’étude (risque fixé à 5% et puissance à 80%). La variable de jugement principal est la taille de la tumeur avec une moyenne dans le groupe contrôle de 1.3 cm3 et dans les groupes traités de 0,9 cm3 avec un écart-type de 0,3. Le nombre a été évalué à 8 souris. Compte tenu du taux de prise de greffe qui est d’environ 80%, 20% d’animaux supplémentaires seront ajoutés à l’étude. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test Anova avec un post test «Bonferroni». Nous prenons comme controle uniquement les nanopolymères seuls à DMT et non à DMT et 15mg/kg. Notre projet comprend une étape de modélisation mathématique permettant de réduire le nombre de tests à effectuer pour définir les modalités d'administrations optimales. Les études de biodistribution sont faites par imagerie et sont donc longitudinales et non invasives.

Raffinement

Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - souris hébergées en groupe - enrichissement des cages (dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques/stériles (Cell Nest) (Fournisseur Safe), - prévention de la douleur(40 mg/kg/jour d'ibuprofène , réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, biodistribution) seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours des diverses étapes des tests) - définition des points limites et évaluation quotidienne (volume tumoral au-delà de 1500mm3, difficultés respiratoires importantes, prostration, atonie, défaut d'alimentation avec perte de poids supérieure à 15%, ou toute autre manifestation de comportement anormal)

Choix des espèces

Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisé ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang. La plupart des études publiées dans la littérature concernant l’évaluation de nouveaux médicaments anticancéreux sont effectuées sur la souris. Nous utiliserons des souris nude athymiques pour la greffe de cellules tumorales humaines (SWISS nude nu/nu). Les souris nude étant dépourvues de réponse immunitaire T, elles seront dans l’incapacité de rejeter les cellules cancéreuses humaines qui seront implantées. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 4-6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanopolymères. De plus le cancer touche généralement une population adulte.

3 600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour le compte de clients pharmaceutiques. Une injection d'adjuvant complet de Freund dans une patte provoque une inflammation douloureuse, certains animaux étant en outre génétiquement modifiés ou injectés deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, avant une mise à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque pour prélèvement d'organes. L'objet est de tester ex vivo des molécules contre la douleur. Le porteur reconnaît que l'adjuvant provoque des douleurs et que les animaux modifiés ne peuvent échapper à leur phénotype, tout en jugeant l'organisme vivant nécessaire.

Objectifs

Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. Par ailleurs, pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ou de cellules nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour se faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le Patch-Clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de douleurs induit par une inflammation périphérique. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule a des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies de douleur du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), chaque animal peut être son propre contrôle puisque une seule patte est lésée; - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Durée : injections deux fois par jour (6min/injection), trois mois au maximum. Les animaux vigiles seront injectés pour assurer une exposition in vivo. Les contentions répétées génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée, soit intrapéritonéale ou soit intramusculaire. Durée : Hébergés trois mois maximum. Si les animaux sont génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas par définition échapper à leur phénotype dommageable. Nous travaillerons uniquement sur des animaux asymptomatiques. Durée : une seule injection (6 min) Ils seront tous injectés, une seule fois, par une solution d’un agent inflammatoire, en sous cutanée dans une patte postérieure. Tous les animaux seront mis à mort par deux techniques, en fonction de leur âge : durée instantanée par décapitation rapide après anesthésie gazeuse ou par perfusion intracardiaque (durée = 3 min) sous anesthésie gazeuse au plus tard 48h après le déclenchement de l’inflammation.

Impact sur les animaux

Notre procédure amène des effets indésirables: *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-l’injection d’adjuvant inflammatoire provoque des douleurs ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress pre-mortem important.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition, la possibilité que chaque animal soit son propre contrôle diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant l’étape par quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes ou 2 rats adultes/cage). Ils bénéficient d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et au maximum un mois de temps d’hébergement avant le début de la procédure. Il se fera en en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptômes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. Toutefois, les symptômes ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limites modifiés pour pallier des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des adultes ou plus âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (douleurs chroniques ou aigues). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.

56 souriceaux mâles porteurs d'une maladie génétique grave vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Ils reçoivent un transporteur synthétique de cuivre par injection sous-cutanée, avec quatre séances d'imagerie et cinq prélèvements sanguins sous anesthésie, avant mise à mort vers le 35e jour. La gravité tient surtout à la maladie elle-même, qui provoque faiblesse musculaire, malformations et risque d'anévrisme chez les animaux non traités. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'évaluer le passage du cuivre vers le cerveau chez l'animal malade.

Objectifs

La maladie de Menkès est une maladie rare dont l’incidence est estimée à 1 patient pour 250 000 naissances. Cette maladie touche les enfants (garçons uniquement) et elle due à une mutation génétique qui entraîne une carence généralisée en cuivre caractérisée par des cheveux fins et tortillés et dont les symptômes sont, entre autres, un défaut du développement squelettique et des troubles neurologiques sévères qui sont la cause du pronostic grave de cette maladie. En effet, le cuivre est un métal impliqué dans un grand nombre de réactions biochimiques intervenant dans la respiration cellulaire, le métabolisme du fer, le métabolisme des pigments, des neurotransmetteurs, etc. Ainsi, une carence en cuivre s’exprime par un déficit de ces différentes activités biologiques. Le seul traitement actuel pour les patients réside dans l’administration d’histidinate de cuivre qui restaure les concentrations normales en cuivre dans le sang, mais pas au niveau du cerveau. Cette absence d’amélioration clinique s’explique par l’impossibilité pour le cuivre de passer la barrière hémato-méningée qui entoure le cerveau. Notre projet vise à tester chez la souris mâle porteuse de la maladie une nouvelle thérapeutique basée sur l’administration, sous la peau, d’un transporteur synthétique du cuivre capable de franchir cette barrière hémato-encéphalique. Nous souhaitons maintenant démontrer grâce à des techniques d’imagerie médicale que ce transporteur synthétique du cuivre est capable de franchir la barrière hémato-encéphalique pour délivrer le cuivre jusqu’au cerveau de la souris porteuse de la maladie.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à tester chez la souris mâle porteuse de la maladie une nouvelle thérapeutique basée sur l’administration sous-cutanée d’un transporteur synthétique du cuivre (TSC) capable de franchir cette barrière hémato-encéphalique. Les effets attendus sont un assombrissement du pelage qui est un indicateur du métabolisme correct du cuivre, ainsi qu’une amélioration de l’activité physique globale et une augmentation de l’espérance de vie ainsi qu'à une amélioration de l'activité locomotrice de la souris.

Procédures

Les animaux ne subissent pas de chirurgie mais 4 séances d'imagerie TEP/TDMX (20 minutes chacune maximum) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane et 5 prélèvements sanguins ( 30 secondes par prélèvement) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane

Impact sur les animaux

Chez les animaux non traités, les effets de la carence en cuivre sont la perte de la couleur du pelage, une baisse du tonus musculaire, poids plus faible qu'une souris non porteuse de la maladie, malformation des membres inférieurs et un risque d'anévrisme aortique. Les séances d'imagerie TEP réalisées dans cette étude n'ont pas d'effets indésirables chez l'animal.

Devenir

les souris sont maintenues en vie à la fin de la PE1 (entretien de la lignée) et de la PE2 (Administration par injection Sous-cutanée du TSC) et sont mises à mort après la derniere séance d'imagerie de la PE3 qui permet de visualiser les effets du traitement sur le passage de la BHE.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’évaluation de l’efficacité de transport du cuivre dans le cerveau via la barrière hémato-encéphalique chez l’animal porteur de la maladie.

Réduction

L’étude portera sur 56 souris mâles de laboratoire. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Le test non paramétrique de Mann et Whitney sera utilisé pour analyser les résultatsde cette étude.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). Les animaux présentant des signes avancés de souffrance liée à la progression de la maladie, seront soulagés par un traitement antalgique.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce souris se justifie par l’existence d’animaux porteurs de la mutation du gène ATP7A conduisant à une carence systémique en cuivre, proche de la maladie de Menkès observée chez l’homme. Le protocole expérimental démarrera chez les souriceaux à J5, en période de lactation, et sera poursuivie jusqu’à J35, date de mise à mort des animaux. L’imagerie médicale nécessite des souris de corpulence supérieure ou égale à J35, mais le protocole ne peut excéder cette date car les animaux hémizygotes non traités avec le TSC ne pourront pas survivre au-delà de 5 semaines.

490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est implantée par chirurgie stéréotaxique, puis elles reçoivent radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie, avec un suivi par imagerie et des prélèvements sanguins, avant mise à mort. Le projet cherche à optimiser des combinaisons de traitements contre le glioblastome, dont le porteur rappelle la médiane de survie d'environ treize mois. Il juge "indispensable" de tester ces combinaisons et n'envisage qu'une étude in vivo à ce stade.

Objectifs

Les nouvelles techniques de radiothérapie (RT) permettent de délivrer des traitements hypofractionnés (avec des fractions de 3 à 15-20Gy) tout en évitant de fortes toxicités radio-induites. Depuis plusieurs années il est décrit dans la littérature que la radiothérapie modifiait le microenvironnement tumoral. La description de ces mécanismes a entrainé un intérêt à associer la RT à des immunothérapies. Cependant, jusqu’à récemment l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire n’était pas connu. L’objectif de ce projet est de décrire la réponse immunitaire radio-induite selon le fractionnement de la radiothérapie et la combinaison avec des chimiothérapies et/ou immunothérapie, pour un modèle de glioblastome orthotopique afin de pouvoir optimiser les combinaisons de traitements.

Bénéfices attendus

Le traitement standard du glioblastome en clinique n’a pas évolué depuis 2005. Pourtant cette pathologie présente une incidence de 3/100 000 habitants et la médiane de survie des patients est d’environ 13 mois. Il est donc indispensable de développer/tester de nouvelles combinaisons de traitements dans le but de les évaluer rapidement via des essais cliniques. Les combinaisons de radiothérapie et immunothérapie sont de plus en plus développé en essais cliniques pour d’autres localisations que des tumeurs cérébrales. Ces combinaisons semblent plutôt bien tolérées et pour plusieurs indications les premiers résultats sont très encourageants. Les résultats obtenus dans ce projet permettront de proposer une combinaison de RT + immunothérapie +/- CT optimisé sur le schéma de fractionnement de la RT et son effet sur la réponse immunitaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de chirurgie stéréotaxique pour implantation de cellules tumorales, puis 7 jours plus tard à un traitement par radiothérapie (1 ou 4 fractions espacées de 24h - non invasif sous anesthésie) et/ou chimiothérapie (per os 5 fois par semaine pendant 3 semaines et/ou immunothérapie (intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines). Le volume tumoral sera suivi par IRM ou imagerie optique à J7, J14, J21 (procédure non invasive sous anesthésie). 150 µL de sang sera prélevé à J0, J7, J14 et J21 sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les nuisances / effets indésirables peuvent provenir de trois éléments du protocole : 1) la procédure de chirurgie intra cérébrale par technique de stéréotaxie ; 2) la radiothérapie intracérébrale ; 3) la croissance tumorale intra cérébrale. 1) La chirurgie stéréotaxique pour l’implantation des tumeurs sera réalisée selon la procédure enseignée par l’université de Strasbourg lors du DU de chirurgie intra cérébrale, et déjà utilisée par nos collaborateurs qui se sont proposés pour nous assister pour les premières injections. Une étude pilote de 10 souris est prévue afin de pouvoir affiner si besoin les points limites détaillés dans ce protocole. Ces souris bénéficieront d’un suivi plus fin (notamment durant les heures post-opératoires….). Les effets indésirables potentiels attendus lors de la procédure de chirurgies, sont: une hypothermie post opératoire, une infection post opératoire, des signes de douleurs, et d’éventuels signes neurologiques comme amaurose, ataxie, parésie, syndrome vestibulaire, convulsions. 2) Concernant la procédure de radiothérapie externe, peu d’effets indésirables sont attendus puisque ce traitement sera délivré en plusieurs faisceaux et avec une précision qui permet de délivrer la dose souhaitée sur la tumeur tout en évitant la dose reçue aux organes à risque avoisinants. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. 3) Enfin une tumeur intra cérébrale de taille trop importante peut entrainer des symptômes tels qu’un comportement atypique, et d’éventuels signes neurologiques comme amaurose, ataxie, parésie, syndrome vestibulaire, convulsions ainsi qu’une perte de poids ou une douleur. Si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids de plus de 20%, cf tableau annexe), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : -Les animaux dont la greffe n’aura pas prise -Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude -Euthanasiés si points limites atteints L’ensemble des souris seront euthanasiées de la même manière : dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Remplacement

A ce stade de nos connaissances, seule une étude in vivo sur des modèles animaux syngéniques (animaux pour lesquels une greffe de cellules cancéreuses d’origine murine pourra former une tumeur) de développement tumoral permettra d’analyser l’effet de l’inhibiteur de PAR1 (traitement en développement) seul et/ou combiné à la radiothérapie et/ou chimiothérapie et/ou immunothérapie sur l’efficacité thérapeutique et la réponse immunitaire. De plus, notre étude repose sur l’effet de la radiothérapie hypofractionnée (forte dose administrée à en 1 ou 4 séances) sur le recrutement de cellules immunitaires au sein de la tumeur (selon les cellules présentes elles peuvent accélérer ou ralentir l’efficacité de la radiothérapie). Le modèle animal est le seul permettant de tels objectifs impliquant la présence de plusieurs types de cellules dans une tumeur.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus sur l’étude du système immunitaire dans l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales (avec évaluation de la croissance des tumeurs et/ou de leur composition en différents types de cellules au cours du temps après traitement). Dans une démarche de Réduction, les quantités de cellules injectées ainsi que les coordonnées stéréotaxiques utilisées pour les injections seront celles optimisées par nos collaborateurs de ce projet qui ont testé cette année plusieurs conditions et fixé les conditions optimales d’injections. Ces échanges de protocole au sein d’une collaboration nous permettent d’éviter de répéter ces étapes d’optimisation et ainsi de réduire le nombre d’animaux à utiliser, notamment dans l’étude pilote de la procédure N°1. La prise tumorale dans des souris sélectionnées est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% (8+2 souris/groupe) d’animaux supplémentaires (pour garantir des volumes de tumeurs homogène au moment du traitement) au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris (qui se sont initialement développées dans les mêmes types de souris) permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité et la fiabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat (trois expérimentations indépendantes).

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages (ayant une surface de 800 cm2 (425 x 266 x 185 mm)) de 10 individus en présence d’enrichissement. Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées sans anesthésie en intra péritonéale ou en par voie orale selon les formulations des médicaments. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids (cf tableau annexe Points limites)), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur (transplantation, irradiation) seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs évaluée régulièrement. Les symptômes seront gradés à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de la douleur, poids…) et l’animal pris en charge selon le score obtenu (traitement de la douleur si nécessaire). Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% (8+2 souris/groupe) d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Souris de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.

4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées pour détruire leur moelle osseuse puis greffées par injection de cellules malades, avec des biopsies de moelle au fémur, pour reproduire la transformation d'une maladie chronique du sang en leucémie aiguë. Le porteur indique des complications possibles comme des thromboses, des hémorragies, des infections et des diarrhées liées à l'immunodépression. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces interactions et qu'un "organisme entier" est nécessaire pour tester les molécules.

Objectifs

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) représentent un ensemble de maladies hématologiques (maladies du sang) affectant un des sous-groupes de cellules constituant le sang: le groupe myéloïde. Celui-ci inclut les granulocytes (cellules impliquées dans l’immunité), les thrombocytes (communément appelés « plaquettes », responsables de la coagulation sanguine) et les érythrocytes (couramment appelés « globules rouges » chargés du transport d’oxygène dans le sang). Des études scientifiques basées sur le « séquençage de l’ADN » (une méthode utilisée en laboratoire afin de connaître de manière exacte le type et l’ordre des molécules constituant notre ADN), ont permis de montrer l’existence de modifications génétiques (mutations) à l’origine de cette maladie. Ces mutations perturbent principalement des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire, entraînant ainsi la multiplication anormale et accrue de ces cellules. D’une part, ces mutations semblent également être impliquées dans la transformation de cette maladie vers en un cancer du sang particulier dit «Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM) », associé à de très faibles chances de guérison et/ou de survie. D’autre part, cette transformation en LAM serait aussi liée à des modifications touchant à l’environnement dans lequel se trouvent ces cellules : la moelle osseuse. Ainsi, l’objectif de notre projet est d’identifier les processus biologiques propres aux cellules des NMP et propres à leur environnement (moelle osseuse) impliqués dans la transformation de la maladie (NMP) vers un cancer du sang plus grave (LAM). Il permettra alors de déterminer de nouvelles pistes de préventions et de traitements (cibles thérapeutiques), afin d’empêcher la transformation des NMP en cette maladie dévastatrice qu'est la LAM.

Bénéfices attendus

Les processus responsables de la transformation des NMP en LAM secondaire sont encore mal compris. Ils semblent liés d’une part à des anomalies génétiques au sein des cellules sanguines et d’autre part à des anomalies de leur microenvironnement, au sein de la moelle osseuse, dans lequel évoluent les cellules malades des NMP. Le microenvironnement est constitué d’autres types de cellules (immunitaires, neuronales, ...etc.) baignant dans une matrice (une sorte de gelée chargée de molécules nécessaires à la survie de ces cellules). L’altération de ces cellules et/ou de cette matrice conduit à des anomalies du microenvironnement, ce qui perturberait aussi les cellules sanguines se nichant dans cette moelle osseuse. Ainsi, la compréhension des mécanismes responsables de la transformation des NMP en LAM et le développement de stratégies thérapeutiques permettant de prévenir l’apparition de cette complication, représentent un enjeu important pour les patients atteints de NMP.

Procédures

Afin d'identifier les mécanismes à l'origine de la transformation de la NMP en un cancer du sang plus grave qu’est la LAM, nous mettrons en place un modèle de souris « chimères », c’est-à-dire, ayant reçu des cellules provenant de notre modèle de souris malade afin de suivre leur développement. Pour cela des souris normales seront irradiées (étape durant 15 minutes, non douloureuse permettant d’éliminer les cellules de leur moelle osseuse) avant de recevoir par injection intraveineuse (injection d’une durée d’une minute, sur souris éveillée dans la veine de la queue) des cellules obtenues à partir de la moelle osseuse de nos souris transgéniques en post-mortem. Les souris seront alors maintenues sous antibiotiques durant les deux semaines afin d’éviter tout risque d’infection liée à la perte de leur système immunitaire causée par cette irradiation. Les cellules injectées, correspondant à des cellules malades de NMP, pourront être préalablement modifiées génétiquement afin d'invalider l'expression d'autres gènes et ainsi déterminer comment a lieu la transformation de la NMP en LAM. Pour suivre le développement des cellules malades de NMP et leur éventuelle modification à l'origine d'un cancer du sang, nous réaliserons des biopsies de moelle osseuse au niveau du fémur des souris (geste technique de moins de 5 minutes réalisé sous anesthésie et analgésie, deux fois maximum pour chaque souris). Nous effectuerons également des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux réalisé sur souris éveillées et durant maximum une minute par souris) de manière bimensuelle sur toute la durée (maximum 12 mois) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Enfin, nous réaliserons des expériences d'imagerie afin de visualiser les interactions potentielles entre les cellules de la NMP et celles de leur environnement (observation d'une heure au niveau du crâne sur souris anesthésiée après incision de la peau sur 5mm. L'incision sera refermée après l'imagerie par des points de suture). Ensuite nous testerons des traitements sur une durée de 28 jours (injection non douloureuse deux fois par jour dans l'abdomen ou sous la peau ou par gavage avec une sonde spécifique). Chaque injection, réalisée sur souris éveillée, prend moins d'une minute. Le suivi de l'efficacité des traitements sera réalisé par prélèvement de sang ou de moelle osseuse, comme décrit précédemment.

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement modifiées exprimant la mutation fréquemment retrouvée chez les patients NMP peuvent présenter des complications thrombotiques et hémorragiques (caillot sanguins et saignements), comme cela est observé chez les patients. Pour prévenir ces complications, plusieurs mesures seront prises, en particulier lors des prélèvements sanguins afin d'éviter la survenue de thrombose. Dans le cas des procédures impliquant une irradiation des animaux préalablement à l’injection de cellules par voie intraveineuse, des événements d’infection et de déshydratation pourraient apparaître. Ceci pourrait potentiellement induire des diarrhées modérées ou aiguës, ce pourquoi les souris seront maintenues sous antibiotiques durant la période de prise de greffe. En outre, l’administration des traitements standards de NMP par voie orale (gavage) constitue un risque d’irritation du tube digestif des animaux. Pour cela, nous prévoyons d’administrer un antidouleur par voie non invasive (sous-cutanée) afin de réduire au minimum leur souffrance. Toutefois, les conditions d’hébergement des souris ainsi que leur suivi quotidien permettront de prévenir le risque de souffrance et d’agir dans un délai très court (compensation de la perte en eau par ajout d’une gélose hydratée notamment). Enfin, et étant donné que nous travaillons sur la transformation des NMP en LAM secondaires, les animaux risquent de développer une leucémie mais seront aussitôt euthanasiés dès l’apparition de la maladie. Lors de la mise en place des essais thérapeutiques, nous veillerons au bien-être des souris, malgré la répétition des administrations (deux fois par jour pendant 28 jours) et nous arrêterons les tests dès que des signes de souffrance apparaîtront chez ces animaux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de modèle in vitro pertinent pour l'étude de la transformation leucémique des NMP, récapitulant les interactions entre l'environnement (moelle osseuse) et les cellules de NMP. Or la transformation des cellules malades de NMP vers le cancer du sang implique ces interactions. De plus, le test de molécules thérapeutiques nécessite l'utilisation d'un organisme entier afin de miner les conditions de distribution du médicaments comme cela se passera chez l'Homme.

Réduction

Étant donné que nous travaillons depuis plusieurs années sur des modèles animaux, nous avons acquis de l’expérience et une expertise dans ce domaine. Nous avons ainsi mis à profit nos connaissances théoriques et pratiques afin de mettre en place un protocole exprimental incluant le minimum d’animaux. Grâce à des analyses statistiques, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements, ...etc.). De plus, un suivi clinique quotidien des souris sera également entrepris pour détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. En cas d’irritation du tube digestif, les animaux recevront une dose d’antidouleur afin de réduire leur souffrance au minimum. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement. Enfin, les cages où sont maintenus les animaux feront l’objet d’un change hebdomadaire, et nous nous assurerons d’y apporter le maximum d’enrichissements (Social : les souris seront en groupe de 5 pour favoriser les interactions sociales entre elles. Matériel : bûchettes en bois, papier kraft, tunnels, ...etc.).

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l’angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. De plus, la souris et l’homme partagent 99 % de leurs gènes. Ainsi, les résultats des expériences réalisées chez la souris pourront être facilement transposables à l'être humain et donc améliorer l'étude des pathologies humaines et leurs thérapeutiques. Dans notre cas, nous disposons d'un modèle de souris génétiquement modifiées, exprimant la mutation la plus fréquemment retrouvée chez les patients atteints de la pathologie humaine que notre projet vise à étudier (la NMP). Pour mettre en place ce projet, nous utiliserons des souris âgées de 6 à 12 semaines (jeunes adultes). Notre modèle de souris "chimères" nécessitera des souris receveuses normales, âgées de 6 et 8 semaines au moment de la transplantation de moelle osseuse. Ce âge est celui où la mise en place du modèle de souris "chimère" est le meilleur comme cela est décrit dans de nombreux articles scientifiques du domaine.

96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer du pancréas vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant huit semaines pour tester une molécule anti-tumorale, la ZZW-115, et ses dérivés. Le porteur décrit des signes possibles de cyphose, de prostration, de poil hirsute et de perte de poids, et prévoit la mise à mort avant l'apparition d'un phénotype trop dommageable. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle proche de l'humain est indispensable et qu'il ne peut se passer de l'animal vivant.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer très meurtrier. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents efficaces basés sur la nanotechnologie pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, un analogue de la trifluopérazine (ZZW-115) et des dérivées sont été développé et s'ont avéré très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs ont été obtenu in vitro qui montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire de plus de 50 lignées cellulaires différentes. De plus, nous avons obtenu des résultats prometteurs in vivo qui montrent une réduction significative de la croissance tumorale de xénogreffes obtenues après implantation de cellules tumorales humaines (MIAPaCa2 ou Hep3B) sur des souris NUDE. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique, NUPR1. Cependant, nos résultats ont été basés sur des modèles de xénogreffes et jamais sur des modèles spontanés, qui se rapprocheraient davantage de la réalité du patient. En ce sens, nous avons deux objectifs avec ce projet, d'une part évaluer le pouvoir de cette famille de molécules comme agent préventif, pour cela nous utiliserons des souris avec la mutation Pdx1-Cre;KrasG12D/+, qui développent des lésions précancéreuses : les PanINs. Notre objectif est d'évaluer si le traitement à partir de l'âge de 5 semaines réduit l'apparition de ces lésions chez les souris traitées avec le ZZW-115 ou ses dérivés. D'autre part, notre objectif est d'évaluer si ce groupe de molécules a un effet curatif dans des modèles d'adénocarcinome pancréatique spontané. À cette fin, nous utiliserons le modèle KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), l'un des modèles les plus précis qui récapitule le plus fidèlement la carcinogenèse telle qu'elle se produit chez les patients. Dans ce cas, nous allons évaluer si le ZZW-115 et ses dérivés ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, notre objectif est de déterminer si le ZZW-115 (et deux de ses dérivés) est efficace dans le traitement de l'hypertension artérielle. 1) prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. Par le passé, notre groupe de recherche a démontré que l'apparition des PanINs était liée à la présence de NUPR1, c'est-à-dire que chez les souris KO de NUPR1, même en présence de l'oncogène Kras, les lésions précancéreuses n'apparaissaient pas. En ce sens, notre objectif est de démontrer qu'avec des inhibiteurs pharmacologiques, nous pourrions prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. 2) étudier l'effet du ZZW-115 et de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) dans des modèles animaux de cancer pancréatique spontané. Dans le passé, nos études ont toujours été réalisées dans des modèles animaux avec des xénogreffes, cependant, ce modèle, bien qu'il présente de nombreux avantages, est insuffisant à plusieurs égards. Avec le modèle animal KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), un modèle qui récapitule plus fidèlement la carcinogenèse pancréatique chez les patients, nous pourrons déterminer si l'inhibition de NUPR1 par des inhibiteurs pharmacologiques a un effet anti-tumoral dans un modèle spontané et immunocompétent. 3) d'évaluer quel traitement, le ZZW-115 ou l'un de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) a un plus grand pouvoir antitumoral. Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.

Procédures

Les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution (véhicule ou traitement, 60 microlitres) par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 8 semaines (chaque jour). L’intervention dure 15-20 secondes.

Impact sur les animaux

Les premiers signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, poil hirsute, diminution du poids de l’animal. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris NUDE dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que le ZZW-115 n'a montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse (4% isoflurane, 3 - 5 minutes). Le sang, les tumeurs et les organes seront ensuite prélevés en vue des analyses biochimiques et histologiques pour l’évaluation de l’effet anti-cancer et la toxicité éventuelle. Les cadavres seront stockés dans un congélateur à -20°C en attendant leur évacuation par la société spécialisée dans le traitement des déchets biologiques.

Remplacement

Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le ZZW-115 et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 96 individus (4 groupes de 12 souris KIC et 4 groupes de 12 souris KC) conformément à la règle de réduction.

Raffinement

Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution contenant le ZZW-115 sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort. Le nombre de souris de chaque groupe a ete calculé avec Biosta TGV, avec un risque alpha de 5 % (valeur normale pour un paramètre) et une force statistique de 85%. Aucun animal ne faisant pas partie de l'étude n'est maintenu avec un phénotype dommageable. Les souris sont sacrifiées avant l’apparition de ce phénotype dommageable

Choix des espèces

Les souris sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées. Les animaux KC seront utilisés à 6 semaines, juste avant l'apparition des lésions précancéreuses, pour évaluer l'effet protecteur du ZZW-115 et de ses analogues. Les animaux KPC seront utilisés à partir de 10 semaines, lorsque des lésions précancéreuses se seront développées, pour évaluer si le ZZW-115 et ses analogues sont efficaces pour inhiber la progression des tumeurs.

416 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière qui paralyse ses membres inférieurs, puis des instillations vésicales, des gavages et des prélèvements de sang, pour étudier les troubles digestifs et urinaires qui suivent une atteinte médullaire. Le porteur anticipe 15 à 20 % de pertes liées à la chirurgie et signale un risque d'infections urinaires. Sur le remplacement, il affirme que la corrélation entre in vitro et in vivo est insuffisante et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

En France, les lésions de la moelle épinière représentent 10 à 80 cas/million d’habitants/an, soit environ 1000 nouveaux patients/an. Les troubles du transit après lésion médullaire sont majeurs, et notamment les troubles de motricité colique. Les troubles urinaires sont également invalidants. La compréhension de ces troubles apparaît comme un enjeu de santé majeur, et n’est pas faisable en tant que telle en recherche chez l’Homme. Nous avons malheureusement besoin d’un modèle animal de lésion médullaire chronique pour partir des troubles observés in vivo, et en faire le parallèle avec les troubles fonctionnels observables ex vivo. Lors d’une 1ère étude, nous avons soulevé le rôle de médiateurs lipidiques dans les processus physiopathologiques affectant à la fois les fonctions de la barrière intestinale et vésicale ainsi que le Système Nerveux Entérique (SNE). Parmi ces médiateurs, figurent les médiateurs lipidiques dérivés des acides gras. En effet, les dérivés d'acides gras polyinsaturés (AGPI), peuvent réguler une multitude de réponses cellulaires, notamment la croissance et la mort cellulaire, l'inflammation. Cependant, leur impact sur le SNE et les dysfonctionnements de la barrière intestinale et vésicale reste inconnu. Les objectifs de cette étude seront de développer un modèle murin de lésions médullaires chroniques et de tester l’effet de différents médiateurs lipidiques sur la barrière urothéliale et digestive. Ce projet sera réalisé en tenant compte du principe des 3R. Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable (Réduire). Afin de limiter toutes sources d'angoisse et de souffrance, la réalisation du modèle de lésion médullaire sera effectuée sous anesthésie générale et les animaux recevront de l'analgésique avant et après l'opération. Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, et avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Le bien-être des souris sera surveillé quotidiennement, avec un remplacement de la litière et un enrichissement par frisottis, et en évaluant l'état général des animaux, et des points limites seront mis en place (Raffiner). La corrélation in vitro-in vivo n'étant pas satisfaisante, le recours à l'utilisation de modèles animaux est indispensable dans notre étude et il n’y a pas d’alternative au Remplacement. Les expériences seront réalisées en plusieurs fois et ce projet nécessitera 416 animaux (souris C57Bl6) dont 32 souris de «réforme».

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices sont attendus suite à ces expériences : - Démontrer les changements suite à une lésion médullaire haute, de la motilité et des fonctions de barrière dans des souris SCI (Spinal Cord Injury) par rapport à des souris contrôles -Identifier le rôle de dérivés de certains médiateurs lipidiques sur les fonctions de la barrière urothéliale et les processus associés (prolifération cellulaire, mort cellulaire, …) ainsi que leur implication suite à une lésion médullaire - Identifier les cibles moléculaires clés sous-jacentes à ces changements fonctionnels grâce aux tissus murins collectés à la fin des expériences

Procédures

Lésion médullaire: Les animaux seront anesthésiés dans un 1er temps afin d’effectuer la lésion médullaire ; et cette procédure dure 15 minutes par animal ; au début de l’expérimentation. Les instillations de médiateur lipidique (ou de son solvant) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane, que ce soit par instillation transuréthrale ou par voie sus-pubienne sous contrôle échographique. Les souris seront anesthésiées 3 minutes au maximum ; à partir de J14 et 3 fois/semaine soit 6 fois au total. L’étude du transit colique, du transit total et de la perméabilité intestinale sont réalisées en même temps ce qui permet de limiter les manipulations. Les souris seront gavées au début. Il y aura un prélèvement de sang (15 µl ± 5 µl) pour la perméabilité intestinale. L’endroit de l’incision sera ensuite comprimé avec une compresse afin de stopper le saignement. Ces 3 techniques seront réalisées 2 fois au total ; à J7 et J21. Pour le transit colique distal, les souris seront anesthésiées très rapidement (1 min), le temps de mettre la bille dans le colon. Cette procédure sera réalisée à J8 et J22. Pour l’open field, les animaux seront placés individuellement au centre d’une enceinte carrée et leurs mouvements seront enregistrés. Nous effectuerons cette procédure 2 fois au total : à J8 et J25.

Impact sur les animaux

La lésion médullaire induit une mobilité réduite des animaux. Les souris ont les membres inférieurs paralysés mais peuvent toujours se déplacer. Il peut y avoir des risques d’infections urinaires et pour éviter cela, nous changerons la litière quotidiennement tout au long de l’expérimentation. Suite à la chirurgie, les animaux recevront du Metacam associé à de la buprénorphine pendant 3 jours afin de réduire au maximum la douleur. La période post-chirurgie est très importante et la responsable du projet ainsi que l’étudiant associé prêteront une grande attention au bien-être de l’animal : les souris seront observées 2 à 3 fois/jour les 3 premiers jours ; puis quotidiennement. Afin d’éviter une déshydratation de l’animal, nous lui injecterons du NaCl en s.c (200 ul) le soir de la chirurgie ainsi que les 2 à 3 jours suivants. Les animaux auront un accès à l’eau facilité par des tétines plus longes sur les biberons ainsi que des croquettes humides ajoutées quotidiennement dans la cage. Au cours du temps, il est possible de voir les animaux avec des « fécès accrochées à leur postérieur ». Si c’est le cas, les animaux seront nettoyés à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique.

Devenir

Procédures 1, 2 et 3 : les procédures 1 et 2 serviront à la mise au point du modèle (cathétérisation transuréthrale ou instillation sus-pubienne) tandis que la procédure 3 sera la manip complète. Dans les 3 procédures, les animaux auront une chirurgie de lésion médullaire et ceci est classé en procédure sévère.

Remplacement

La compréhension des troubles du transit observés chez les patients ayant une atteinte de la moelle épinière apparaît comme un enjeu de santé majeur, et n’est pas faisable en tant que telle en recherche chez l’Homme. Nous avons malheureusement besoin d’un modèle animal de lésion médullaire chronique pour partir à la fois des troubles observés in vivo, et en faire le parallèle avec les troubles fonctionnels observables ex vivo, et également sur des études plus fondamentales protéiques ou transcriptomiques des régulateurs de motricité digestive au niveau du SNE, ou bien en immunohistochimie. Par conséquent, le recours à l'utilisation de modèles animaux est indispensable dans notre étude et il n’y a pas d’alternative au Remplacement.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable. 2 types d’analyses statistiques seront réalisés : A- "one way anova (Kruskal Wallis test)" pour comparer les différents groupes entre eux à un instant donné, suivi d'un post test de Dunn (qui permettra de comparer 2 conditions données) B- Un two way repeated measure ANOVA suivi d’un post test de Bonferroni pour comparer l'évolution des groupes entre eux au cours du temps Dans ce nombre d’animaux, nous avons inclus les pertes liées à la chirurgie qui est une procédure sévère. Nous estimons entre 15 et 20 % de perte malheureusement (échec de la chirurgie, euthanasie de l’animal si atteinte de points limites, …) Nous avons prévu 24 animaux/condition afin d’être sûre d’en avoir 20/condition.

Raffinement

Afin de limiter toutes sources d'angoisse et de souffrance, la réalisation du modèle de lésion médullaire sera effectuée sous anesthésie générale. Les animaux du modèle recevront de l'analgésique avant l'opération, puis 1 fois par jour pendant 3 jours, pour éviter toute souffrance. Afin d’éviter une déshydratation de l’animal, nous lui injecterons du NaCl en s.c (200 ul) le soir de la chirurgie ainsi que les 2 à 3 jours suivants. Les animaux auront un accès à l’eau facilité par des tétines plus longes sur les biberons ainsi que des croquettes humides ajoutées quotidiennement dans la cage. Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, et avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l’étude tous les jours, avec un remplacement journalier de la litière et une mise en place d'un enrichissement par frisottis. La période post-chirurgie est très importante et la responsable du projet ainsi que l’étudiant associé prêteront une grande attention au bien-être de l’animal : les souris seront observées 2 à 3 fois/jour les 3 premiers jours ; puis quotidiennement. Au cours du temps, il est possible de voir les animaux avec des « fécès accrochées à leur postérieur ». Si c’est le cas, les animaux seront nettoyés à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique. Des points limites seront mis en place pour évaluer le mal-être des animaux (douleur, stress, souffrance). En cas d'éventuels signes de souffrance les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris présente un temps de transit idéal pour les études de motricité et de perméabilité in vivo. Les souris seront âgées de 6-8 semaines. A ce stade, les souris sont adultes et ont des fonctions digestives assez développées pour nos études.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière qui le prive de ses fonctions urinaires et motrices, avant d'être tué pour prélever la moelle et l'analyser. Le porteur suit la douleur avec une grille faciale et prévoit des massages vésicaux quotidiens et une antibiothérapie, la perte des fonctions vésicales étant importante. Il présente le projet comme la démonstration de la "véracité" d'une méthode déjà utilisée en Chine, avec l'espoir lointain de faire retrouver l'usage des jambes à des patients.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de montrer l'efficacité d'injection de cellule en provenance de "tissus adipeux", dans un modèle lésionnel de moelle épinière sur le rat. Cette étude vise à prouver l'intéret de cette méthode, déja utilisée en chine et à en démontrer toute la véracité.

Bénéfices attendus

les bénéfices pour les patients seraient de retrouver l'usage des membres inférieurs.

Procédures

Les animaux auront une intervention chirurgicale de lésion de moélle épinière, cette opération dure 20 minutes et est réalisée sous anesthésie générale et sous morphinique (buprecare). Des tests Locomoteurs sont également réalisés, les animaux sont entrainés et ne subissent aucune contrainte physique . Pour éviter tout stress, les tests sont réalisés par une personne qualifiée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont mulitiples, l'animal perdra ses fonctions vésicales et fonctionnelles.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés avec une dose léthale d'Euthoxin, associée à une injection de morphinique (Buprecare) en IP et ensuite, un prélevement de moelle épinière sera effectué, afin de faire une évaluation histologique.

Remplacement

Le rat est un modèle où les évènements cellulaires qui suivent la lésion médullaire miment ceux retrouvés chez l’Homme. En effet, chez le rat la lésion médullaire entraine la formation de cavités dépourvues de toute cellule. De plus, le rat ne présente pas de récupération spontanée. L'utilisation de ce modèle animal est absolument indispensable, afin d'établir, selon un cahier des charges de l'IRME, une étude sur une thérapie adopté chez l'homme ( voir les informations sur la justification).

Réduction

Nous avons utilisé un nombre minimal d'animaux, afin que l'étude sur des différents plans (histologique, statisitique) puisse se dérouler sans emconbres. Le nombre d’animaux a été évalué à partir des études précédentes, à savoir que les expériences histologiques seront effectuées avec 5 à 10 animaux par groupe et celles concernant la récupération fonctionnelle seront effectuées avec 10 à 20 animaux par groupe. C’est pourquoi nous comptons opérer 40 animaux. Des tests statistiques non paramétriques de type Mann Whitney seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=5 à 10 par groupe.

Raffinement

Nous utilisons le score du Grimace scale: Une observation quotidienne sera effectué, afin d'oberver les animaux et d'utiliser cet outil de diagnostic , basé sur l'observation de l'animal. Définition de l'indice grimace faciale ou grimace scale; il est basé sur l'observation de 4 caratéristiques faciales marquant la souffrance , à savoir le resserrement orbital, le renflement du nez ou le renflement des joues, la position des oreilles et le changement des vibrisses. chaque signe clinique établi un score, voici le tableau définissant la méthode: 0-aucun signe De 1 à 3 : signes modérés, a ce stade, l'administrtion de morphinque sera réalisé (Buprecare), afin de limitre la souffrance. A partir de 4: ces signes évidents de caractéristiques de la souffrance, nous conduisent à l'euthnasie del'animal ( une injection d'une dose léthale d'Euthoxin sera réalisé en IP). De plus, les animaux seront hébergés aux normes requises et un enrichissement (plaques de cellulose vierge et "loft" en carton) est mis en place. Les conditions d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux qui seront observés régulièrement durant toute la durée du protocole expérimental. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire permettra de contrôler l’absence de souffrance. De même, l’examen de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, des yeux et des muqueuses) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales et de changement de comportement (agitation, prostration, grimace) seront minutieusement surveillés. La perte des fonctions vésicales est importante, les animaux seront tous massés plusieurs par jour et une antibiothérapie sera mis en place d'une façon systématiquement , afin d'éviter tous risques d'infection urinaire.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le rat, afin de poursuivre les études et la thématique , réalisées au sein du laboratoire. Ceux-ci, dans le but de connaitre les effets de la transplantation de Tissus Adipeux centrifugé et de connaitre et d'observer l'impact sur la récupération fonctionnelle et la régénération tissulaire, dans un modèle, mimant ceux retrouvés chez l’homme. Les animaux seront utilisés lorsqu’ils seront jeunes (âgés de 8 à 10 semaines) dans le but de se rapprocher des cas observés chez l’homme.